RESUMEN

Cuando una especie qumica absorbe radiacin electromagntica ultravioleta o visible pasa a un estado electrnico excitado. Muchas sustancias en dicho estado disipan el exceso de energa en forma de calor, mediante colisiones con tomos o molculas vecinas, como ocurre en la espectrofotometra de absorcin. Sin embargo, un cierto nmero de especies pierde solo una parte de este exceso de energa en forma de calor, y emite la energa remanente en forma de radiacin electromagntica, de distinta frecuencia que la absorbida, y que puede utilizarse con fines analticos.

El proceso de emisin de radiacin como consecuencia de la desactivacin de una molcula se denomina genricamente luminiscencia, mientras que el trmino fotoluminiscencia se refiere al caso particular en el que la excitacin tenga lugar por absorcin de fotones. Cuando la energa de excitacin es de otro tipo, se originan otras modalidades de luminiscencia: as, la quimioluminiscencia es un fenmeno anlogo a la fluorescencia, excepto en el hecho de que la energa de excitacin proviene de una reaccin qumica. Cuando la quimio-luminiscencia tiene lugar en un ser vivo, como por ejemplo, en la lucirnaga, recibe el nombre de bioluminiscencia. Por otra parte, la tribo-luminiscencia (del Griegro, tribo = frotar) se produce al liberarse la energa almacenada en ciertas sustancias cristalinas, como azcar, y como consecuencia de su rotura.

La fotoluminiscencia puede clasificarse, en principio, en fluorescencia y fosforescencia, segn el mecanismo mediante el cual la sustancia vuelve al estado fundamental, si bien, una distincin desde el punto de vista prctico se basa en el tiempo transcurrido entre la absorcin y la emisin.

La luminiscencia puede considerarse como una de las tcnicas analticas ms antiguas, pues su descubrimiento data del siglo XVI, cuando el fsico y botnico espaol Nicolas Monardes observ, en 1565, un misterioso matiz azulado en el agua almacenada en un recipiente construido con madera de la especie

"Lignum nifriticum". Sin embargo, no fue hasta el siglo XIX en que el fsico ingls George Stokes estableci las bases de su utilidad analtica al describir los primitivos mecanismos de absorcin y emisin.

FUNDAMENTO TEORICO
Para que una sustancia origine emisin foto-luminiscente es necesario que previamente tenga lugar la absorcin de radiacin electromagntica. A continuacin se ampliarn algunos conceptos relacionados con los procesos de absorcin y emisin de forma general, pero que son aplicables a las mencionadas transiciones >*.

La multiplicidad molecular, M, se define como:

M = 2S + 1

donde S es el nmero cuntico de espn de la molcula, y es la suma de los espines de cada uno de sus electrones.

Muchas molculas orgnicas tienen un nmero par de electrones, por lo que S=0 y M=1. A dicho estado se le denomina singulete. El estado energtico ms bajo (estado fundamental) deber ser uno en el cual todos los electrones estn apareados, y a dicho estado se le denomina estado singulete fundamental (figura 4.1.a.)

Cuando un electrn pasa a un nivel energtico superior puede ocurrir que conserve su espn, o que se produzca cambio de ste. En el primer caso se tiene un estado singulete excitado (figura 4.1.b.) y en el segundo, un estado triplete, ya que, en estas condiciones, M=3, debido a que S=+1/2 +1/2 = 1 Las transiciones desde el estado singulete fundamental hasta el estado triplete son muy poco probables; normalmente es necesario pasar a travs del estado singulete excitado*.

* Las molculas con electrones desapareados (nmero impar de electrones) constituyen un

estado doblete y es el caso, por ejemplo, de radicales libres orgnicos.

Figura 4.1. Estados singulete y triplete.

En la figura 4.2. Se han representado parcialmente diferentes niveles de energa para una molcula fotoluminiscente.

El nivel S0 representa el estado singulete fundamental, mientras que S1 y S2 estados singulete excitados, y T1 el estado triplete. Por otra parte, superpuestos a cada nivel de energa electrnico hay una serie de niveles de energa vibracionales estrechamente espaciados, representados en la figura por v0, v1, v2, etc. Los niveles rotacionales no se han incluido porque no pueden resolverse con los espectrmetros convencionales.

Cuando una molcula absorbe radiacin se produce el paso desde el estado electrnico y vibracional fundamental a un estado electrnico excitado y cualquiera de los posibles estados vibracionales excitados. Este proceso de excitacin tiene lugar en un tiempo del orden de los 1015 segundos.

En sistemas condensados, como cuando se opera en disolucin, el exceso de energa vibracional se pierde inmediatamente, como consecuencia de los choques entre las molculas excitadas y el disolvente. Este proceso recibe el nombre de relajacin vibracional. Adems, puede ocurrir que se pase a un estado electrnico de ms baja energa sin emisin de radiacin (S2 a S1). Este proceso, denominado conversin interna, se produce cuando dos niveles de energa electrnicos estn suficientemente prximos para que haya un solpamiento de los niveles de energa vibracionales.

Los procesos de conversin interna y de relajacin vibracional transcurren en un tiempo muy pequeo (del orden de los 10 12 seg.)

El proceso de emisin de un fotn desde S1 a So recibe el nombre de fluorescencia, y ocurre inmediatamente despus de la excitacin (en aproximadamente 109 a 107 segundos), por lo cual, no es posible percibir visualmente la emisin de fluorescencia una vez eliminada la fuente de excitacin. Por otra parte, debido a la conversin interna y a los procesos de relajacin vibracional, la emisin de fotones fluorescentes desde estados electrnicos excitados superiores al primero son procesos muy poco probables. As, en relacin con la figura 4.2., la excitacin por radiacin a la longitud de onda 2 normalmente provoca fluorescencia de una longitud de onda 3, con exclusin de la transicin que resultara entre S2 y S0. La desactivacin de un estado electrnico excitado por prdida de energa no radiante puede tener lugar mediante unos procesos de conversin interna, si los niveles vibracionales del estado fundamental se solapan con los del primer estado excitado, o por conversin externa, lo cual implica interaccin y transferencia de energa entre la molcula excitada y el disolvente u otros solutos.

Como se coment anteriormente, mientras una molcula est en un estado excitado, puede tener lugar un cambio de espn en un electrn, con lo que se adquiere el estado triplete. Este proceso de transformacin de un estado singulete a un estado triplete se denomina cruzamiento entre

sistemas, y la probabilidad de que esto suceda aumenta si los niveles vibracionales se solapan.

Una vez adquirido el estado triplete, la molcula puede llegar al nivel vibracional inferior mediante procesos de relajacin vibracional, y

posteriormente emitir un fotn para retornar finalmente al estado fundamental. Esta emisin se denomina fosforescencia.

Debido a que las transiciones entre estados de diferentes multiplicidades estn "prohibidas", la emisin fosforescente se produce con un cierto retraso respecto a la absorcin (entre 103 y 10 segundos). Por ello, con frecuencia, puede ser observada a simple vista despus de cesar la radiacin de excitacin. Sin embargo, como consecuencia del mayor tiempo de vida del estado triplete, los procesos de desactivacin en forma de energa no radiante pueden competir ms eficazmente con la fosforescencia que con la fluorescencia. Por esta razn, la fosforescencia casi nunca se observa a temperatura ambiente, siendo necesario operar en condiciones criognicas para que se reduzca la probabilidad de desactivacin por choques*.

A modo de resumen, puede decirse que los procesos de desactivacin de una especie en forma de energa no radiante son los ms probables, seguidos de la emisin fluorescente, y los menos probables son los correspondientes a la fosforescencia. Esto hace que los mtodos

absorciomtricos sean ms numerosos que los fluorimtricos, y stos, a su vez, ms que los basados en el empleo de la fosforescencia.

* En poca relativamente reciente, ha sido posible observar fosforescencia a temperatura ambiente cuando la muestra se incorpora a una matriz slida.

FACTORES QUE AFECTAN A LA FLUORESCENCIA

La emisin fluorescente observada en una determinada especie est condicionada por la propia estructura molecular de la sustancia y por otros factores dependientes del medio en que se trabaje.

Influencia de la estructura molecular sobre la fluorescencia

El primer requisito para que exista florescencia (o fosforescencia) es que la molcula posea una estructura capaz de absorber radiacin ultravioleta o visible, esto es, puedan tener lugar transiciones >* y n>*. Sin embargo, experimentalmente se ha observado que el comportamiento

fluorescente se presenta con ms frecuencia en compuestos en los que la transicin es >* y no en aquellos en los que es n>*. Esta condicin elimina virtualmente los compuestos orgnicos saturados, mientras que los compuestos conteniendo dobles enlaces conjugados, especialmente aquellos con un alto grado de estabilizacin por resonancia sern muy prometedores. As, suelen presentar fluorescencia muchos hidrocarburos aromticos, particularmente si tienen gran rigidez y estructuras multi-cclicas.

Las caractersticas de la emisin fluorescente (longitud de onda de mxima emisin y su intensidad) de una molcula orgnica aromtica suele estar muy influida por los sustituyentes en el anillo bencnico. As, por ejemplo, cuando los sustituyentes son halgenos, se observa una disminucin de la fluorescencia al aumentar el peso atmico del halgeno, lo cual parece debido al llamado efecto del tomo pesado. Este efecto aumenta la probabilidad de que se produzca el cruzamiento entre sistemas, con el consiguiente aumento de la fosforescencia. Por otra parte, la presencia de un cido carboxlico en un anillo aromtico hace que tengan lugar transiciones n >* con menos energa que >*, lo cual generalmente inhibe la fluorescencia.

Un factor estructural importante es la rigidez. Experimentalmente se observa que la fluorescencia est particularmente favorecida en molculas que poseen estructuras rgidas. As, la intensidad de la fluorescencia del fluoreno es unas cinco veces mayor que la del bifenilo.

La diferencia parece ser debida a la rigidez que proporciona el grupo metileno del fluoreno. Asimismo, la fluorescena presenta una intensa fluorescencia en disolucin lquida y, sin embargo, la fenolftalena no, a pesar de su similitud estructural.

En ambos ejemplos, la forma rgida (fluoreno y fluorescena) presenta mayor fluorescencia. Este efecto se debe a que las estructuras ms rgidas limitan las vibraciones, lo cual minimiza la degradacin por colisiones y el cruzamiento de sistemas.

El aumento de fluorescencia de ciertos agentes orgnicos cuando forman quelatos con iones metlicos parece debido tambin a producirse un incremento en la rigidez del sistema. As, por ejemplo, el colorante pontacromo BBR no es fluorescente, pero s lo es su quelato con Al3+.

La formacin del quelato aumenta considerablemente la rigidez molecular, al impedir que la molcula gire alrededor del grupo azo.

Otros factores de tipo estructural que influyen sobre el comportamiento luminiscente son: La presencia de grupos donadores de electrones, como NH2 y OH favorecen la fluorescencia, puesto que aumentan la probabilidad de transicin entre el estado singulete de menor energa vibracional y el estado fundamental. La introduccin de un tomo de nmero atmico elevado en un sistema de electrones suele aumentar la fosforescencia, en detrimento de la fluorescencia. Los grupos aceptores de electrones, como COOH, NO2, N=N y X disminuyen y, en ocasiones inhiben la fluorescencia.

Influencia de otros factores medioambientales sobre la fluorescencia

El "ambiente" en el que se encuentre la especie fluorescente constituye un parmetro importante que puede usarse en anlisis para incrementar la sensibilidad y la selectividad de la fluorescencia, ya que existen varios factores medioambientales que pueden influir fuertemente sobre el comportamiento

fluorescente de molculas poliatmicas.

Influencia del disolvente. En muchas ocasiones se observa que al aumentar la polaridad del disolvente se produce un desplazamiento en el espectro de fluorescencia hacia mayores longitudes de onda. Este hecho puede explicarse de la forma siguiente:

Las transiciones electrnicas entre diferentes niveles energticos ocurren muy rpidamente, de forma que cuando una molcula en estado fundamental absorbe un fotn, pasa a un estado excitado meta-estable (estado excitado Franck-Condon), en el cual la geometra molecular y la configuracin del disolvente son todava las caractersticas del estado fundamental (figura 4.3.). La reorientacin del disolvente tiene lugar aproximadamente 10
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1012 segundos despus de la excitacin, originando un

estado excitado de "equilibrio", en el cual la configuracin del disolvente es ptima para la geometra y configuracin electrnica de la molcula. La emisin ocurre desde ese estado excitado de "equilibrio", hasta un estado fundamental meta-estable, teniendo lugar posteriormente la relajacin del disolvente, para conducir hasta el verdadero estado fundamental.

En la mayora de las molculas polares el estado excitado es ms polar que el estado fundamental; por ello, al aumentar la polaridad del disolvente se tiende hacia una estabilizacin del estado

excitado, en mayor grado que lo hace el estado fundamental (figura 4.3.A, B y C). En consecuencia, al aumentar la polaridad del disolvente tiene lugar un desplazamiento hacia mayores longitudes de onda (menor energa).

Figura 4.3. Influencia de la polaridad del disolvente sobre la emisin de fluorescencia.

Respecto a la constitucin del disolvente hay que hacer notar lo siguiente: anteriormente se ha mencionado que la introduccin de tomos pesados como sustituyentes en molculas aromticas produce un incremento en la fosforescencia a expensas de la fluorescencia. Este efecto se observa frecuentemente incluso cuando el elemento en cuestin no forma parte de la molcula luminiscente. As, disolventes conteniendo tomos pesados,

normalmente dan lugar a una disminucin de la fluorescencia. Este comportamiento puede justificarse en algunos casos: concretamente cuando se trata de disolventes halogenados, por formacin de complejos 1:1 en los que interviene el estado excitado del soluto fluorescente, pues la reactividad de los estados excitados es normalmente diferente a la que presenta la molcula en estado fundamental.

Influencia del pH. El espectro de fluorescencia de muchos compuestos aromticos conteniendo grupos funcionales cidos o bsicos es sensible al pH. Los cambios en la emisin de los compuestos de este tipo proviene del nmero de especies resonantes diferentes que estn asociadas con las formas cidas o bsicas de las molculas. As, por ejemplo, la anilina, en medio neutro y alcalino presenta fluorescencia en la regin visible, pero dicha fluorescencia

desaparece en medio cido. La razn est en que el ion anilinio (forma cida) tiene las mismas formas resonantes que el benceno y solo presenta fluorescencia, como l, en la regin ultravioleta, mientras que la anilina tiene tres estructuras resonantes adicionales.

Estas

formas

resonantes

adicionales

proporcionan

una

mayor

estabilidad al primer estado excitado, y la consecuencia es una emisin fluorescente a mayor longitud de onda.

La fluorescencia de ciertos compuestos en funcin del pH ha sido utilizada para la deteccin de puntos finales en volumetras cidobase. Sin embargo, es realmente curioso el hecho de que el cambio de comportamiento espectral se produzca a un pH diferente del que puede predecirse de su constante de disociacin. As, el pKa del 2-naftol es 9.5, por lo que la fluorescencia de la forma aninica solo debera observarse a valores de pH superiores a 9.5, mientras que en la prctica, se percibe a pH muy inferiores a ese valor. La explicacin de este hecho reside en que la molcula excitada (el primer estado singulete excitado) posee un carcter cido diferente del estado fundamental. Algo parecido sucede con los estados triplete, si bien, en menor medida.

Influencia del oxgeno disuelto. El efecto del oxgeno disuelto es uno de los problemas ms molestos de la fluorimetra, ya que a menudo reduce la intensidad de emisin de una disolucin fluorescente. Normalmente, el oxgeno presente en concentracin 103 M reduce la emisin fluorescente del orden del

20%. Por ello, es necesario desairear las disoluciones antes de llevar a cabo la medida. El papel que juega el oxgeno en la atenuacin de la fluorescencia se debe fundamentalmente a sus propiedades oxidantes y a sus caractersticas paramagnticas. As, frente a especies reductoras, el oxgeno puede llevar a cabo la oxidacin inducida foto-qumicamente de las especies fluorescentes, si bien, con mayor frecuencia, la atenuacin de la fluorescencia se produce debido a que el paramagnetismo del oxgeno molecular favorece el cruzamiento entre sistemas, lo cual conduce hasta el estado triplete. Al parecer, el cruce entre sistemas se produce mediante colisiones con especies excitadas y por formacin transitoria de complejos de transferencia de carga.

Por otra parte, el que la presencia de oxgeno favorezca el cruzamiento entre sistemas en muchas molculas fluorescentes no significa que aumente la fosforescencia, pues el O2 es tambin un efectivo atenuador de estados tripletes. Debido a que el estado triplete tiene una vida ms larga que el singulete, le hace mucho ms susceptible para colisionar con impurezas, tales como el propio oxgeno, u otras producidas por foto-descomposicin del soluto.

En

cualquier

caso,

la

capacidad

del oxgeno

para

inhibir

la

fotoluminiscencia puede ser utilizada para su determinacin en disolucin.

Otros gases paramagnticos, como el xido ntrico, se comportan de forma similar, as como iones paramagnticos de los metales de transicin.

Influencia de la temperatura. La temperatura es una variable importante en fluorimetra analtica, observndose una disminucin de la fluorescencia al aumentar aquella. El cambio en la fluorescencia es normalmente del 1 % por C, si bien, en algunos compuestos, como el triptofano o la rodamina B puede ser hasta del 5 %. La disminucin de la emisin fluorescente con la temperatura se debe a que el aumento de la frecuencia de choques a temperatura elevada incrementa la probabilidad de desactivacin en forma de energa no radiante. Por otra parte, el aumento de

temperatura hace disminuir la viscosidad del disolvente, lo cual, tambin aumenta la probabilidad de desactivacin mediante colisiones.

ESPECTROS DE EXCITACION Y EMISION

Debido a la presencia de dos monocromadores, pueden registrarse dos tipos de espectros: el espectro de excitacin (intensidad de fluorescencia observada en funcin de la longitud de onda de excitacin a una determinada longitud de onda de emisin) y el espectro de emisin (intensidad de la emisin fluorescente en funcin de la longitud de onda de emisin, a longitud de onda de excitacin fija). Esto es, si se fija la ex y se mide la radiacin emitida a las diferentes em se obtiene el espectro de emisin. En cambio, si se mantiene constante la em y se van variando las ex , se obtiene el espectro de excitacin. Este es ligeramente diferente del espectro de absorcin, pero muy semejante a l.

Figura 4.5. Espectros de excitacin y de emisin

El espectro de emisin aparece, evidentemente, a longitudes de onda ms largas que el de excitacin (absorcin) (figura 4.5.). Solamente las bandas de mayor longitud de onda del espectro de absorcin suelen estar superpuestas con las bandas de menores longitudes de onda de la emisin*. Adems, debido a que los espaciados entre los niveles vibracionales son similares en el estado fundamental y en el primer estado singulete excitado, el espectro de fluorescencia es aproximadamente una imagen especular del espectro de absorcin.

Para aplicaciones analticas se usa el espectro de emisin, aunque corrientemente, cuando se trabaja con un espectrofluormetro, se obtiene primero un espectro de excitacin, con objeto de confirmar la identidad de la sustancia y seleccionar la longitud de onda ptima de excitacin.

* Estas bandas, ordinariamente llamadas "transiciones 0 0" se producen como consecuencia de transiciones entre niveles vibracionales cero de los estados fundamentales y primer estado singulete excitado.

FOSFORESCENCIA
Las medidas de fosforescencia se llevan a cabo de forma anloga a las de fluorescencia, excepto en lo siguiente: la muestra normalmente se mide a la temperatura del nitrgeno lquido (77K) para minimizar la desactivacin por colisiones, y la excitacin debe ser interrumpida un cierto tiempo para observar la emisin de fosforescencia en ausencia de la emisin fluorescente. Para ello se utilizan dispositivos como el representado en la figura 4.6.

Figura 4.6. Medida de fosforescencia.

En cuanto a las aplicaciones, la fosforimetra no ha tenido una utilizacin tan amplia como la fluorimetra, debido probablemente a la necesidad de trabajar a bajas temperaturas y a la poca precisin de las medidas. Sin embargo, la gran selectividad que potencialmente presenta esta tcnica la hace particularmente adecuada para algunas determinaciones. As, por ejemplo, de entre las muchas sustancias que normalmente se encuentran en la sangre, solo el triptofano presenta una cierta fosforescencia. Ello hace que la sangre normal muestre muy poca fosforescencia, lo cual hace posible la determinacin de un cierto nmero de frmacos fosforescentes presentes a nivel de trazas.

Las medidas de fosforescencia a temperatura ambiente pueden llevarse a cabo en ocasiones sobre compuestos adsorbidos en un soporte rgido, como papel de filtro, lo cual minimiza la desactivacin del estado triplete en forma no radiante.