CUARTA PARTE

MINERALIZACION DE MATERIA ORGANICA

PODEMOS MEDIR LA ACTIVIDAD metablica de microorganismos heterotrficos estudiando la mineralizacin de sustratos orgnicos. Definimos mineralizacin como la degradacin completa de un compuesto a sus constituyentes minerales, en donde el carbono orgnico es oxidado hasta CO2. Dado que la descomposicin de un sustrato orgnico por medio del proceso de respiracin aerbica tiene como productos principales a CO2 y H 2O, la evolucin de CO 2 puede utilizarse como un indicador bastante preciso de la actividad respiratoria de comunidades en agua y suelo. Dicho objetivo se cumple en la medida que el ensayo de mineralizacin es realizado bajo condiciones aerbicas. Por otro lado, los ensayos de mineralizacin nos permiten evaluar el efecto de variaciones de factores biticos y abiticos sobre la descomposicin de materia orgnica. A travs de los estudios de mineralizacin podemos entonces determinar la susceptibilidad y razn de descomposicin de compuestos orgnicos naturales y sintticos. De esta forma, podemos anticipar el impacto ambiental de substancias orgnicas identificadas como xenobiticos y/o txicos.

MINERALIZACION MATERIA ORGANICA

METODOLOGIA
Para el estudio de mineralizacin utilizaremos un sistema cerrado diseado por Bartha y Pramer (1970), conocido con el nombre de Matraz Biomtrico ("Biometer Flasks") [Figura 1]. Este sistema nos permite llevar a cabo estudios de mineralizacin por periodos de tiempo prolongados, al mismo tiempo que permite realizar un monitoreo contnuo del proceso. La frecuencia del monitoreo estar supeditada a la velocidad con que se lleva a cabo la mineralizacin y a la concentracin del absorbente alcalino que utilizemos. Figura 1: Matraz biomtrico ("Biometer Flasks").

A ... tapn de goma grande F ... compartimento de oxidacin B ... torre empacada con Ascarite G ... tubo lateral (absorbente granulado de CO2) C ... llave de paso para aire libre de CO2 H ... trampa alcalina (10 ml solucin KOH) D ... tapn de goma pequeo I ... puente de conexin entre trampa alcalina y compartimento de oxidacin E ... aguja para retirar y reponer J ... muestra biolgica (suelo, agua o absorbente de CO2 de la trampa cultivo)

MINERALIZACION MATERIA ORGANICA

El matraz biomtrico consta de un matraz cnico conectado a un tubo de ensayo lateral. Este ltimo funciona como una trampa de absorcin para el CO2 liberado por la muestra biolgica encerrada en el matraz. Mediante el uso del matraz biomtrico podemos medir la evolucin de CO2 en muestras de suelo, aguas naturales o en cultivos microbianos puros o mixtos. El CO2 generado por los elementos biticos contenidos en el matraz es absorbido por una solucin alcalina colocada en el tubo de ensayo lateral. Utilizando una hipodrmica podemos retirar la solucin alcalina de la trampa de CO2, para inmediatamente reponerla con un volumen igual del absorbente alcalino fresco. Esta operacin se realiza sin que el sistema se contamine con CO2 atmosfrico. Los componentes del matraz biomtrico son los siguientes: Materiales: Matraces biomtricos de 250 ml Buretas de 50 ml Matraces cnicos de 25 ml Pipetas (0.1 ml y 1.0 ml) Hipodrmicas (10 ~ 15 cc) Solucin de fenolftalena (indicador de pH) Solucin saturada de BaCl2 Solucin de hidrxido de potasio (O.1 N KOH) Solucin valorada de cido hidroclorhdrico (0.05 N HCl) Solucin de 30% cloruro de mercurio (HgCl2) ( Cuidado! Es material venenoso, maneje con cuidado, use guantes desechables al manejar esta solucin)

Protocolo para ensayo de mineralizacin: 1. Aada la muestra biolgica (100 ml de aguas naturales, 100 ml suspensin de clulas lavadas, 100 ml dilucin de sedimentos ~ 25 g de suelo) a cada uno de los matraces biomtricos. Las muestras constituyen su inculo para el ensayo de mineralizacin. Los inculos se depositarn en el compartimento de reaccin (F) (Figura 1). 2. Prepare los siguientes sistemas (Figura 2): a. SISTEMAS #1 y #2: b. SISTEMAS #3 y #4: no llevan adiciones de sustratos * aada 1 ml de HgCl2 para muestras de agua o suspension de clulas ** esterilize la muestra de suelo en la autoclave (121C / 30 min) o aada 2 ml de cido sulfrico concentrado a la muestra de suelo

MINERALIZACION MATERIA ORGANICA

c. SISTEMAS #5 y #6: d. SISTEMAS #7 y #8:

aada 1 ml glucosa 10% aada 1 ml de petrleo crudo (o de cualquier sustrato que le interese medir su susceptibilidad a ser mineralizado biolgicamente)

Figura 2:

Preparacin de un sistema biolgico para ensayo de mineralizacin en matraz biomtrico.

3. Selle cada matraz biomtrico con su correspondiente torre empacada con Ascarite ( F) (trampa para CO2 ambiental). Asegrese que la llave de paso (C) est cerrada. 4. Inyecte 10 ml de 0.1 N KOH en el tubo lateral del matraz biomtrico usando una hipodrmica (Figura 3). Tome cuidado en evitar que la solucin alcalina entre en contacto con su inculo. Si esto llegar a ocurrir durante el transcurso del experimento deber descartar dicho sistema y substituirlo con un sistema idntico. 5. Incube por 1 semana a temperatura de saln, en la obscuridad. Tome muestras de la trampa alcalina a intrvalos de 24 a 48 horas. Posteriormente, ajuste la frecuencia de los muestreos a la razn de mineralizacin que exhiben sus sistemas. 6. Para cada periodo de muestreo retire los 10 ml de KOH del tubo lateral de cada matraz biomtrico, usando una hipodrmica. Refirase a la Figura 1 para identificar los componentes del matraz biomtrico. Remueva primero el tapn de goma (A) de la torre que contiene la trampa de ascarite (B). Abra la llave de paso (C). Remueva el tapn de goma pequeo (D) y conecte inmediatamente la hipodrmica a la aguja (E) [no debe exponer el KOH de la trampa al CO2 atmsfrico]. Tenga preparado en otra

MINERALIZACION MATERIA ORGANICA

hipodrmica 10 ml de KOH 0.1 N fresco e inyctelo inmediatamente al tubo lateral (G). Inserte inmediatamente el tapn pequeo (D) a la aguja (E). Cierre la llave de paso ( C) y coloque el tapn de goma grande en la torre (B). Regrese sus sistemas a la cmara de incubacin. Figura 3: Ensamblaje final del matraz biomtrico.

7. Transfiera rpidamente la muestra de KOH que tom de cada matraz biomtrico a un matraz cnico de 25 ml al que le ha aadido previamente 0.1 ml de fenolftalena y 1.0 ml de BaCl2 (Figura 4). En este punto la solucin se tornar rosada. Cierre el matraz cnico y agite la muestra con movimientos circulares suaves. Tome ahora 10 ml de KOH fresco y transfiera a otro matraz cnico de 25 ml conteniendo la fenolftalena y el BaCl2. Proceda a tapar y mezclar como lo hizo anteriormente. Una vez en contacto con la fenolftalena, la solucin de KOH deber adquirir una coloracin rosada intensa. En el caso de que la solucin se torne blancuzca o incolora, ello ser indicativo de que el KOH de la trampa fue neutralizado por el CO2 producido en sus sistemas. En dicho caso no podr determinar la cantidad exacta de CO2 producida, aunque s podr estimar un mnimo de CO2 producido. De sucederle esto, proceda a acortar el periodo de incubacin entre muestreos.

MINERALIZACION MATERIA ORGANICA

Figura 4:

Preparacin de la solucin de KOH para titulacin.

8. Titule sus muestras de KOH con 0.05N HCl, hasta que las soluciones se tornen incoloras. Anote el volumen de HCl que requiri para neutralizar el KOH de ambas muestras (Figura 5). Figura 5: Titulacin de la solucin de KOH.

9. Reste el volumen de HCl necesario para neutralizar sus muestras experimentales del volumen de KOH requerido para neutralizar la muestra de KOH fresco. Esta diferencia representa la cantidad de CO2 atrapada en la muestra experimental de KOH.

MINERALIZACION MATERIA ORGANICA

10. Para obtener micromoles de CO2 producidos, multiplique el valor que obtuvo en el paso 9 por 25. Registre la evolucin de CO2 en forma acumulativa para cada sistema. Sume para cada intrvalo de muestreo, el CO2 producido en intrvalos anteriores al CO2 que ha registrado para ese da. Construya una grfica de evolucin de CO2 contra tiempo de incubacin. Datos & Anlisis: Anote sus resultados en la siguiente tabla moles CO2 producidos INTERVALOS DE MUESTREO (das) 7 14 21 28 35

SISTEMA 0 #1 #2 #3 #4 #5 #6 #7 #8

42

moles de CO2

Tiempo (semanas)

MINERALIZACION MATERIA ORGANICA

Observaciones:

PREGUNTAS...
1. Indique qu medimos con los sistemas: a. #1 y #2 b. #3 y #4 2. Cmo compara la mineralizacin de la glucosa con el sustrato alterno que usted seleccion (petrleo crudo u otro)? 3. Por qu razn incubamos los matraces biomtricos en la obscuridad, cuando el inculo consiste de una muestra de agua natural o una muestra de suelo? 4. Al utilizar muestras de suelo o de agua como inculos en los ensayos de mineralizacin, hablamos de la actividad respiratoria de la comunidad y no de de la actividad respiratoria microbiana. Explique.