19 Congresso de Iniciao Cientfica DEFINIO DE PARMETROS ESPECTROFOTOMTRICOS PARA QUANTIFICAO DE PRINCPIOS ATIVOS EM PRODUTOS FITOTERPICOS

Autor(es)

ALINE APARECIDA ARANTES E SILVA AZEVEDO

Orientador(es)

CARLOS OTVIO MARIANO

Apoio Financeiro

FAPIC/UNIMEP 1. Introduo

As plantas so uma fonte importante de produtos naturais biologicamente ativos, muitos dos quais se constituem em modelos para a sntese de um grande nmero de frmacos (SIMES et al., 2002). A utilizao de plantas medicinais tornou-se um recurso em teraputica que apresenta uma grande aceitao pela populao, segundo dados da Organizao Mundial da Sade (OMS), cerca de 80% da populao mundial utilizam produtos de origem natural para combater problemas como presso alta, queimaduras, gripe, tosse, priso de ventre, entre outros (CAFITO, 2009; OLIVEIRA, 2005). Os mtodos analticos permitem a avaliao da qualidade do produto fitoterpico, garantindo a constncia de ao teraputica e segurana de utilizao, fatores necessrios para a transformao de uma planta em medicamento (OLIVEIRA, 2005). Pretende-se com este projeto desenvolver uma metodologia prtica de quantificar os princpios ativos em tinturas (forma de extrao mais prxima da popular) e extratos secos, bem como desenvolver um estudo de estabilidade em frmacos, conforme Resoluo RE n 1, de 29 de julho de 2005 - ANVISA. Para tanto, sero estudados os parmetros espectrofotomtricos para quantificar os princpios ativos nas amostras, e a manuteno da proporcionalidade quantitativa nas diversas manipulaes realizadas a partir das amostras me. Visando uma futura aplicao do procedimento desenvolvido em farmcias de manipulao. DETERMINAO DE PRINCPIOS ATIVOS POR ESPECTROFOTOMETRIA UV-VIS Os princpios ativos so substncias presentes nas plantas responsveis pelo seu efeito teraputico, sendo assim, a qualidade das plantas medicinais est relacionada ao seu teor de princpio ativo e, portanto, a sua eficincia teraputica (MENDES et al., 2005). A determinao do teor de princpio ativo se faz muito importante, uma vez que a quantidade de substncias ativas presentes em uma determinada planta varia de acordo com as caractersticas climticas-edficas a que esta se expe no seu local de cultivo (habitat, regime de chuvas, insolao, tipo de solo, sazonalidade, etc.), alm da idade da espcie, poca da colheita e condies de estocagem. Portanto, a avaliao e determinao desses princpios so tarefas indispensveis para a obteno de produtos de boa qualidade (HUBINGER, 2009; OLIVEIRA, 2005). A espectrofotometria na regio UV-VIS do espectro eletromagntico uma das tcnicas analticas mais empregadas, em funo de sua robustez, custo relativamente baixo e grande nmero de aplicaes (POZZI, 2007). Porm, a determinao de princpios ativos por Espectrofotometria em Ultra Violeta-Visvel (UV-VIS) s possvel quando estes possuem grupos cromforos (grupo insaturado covalente responsvel pela absoro da radiao eletromagntica) na sua estrutura molecular (SOBRINHO et al., 2008).

FLAVONIDES Entre os diversos princpios ativos existentes na natureza, os flavonides constituem um dos mais importantes, denominados metablicos secundrios (VIEIRA et al., 2008; SIMES et al, 2002). Diversas funes so atribudas aos flavonides nas plantas, garantindo o equilbrio ecolgico. Entre elas podemos citar a proteo dos vegetais contra a incidncia dos raios ultravioletas e visvel, alm de proteo contra insetos, fungos, vrus e bactrias; atraentes de animais com finalidade de polinizao e antioxidantes. (SIMES et al., HUBINGER, 2009). Esses metablicos podem ser encontrados nas frutas, vegetais, sementes, flores e cascas de rvores, tambm no vinho, em cereais e ocasionalmente em corantes alimentares. Dessa forma, tornam-se parte ntegra da dieta humana (SIMES et al., 2002; VIEIRA et al., 2008). A espectroscopia no ultravioleta a principal tcnica utilizada na determinao de flavonides, declara Simes et al. (2002). A complexao desses metablicos com metais, principalmente com o on Al3+, comumente empregada nos seus estudos pela anlise da absoro UV-Visvel, os deslocamentos so devidos formao do complexo Al3+-flavonide (POZZI, 2007).

2. Objetivos

Determinao de uma metodologia vivel para quantificao de flavonides totais em tinturas e extratos secos.

3. Desenvolvimento

AMOSTRAS Foram utilizadas amostras de Prpolis, Cassau (Aristolochia cymbifera Mart & Zucc) e Arnica, sendo que esta ltima corresponde combinao de dois tipos de Arnica, a Arnica Imperial (Arnica Montana L) e a Arnica Nacional (Solidago microglossa DC), em proporo de 50% p/p. As amostras foram fornecidas pelo laboratrio da Farmcia de Manipulao Prof. Accorsi Plantas Medicinais/ Piracicaba-SP, sob a forma de tinturas e extratos secos das mesmas. As tinturas foram preparadas em solues etanicas, sendo que a prpolis foi preparada a 30% com etanol a 85%, e as duas ltimas a 20% com etanol a 70%. Os extratos secos foram modos em moinho Marconi MA 345, at uma granolumetria de 0, 250 mm. EQUIPAMENTOS Espectrofotmetro UV-VIS Femto modelo 800 XI, localizado no laboratrio de Engenharia de Alimentos, da FEAU UNIMEP Espectrofotmetro UV-VIS Femto 800 XI, localizado na Farmcia de Manipulao Prof. Accorsi Plantas Medicinais Espectrofotmetro UV-VIS Jasco modelo 7800, localizado no laboratrio de Qumica, da FEAU UNIMEP MTODOS PROCEDIMENTO 1: Determinao do teor de Flavonides Totais em Quercetina nas tinturas (Mtodo descrito por Park et al., 1995). Preparao da curva padro de Quercetina Concentraes crescentes de quercetina foram preparadas em soluo etanica. Em duas sries de tubos de ensaio, com e sem nitrato de alumnio, adicionou-se 0,5mL da amostra (quercetina) em cada um. Nos tubos que receberiam nitrato, adicionou-se 4,3mL de etanol a 80% e nos demais, 4,4mL de etanol a 80%. Em todos os tubos adicionou-se 0,1mL de acetato de potssio. E, apenas nos que receberiam nitrato, adicionou-se 0,1mL de nitrato de alumnio. Preparou-se o branco com 4,9 mL de etanol a 80% e 0,1mL de acetato de potssio. Aps 40 minutos medir absorbncia em 415nm, zerando com o branco. Preparao das amostras:

A preparao das amostras foi executada da mesma maneira que a curva padro de quercetina. No lugar das solues de quercetina, adicionou-se 0,5mL das tinturas de prpolis, cassau e arnica, nas suas respectivas diluies. Posteriormente seguiu-se a mesma sequncia citada anteriormente. A Arnica e a Cassau foram utilizadas nas diluies de 1:5 e 1:10 em soluo etanica, porm, a Prpolis apresentou melhores resultados nas propores de 1:25, 1:50 e 1:100. Clculos: A partir da curva padro de quercetina realizou-se o seguinte clculo: Y=(A.?)+B, sendo ?=C-S X=(y.0,8936.2.F)/1000 [%] FLAVONIDES TOTAIS = (X.1000/CONC.AMOSTRA).100 Onde: A: Fator A, obtido a partida da equao da curva padro de quercetina; B:Fator B, tambm obtido a partir da curva padro de quercetina; C: Absorbncia da amostra Com Nitrato; S: Absorbncia da amostra Sem Nitrato; X: Concentrao de Flavonides expresso em quercetina em mg/mL da soluo; F: Fator de Diluio (ex: 1:5, 1:50); Conc. da Amostra: Concentrao inicial da amostra (ex: 20% =200); Fator de Correo (quercetina): 0,8936. PROCEDIMENTO 2: Determinao do teor de Flavonides Totais em Hiperosdeo (Metodologia interna descrita pelo laboratrio Santosflora, 2009) e Isoquercetina (Farmacopia Portuguesa 6 ed. Supl. 1998), nos extratos secos. Ambas as metodologias so idnticas, diferenciando apenas na preparao do Branco. Aps a anlise de estruturas do Hiperosdeo e da Isoquercetina, verificou-se que ambos apresentam o mesmo grupo cromforo, portanto podem ser identificados pela mesma metodologia: Realizou-se a extrao da amostra seca em acetona, sob refluxo. Denominou-se o extrato obtido de soluo-estoque1. Posteriormente preparou-se a soluo-estoque2, submetendo o extrato em acetato de etila, em funil de separao, lavando com gua destilada e filtrando em sulfato de sdio anidro. A amostra foi preparada adicionando-se 10mL da soluo-estoque2 em balo volumtrico de 25 mL, 1mL de soluo reagente de cloreto de alumnio e o volume completado com soluo de cido actico 5% em metanol. Aps 30 minutos medir a absorbncia em 425 nm, zerando com o branco. Branco: Transferir 4 mL de acetona para balo volumtrico de 10 mL e completar o volume com soluo de cido actico 5% em metanol. Clculo: [%] Flavonides = (Abs/p).1,25 Onde: Abs = absorbncia medida; P = peso da droga (g); PROCEDIMENTO 3: Adaptao do PROCEDIMENTO 2 nas tinturas. Escolheu-se empregar tinturas de Arnica e Cassau nas propores de 1:10, e a Prpolis, na proporo de 1:50. Aplicou-se o PROCEDIMENTO 2 a partir da preparao da soluo-estoque 2, exatamente como descrito. PROCEDIMENTO 4: Aplicao da soluo-estoque 1 (obtida no segundo procedimento) no PROCEDIMENTO 1.

Utilizou-se a soluo-estoque1 como amostra, pura e diluda em soluo etanica. Porm, as amostras puras apresentaram melhores resultados. O procedimento foi realizado exatamente como o primeiro. PROCEDIMENTO 5: Determinao do teor de Flavonides Totais em Rutina (Metodologia descrita por Santos e Blatt, 1998) nas tinturas e extratos secos. Utilizou-se neste procedimento as tinturas e a soluo-estoque 1 de Prpolis, Cassau e Arnica. As tinturas foram diludas nos respectivos alcois em que foram preparadas, nas propores de 1:50 para a Prpolis e 1:10 para as duas ltimas. J a soluo-estoque 1 foi utilizada sem diluir. Preparao da curva padro de Rutina: Alquotas de 3,5 a 7,5mL da soluo de Rutina 100 g/mL (com intervalos de 0,5 mL) em balo volumtrico de 50 mL, acrescidas de 1 mL de cloreto de alumnio 5% em metanol, completando com metanol a 70%. Preparou-se o branco com 1 mL de cloreto de alumnio 5% em metanol, acrescido com metanol a 70% em balo volumtrico de 25 mL. Aps 30 minutos mediu-se a absorbncia em 425nm, zerando com o branco. Preparao das amostras: A preparao das amostras foi realizada da mesma maneira citada acima, adicionando-se 15mL das mesmas em balo volumtrico de 50mL. Procedeu-se o restante de forma idntica. Os clculos so os mesmos realizados no primeiro procedimento, com exceo ao fator de correo da rutina, que igual a 0,94427.

4. Resultado e Discusso

Todos os procedimentos apresentaram-se viveis para a quantificao de flavonides totais nas condies dos laboratrios disponveis para o mesmo. Os mtodos so simples e requerem o uso de poucos reagentes e de baixo custo. Os procedimentos 3 e 4 foram realizados apenas para verificar a versatilidade dos procedimentos 1 e 2, pois o que se busca uma metodologia que quantifique flavonides totais em diferentes tipos de amostras (no caso, tinturas e extratos secos). Ambos os procedimentos foram realizados com sucesso, comprovando esta versatilidade. A Tabela 1 apresenta os resultados das trs principais metodologias quercetina, hiperosdeo/isoquercetina e rutina para cada tipo de amostra (tintura e soluo-estoque 1), da Prpolis, Cassau e Arnica, assim como o desvio padro entre elas. Posteriormente aplicou-se nos resultados o teste F, teste t, teste de Tukey e de Duncan, verificando se h significncia nos resultados (Tabela 2). Todos os testes foram realizados ao nvel de significncia de 1%. O valor de F na tabela 30,8, logo, para este teste os desvios no foram significativos. No teste t e de Duncan, o procedimento de quantificao de flavonides totais por rutina apresentou significncia nas amostras de Prpolis, demonstrando uma diferena mdia significantemente maior que o valor absoluto da diferena mdia (d.m.s.). O doseamento de fitoterpicos feito atravs de um ou mais marcadores, que so substncias qumicas definidas presentes no fitoterpico e que o caracteriza. Sendo assim, o procedimento de rutina tem menor sensibilidade para quantificao de flavonides totais na Prpolis e no pode ser considerado, portanto, como uma metodologia vivel, pois no quantifica qualquer espcie de amostra. Entre os tipos de amostra, a diferena entre os resultados no foi significativa, ou seja, a quantificao de flavonides totais pode ser realizada tanto em tinturas quanto em extratos secos (soluo-estoque 1).

5. Consideraes Finais

Este projeto realizou a aplicao dos trs principais procedimentos para a quantificao de flavonides totais quercetina, hiperosdeo/isoquercetina e rutina. Comparando-os verificou-se que o procedimento rutina no verstil, pois apresentou menor sensibilidade para a anlise de Prpolis. Os procedimentos de determinao por quercetina e hiperosdeo/isoquercetina, por sua vez, apresentaram bons resultados entres as diferentes condies de amostra e nenhuma significncia. Levando em considerao as condies de laboratrio, os reagentes e o tempo para realizao dos procedimentos, conclui-se que o PROCEDIMENTO 1 que faz quantificao de flavonides totais em quercetina (mtodo descrito por Park et al., 1995) vivel para quantificao de qualquer tipo de amostra, seja esta em forma de tintura ou extrato seco.

Referncias Bibliogrficas

BRASIL. Farmacopia Brasileira. 5 ed. Braslia: Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria, 2010. 546 p. CAFITO. Fitoterapia. Crf-sp, So Paulo, jul. 2009. HUBINGER, Silviane Zanni. Estudo farmacognstico e desenvolvimento de fitocosmticos de ao antioxidante dos frutos de ( Dimorphandra mollis Benth. (Leguminosae Caesalpinioideae). Dissertao (Mestrado) Curso de Cincias Farmacuticas, Unesp, Araraquara, 2009. MENDES, A.D.R. et al. Produo de biomassa e de flavonides totais por fava d'anta (Dimorphandra mollis Benth.) sob diferentes nveis de fsforo em soluo nutritiva. Revista Brasileira de Plantas Medicinais, Botucatu, v.7, n.2, 2005. OLIVEIRA, Marcos Andr Cunha de. Fitoterpico: Perfil Fitoqumico, Controle e Validao da Metodologia Analtica. Dissertao (Mestrado) - Curso de Cincias Farmacuticas, Departamento de Cincias Farmacuticas, Ufpe, Recife, 2005. POZZI, Alessandra Cristina Soares. Desenvolvimento de mtodos de anlise espectrofotomtrica de flavonides do "Maracuj": Passiflora alata e Passiflora edulis. Dissertao (Mestrado) - Curso de Cincias, Usp, So Carlos, 2007. SANTOS, M.D. dos; BLATT, C.T.T. Teor de flavonides e fenis totais em folhas de Pyrostegia venusta Miers. de mata e de cerrado. Revista Brasileira de Botnica, So Paulo, v. 21, n. 2, ago. 1998. Disponvel em: Anexos