Preconcentration Techniques DETERMINATION OF MELAMINE USING MAGNETIC MOLECULAR IMPRINTED POLYMERS AND HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY Miao

Wang, Yong-xin She, Xin-wei Du, Yu-ting Huang, Xiao-mei Shi, Mao-jun Jin, Fen Jin, Hua Shao, and Jing Wang Key Laboratory of Agrifood Safety and Quality, Ministry of Agriculture, P. R. China, Institute of Quality Standards and Testing Technology for Agriproducts of CAAS, Beijing, China A novel method using magnetic molecular imprinting polymers (MMIP) specic for recognizing, separating, and extracting melamine in bovine milk was developed with an external additive magnetic shelf in this paper. The MMIP was synthesized with Fe3O4 nanoparticles and molecular imprinted polymer synthesis technology. With the help of an elution step using methanol/acetic acid mixture elution, the melamine could be collected and concentrated. By using high performance liquid chromatography combined with this pretreatment technique, the analytes eluted from the magnetic polymers can be determined. This extraction method was validated by analysis of incurred bovine milk matrix. The proposed method simplied the procedures of classical solid-phase extraction method and improved the reliability of method. The obtained recoveries of this method were in the range of 85.04105.2% in spiked milk samples. The limit of detection (LOD) was below 29.2 ng g-1. Keywords: High-performance liquid chromatography; Magnetic molecular imprinted polymer; Melamine; Pretreatment INTRODUCTION Melamine is a nitrogen-containing heterocyclic triazine with a nitrogen content of 66.7%. It has been illegally added to dairy products and raw milk to make products appear to have high protein content (Li et al. 2010). There are many detection methods for melamine, including high-performance liquid chromatography (HPLC), HPLC-mass spectrometry (Ding et al. 2008; Received 24 May 2012; accepted 23 June 2012. This work was supported by National Natural Science Foundation of China (No. 31171890, 30771425). Address correspondence to Jing Wang, Chinese Academy of Agriculture Science, Institute of Quality Standards & Testing Technology for Agro-Products, Zhongguancun South Street No.12, Haidian District, Beijing 100081, China. NEW METHOD TO TEST MELAMINE IN MILK Filigenzi et al. 2008), gas chromatography-mass spectrometry (Miao et al. 2009), surface enhanced Raman spectroscopy (Lin et al. 2008), and capillary electrophoresis (Yan et al. 2009). Molecular imprinting is a popular method developed in recent years that is based on the lock and key hypothesis (Pauling 1940). In a suitable solvent, with the help of intermolecular forces, the template molecule and functional monomer can form a host-guest complex. Addition of a cross-linking agent and initiator can initiate formation of stable polymers. After elution of the

template molecule, cavities that act as specic binding sites for the analytes are formed in the polymer. These molecular imprinted polymers (MIPs) have stable and specic selectivity for the target molecules. (Wulff, Sarhan, and Zabrocki 1973) Compared to biological antibodies, MIPs have better physical and chemical stability, are less expensive, easier to prepare, and could be used in a wide range of chromatographic separations, biomimetic sensors, solidphase extractions, and many other areas (Koohpaei et al. 2008). The Fe3O4 nanoparticles are functional nanomaterials that are used in nucleic acid analysis, clinical diagnosis, targeting of drugs, enzyme and cell immobilization, and many other elds because of their magnetic characteristics, superpara- magnetism, and ability to be functionalized to gain biochemical activity (Gubin 2009). Synthesis of MIPs on the surface of Fe3O4 nanoparticles would combine their selective adsorption and magnetic properties. Magnetic beads with aMIP shell could be used in many applications for the detection of residues (Ansell and Mosbach 1998). In the present study, magnetic particles were coated with MIPs that could specically recognize melamine. These magnetic MIPs (MMIPs) were used to detect melamine in bovine milk. EXPERIMENTAL Chemicals The FeC13- 6H2O, FeC12 - 4H2O, azobisisobutyronitrile, and NaOH were purchased from Beijing Chemical Co. (Beijing, China). The PEG6000, PVA, and oleic acid were obtained from Sinopharm Reagent Co. Melamine was purchased from Alfa Aesar Co. Meth acrylic acid (MAA) and ethyleneglycol dimethacrylate (EGDMA) were obtained from Acros Organics, and acetonitrile and methanol were from Thermo Fisher Scientic. Synthesis of Magnetic Nanoparticles A solution of FeCl3 - 6H2O (5.4 g) and FeCl2 - 4H2O (1.99 g) (molar ratio 2:1) was prepared in 80mL of double-distilled H2O, and then transferred into a three-necked ask and stirred at 600 rpm. The mixture was heated to 700C, and N2 was bubbled through the solution for 30min to remove O2. A 20mL amount of an aqueous NaOH (16 g=mL) solution that had been bubbled with N2 was then quickly added to the mixture. The mixture was then stirred under N2 for 2 h to ensure the reaction reached completion. When the reaction reached completion, black Fe3O4 nanoparticles were observed in the three-necked ask. Then 1 g ofPEG6000 and 2mL of oleic acid were added to the ask for surface modication of the nanoparticles. The nanoparticles were then washed with each of the following solvents in sequence: doubledistilled H2O, methanol, and acetonitrile. The magnetic particles were collected with a magnetic separation rack, and dried in a vacuum oven at 600C for 30min (Harris et al. 2003). Synthesis of MMIPs for Melamine Melamine (0.25mmol, 31.5mg), MAA (1mmol, 0.085mL), DMSO (2mL), and glycol (5mL) were added to a 100-mL round bottom ask. The mixture was vortex mixed and heated at 600 C until the melamine completely dissolved. Acetonitrile (40mL) was added, and the mixture was

shaken at room temperature, and then stored in the refrigerator (40 C) over night. The Fe3O4 magnetic particles (100mg), EGDMA (5mmol, 0.95mL), and azobisisobutyronitrile (10mg) were added, and the solution was bubbled with N2 for 10min to remove O2. The ask was sealed and heated at 600 C for 12 h, and then cooled on ice to room temperature. Polymers were visible in the ask after cooling, and these were isolated after ultrasonication for 10min and centrifugation at 5000 r=min for 5min. ThemagneticMIPs were then dried in a vacuum oven at 600 C for 30min (M. Ding et al. 2011). After polymerization, the template molecules needed to be removed from the cavities of the polymers. In this case, the magnetic polymers were washed with 95% methanol=5% glacial acetic acid in a Sox let extractor for 12 h to remove the melamine template from the MIP. The MMIPs were washed until melamine was no longer detected in the supernatant. After separation of the MMIPs with the magnetic rack, they were dried in a vacuum oven at 600 C for 2 h. (Li et al. 2010) Polymer Microspheres Characterization The surface structures and particle sizes of the polymer microspheres were analyzed by electron microscopy. The MIPs were also analyzed by Fourier transform infrared (FT-IR) spectrometry as KBr pellets. Adsorption Experiments with the Polymer Microspheres To investigate the effect of the reaction time on melamine absorption, MMIPs (2mg) were placed in a 1.5-mL centrifuge tube, and an acetonitrile solution of melamine (60mmol=L) was added. The mixture was placed in an oscillating shaker at 280 C, and shaken for various lengths of time. The MIPs were then isolated using the magnetic separation and the supernatant was analyzed by HPLC. For each shaking time, the binding capacity per unit mass of polymer adsorbed was calculated. The MIPs (2mg) were placed in 1.5-mL centrifuge tubes, and an acetonitrile solution of melamine (1mL, 0.164mg=L) was added. The mixture was placed in an oscillating shaker, and shaken for 12 h at 280 C. The binding capacity per unit mass of polymer was calculated, and adsorption isotherms of the melamine imprinted polymer microspheres were obtained. Selectivity of the MMIPs Atrazine, a structure analogue of melamine, and chloramphenicol, which is another prohibited chemical in milk, were used to investigate the selectivity of the MMIPs. The structures of these chemicals are shown in Fig. 1. Standard solutions (1mmol=L) of each compound were prepared in ethanol: water (9:1, v=v). An aliquot (1mL) of each standard solution was added to MMIPs (2.0mg) in an Eppendorf tube. The tubes were mixed vigorously for 15min at room temperature, and then the MMIPs were removed from the supernatant with an external magnet. The residual amount of each compound in the supernatant was determined by HPLC. HPLC Analysis A melamine standard stock solution (1.000 g=L) was prepared by dissolving an accurately weighed amount of melamine standard in solvent of methanol and water (4:1). The standard stock solution was diluted to prepare a series of melamine standard working solutions (0.1 256mg=L), which were used to construct a calibration curve.

The HPLC was performed on a Waters 2475=2998 (Waters Corporation, Milford, MA) with a Sepax Polar-100 HILIC column (Sepax, Newark, DE). The mobile phase was acetonitrile and ultra-pure water with 3mmol=L ammonium acetate (9:1), and mobile phase ow rate was 1.0mL=min. Melamine was detected at 240 nm using a diode array detector. Detection for Melamine by HPLC in Bovine Milk Bovine milk samples (2mL) were spiked with melamine (2.5 mg=mL), and then transferred into 50-mL centrifuge tubes. An extraction reagent (18mL) was added to each tube. The following extraction regents were evaluated for extraction of melamine from milk: (a) 18mL of pure acetonitrile; (b) 18mL of acetonitrile with 0.8 gMgSO4 and 0.2 g Na2SO4 as drying agents; and (c) 13.5mL of 1% triuoroacetic acid (TFA) and 4.5mL of acetonitrile. Each tube was mixed by ultrasonication for 10min and left to stand for 1min, and then 30mg of MMIPs was added. The tubes were vortex mixed for 5min, centrifuged for 10min at 8000 r=min, and left to stand for 1min, which separated the mixture into a clear supernatant and white sediment. TheMMIPs were then transferred into a clean 10-mL tube, and prewashed and conditioned with methanol. The supernatant from the last step was then pipette into the tube, and the tube was shaken so melamine came in direct contact with the MIPs and transferred onto them from the sample matrix. An external magnet was used to retain the MMIPs in the tube while they were washed twice to remove impurities. The melamine on the MMIPs was then eluted with 1.5mL of methanol: acetic acid (95:5, v=v) three times. The eluates were combined and evaporated to dryness under a stream of N2. The residue was resuspended in HPLC grade pure acetonitrile, ltered through a 0.22-mm membrane lter and injected into the HPLC (Chen 2009). RESULTS AND DISCUSSION Characterizations of the Magnetic Particles and MMIPs The Fe3O4 particles were synthesized and coated with oleic acid and PEG 6000 to form a hydrophobic shell and add some necessary chemical groups. The coated Fe3O4 then bound easily to MAA and EGDMA, which were used as a functional monomer and cross linker to synthesize the MMIPs. The average diameter of the nanoparticles was about 10 nm. Figure 1 shows the FT-IR spectrum of the modied Fe3O4 nanoparticles. The peak at 560 cm-1 is a characteristic peak of Fe3O4, and can be attributed to Fe-O stretching and bending vibrations. Peaks were also observed at 580 and 400 cm-1 because of displacement caused by the nanoparticle size effect. The broad absorption band near 3400 cm-1 corresponds to hydrogen bonds, and the peaks at 2920 and 3024 cm-1 can be attributed to stretching vibrations of CH-2. The peaks at 1500 cm-1 and 1150 cm-1 are from OH bending and C-O stretching of the alcoholic hydroxyl, respectively, in PEG6000. The two peaks at 1700 cm-1 (C-O stretch) and 3444 cm-1 (OH stretch) indicate carboxylic groups are present in the polymer. In the FT-IR spectrum of the MMIPs (Fig. 2), peaks were observed at 1700 cm-1 (C-O stretch) and 3444 cm-1 (O-H stretch) for the carboxylic groups on the surface of the polymer. Peaks at 1601, 1492, and 1452 cm-1 can be attributed to benzene, and peaks at 700 and 750 cm-1 correspond to mono-substituted peaks of benzene. The peaks at 2923 and 3025 cm-1 are from methylene and C-H. The peak at 554 cm-1 is from Fe-O. These results show the MMIPs have the

characteristic absorption peaks of Fe3O4, which conrms they contain the magnetic nanoparticles. Adsorption Characteristics, Binding Study, and Scatchard Analysis The absorption of Melamine by MMIP increased as the shaking time increased, but most of the absorption occurred in the rst 30min (Fig. 3). The absorption of melamine by MMIPs and MNIPs increased as the concentration of melamine increased. The amount of melamine adsorbed by the MIPs was higher than that for the NIPs because of the specic binding ability of the MIPs for melamine (Fig. 4). Scatchard analysis is a method to study characters of binding sites of molecular imprinted polymers. In this equation, Q means absorbance capacity; C refers to concentration of the substrate melamine (mg=L); Qmax means maximum apparent binding capacity;, while Kd is the disassociation constant at binding site. By plotted Q=C vs. Q and nding numbers of the regression curves, a number of types of binding sites could be assured. Scatchard analysis (Fig. 5) indicated that there were two types of binding sites in the MMIPs. Binding site 1 worked in a appropriated range of substrate concentrations, with Qmax1 1.3857 and Kd1 6.8611 according to Scatchard equation Q=CMelamine Qmax QKd: The other binding site, with Qmax2 61.7047 and Kd2 0.0149, mainly worked at very low or high substrate concentrations. This could be explained by the relatively low number of binding site 1 and its relatively high affinity compared to binding site 2. Binding site 2 would be functional when there were very low concentrations of melamine or in solutions with very high melamine concentrations, which would lead to saturation of binding site 1. Selectivity of the MMIPs Even in the presence of atrazine and chloramphenicol, melamine was selectively adsorbed by the MMIPs (Fig. 6). Analysis of Authentic Bovine Milk Samples The method was validated by analyzing authentic bovine milk samples for melamine. The extraction and clean-up procedures were simplied into one step. Matrix Effect The complex ingredients in sample matrices can greatly increase background noise and affect the analytical sensitivity. Some studies have reported that selective extraction techniques can be used to reduce or even eliminate the matrix effects (M. Ding et al. 2011). Chromatograms (Fig. 7) were obtained of melamine in spiked milk samples that were extracted with the MMIPs. A slight ion

enhancement was observed for melamine using theMMIPs. These results show the MMIPs eliminate the matrix effect. Analytical Performance The chromatograms of melamine extracted from spiked bovine milk samples are shown in Fig. 7. The Polar-100 HILIC Column gave good peak patterns and high sensitivity for melamine. For the spiked samples (0.1256mg=L), the HPLC analysis of melamine in spiked bovine milk showed good linearity with correlation coefficients (r) between 0.995 and 0.999. The limit of detection, determined as the minimum quantity of each analyte in the sample matrix providing a signal-to-noise ratio of three, was 29.2 ng=mL. The recoveries of melamine varied using the three different extraction reagents. For pure acetonitrile and acetonitrile with the drying agents the melamine recoveries were 99.2% and 105.2%, respectively. With TFA acetonitrile no melamine was recovered, even though this solvent mixture is widely used in other melamine extraction methods. The reason for this may be that the MMIPs could not effectively capture melamine in the strong acid (1% TFA) as it may damage the binding sites of the MIP. The recoveries in acetonitrile were >90%, which is satisfactory for the trace analysis. Results from the proposed extraction method were compared to those from other analytical methods, including MIP-solid-phase microextraction (Hu et al. 2008) and MIP-solid-phase extraction (Caro et al. 2005). The proposed method is simpler than these other methods because it did not required additional centrifugation or ltration. Instead, the analytes were easily extracted, cleaned-up, and separated from the sample matrix with an external magnet. This could reduce the analysis time. To avoid the problem of template molecule leaking, the use of an articial template molecule with a similar chemical structure to melamine could be investigated in the future. An articial template molecule would ensure the template and substrate peaks were well-separated in the chromatograph, and this would eliminate interference from leaked template molecules. Analysis of Authentic Samples Fresh milk samples were purchased from a local supermarket, and analyzed using the method described above (Selectivity of the MMIPs section). Melamine was not detected in these samples. CONCLUSIONS In this study, the MMIPs beads with magnetic nanoparticle core and melamine specic MIP shell were synthesized. The MMIPs were successfully used to separate melamine from milk samples. Rather than using centrifugation and ltration as in conventional solid-phase extraction, the melamine was selectively adsorbed and rapidly collected by the MMIPs with the help of an external magnet. Compared with conventional sample preparation procedures, such as solvent extraction, centrifugation, clean-up, and concentration by solid-phase extraction, this technique is efficient, simple, and rapid. The magnetic polymers can be recycled and reused

many times. This method is promising for the determination of pesticide residues, veterinary drug contaminants, and prohibited additives in food samples. Compared to conventional methods, this method has lower solvent requirements and is less expensive. Las tcnicas de preconcentracin DETERMINACIN DE LA MELAMINA USO MAGNTICA polmeros de impresin molecular y cromatografa lquida de alta Miao Wang , Yong - xin Ella , Xin Wei Du, Yu- Ting Huang Xiao -Mei Shi , Mao -jun Jin, Jin Fen , Shao Hua y Wang Jing Clave Laboratorio de Seguridad y Calidad Agroalimentaria del Ministerio de Agricultura , PR China, Instituto de Estndares de Calidad y Testing Technology for Agriproducts del CAAS , Beijing , China Un nuevo mtodo utilizando polmeros de impronta molecular magnticos ( MMIP ) especficos para el reconocimiento, separacin , y extraccin de la melamina en la leche bovina se desarroll con un aditivo estante magntico externo en el presente documento . El MMIP se sintetiz con Fe3O4 nanopartculas y la tecnologa de sntesis de polmeros de impresin molecular . Con la ayuda de una etapa de elucin con metanol / cido actico mezcla de elucin , la melamina se puede recogi y se concentr . Mediante el uso de cromatografa lquida de alto rendimiento combinado con esta tcnica de tratamiento previo , los analitos se eluyeron a partir de los polmeros magnticos pueden ser determinados . Este mtodo de extraccin fue validado por el anlisis de la matriz de la leche de vaca que se incurren. El mtodo propuesto simplifica los procedimientos del mtodo de extraccin en fase slida clsica y mejora la fiabilidad del mtodo . Las recuperaciones obtenidas de este mtodo estaban en el rango de 85,04 a 105,2 % en muestras de leche con pas . El lmite de deteccin (LOD ) fue inferior a 29,2 ng g - 1 . Palabras clave: cromatografa lquida de alta eficacia , polmero impreso molecular magntica; melamina ; Pretratamiento INTRODUCCIN La melamina es una triazina heterocclico que contiene nitrgeno con un contenido de nitrgeno de 66,7 % . Se ha aadido ilegalmente a los productos lcteos y leche cruda para hacer que los productos parecen tener un alto contenido de protena ( Li et al . 2010 ) . Hay muchos mtodos de deteccin de melamina , incluyendo la cromatografa lquida de alto rendimiento ( HPLC ) , HPLC - espectrometra de masas ( Ding et al 2008 . ; Recibido el 24 de mayo de 2012; aceptado el 23 de junio de 2012. Este trabajo fue apoyado por la Fundacin Nacional de Ciencias Naturales de China ( N 31171890 , 30771425 ) . Correspondencia: Jing Wang , de la Academia de Ciencias Agrcolas , Instituto de Estndares de Calidad y Tecnologa de Ensayos para la agro -productos, Zhongguancun South Street No.12 , Haidian District, Beijing 100081 , China chino.

NUEVO MTODO PARA PROBAR MELAMINA EN LA LECHE Filigenzi et al . 2008 ) , cromatografa de gases- espectrometra de masas ( Miao et . Al 2009) , la superficie mejorada espectroscopia Raman (Lin et al. 2008 ) , y la electroforesis capilar ( Yan et . Al 2009) . La impresin molecular es un mtodo popular desarrollado en los ltimos aos que se basa en la hiptesis de cerradura y llave ( Pauling 1940 ) . En un disolvente adecuado , con la ayuda de las fuerzas intermoleculares , la molcula plantilla y el monmero funcional puede formar un complejo hospedador-husped . La adicin de un agente de reticulacin y el iniciador puede iniciar la formacin de polmeros estables . Despus de la elucin de la molcula molde , las cavidades que actan como sitios de unin especficos para los analitos se forman en el polmero . Estos polmeros de impresin molecular ( MIP ) tienen selectividad estable y especfica para las molculas diana . ( Wulff , Sarhan , y Zabrocki 1973 ) En comparacin con anticuerpos biolgicos , MIP tener mejor estabilidad fsica y qumica , son menos costosos , ms fciles de preparar , y podran utilizarse en una amplia variedad de separaciones cromatogrficas , sensores biomimticos , extracciones en fase slida , y muchas otras reas ( Koohpaei et al. 2008 ) . Los Fe3O4 nanopartculas son nanomateriales funcionales que se utilizan en el anlisis , el diagnstico clnico de cido nucleico , la focalizacin de medicamentos , enzima y la inmovilizacin de clulas , y muchos otros campos debido a sus caractersticas magnticas , superpara - magnetismo, y la capacidad de ser funcionalizado para obtener actividad bioqumica ( Gubin 2009 ) . Sntesis de MIP en la superficie de las nanopartculas de Fe3O4 sera combinar su adsorcin selectiva y propiedades magnticas . Las perlas magnticas con AMIP cscara se podran utilizar en muchas aplicaciones para la deteccin de residuos ( Ansell y Mosbach 1998 ) . En el presente estudio , las partculas magnticas se recubrieron con MIP capaces de reconocer especficamente la melamina . Estos MIP magntica ( MMIPs ) se utilizaron para detectar la melamina en la leche bovina . EXPERIMENTAL Productos Qumicos El FeC13 - 6H2O , FeC12 - 4H2O , azobisisobutironitrilo y NaOH fueron adquiridos de Beijing Chemical Co. ( Beijing , China). El PEG6000 , PVA , y el cido oleico se obtuvieron de Sinopharm Reactivo Co. melamina fue adquirido de cido Alfa Aesar Co. Meth acrlico ( MAA) y dimetacrilato de etilenglicol ( EGDMA ) se obtuvieron en Acros Organics , y acetonitrilo y metanol fueron de Thermo Fisher Scientific . Sntesis de nanopartculas magnticas Una solucin de FeCl3 - 6H2O ( 5,4 g) y FeCl2 - 4H2O ( 1,99 g ) ( relacin molar 2:1) se prepar en 80 ml de H2O destilada dos veces , y luego se transfiri a un matraz de tres bocas y se agit a 600 rpm . La mezcla se calent a 700 C , y se burbuje N2 a travs de la solucin durante 30 minutos para eliminar O2 . Una cantidad de 20 ml de una solucin acuosa de NaOH ( 16 g = ml

) solucin que se haba burbujeado con N2 y luego se aadi rpidamente a la mezcla . Despus, la mezcla se agit bajo atmsfera de N2 durante 2 h para asegurar la reaccin lleg a la finalizacin . Cuando la reaccin lleg a la finalizacin , se observaron negro Fe3O4 nanopartculas en el matraz de tres bocas . Luego 1 g ofPEG6000 y 2 ml de cido oleico se aadieron al matraz para modificar la superficie de las nanopartculas . Las nanopartculas se lavaron despus con cada uno de los siguientes disolventes en secuencia : doble - H2O destilada , metanol , y acetonitrilo . Las partculas magnticas se recogieron con una rejilla de separacin magntica , y se secaron en un horno de vaco a 600 C durante 30 minutos ( Harris et al . 2003 ) . Sntesis de MMIPs de melamina Melamina ( 0,25 mmol , 31.5mg ) , MAA ( 1 mmol , 0.085mL ) , DMSO ( 2 ml ) , y el glicol ( 5 ml ) se aadieron a un matraz de fondo redondo de 100 ml . La mezcla fue vrtice se mezcla y se calent a 600 C hasta que la melamina completamente disuelto . Se aadi acetonitrilo ( 40 ml ) , y la mezcla se agit a temperatura ambiente , y despus se almacen en el refrigerador ( 40 C ) durante la noche . Se aadieron las partculas de Fe3O4 magnticos ( 100 mg ) , EGDMA ( 5 mmol , 0.95mL ) , y azobisisobutironitrilo ( 10 mg ) , y la solucin se burbuje con N2 durante 10 min para eliminar O2 . El matraz se cerr hermticamente y se calent a 600 C durante 12 h , y despus se enfri en hielo a temperatura ambiente . Polmeros eran visibles en el matraz despus de la refrigeracin , y estos se aislaron despus de tratamiento con ultrasonidos durante 10 min y centrifugacin a 5000 r = min durante 5 min . ThemagneticMIPs se secaron en un horno de vaco a 600 C durante 30min ( M. Ding et al . 2011 ) . Despus de la polimerizacin , las molculas de plantilla necesarios para ser trasladados de las cavidades de los polmeros. En este caso , los polmeros magnticas se lavaron con metanol al 95% = 5 % de cido actico glacial en un extractor de Medias dej durante 12 h para eliminar la plantilla de melamina a partir de la MIP . Los MMIPs se lavaron hasta que la melamina ya no se detect en el sobrenadante . Despus de la separacin de los MMIPs con la rejilla magntica , que se secaron en un horno de vaco a 600 C durante 2 h . ( Li et al . 2010 ) Microesferas de polmero Caracterizacin Las estructuras de la superficie y tamaos de partcula de las microesferas de polmero se analizaron por microscopa electrnica . El MIP tambin se analizaron por rayos infrarrojos de Fourier ( FT-IR ) espectrometra como pastillas de KBr . Los experimentos de adsorcin con el microesferas de polmero Para investigar el efecto del tiempo de reaccin sobre la absorcin de melamina , MMIPs (2 mg ) se colocaron en un tubo de centrfuga de 1,5 ml, y se aadi una solucin en acetonitrilo de melamina ( 60 mmol = L ) . La mezcla se coloc en un agitador oscilante a 280 C , y se agit durante diversos perodos de tiempo . El MIP se aislaron a continuacin, utilizando la separacin magntica y el sobrenadante se analiz por HPLC . Para cada tiempo de agitacin , se calcul la capacidad de unin por unidad de masa de polmero adsorbido . La MIP (2 mg ) se colocaron en tubos de centrfuga de 1,5 ml, y se aadi una solucin en acetonitrilo de la melamina (1 ml , 0,1 - 64mg = L ) . La mezcla se coloc en un agitador oscilante , y se agita

durante 12 horas a 280 C. Se calcul la capacidad de unin por unidad de masa de polmero , y las isotermas de adsorcin de la melamina polmero impreso microesferas se obtuvieron . La selectividad de los MMIPs Atrazina , una estructura analgica de melamina , y el cloranfenicol , que es otro producto qumico prohibido en la leche , se utilizaron para investigar la selectividad de los MMIPs . Las estructuras de estos productos qumicos se muestran en la figura . 1 . Soluciones estndar ( 1 mmol = L ) de cada compuesto se prepararon en etanol : agua ( 9:1, v = v ) . Una alcuota (1 ml ) de cada solucin estndar se aadi a MMIPs ( 2,0 mg ) en un tubo Eppendorf . Los tubos se mezclaron vigorosamente durante 15 min a temperatura ambiente , y luego se eliminaron los MMIPs a partir del sobrenadante con un imn externo . La cantidad residual de cada compuesto en el sobrenadante se determin por HPLC . Anlisis HPLC Una solucin madre de patrn de melamina ( 1,000 g = L ) se prepar disolviendo una cantidad exactamente pesada de estndar de melamina en un disolvente de metanol y agua ( 04:01 ) . La solucin madre de patrn se diluy para preparar una serie de soluciones patrn de trabajo de melamina ( 0,1 - L = 256 mg ) , que se utilizaron para construir una curva de calibracin . La HPLC se realiz en una columna Waters 2475 = 2998 ( Waters Corporation , Milford , MA ) con una columna polar HILIC - 100 SEPAX ( SEPAX , Newark, DE ) . La fase mvil fue acetonitrilo y agua ultra - pura con 3 mmol = L de acetato de amonio ( 09:01 ) , y el caudal de la fase mvil fue de 1,0 ml = min . La melamina se detect a 240 nm usando un detector de matriz de diodos . Deteccin de melamina por HPLC en leche bovina Muestras de leche de vaca ( 2 ml ) se enriquecieron con melamina ( 2,5 mg = ml ) , y despus se transfirieron en tubos de centrfuga de 50 ml . Un reactivo de extraccin ( 18 ml ) se aadi a cada tubo . Se evaluaron los siguientes regentes de extraccin para la extraccin de melamina a partir de la leche : ( a) 18 ml de acetonitrilo puro ; ( b ) 18 ml de acetonitrilo con 0,8 gMgSO4 y 0,2 g de Na2SO4 como agentes de secado , y (c ) 13,5 ml de cido trifluoroactico al 1 % ( TFA ) y 4,5 ml de acetonitrilo . Cada tubo fue mezclado por ultrasonidos durante 10 min y se dej reposar durante 1 minuto , y despus 30 mg de MMIPs se aadi . Los tubos fueron mezclados vrtice durante 5 min , se centrifugaron durante 10 min a 8000 r = min , y se dejaron reposar durante 1 min , que se separ la mezcla en un lquido claro sobrenadante y sedimento blanco . TheMMIPs se transfirieron entonces a un tubo de 10 ml limpio , y prelavados y acondicionados con metanol . El sobrenadante de la ltima etapa fue entonces pipeta en el tubo , y el tubo se agit por lo melamina entr en contacto directo con los PIM y se transfiere a ellos desde la matriz de la muestra . Un imn externo se utiliza para retener los MMIPs en el tubo mientras que se lavaron dos veces para eliminar las impurezas . La melamina en los MMIPs se eluy despus con 1,5 ml de metanol : cido actico ( 95:5, v = v) tres veces . Los eluatos se combinaron y se evaporaron a sequedad bajo una corriente de N2 . El residuo se resuspendi en acetonitrilo puro de grado HPLC , se filtr a travs de un filtro de membrana de 0,22 mm y se inyect en la HPLC ( Chen 2009 ) .

RESULTADOS Y DISCUSIN Caracterizacin de las partculas magnticas y MMIPs Las partculas de Fe3O4 se sintetizaron y se revistieron con cido oleico y PEG 6000 para formar una cscara hidrfobo y aadir algunos grupos qumicos necesarios . El Fe3O4 recubierto entonces unido fcilmente a MAA y EGDMA , que se utiliza como un monmero funcional y cruzar enlazador para sintetizar los MMIPs . El dimetro medio de las nanopartculas fue de aproximadamente 10 nm . La Figura 1 muestra el espectro de FT - IR de las nanopartculas modificadas Fe3O4 . El pico a 560 cm - 1 es un pico caracterstico de Fe3O4 , y se puede atribuir a Fe -O estiramiento y flexin vibraciones . Tambin se observaron picos a 580 y 400 cm - 1 debido al desplazamiento causado por el efecto de tamao de las nanopartculas . La banda de absorcin ancha cerca de 3400 cm - 1 corresponde a enlaces de hidrgeno , y los picos a 2920 y 3024 cm - 1 se puede atribuir a las vibraciones de CH - 2 . Los picos a 1500 cm - 1 y 1150 cm - 1 son de OH - flexin y el estiramiento de la CO hidroxilo alcohlico , respectivamente , en PEG6000 . Los dos picos a 1700 cm - 1 ( tramo CO) y 3444 cm - 1 ( O- H estiramiento) indican grupos carboxlicos estn presentes en el polmero . En el espectro de FT - IR de la MMIPs (Fig. 2 ) , se observaron picos a 1700 cm - 1 ( tramo CO) y 3444 cm - 1 ( tramo OH ) de los grupos carboxlicos en la superficie del polmero . Los picos en 1601 , 1492 , y 1452 cm - 1 se pueden atribuir a benceno , y picos a 700 y 750 cm - 1 corresponden a los picos de mono - sustituidos de benceno . Los picos a 2923 y 3025 cm - 1 son de metileno y CH . El pico a 554 cm - 1 es de Fe -O . Estos resultados muestran los MMIPs tienen los picos de absorcin caractersticos de Fe3O4 , lo que confirma que contienen las nanopartculas magnticas . Caractersticas de adsorcin , estudios de fijacin y anlisis Scatchard La absorcin de melamina por MMIP aument a medida que aument el tiempo de agitacin , pero la mayor parte de la absorcin se produjo en la primera 30min ( fig. 3 ) . La absorcin de melamina por MMIPs y MNIPs aument a medida que la concentracin de melamina aument . La cantidad de melamina adsorbida por los PIM fue mayor que la de los PIN , debido a la capacidad de unin especfica de los PIM para la melamina ( fig. 4 ) . El anlisis de Scatchard es un mtodo para estudiar caracteres de sitios de unin de polmeros de impresin molecular . En esta ecuacin , Q significa la capacidad de absorbancia ; C se refiere a la concentracin del sustrato de melamina ( mg = L ) ; Qmx significa la capacidad mxima de unin aparente ; , mientras Kd es la constante de disociacin en el sitio de unin . Por trazado Q = C vs Q y la bsqueda de los nmeros de las curvas de regresin , un nmero de tipos de sitios de unin podra ser asegurado . Anlisis Scatchard (Fig. 5 ) indic que haba dos tipos de sitios de unin en las MMIPs . Sitio de unin 1 trabaj en una gama apropiada de concentraciones de sustrato , con Qmax1 1,3857 y Kd1 6,8611 segn Scatchard ecuacin q = C melamina Qmax QKd :

El otro sitio de unin , con Qmax2 61.7047 y Kd2 0,0149 , trabaj principalmente en concentraciones muy bajas o altas de sustrato . Esto podra explicarse por el nmero relativamente bajo de sitio de unin 1 y su afinidad relativamente alta en comparacin con el sitio de unin 2 . Sitio de unin 2 sera funcional cuando haba muy bajas concentraciones de melamina o en soluciones con concentraciones muy altas de melamina , lo que conducira a la saturacin del sitio de unin 1 . La selectividad de los MMIPs Incluso en la presencia de la atrazina y el cloranfenicol , la melamina se adsorbi selectivamente por el MMIPs ( fig. 6 ) . El anlisis de muestras autnticas leche bovina El mtodo fue validado mediante el anlisis de muestras de leche bovina autnticos para la melamina . Los procedimientos de extraccin y limpieza se han simplificado en un solo paso. Efecto Matrix Los ingredientes complejos en matrices de muestras pueden aumentar en gran medida el ruido de fondo y afectar a la sensibilidad analtica . Algunos estudios han informado de que las tcnicas de extraccin selectiva se pueden utilizar para reducir o incluso eliminar los efectos de la matriz ( M. Ding et al . 2011 ) . Los cromatogramas (Fig. 7 ) se obtuvieron de la melamina en muestras de leche con pas que se extrajeron con los MMIPs . Se observ una ligera mejora de iones para la melamina usando theMMIPs . Estos resultados muestran los MMIPs eliminan el efecto de la matriz . Rendimiento analtico Los cromatogramas de melamina extrados de muestras de leche bovina con pas se muestran en la figura . 7 . La Columna HILIC Polar- 100 dio buenos modelos de picos y alta sensibilidad para la melamina . Para las muestras adicionadas ( 256 mg = 0,1 - L ) , el anlisis por HPLC de la melamina en la leche enriquecida bovina mostr una buena linealidad con coeficientes de correlacin (r ) entre 0.995 y 0.999 . El lmite de deteccin , determinado como la cantidad mnima de cada analito en la matriz de la muestra que proporciona una relacin seal - a - ruido de tres, fue 29,2 ng = ml . Las recuperaciones de melamina variados con los tres reactivos de extraccin diferentes . Para acetonitrilo puro y acetonitrilo con los agentes de secado las recuperaciones de melamina fueron 99,2 % y 105,2 % , respectivamente . Con TFA acetonitrilo se recuper ninguna melamina , a pesar de que esta mezcla de disolventes es ampliamente utilizado en otros mtodos de extraccin de melamina . La razn de esto puede ser que los MMIPs no pudieron capturar eficazmente melamina en el cido fuerte ( 1 % de TFA ) , ya que puede daar los sitios de unin de la MIP . Las recuperaciones en acetonitrilo fueron> 90 %, lo que es satisfactorio para el anlisis de trazas . Los resultados del mtodo de extraccin propuesto se compararon con los de otros mtodos de anlisis , incluyendo MIP - microextraccin en fase slida ( Hu et al . 2008 ) y la extraccin

en fase slida - MIP ( Caro et al . 2005 ) . El mtodo propuesto es ms sencillo que estos otros mtodos , ya que no requiere centrifugacin o filtracin adicional . En su lugar , los analitos se extraen fcilmente , limpiada , y se separan de la matriz de la muestra con un imn externo . Esto podra reducir el tiempo de anlisis . Para evitar el problema de la molcula plantilla de fugas , el uso de una molcula de plantilla artificial con una estructura qumica similar a la melamina podra ser investigada en el futuro . Una molcula de plantilla artificial sera asegurar la plantilla y de los picos de sustrato fueron bien separados en el cromatgrafo , y esto sera eliminar la interferencia de las molculas de plantilla filtrados . El anlisis de muestras autnticas Muestras de leche fresca se compraron de un supermercado local , y se analizaron usando el mtodo descrito anteriormente ( Selectividad de la seccin MMIPs ) . La melamina no se detect en estas muestras . CONCLUSIONES En este estudio , se sintetizaron los granos MMIPs con ncleo de nanopartcula magntica y melamina especfica MIP cscara . Los MMIPs se utilizaron con xito para separar melamina a partir de muestras de leche . En lugar de utilizar centrifugacin y filtracin como en la extraccin en fase slida convencional , la melamina se adsorbi selectivamente y se recogi rpidamente por los MMIPs con la ayuda de un imn externo . En comparacin con los procedimientos de preparacin de muestras convencionales , tales como extraccin con disolventes , centrifugacin , la limpieza , y la concentracin por extraccin en fase slida , esta tcnica es eficiente , simple y rpida . Los polmeros magnticos pueden ser reciclados y reutilizados muchas veces. Este mtodo es prometedor para la determinacin de residuos de plaguicidas , contaminantes , medicamentos veterinarios y aditivos prohibidos en muestras de alimentos . En comparacin con los mtodos convencionales , este mtodo tiene requisitos ms bajos de disolvente y es menos costoso .