CROMATOGRAFA EN PAPEL DE CARBOHIDRATOS. Objetivo. - Aprender el procedimiento para trabajar la tcnica de cromatografa en papel.

- Identificar l o los azcares presentes en una muestra. - Se emplear la cromatografa descendente y ascendente para tal propsito. Marco terico. Entre los mtodos cualitativos y cuantitativos para determinacin de carbohidratos, se encuentra la cromatografa. Esta tcnica es de considerable importancia ya que su efectividad radica en hacer separaciones de sustancias mucho muy semejantes entre s estructuralmente, como son los ismeros y los estereoismeros; as como separar sustancias diferentes. La cromatografa se define como un mtodo de anlisis adecuado para la separacin de los componentes de una muestra por percolacin de un lquido sobre un material poroso (papel) finamente dividido (slica gel), producindose as un intercambio entre las fases. De esta forma, los constituyentes de la mezcla se separarn debido a la diferencia en sus velocidades de migracin. Para identificar las sustancias en el papel, se ha introducido una relacin conocida como Rf Relacin de Frentes, que es una relacin entre la distancia recorrida por una sustancia y la distancia migrada por el solvente. El Rf es un valor caracterstico de capa compuesto, y depende tanto del solvente utilizado como de las condiciones empleadas para la cromatografa. Cuando se agita un compuesto con dos disolventes que no se mezclan, este se distribuye en las dos fases en equilibrio, la razn de la concentracin del compuesto en los dos solventes es constante y se conoce como el coeficiente de particin ( ).

[ ] [ ]

) ( (

)(

Donde: kr = Coeficiente de reparto para el soluto x entre los solventes 1 y 2. n = Nmero de extracciones realizadas. W0 = Gramos de x iniciales en el solvente 2, antes de cualquier extraccin. Wn = Gramos de x (finales) en el solvente 2, despus de n extracciones. V1 = Volumen de solvente utilizado para cada extraccin. V2 = Volumen de solvente donde est el soluto originalmente. Fundamento. La cromatografa consiste en efectuar una particin de la muestra, en dos fases; la fase estacionaria que es el papel y la fase mvil que es el eluente donde se desarrolla en cromatograma. El agua del solvente forma complejos con las distintas fibras de celulosa del papel; y a estos complejos formados se pueden unir los azcares mediante interacciones no covalentes como son los puentes de hidrgeno, fuerzas de Van der Waals o intercambio de iones. A este proceso se le considera Adsorcin, por este motivo en la cromatografa en papel intervienen dos fenmenos, la adsorcin y la particin. La fase mvil migra por capilaridad sobre la fase estacionaria, separando los componentes de la muestra. Una vez que esto ha terminado, se utiliza un revelador

apropiado, que reacciona especficamente con los azcares ponindolos de manifiesto en forma coloreada, obtenindose de esta manera un cromatograma. Material: - 6 tubos de ensaye 16mm x 100mm. - Gradilla. - 6 tubos capilares. - Atomizador. - Caja Petri. - Cinta Scotch. - Regla e hilo. - Papel filtro. Reactivos: - Soluciones al 5% de diferentes azcares: lactosa, glucosa, sacarosa. - Eluentes recomendados: Mezcla las partes indicadas de los componentes: a) b) c) d) a) Butanol : cido Actico : Agua (4:1:5) Isopropanol : cido Actico : Agua (3:1:1) Butanol : Piridina : Agua (3:1:1) Cloroformo : cido Actico : Agua (30:35:5) Reveladores: Disolver 0.1ml de anilina (0.93g) y 1.7g de cido ftlico en 100ml de butanol. Calentar a 100C por 10 minutos y dejar enfriar. b) Mezclar 80ml de solucin I y 20ml de solucin II. - Solucin I. NaIO4 al 2%: Disolver 2g de peryodato de sodio en 100ml de agua - Solucin II. KMnO4 al 1% en Na2CO3 al 2%: Disolver 1.0g de KMnO4 en 100ml de Na2CO3 al 2%, el cual previamente se prepar disolviendo 2.0g de Na2CO3 en 100ml de agua. c) NaOH al 1% en etanol de 60. Disolver calentando a 105C durante 2 minutos. Procedimiento: 1. Mide 20ml del eluente Isopropanol:cido Actico:Agua (3:1:1). 2. Colcalos en la base de la caja Petri. 3. Cbrela con un vaso de precipitados, puede ser de 250ml o 400ml. NOTA: Este procedimiento tiene que realizarse por lo menos 20 minutos antes de colocar la tira de papel con los carbohidratos, para saturar la cmara con el eluente. Debe tenerse especial cuidado, al colocar la tira de papel, la lnea basal donde se colocaron los carbohidratos quede por encima del nivel del eluente. 4. Para llevar a cabo el experimento de cromatografa en papel de carbohidratos, se utiliza una tira de papel filtro de 15cm x 6cm. NOTA: No toque el papel con los dedos, use guantes de hule o pinzas. 1. Traza con lpiz una lnea, a 2.5cm de la base del rectngulo del papel. 2. Sobre la lnea basal hay que marcar tres puntos. 3. El primero de ellos se coloca a una distancia de 1.5cm de uno de los bordes, los dos puntos siguientes se colocan a intervalos de 1.5cm a partir del primer punto. 4. En el primer punto marcado, con un capilar aplica 5 gotas de solucin de glucosa al 5%. NOTA: Antes de aplicar la siguiente gota, espere a que la anterior se haya secado. 5. De igual manera se aplica en el segundo punto 5 gotas de lactosa al 5%.

6. Finalmente, en el tercer punto 5 gotas de la solucin de sacarosa al 5%. 7. Utilice cinta masking para fijar el borde superior de la tira de papel a la cmara. 8. Tape hermticamente la cmara con papel aluminio. 9. Tome nota del tiempo al cual inicio el corrimiento del cromatogrma. 10. Espere a que los disolventes asciendan hasta cerca de 2cm 3cm del borde superior del papel. 11. Saque la tira de papel marcando la altura a donde lleg el eluente. 12. Anote el tiempo final del corrimiento del cromatogrma; 13. Deje secar al aire. 14. Cuando la hoja est perfectamente seca, roce con la solucin reveladora (NaOH al 1% en etanol de 60) sin que sta escurra y homogneamente. 15. Mantenga el cromatograma en posicin horizontal y deje que seque al aire el exceso de revelador. 16. Coloque el cromatogrma sobre una hoja de papel, dentro de una charola metlica. 17. Introduzca la charola en un horno a 100C hasta que aparezcan las manchas bien delineadas. 18. Utilice un lpiz para marcar las manchas y determine los valores de Rf de cada una de ellas.