QUMICA BIOLGICA Trabajo Prctico N 1: Cintica enzimtica Si se mide la aparicin de producto o el consumo de sustrato en funcin del tiempo de reaccin

enzimtica, se obtiene una curva cuya pendiente en cada punto es numricamente igual a la velocidad de reaccin en ese instante. En la mayora de las reacciones enzimticas es posible, acortando suficientemente los perodos de medida de la la reaccin, obtener una zona inicial donde la aparicin del producto o el consumo de sustrato es funcin lineal del tiempo. En esta zona la pendiente es constante y en consecuencia la velocidad en cualquier instante es la misma. La pendiente de la zona de linealidad de aparicin de producto o de consumo de sustrato en funcin del tiempo se denomina "velocidad inicial". En la prctica se considera que se est en condiciones de "velocidad inicial" cuando la cantidad de sustrato consumido es a lo sumo el 5% del inicial. Todas las ecuaciones de cintica enzimtica han sido desarrolladas suponiendo que lo que se mide es la velocidad inicial. Por este motivo la determinacin del tiempo de incubacin en el que es posible medir la velocidad inicial, es un paso indispensable en el estudio de cualquier enzima. En el experimento que se describe a continuacin se har el estudio cintico de una enzima, la fosfatasa alcalina. Esta enzima, en medio alcalino y en presencia de Mg2+ cataliza la hidrlisis de steres fosfricos. Para su determinacin se utiliza como sustrato el p-nitrofenil fosfato, que se escinde en p-nitrofenol y cido fosfrico. El p-nitrofenol liberado se encuentra en forma de anin de color amarillo, que puede determinarse espectrofotomtricamente a 410 nm (coeficiente de extincin molar: 18.000 M-1.cm-1). Objetivo del experimento: Determinar la concentracin proteica de una solucin de fosfatasa alcalina. Determinar los parmetros cinticos de la enzima mediante un mtodo espectrofotomtrico cintico. Expresar la Vmax en UI / mg de protena.

Parte A: Determinacin de la concentracin proteica Mtodo de Bradford: mtodo por unin a colorantes

En condiciones adecuadas los grupos cidos o bsicos de las protenas pueden interactuar con grupos orgnicos de determinados colorantes para dar lugar a complejos con un color caracterstico. Para el ensayo de Bradford se utiliza el colorante Coomassie Brillant Blue G250. Se basa en la conversin de la forma leuco del colorante (marrn-naranja) a una de color intensamente azul cuando los grupos aninicos del colorante interactuan con los grupos amino de las protenas. Dicha reaccin se mide por absorbancia a 595nm, existiendo una relacin lineal dentro de determinadas concentraciones de protenas.

Este mtodo es muy rpido y sensible y se puede trabajar en un rango de 20 a 140 microgramos de protena para el ensayo estndar y de 1 a 50 microgramos para el microensayo.

Materiales y Mtodos: Espectrofotmetro y cubetas adecuadas Estndar de protenas con concentracin conocida: 1mg/ml de Seroalbmina bovina (BSA) Muestra de concentracin desconocida (muestra incgnita) Reactivo de Bradford: 100 mg de Coomassie Brilliant Blue G-250 se disuelven en 50 ml de etanol y 100 ml de cido fosfrico al 85%. Se ajusta el volumen a 1 litro con agua y se filtra. Estable por 2 meses. Microensayo: las muestras se llevan a 800 microlitros con agua, se agrega 0,2 ml de reactivo de Bradford, se agita y se deja 5 min a temp ambiente. Leer a 595 nm e interpolar en una curva estndar. Corregir por el factor de dilucin si fuera necesario.

Preparacin de la curva estndar: g de BSA 0 2 4 7 10 25 l 0 H2O (l) 800 c.s.p 800 c.s.p 800 c.s.p 800 c.s.p 800 c.s.p 800 Bradford(l) 200 200 200 200 200 200 Abs 595nm

Luego de agregar el reactivo de Bradford agitar e incubar a T ambiente 5. Leer Abs a 595nm Graficar Absorbancia en funcin de g de protena, calcular la pendiente de la curva. Efectuar diluciones de la muestra e interpolar esos datos en la curva estndar para averiguar la concentracin.

Parte B: Determinacin de las velocidades iniciales Materiales y mtodos:

Pipetas automticas Cubetas de 100 ul Recipiente con hielo granizado Bao termostatizado a 37C Cronmetro Espectrofotmetro p-nitrofenilfosfato (sal disdica) CO32-/HCO3- (pH 10.7) MgCl2 fosfatasa alcalina CO32-/HCO3- (pH 10.7) MgCl2 2x10-2 M 2x10-1 M 3x10-5 M 2x10-1 M 3x10-5 M

a) Sustrato:

b) Enzima:

Estas soluciones deben conservarse a baja temperatura en un recipiente con hielo granizado. c) Buffer: CO32-/HCO3- (pH 10.7) MgCl2 2x10-1 M 3x10-5 M

Tabla: Composicin de las mezclas de reaccin para determinar la velocidad de aparicin de producto en funcin del tiempo para cada concentracin de sustrato

Tubo N 1 2 3 4 5 6

Sustrato (ul) 5 10 20 30 40 50

Enzima (ul) 10 10 10 10 10 10

Buffer (ul) 85 80 70 60 50 40

Procedimiento: Efectuar una dilucin adecuada de la solucin que contiene la enzima. Llevar a cero el espectrofotmetro con agua, seleccionando 410 nm de longitud de onda. Preincubar cada mezcla de sustrato y buffer durante 1 minuto a 37C segn los volmenes que figuran en la tabla. Iniciar la reaccin con el agregado de la enzima poniendo en marcha, simultneamente, el cronmetro. Pasar la mezcla de reaccin a la cubeta y leer las absorbancias cada 30 segundos durante 5 minutos. Para cada concentracin de sustrato

determinar la velocidad inicial de reaccin expresada como micromoles de producto generados por minuto. Parte C: Determinacin de los parmetros cinticos

Grafique velocidad inicial en funcin de la concentracin de sustrato y la inversa de la velocidad inicial en funcin de la inversa de la concentracin de sustrato. Inspeccione los grficos e interprete si la cintica obedece a la ecuacin de Michaelis-Menten. Estime de las dos representaciones las constantes cinticas de la enzima: la velocidad mxima (Vmx) y la constante de Michaelis (KM). Expresar la Vmx como UI/mg de protenas. Cuestionario: 1- Qu representacin le parece ms adecuada para estimar los parmetros cinticos?Por qu? 2 En el caso de considerar significativa la hidrlisis no enzimtica del sustrato, cmo procedera para determinar la velocidad inicial de reaccin para cada concentracin de sustrato? 3 - Hasta qu tiempo la velocidad de formacin de producto es constante? Por qu? Relacione esta observacin con el clculo de la cantidad total de sustrato consumida durante cada ensayo y si se cumple la condicin de velocidad inicial.