LA REACIN ANTGENO - ANTICUERPO

Mg. Benites Azabache Juan Carlos

Concepto de reaccin Ag - Ac
Cuando un Ac entra en contacto con un Ag contra el que est dirigido, ambos se unen formndose un complejo Ag-Ac. La unin Ag-Ac es reversible. La permanencia de la unin depende de:
Grado de adaptacin entre ambas molculas. Fuerza y estabilidad de los enlaces que las unen.

Caractersticas de la Interaccin Antgeno - Anticuerpo

Especfica
Reversible Dependiente de pH Sensible a la Temperatura Sensible a la fuerza inica

Enlaces que intervienen en la unin Ac-Ag

No son covalentes. Son cuatro tipos: 1. Electrostticos: Entre grupos inicos (NH3+ y -COO-) de Prots. distintas. 2. Puentes de hidrgeno entre grupos polares hidroflicos (-OH, -NH2, -COOH). 3. Hidrofbicos: Gr. No polares hidrfobos en medio acuoso (cadenas laterales de algunos AA.) 4. De van der Waals: Fuerzas intermoleculares dbiles de origen elctrico que se ejercen a distancia entre molculas. Las fuerzas de unin de cada uno de ellos son menores que en los covalentes, pero en conjunto consiguen una considerable energa de unin.

COMPLEMENTARIEDAD DE EPTOPE Y PARATOPE

EPTOPE Y PARATOPE han de tener estructuras complementarias que encajan entre s. Se forman varios enlaces no coovalentes simultneamente. La distancia entre Ag y Ac es muy pequea en el punto de unin, lo que incrementa la fuerza de esa unin.

AFINIDAD DEL ANTICUERPO

Es la fuerza de unin entre el Ac con su Ag Determina la atraccin entre ellos. Esa fuerza es la suma de las fuerzas de los enlaces que intervienen en la unin.

AVIDEZ DEL ANTICUERPO

Es una medida de la fuerza de unin y estabilidad del complejo: Ag multivalente Ac multivalente. Ac multivalentes: Tienen ms de un punto de unin para Antgenos. Ag multivalentes: Tienen varios determinantes antignicos (ms de un punto de unin para los Ac). La fuerza de unin es mayor que la suma de las afinidades de cada uno de los puntos de unin

(ecuacin vlida solo para molculas monovalentes)

Cintica de la Reaccin

k Hapteno + Ac k
k Ka= = (Hapteno-Ac)

( Hapteno-Ac)

(Hapteno)(Ac)

k
[Ac] la concentracin de sitios libres de Ac [Ac-H] la concentracin de sitios ocupados del Ac

Equilibrio de dilisis
Para calcular Ka

ESPECIFICIDAD DEL ANTICUERPO

Si un anticuerpo reacciona solo con un Ag: Es muy especfico. Si un Ac reacciona con varios Ag: Tiene una especificidad baja. Se habla de REACTIVIDAD CRUZADA. Esto ocurre porque varios antgenos tienen uno o ms determinantes antignicos iguales o similares, capaces por tanto de unirse al mismo Ac.

REACCIONES ANTIGENO ANTICUERPO

APLICACIN AL DIAGNOSTICO DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS

Los anticuerpos como sondas para buscar antgenos de inters

Ventajas

Especificidad Sensibilidad Estabilidad Versatilidad en el diseo: ELISA, IFI, Western blot, etc. Tiempo de ejecucin razonable: minutos a ~ hrs Costo conveniente Infraestructura mnima

Los anticuerpos como sondas para buscar antgenos de inters

Ej. Haptenos (drogas, toxinas, hormonas, etc).

Inmunizacin con Carrier-hapteno

Antisuero

Anlisis de los Ac. unidos a: Hapteno libre Hapteno en otra Protena Hapteno al mismo carrier

Tcnicas Inmunoanalticas
- Reaccin de precipitacin En medio lquido
Floculacin Nefelometra Precipitacin de complejos Inmunes Inmunodifusin doble Inmunodifusin radial Inmunoelectroforesis Rocket electroforesis Contrainmunoelectroforesis Inmunoelectroforesis cruzda bidimensional de Laurel

En gel

- Reaccin de aglutinacin
Aglutinacin pasiva Aglutinacin directa

- Fijacin y actividad hemoltica del complemento - Reacciones en fase slida

o o

ELISA Western blot

REACCIONES DE INMUNOPRECIPITACION CARACTERISTICAS:

Ag solubles Ac de clase Ig G Reaccin poco sensible Reaccin muy especfica Intervienen Ac policlonales frente a Ag polivalentes

 Modalidades: Inmunoprecipitacin simple en tubo Inmunodifusin o Inmunoprecipitacin en medio slido:

Inmunodifusin simple: en tubo (Oudin) En placa o Radial (Mancini) Inmunodifusin doble o radial (Ouchterlony) Inmunoelectroforesis (Grabar y Willians) Contrainmunoelectroforesis Inmunoelectroforesis en cohete (Rocket y Laurel) Inmunoelectroforesis bidimensional.

Reacciones de Precipitacin y Floculacin en solucin

Reacciones de sueros humanos de pacientes con Tiroiditis de Hashimoto auotoinmune.
Equivalencia

Precipitado de protenas (mg)

Tiroglobulina agregada (mg)

Inmunodifusin Doble
(o de Ouchterloni)

Suero humano

Ej: Mezcla de antgenos y suero polivalente

AS (pozo central) : Antisuero de conejo anti-suero humano HSA: Albmina humana purificada HIg: Inmunoglobulina humana purificada

HIg

HSA

Suero humano

Ensayo Immunoturbidimtrico

Suero + Ag complejos insolubles Aumenta turbidez de la solucin y puede ser medida pticamente Turbidez proporcional a la cantidad de protenas en la muestra

Sensibilidad de mtodo se puede incrementar con los anticuerpos Unidos a ltex: mayores agregados

Inmunodifusin Radial
Ag

Anticuerpo incorporado al gel

El tamao de los halos es proporcional a la concentracin del antgeno

 REACCIONES DE AGLUTINACION Caractersticas: Ag particulados, generalmente poliantignicos Ac de clase Ig M e Ig G Reaccin con Ag superficiales. Reaccin bastante sensible Reaccin relativamente especfica Intervienen Ac policlonales frente a Ag polivalentes.

 Modalidades: Aglutinacin directa:

Cualatitativa/cuantitativa En tubo/en porta

Aglutinacin pasiva:
Prueba de Coombs directa e indirecta Hemaglutinacin pasiva Prueba de Ltex Pruebas de coaglutinacin

Reacciones de Aglutinacin
Se considera aglutinacin cuando el antgeno es particulado y tiene como tamao mnimo el bacteriano

Aglutinacin Directa: Las partculas o clulas tienen un antgeno intrnseco.

Aglutinacin Pasiva: partculas o clulas a las cuales se le agrega el antgeno

Reacciones mediadas por Complemento

Lisis celular

REACCIONES DE FIJACION DEL COMPLEMENTO

Reaccin positiva (No hemolisis)

Reaccin Negativa (Hemolisis)

Reacciones en fase slida

ELISA Western blots Inmunofluorescencia Cromatografa de Afinidad

ELISA

(Enzime linked immunosorbent assay )

Deteccin de anticuerpos

Deteccin de Antgeno

Determinacin de antgenos por ELISA

Competencia Sndwich

Densidad ptica

[ Ag ]

Densidad ptica

[ Ag ]

Caso de Haptenos

Caso de Protenas

Mtodo indirecto
Tambin conocido como mtodo Sndwich (Antgeno-anticuerpos-anticuerpo), se basa en la fijacin de un antgeno a la fase slida, el cual atrapa los anticuerpos homlogos en la muestras que posteriormente son identificados con un anticuerpo especfico marcado con una enzima. En estos casos la cantidad de antgeno es directamente proporcional a la cantidad de producto enzimtico formado.

TCNICA DE SANDWICH
POZO DE LA PLACA DE ELISA

MUESTRA DEL PACIENTE

Antgeno en Placa Anticuerpos anti-IgG Humana marcados con Peroxidasa

TMB

P
Anticuerpos IgG en la Muestra del paciente

STOP

Directo
Detecta al antgeno y se basa habitualmente en la captura de este por anticuerpos especficos unidos a una fase slida El antgeno presente en la muestra se combina con el anticuerpo fijado. El antgeno se detecta con otro anticuerpo especfico conjugado a una enzima, se adiciona un sustrato para la enzima y se mide la intensidad de color.

TCNICA DIRECTA
POZO DE LA PLACA DE ELISA

MUESTRA DEL PACIENTE

Placa con Anticuerpos IgG contra el Ag Antgeno en La muestra Anticuerpos IgG marcados con Peroxidasa

TMB

STOP

TCNICA DE INMUNOCAPTURA
POZO DE LA PLACA DE ELISA

MUESTRA DEL PACIENTE

Placa con Anticuerpos De Captura contra IgM Humana

TMB
Antgeno en solucin

P
Anticuerpos IgM en la Muestra del paciente Anticuerpos anti-antgeno marcados con Peroxidasa

STOP

Mtodo competitivo
Se basa en la competencia que se establece entre un antgeno marcado enzimticamente y el mismo antgeno sin marcar (muestra objetivo) al ser colocados frente a una cantidad limitada del anticuerpo homlogo fijado a la fase slida. En estos casos la cantidad de antgeno es indirectamente proporcional a la cantidad de producto enzimtico formado.

Western blot
Precipitado producto enzimtico

Quimioluminiscencia
Sustrato Anti-anticuerpo-Enzima Anticuerpo especfico

Inmunofluorescencia indirecta

Anticuerpo anti-Acrosina

Se puede hacer con clulas vivas o fijadas,

con o sin permeabilizar.

Anticuerpo anti-Ag de embrin de ratn

Cromatografa de Afinidad
Ej: Purificacin de un anticuerpo uniendo el antgeno a una resina (sp). Sin embrago, tambin se puede hacer lo contrario.
Anticuerpo

Anticuerpo no unido

Buffer de elusin

Elucin de Anticuerpo

Quimioluminiscencia
Es el fenmeno que ocurre en las lucirnagas: una reaccin qumica con un muy alto rendimiento energtico produce una molcula potencialmente fluorescente. (No hay excitacin luminosa como en la fluorescencia) Usualmente son reacciones redox catalizadas por enzimas que involucran O2 o H2O2 y un sustrato orgnico oxidable. La energa se libera como luz visible.

Quimioluminiscencia

Oxidante (H2O2,, perborato Na) PO

N2

Luz, 425 nm

Luminol

Intermediario electrnicamente excitado aminoftalato

Quimioluminiscencia
Se utiliza para detectar concentraciones muy bajas de molculas, menor lmite de deteccin que en los otros mtodos enzimticos. Se marcan Ag o Ac con sustancias que participan en la reaccin quimioluminiscente (luminol, peroxidasa). Se detecta la seal quimioluminiscente Se hacen en fase slida, o en tcnicas homogneas

Electroquimioluminiscencia
Ej.: determinacin de TSH Incubacin a 37 anti-TSH-Ru(bipy)3

Partcula magn AntiTSHbiotina Muestra con TSH Streptavidina

Electroquimioluminiscencia
Ejemplo: TSH

ELECTRODO

IMN

Anal Chim Acta, 378, 1(1999)

Electroquimioluminiscencia
Marca: Ru(bipy)2+3 Ru 2+ Ru 3+
En presencia de N(Pr)3, en un nodo, el pasaje de la forma +3 a +2 va acompaado de quimioluminiscencia., Con partculas magnticas y un imn asociado al electrodo, se realiza la reaccin all.