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MANUAL DE AULAS PRTICAS DE MICROBIOLOGIA

Ana Mendes Ferreira, Antnio Ins, Maria Jos Saavedra, Arlete Mendes Faia

Universidade de Trs-os-Montes e Alto Douro

2009

Manual de aulas prticas de Microbiologia


1 - NORMAS A ATENDER NUM LABORATRIO DE MICROBIOLOGIA

As aulas prticas visam ensinar aos alunos as metodologias utilizadas num laboratrio de Microbiologia. Nessas aulas sero utilizados vrios grupos de microrganismos, bactrias e fungos, alguns dos quais podero ser patognicos pelo que os alunos devem seguir um conjunto de regras de modo a evitar qualquer tipo de contaminaes. 1 - A roupa deve ser sempre protegida por uma bata ; 2- No fumar nem comer no laboratrio. No levar boca qualquer objecto nomeadamente lpis, canetas, etc. No humedecer etiquetas com a boca; 3 - Manter a superfcie da bancada livre de todo o material que no for utilizar durante a experincia; 4 - Antes de iniciar qualquer trabalho bem como ao termin-lo lavar e desinfectar as mos; 5 - Desinfectar a superfcie da bancada que ir utilizar com lcool a 70%, antes e aps a execuo do trabalho; 6 - Evitar que objectos ou produtos inflamveis fiquem prximos da chama; 7 - Todo o material usado (pipetas, lminas, lamelas, etc...) deve ser colocado dentro do recipiente com desinfectante colocado na bancada para o efeito. As placas de Petri sero colocadas dentro do balde para posterior inactivao; 8 - O estudante com cabelos longos deve apanh-los, sobretudo quando o trabalho exige a utilizao do bico de Bunsen, de forma a no os queimar. 9 - Comunicar imediatamente ao professor caso entorne alguma cultura ou efectue aspiraes indevidas ; 10 - Comunicar imediatamente qualquer acidente do gnero corte, queimadura, etc. 11 - Nunca esquecer de flamejar as ansas antes de as guardar no suporte. 12- Antes de utilizar qualquer aparelho deve ler as normas de utilizao; 13 - O microscpio deve ser manuseado com cuidado : a) Guardar a capa debaixo da bancada e voltar a coloc-la no final; b) As lminas j observadas devem ser colocadas dentro do recipiente que est em cima da bancada para o efeito; c) S dever remover a lmina da platina, depois deslocao da objectiva;

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d) Nunca deixar a lente de imerso suja de leo, limpando-a com o leno de papel seco, depois com o leno embebido em xilol e novamente com o leno seco. 14 - No misturar material conspurcado com o material esterilizado. 15 - Durante os trabalhos prticos evitar falar e deslocar-se desnecessariamente. 16 - Etiquetar cuidadosamente as culturas antes de as colocar na estufa.

2- MATERIAL UTILIZADO NUM LABORATRIO DE MICROBIOLOGIA Microscpio- amplifica e ilumina objectos tal como bactrias e outros microrganismos que de outro modo seriam invisveis; Autoclave - equipamento destinado esterilizao de materiais e meios de cultura utilizados em Microbiologia, por vapor de gua sob presso; Estufas- equipamento para esterilizar material de vidro (forno de Pasteur), com temperaturas mximas at 180-200C; para incubaes, 5C acima da temperatura ambiente, com temperaturas mximas de 70-100C; Incubadora- equipamento de temperatura controlada (0 a 50C) para cultivo de microrganismos; Jarra de anaerobiose- cmara que permite remover o oxignio do ar, substituindo-o por outro gs, para crescimento de microrganismos anaerbios; Caixas de Petri- caixas de vidro com tampa rasa, onde se colocam os meios de cultura slidos (Placa de Petri) para o crescimento dos microrganismos; Tubos de cultura- tubos de vidro para o cultivo dos microrganismos em meios lquidos e slidos; Tubos Durham- tubos de vidro de dimenses reduzidas utilizados para o aprisionamento do gs produzido pelos microrganismos, em meios lquidos; Pipetas- utilizadas para transferncias de lquidos, inoculaes, etc. Devem ter um tampo de algodo na extremidade superior; Micropipetas- utilizadas para transferncias de lquidos, inoculaes, quando se pretendem volumes muito reduzidos; Lminas e lamelas- para observaes ao microscpio; Cmaras de contagem- lminas de vidro padronizadas e desenhadas para permitirem a contagem de microrganismos totais numa suspenso;

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Ansas e agulhas instrumento com um fio de platina, enrolado ou recto, esterilizvel chama antes e aps utilizao, usado para transferir culturas de microrganismos; Para alm deste material, h outro tipo de equipamento que necessrio ter num laboratrio de Microbiologia nomeadamente frigorfico, balana, aparelho de destilao e desionizao de gua, banho-maria, centrfuga, agitadores magnticos, filtros de esterilizao.

3- LIMPEZA E PREPARAO DE MATERIAL Num laboratrio de Microbiologia devem ser mantidas condies de higiene apropriadas na medida em que se trabalha com uma grande variedade de microrganismos, alguns dos quais podero ser patognicos. O cho deve ser lavado e desinfectado diariamente; As bancadas e todas as superfcies devem ser convenientemente desinfectadas com lcool a 70%; As placas de Petri com culturas devem ser previamente esterilizadas (121C durante 20-25 min.) para inactivao das culturas. Aps a esterilizao o meio de cultura escorrido e as caixas so lavadas com gua e detergente e posteriormente mantidas algumas horas nesta soluo. Depois so escorridas, passadas por gua da torneira, e no fim por gua destilada. As caixas so embrulhadas em papel e esterilizadas a 180C durante 2 horas num forno de Pasteur; Os tubos com culturas so submetidos ao procedimento descrito anteriormente. So esterilizados a 180C durante 2 horas num forno de Pasteur. Quando contm meios de cultura so esterilizados em autoclave a 121C durante 15 min. As pipetas so lavadas com gua corrente e posteriormente mantidas algumas horas numa soluo com detergente. Depois so escorridas, passadas por gua da torneira, e no fim por gua destilada. Depois de secas, coloca-se um tampo de algodo na parte superior. So colocadas em caixas apropriadas ou embrulhadas em papel antes da esterilizao a 180C durante 2 horas num forno de Pasteur; As lminas e lamelas utilizadas nas observaes ao microscpio so colocadas numa soluo com detergente. Depois de lavadas devem ser colocadas numa mistura cromo-sulfrica durante a noite e posteriormente lavadas. Notas importantes: Flamejar as ansas antes e depois do contacto com as culturas. Deixar arrefecer a ansa antes de tocar na colnia da cultura;

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Flamejar as aberturas dos tubos de ensaio, aps a abertura e antes da colocao da tampa. Manter a tampa na mo por presso do dedo mnimo; A abertura da tampa da placa de Petri deve ser cuidadosa, devendo ser manuseada junto chama.

4 - PREPARAO DE MEIOS DE CULTURA O crescimento microbiano est dependente da presena de gua e de nutrientes indispensveis biossntese de material celular e obteno de energia. As exigncias nutritivas e as condies ambientais que asseguram o crescimento so dependentes do tipo de microrganismo. No cultivo de microrganismos so utilizadas solues de substncias que funcionam como nutrientes necessrios ao seu crescimento e multiplicao celular. Estas solues designadas por meios de cultura tm uma composio varivel com as exigncias nutricionais de cada espcie. Os meios de cultura podem ser lquidos (caldo), semi-slidos ou slidos (1,5 a 2% de agar). O agar um agente gelificante, de baixo valor nutritivo, extrado de algas marinhas, que se liquefaz a 100C e solidifica a 40C. Quanto composio qumica, so designados por meios sintticos quando quimicamente definidos; e complexos - com composio qumica desconhecida (com extracto de levedura, extracto de carne, extracto de malte, peptona, ou triptona, por exemplo). Quanto funo, os meios de cultura podem ser: meios de enriquecimento formulados para permitirem o crescimento de microrganismos mais exigentes; meios selectivos formulados para o crescimento de uns em detrimento de outros; e meios diferenciais formulados para distinguir microrganismos que possuam determinada caracterstica bioqumica.

Material necessrio: Erlenmeyer; Balana; gua destilada; Peptona; extracto de carne; Tubos de ensaio

Preparao de agar nutritivo (Como exemplo) 1- Pesar individualmente 5 g de peptona e 3 g de extracto de carne (usar esptulas bem limpas e limpar entre pesagens). No voltar a introduzir o excesso no frasco. 2- Adicionar os ingredientes a 500 ml de gua destilada colocada num Erlenmeyer de 2000 ml. 3- Homogeneizar cada um deles em separado e agitar a mistura at que se verifique a dissoluo completa dos ingredientes. 4- Adicionar 15 a 20 g de agar aos outros componentes e homogeneizar. 5- Adicionar gua destilada de modo a perfazer o volume de 1000 ml. 6- Acertar a pH 7.0 com hidrxido de sdio ou cido clordrico 1N, a uma temperatura de 60 C. Lavar rapidamente os elctrodos do potencimetro.

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7- Repartir o meio por 3 bales de 500 ml, previamente esterilizados. Rolhar e esterilizar em autoclave a 121 C durante 15 minutos.

Composio do agar nutritivo: Extracto de carne ................................ Peptona .............................................. Agar ................................................... H2O destilada ................................... 3g 5g 15 g 1000 ml

Acertar a pH 6,8-7,0. Esterilizar a 121C durante 15 minutos

Notas importantes: A adio do agar aos meios deve ser sempre feita no final, depois de todos os ingredientes estarem dissolvidos; O meio de cultura deve ser esterilizado logo aps a sua preparao; Os fracos no devem conter mais de metade do seu volume; Os frascos no devem ter as rolhas completamente apertadas durante a esterilizao;

5 - TCNICAS UTILIZADAS NA CULTURA DE MICRORGANISMOS O estudo de microrganismos no laboratrio envolve o seu crescimento e manuteno em meios de cultura. H um conjunto de tcnicas bsicas de repicagens e sementeiras de modo a preservar o organismo. Para isso necessrio obter em primeiro lugar uma cultura pura do isolado (colnia obtida a partir de uma nica clula). A principal fonte de contaminao externa a atmosfera por isso a manipulao dos organismos ter que ser efectuada em condies de assepsia.

Material necessrio -Culturas de microrganismos -Placas de Petri com agar nutritivo -Tubos com caldo nutritivo -Tubos com agar nutritivo inclinado -Tubos com agar nutritivo -Ansas e agulhas -Pipetas -Estufa

Procedimento 1- Isolamento de colnias em meio slido

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Por espalhamento- Retirar 0,1 ml de uma cultura lquida para a superfcie da placa de Petri. Espalhar uniformemente com auxlio de um semeador (vareta de vidro dobrada) ou com prolas de vidro esterilizadas de modo a que as clulas fiquem afastadas umas das outras e se obtenham colnias individualizadas. Identificar a placa com o nome do operador e a data. Incubar as placas temperatura apropriada para o microrganismo em estudo.

Sementeira por esgotamento (streak plate) isolamento e obteno de cultura pura Com auxlio de uma ansa previamente aquecida ao rubro e arrefecida, retire uma poro de colnia que pretende isolar e espalhe superfcie da placa de Petri de modo a que as clulas fiquem afastadas umas das outras e se obtenham colnias individualizadas. Identificar a placa com o nome do operador e a data. Incubar as placas temperatura apropriada para o microrganismo em estudo.

2- Repicagem de colnias Para agar inclinado- Com auxlio de uma ansa previamente aquecida ao rubro e arrefecida, retire uma poro de colnia que pretende guardar e ou fazer crescer e espalhe superfcie do agar inclinado. Identifique o tubo com o nome do operador e a data. Incubar os tubos temperatura apropriada para o microrganismo em estudo. Para agar em tubo- Com auxlio de uma agulha previamente aquecida ao rubro e arrefecida, retire uma poro de colnia que pretende guardar e/ou fazer crescer e introduza por picada dentro do agar. Identifique o tubo com o nome do operador e a data. Incubar os tubos temperatura apropriada para o microrganismo em estudo.

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Figura 1- Sementeira superfcie da gelose inclinada Nota:


Aps a obteno de uma cultura pura de um isolado, a cultura deve ser mantida em laboratrio de modo a que as clulas permaneam viveis e sem contaminaes. Podem ser refrigeradas a 4C ou congeladas (-18C) por perodos curtos ou por perodos mais longos a -70C ou liofilizadas.

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Trabalho prtico 1 Diversidade e ubiquidade dos microrganismos Os microrganismos existem no ar, na gua e principalmente no solo. Do solo podem ser arrastados pelo vento atravs das partculas de poeira. Desenvolvem-se logo que as condies ambientais (nutrientes, humidade e temperatura) sejam favorveis ao seu crescimento. Cada organismo aparece pelo menos num habitat natural especfico no qual pode ser normalmente encontrado, pode crescer e do qual pode ser isolado.

Objectivos: Comprovar a diversidade e a ubiquidade dos microrganismos

Material necessrio -Placas de Petri com meio de agar nutritivo -Pipetas -Estufa -Zaragatoas

Procedimento 1- Pesquisa de microrganismos do ar Retirar a tampa de vrias placas de Petri com agar nutritivo e manter abertas durante 5, 10 e 15 minutos. Identificar a placa com o nome do operador e a data. Incubar as placas a 30C durante 3 dias. 2- Pesquisa de microrganismos das superfcies da sala de aulas Passar um cotonete estril sobre uma superfcie da bancada antes e aps a sua desinfeco com lcool a 70%. Passar o cotonete (zaragatoa) sobre a superfcie do meio de cultura. Identificar a placa com o nome do operador e a data. Incubar as placas a 30C durante 3 dias.

3- Pesquisa de microrganismos de outros ambientes Passar um cotonete estril entre os dedos, antes e aps a lavagem das mos. Passar o cotonete sobre a superfcie do meio de cultura. Identificar a placa com o nome do operador e a data. Incubar as placas a 37C durante 3 dias.

4- Pesquisa de microrganismos do solo Pipetar 100ul da soluo de solo e colocar numa placa de Petri com o meio de cultura. Espalhar a soluo superfcie do meio com a ajuda de um semeador.

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Identificar a placa com o nome do operador e a data. Incubar as placas a 30C durante 3 dias.

Resultados: -Examinar as placas e contar o nmero de colnias totais e o nmero de colnias diferentes em cada placa; -Descrever o tipo de colnias com base na descrio apresentada na Fig.1. -Registar os resultados.

Quadro Caracterizao das colnias observadas Caractersticas das colnias Dimenso (mm) Cor Forma Elevao Margem Representao

Escolher 2 ou 3 colnias que considere mais interessantes. Colocar uma alquota de lquido ou uma poro de colnia (homogeneizar) numa lmina e cobrir com uma lamela. Observar ao microscpio. Desenhe cada uma das suas observaes no Quadro:
Observao das clulas retiradas da colnia 1 Observao das clulas retiradas da colnia 2 Observao das clulas retiradas da Colnia 3

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FORMA

Puntiforme

Circular

Filamentosa

Irregular

Rizoide

Pevide

ELEVAO

Plana

Elevada

Convexa

Em abbada

Mamilonada

MARGEM

Inteira

Ondulada

Lobada

Irregularmente crenada

Filamentosa

Frisada

Figura 2- Descrio de vrios tipos de colnias

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Trabalho prtico 2 Morfologia bacteriana e mtodos de colorao As bactrias so organismos unicelulares que podem apresentar formas esfricas (cocos), cilndricas (bacilos) e espirais (espirilos e espiroquetas). Reproduzem-se por ciso binria. Aps o alongamento da clula, forma-se um septo que vai gradualmente progredindo at formao de duas clulas. Estas podem separar-se ou no umas das outras. Com base no nmero e no plano de diviso celular, as clulas podem apresentar-se sob as seguintes formas: Diplococcos (cocos aos pares); Streptococcus (cocos em cadeia); Staphylococcus (cocos em cacho); ttradas (agrupamentos de quatro cocos); sarcinas (agrupamentos de oito cocos em cubo). Os bacilos tambm podem aparecer isolados, aos pares e em cadeia. O tamanho das clulas varivel. O exame das bactrias pode ser feito directamente da suspenso, atravs de preparaes a fresco em gota pendente. As preparaes coradas permitem observar caractersticas morfolgicas e evidenciar diferenas entre espcies (Bactrias Gram positivo e Gram negativo).

Figura 3- Morfologia: Tamanho, forma e arranjos bacterianos

Objectivos: Observar clulas vivas e mobilidade, distinguir microrganismos por colorao do meio envolvente e distinguir microrganismos Gram positivo e Gram negativo.

Material necessrio -Culturas de microrganismos

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-Microscpio -Ansas -Lminas e lamelas -Azul de metileno -Tinta da China -Reagentes para a colorao de Gram

Procedimento Retirar as lminas limpas do contentor que se encontra em cima da bancada. Limpar com papel absorvente. Manipular tocando apenas nos bordos das lminas. Identificar a lmina numa extremidade.

Observao a fresco- Colocar uma alquota de lquido ou uma poro de colnia (homogeneizar com gua) numa lmina e cobrir com uma lamela. Observar ao microscpio.

Observao de mobilidade (preparao de gota pendente) - Colocar uma alquota de lquido ou uma poro de colnia (homogeneizar com gua) numa lamela. Colocar nos cantos da lamela um bocado de vaselina. Cobrir com uma lmina de modo a que a gota fique no centro da zona escavada. Observar ao microscpio.

Colorao simples- Colocar uma alquota de lquido ou uma poro de colnia (homogeneizar com gua) numa lmina, adicionar uma gota de azul-de-metileno e cobrir com uma lamela. Observar ao microscpio.

Preparao dos esfregaos -Marcar na parte inferior da lmina uma pequena rea onde se ir fazer a preparao; -Colocar uma gota de gua na seco delimitada; -Esterilizar a ansa, colocando-a verticalmente chama de um bico de Bunsen at ficar ao rubro. Deixar arrefecer; -Retirar com a ansa uma poro da colnia e misturar com a gua colocada na lmina; - Deixar secar ao ar; -Fixar passando a face inferior da lmina 3 vezes atravs da chama. Deixar arrefecer; -Corar pelo mtodo escolhido;

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Colorao simples com fixao- Aps fixar, deixar arrefecer e adicionar uma das solues apresentadas de seguida, deixando actuar durante o tempo referido para cada uma delas. -Cristal de violeta (1 minuto) -Azul de metileno de Loeffler (5 minutos) -Fucsina (30 segundos). -Lavar cuidadosamente e deixar secar ao ar

Colorao negativa- Aps fixar, espalhar muito bem uma gota de nigrosina (10%) sobre a preparao. Deixar secar o corante e observar com a lente de imerso. Esta colorao poder ser usada na observao de cpsulas. Neste caso a preparao previamente corada com fucsina, lavada e seca antes de se adicionar a nigrosina.

Colorao diferencial de Gram Colocar a lmina com o esfregao fixado sobre 2 varetas na tina de lavagem, Colocar algumas gotas de cristal de violeta. Deixar actuar durante 1 minuto; Retirar o excesso do corante e passar por gua; Colocar algumas gotas de Lugol (mordente que aumenta a reaco entre o cristal de violeta e as clulas). Deixar actuar durante 1 minuto; Passar por gua e secar com papel de filtro; Descorar com lcool a 95% durante 10 a 20 segundos;Passar por gua e secar; Cobrir com safranina. Deixar actuar durante 30 segundos. Lavar com gua e secar com papel absorvente; Examinar ao microscpio com a objectiva de imerso.

Colorao de esporos Colocar a lmina com o esfregao fixado sobre 2 varetas sobre o contentor com gua em ebulio; Cobrir o esfregao com um quadrado de papel de filtro; Colocar algumas gotas de verde malaquite (soluo aquosa a 5%). Deixar actuar durante 5 minutos; Passar por gua; Cobrir com safranina. Deixar actuar durante 30 segundos. Lavar com gua e secar com papel absorvente; Examinar ao microscpio com a objectiva de imerso.

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Trabalho prtico 3 Morfologia e estrutura dos fungos Os fungos so organismos no-fotossintticos que podem apresentar uma forma filamentosa (fungos filamentosos) ou unicelular (leveduras). Alguns fungos podem ser dimrficos,

apresentando uma estrutura micelial ou unicelular dependendo das condies do meio. Objectivos: Observao das estruturas de vrios fungos hifas, miclio, clulas e estruturas de reproduo. 1- Fungos filamentosos Os fungos so constitudos por uma massa de filamentos muito finos (miclio). Cada filamento (hifa) assemelha-se a um longo tubo cilndrico em que as clulas se distinguem umas das outras devido existncia de septos (hifa septada) ou sem separao das clulas (hifas cenocticas). Os fungos so constitudos por hifas vegetativas designadas por talo. Estas hifas penetram no substrato, tendo algumas funes semelhantes s razes das plantas (rizoides). Reproduzem-se por esporos que podem ser formados sexuada ou assexuadamente. As hifas fertis exibem normalmente as estruturas de reproduo que permitem classificar e identificar os fungos.

Figura 4- Morfologia e estrutura de alguns fungos filamentosos

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Material necessrio -Culturas de fungos -Microscpio -Ansas -Lminas e lamelas -Lupa Procedimento Comparar macroscopicamente as colnias de diversas culturas de fungos que lhe so fornecidos; Para o exame microscpico a fresco colocar uma gota de gua sobre a lmina, adicionar uma poro de colnia e cobrir com uma lamela. Observar ao microscpio. Preparar lminas com e sem adio de lactofenol. Resultados Descrever as caractersticas das colnias observadas, Descrever as estruturas reprodutivas dos vrios fungos (fazer um desenho), hifas, etc. 2- Leveduras As leveduras so fungos unicelulares que se reproduzem assexuadamente por gemulao ou ciso. Por vezes, as gmulas no se separam da clula me formando longas cadeias de clulas que se designa por pseudomiclio. Outras, quando cultivadas em determinadas condies formam verdadeiro miclio (dimorfismo). A morfologia das leveduras bastante variada. Apresentam clulas esfricas, ovais elpticas, cilndricas, em forma de limo, triangular e at em forma de garrafa.

Material necessrio -Culturas de leveduras; -Microscpio; -ansas; -Lminas e lamelas;

Procedimento Examinar macroscopicamente as colnias de diversas leveduras; Para o exame microscpico a fresco colocar uma gota de gua sobre a lmina, adicionar uma poro de colnia e cobrir com uma lamela. Observar ao microscpio.

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MORFOLOGIA DAS LEVEDURAS


OVOIDE Dekkera bruxellensis ESFRICA
Saccharomyces cerevisiae

CILNDRICA Pichia membranaefaciens

GARRAFA APICULADA Kloeckera apiculata Pitysporum ovale TRIANGULAR Trigonopsis variable

Figura 5- Morfologia das leveduras

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Trabalho prtico n4 Titulao de uma suspenso de bacterifagos lticos por contagem de placas fgicas Os vrus so entidades biolgicas acelulares constitudos apenas por um cido nucleico (DNA ou RNA) designado por nucleide, envolvido por uma cpsula proteica, designada por cpside. O conjunto da cpside e nucleide designa-se por nucleocpside. Alguns, podem ainda ser revestidos por um invlucro (envelope) constitudo por protenas e fosfolpidos, adquiridos da membrana da clula hospedeira, aquando do processo de libertao das partculas virais. Todos os vrus podem apresentar dois estados: extracelular ou intracelular. O estado extracelular, designado por partcula viral ou virio, corresponde forma inerte do vrus, sob a qual transmitido entre clulas hospedeiras. No estado intracelular ocorre a replicao do cido nucleico viral e a produo de novas partculas virais. Deste modo, os vrus so considerados parasitas intracelulares obrigatrios uma vez que o processo de multiplicao viral estritamente dependente da maquinaria da clula hospedeira. Existe uma enorme especificidade entre os vrus e as suas clulas hospedeiras compatveis. Assim existem vrus que se replicam apenas no interior de clulas animais, outros em clulas vegetais, outros em fungos, outros em algas e outros em protozorios. Os bacterifagos1, ou simplesmente fagos, so vrus que se replicam apenas no interior de bactrias. A replicao dos fagos est ainda restrita a certas espcies/estirpes bacterianas. O ciclo de multiplicao dos fagos envolve as seguintes fases: (1) adsoro a receptores especficos da superfcie; (2) injeco do genoma do fago para o interior da bactria; (3) replicao do genoma viral; (4) maturao em que aps a formao de todos os componentes virais e consequente montagem d origem formao de novos fagos; (5) libertao dos novos fagos com ruptura da clula infectada. Este processo de multiplicao designado por ciclo ltico e os bacterifagos so designados por fagos lticos. Por vezes o genoma do fago no se replica mas integra-se no cromossoma bacteriano, sendo transmitido descendncia bacteriana como parte integrante do seu genoma. Este processo designado por ciclo lisognico e os bacterifagos so designados por fagos temperados. As bactrias que transportam no seu cromossoma um genoma viral (profago) so designadas por lisognicas. Em determinadas circunstncias um profago pode ser activado, replicar-se e induzir o ciclo ltico dando origem libertao de novos fagos. Os vrus lticos provocam a lise da clula bacteriana hospedeira aquando da sua libertao. Por isso podem ser detectados por diluio e espalhamento em superfcies de agar inoculadas com clulas hospedeiras para a formao de placas fgicas. Estas placas so zonas transparentes sobre uma camada de clulas hospedeiras, e representam o ponto sobre o qual uma partcula viral infecciosa foi depositada. Como resultado de ciclos lticos subsequentes, as clulas hospedeiras nessas zonas so destrudas. O tamanho das placas dependente dos tempos de replicao quer dos vrus quer das bactrias hospedeiras. A contagem de placas fgicas por isso anloga contagem de colnias bacterianas em caixa de Petri, e deste
1

Os bacterifagos (fago: do grego phagein: comer) comedores de bactrias foram descobertos por Frederick Twort e Felix dHerelle na 2 dcada do sec. XX

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modo, a contagem de placas fgicas pode ser usada para determinar o ttulo, i.e. a concentrao de partculas fgicas, na suspenso inicial.

Objectivos: Contagem de placas fgicas

Material necessrio Por grupo: 8 eppendorfs com 0.9 ml de meio LB 8 tubos com 5 ml de meio LBss (mantidos em banho a 50 C) 8 tubos vazios esterilizados 1 erlenmeyer com 100 ml de meio LBs (mantido em banho a 50 C) 8 caixas de Petri esterilizadas 1 micropipeta 1 caixa com pontas amarelas esterilizadas 1 tubo com a cultura de clulas hospedeiras (Escherichia coli 5911) 1 eppendorf com a suspenso do fago T72

Procedimento No nicio da aula, distribuir o meio de cultura LBs (slido) pelas caixas de Petri formando uma camada fina no fundo. Deixar solidificar. Fundir o meio LBss (semi-slido) e manter os tubos em banho a 50 C. (Consulte o fluxograma em anexo como um auxiliar durante o procedimento experimental) 1. Preparar diluies seriadas (10-1 at 10-8) da suspenso fgica, adicionando (0.1 ml) da suspenso inicial ao meio lquido estril LB (0.9 ml/eppendorf). 2. Identificar os tubos vazios esterilizados com as diluies realizadas. Retirar 0.1 ml de cada diluio e colocar nos respectivos tubos. 3. Adicionar 0.1 ml da cultura bacteriana hospedeira (DO600nm1.0) a cada um dos tubos anteriores. 4. Identificar as caixas de petri previamente preparadas com as diluies efectuadas (10-1 at 108

).

5. Adicionar a cada um dos tubos (ponto 3.) 5 ml do meio LBss contido nos tubos mantidos em banho a 50 C. Misturar os contedos dos tubos por agitao suave (evitar a formao de bolhas) e em seguida derramar e espalhar uniformemente sobre a superfcie da camada de LBs das caixas

O fago T7 um dos vrios colifagos que infecta estirpes de Escherichia coli. Possui uma molcula linear de DNA em cadeia dupla. Apresenta cabea, cauda curta, no contrctil e pertence famlia Podoviridae (Para mais informaes consultar http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/ICTVdB/54010001.htm)

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de petri correspondentes. (Nota: deve preparar 1 tubo de cada vez para evitar que o meio solidifique). 6. Inocular 0.1 ml da cultura de clulas hospedeiras isoladamente como controlo. 7. Deixar que o agar solidifique e incubar as caixas a 37 C durante 24 horas.

Resultados Observar as caixas e determinar o n de placas fgicas (plaque-forming units-pfu), partculas fgicas infecciosas, por ml da suspenso original. Apenas as caixas contendo 30-300 placas fgicas devem ser consideradas. pfu/0.1 ml = n de placas fgicas x factor de diluio Como apenas foram plaqueados 0.1 ml deve multiplicar-se por 10 para obter pfu/ml pfu/1.0 ml = n de placas fgicas x factor de diluio x 10

placa fgica camada de E. coli

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Procedimento experimental

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Trabalho prtico 5 Avaliao do crescimento microbiano O perfil de crescimento de uma populao microbiana pode ser avaliado atravs da determinao peridica do nmero de indivduos, da massa celular ou atravs da actividade celular. O processo mais usual o de contagem directa ao microscpio, utilizando cmaras de contagem que permitem determinar o nmero total de clulas. Para distinguir clulas viveis (com capacidade para se multiplicar) de no viveis necessrio cultivar as clulas num meio de cultura adequado ao crescimento da espcie em causa. Para o efeito, um volume conhecido de uma suspenso microbiana espalhado uniformemente superfcie do meio de cultura (tcnica de espalhamento) ou misturado com o meio ainda liquefeito (mtodo de incorporao). Aps alguns dias temperatura adequada, as colnias so contadas (30 a 300) e os resultados so expressos em unidades formadoras de colnias (ufc). O nmero de clulas viveis pode ser tambm estimado atravs de diluies sucessivas da suspenso em anlise (3 a 5 tubos para cada diluio). Nas diluies mais elevadas no haver crescimento em todos os tubos. O clculo do nmero mais provvel de microrganismos ser efectuado com base no nmero de tubos positivos, recorrendo s Tabelas de MacGrady. A massa celular pode ser determinada directamente atravs do peso seco ou indirectamente por turbidimetria.

Figura 6- Curva que representa o crescimento microbiano em sistema fechado, em batch (sistema descontnuo)

Objectivos: Comparao de mtodos de avaliao do crescimento microbiano

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1- Avaliao quantitativa de uma populao microbiana - Contagem em cmara Material necessrio -Culturas de microrganismos -Microscpio -Cmara de contagem

Procedimento Colocar na cmara uma gota da suspenso de microrganismos; Cobrir com a lamela; Contar o nmero de clulas por quadrado (Na zona central esto gravadas duas grelhas que so constitudas por um quadrado dividido em 400 pequenos quadrados, cada um com uma rea de 1/400 mm2); Para que o valor seja mais preciso fazer contagens em diferentes quadrados e determinar a mdia;

Resultados O nmero de microrganismos/ml = Nx

1 x1000 ; profundidadexreadoquadrado

N= valor mdio de microrganismos por quadrado

Numa cmara em que a profundidade seja de 0,1 mm e a rea do quadrado de 1/400 = 0.0025 mm2, o nmero de microrganismos/ml ser igual ao valor mdio por quadrado x 4 x 106.

Figura 7- Procedimento para avaliao quantitativa de uma populao microbiana - Contagem de clulas em cmara

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2- Determinao do nmero de clulas viveis - Contagem em placas

Material necessrio -Culturas de microrganismos -Tubos de ensaio com 9 ml de gua estril (soluo salina) -Placas de Petri com meio apropriado cultura -Agitador de tubos -Pipetas esterilizadas de 1 ml

Figura 8 - Determinao do nmero de clulas viveis contagem em placa

Procedimento Pipetar 1 ml da suspenso da cultura para um tubo com 9 ml de gua estril (diluio de 1:10); Homogeneizar muito bem num agitador; Transferir 1ml do tubo da diluio 1 para um segundo tubo 2 com 9 ml de gua estril (diluio de 1:100);Homogeneizar muito bem num agitador Fazer isto sucessivamente at obter a diluio desejada que permita contar as ufc; Espalhar uniformemente em placas de Petri 0,1 ml de cada uma das diluies (Identificar cada uma das placas com a diluio respectiva, data e nome do operador); Incubar as placas a 30C durante 3 dias;

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Resultados Escolher o nmero de placas que contenham 30 a 300 colnias e efectuar a contagem. Determinar o valor mdio de colnias por placa e multiplicar pelo factor de diluio. O resultado ser expresso em ufc/ml.

3- Avaliao do crescimento por turbidimetria Material necessrio -Culturas de microrganismos -Tubos de ensaio com gua estril (soluo salina) -Agitador de tubos -Pipetas esterilizadas de 1 ml -Espectrofotmetro

Procedimento Ligar o espectrofotmetro e acertar o comprimento de onda a 640 nm; Transferir para a cuvete caldo no inoculado e acertar a absorvncia a zero; Transferir as suspenses bacterianas para cuvetes do espectrofotmetro (pode ser necessrio diluir as amostras); Proceder leitura da absorvncia (DO).

Figura 8 Avaliao do nmero de clulas por turbidimetria Resultados Relacionar os valores obtidos por contagem directa ao microscpio, por contagem em placa e por turbidimetria, para a mesma suspenso de clulas.

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Tabelas de MacGrady para determinao do NMP de microrganismos - 3 tubos por diluio N Caract. 000 001 010 011 020 100 101 102 110 111 N Microrg. 0,0 0,3 0,3 0,6 0,6 0,4 0,7 1,1 0,7 1,1 N Caract. 120 121 130 200 201 202 210 211 212 220 N Microrg. 1,1 1,5 1,6 0,9 1,4 2,0 1,5 2,0 3,0 2,0 N Caract. 221 222 223 230 231 232 300 301 302 310 N Microrg. 3,0 3,5 4,0 3,0 3,5 4,0 2,5 4,0 6,5 4,5 N Caract. 311 312 313 320 321 322 323 330 331 332 333 N Microrg. 7,5 11,5 16,0 9,5 15,0 20,0 30,0 25,0 45,0 110,0 140,0

- 5 tubos por diluio N Caract. 000 001 002 010 011 012 020 021 030 100 101 102 103 110 111 112 120 121 122 130 131 140 200 201 202 N Microrg. 0,0 0,2 0,4 0,2 0,4 0,6 0,4 0,6 0,6 0,2 0,4 0,6 0,8 0,4 0,6 0,8 0,6 0,8 1,0 0,8 1,0 1,1 0,5 0,7 0,9 N Caract. 203 210 211 212 220 221 222 230 231 240 300 301 302 310 311 312 313 320 321 322 330 331 340 341 350 N Microrg. 1,2 0,7 0,9 1,2 0,9 1,2 1,4 1,2 1,4 1,4 0,8 1,1 1,4 1,1 1,4 1,7 2,0 1,4 1,7 2,0 1,7 2,0 2,0 2,5 2,5 N Caract. 400 401 402 403 410 411 412 420 421 422 430 431 432 440 441 450 451 500 501 502 503 504 510 511 512 N Microrg. 1,3 1,7 2,0 2,5 1,7 2,0 2,5 2,0 2,5 3,0 2,5 3,0 4,0 3,5 4,0 4,0 5,0 2,5 3,0 4,0 6,0 7,5 3,5 4,5 6,0 N Caract. 513 520 521 522 523 524 525 530 531 532 533 534 535 540 541 542 543 544 545 550 551 552 553 554 555 N Microrg. 8,5 5,0 7,0 9,5 12,0 15,0 17,5 8,0 11,0 14,0 17,5 20,0 25,0 13,0 17,0 25,0 30,0 35,0 45,0 25,0 35,0 60,0 90,0 160,0 180,0

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Trabalho prtico 6 Avaliao do efeito de alguns factores fsicos no crescimento microbiano O crescimento de um microrganismo afectado pela disponibilidade de nutrientes e por um conjunto de factores fsicos como a temperatura, o pH, a presso osmtica e o potencial de oxidao/reduo do meio. A temperatura um dos factores que mais afecta o crescimento e a sobrevivncia dos microrganismos. Cada espcie, em condies experimentais bem definidas, caracterizada por trs temperaturas cardeais temperatura mnima, mxima e ptima de crescimento. Estes valores permitem agrupar os microrganismos em psicrfilos, mesfilos e termfilos e hipertermfilos. O comportamento dos microrganismos relativamente ao oxignio disponvel heterogneo, existindo microrganismos aerbios e anaerbios estritos, aerbios facultativos, aerotolerantes e micro-aeroflicos.

Figura 9 Classificao dos microrganismos com base na temperatura ptima

Objectivos: Avaliar o efeito dos factores fsicos (temperatura e pH) no crescimento microbiano.

Material necessrio -Culturas de microrganismos -Placas com meio de cultura -Tubos com meio de cultura com diferentes valores de pH 3, 5, 7, 9

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Procedimento 1- Efeito do pH Inocular cada uma das culturas numa srie de tubos com um meio de cultura a diferentes valores de pH, Incubar as placas a 30C durante 3 dias; Comparar o crescimento observado em cada tubo, para o mesmo microrganismo.

2- Efeito da temperatura Inocular cada uma das culturas numa srie de tubos com um meio de cultura; Incubar a 5, 25 e 55C durante 3 a 7 dias; Comparar o crescimento observado em cada tubo, para o mesmo microrganismo.

Resultados Verificar os efeitos do pH e da temperatura no crescimento de cada um dos microrganismos.

Figura 10 Classificao dos microrganismos com base nos valores de pH ptimo de crescimento

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Trabalho prtico 7 Controlo do crescimento e morte dos microrganismos por mtodos fsicos A morte de microrganismos, isto , a perda irreversvel da viabilidade, um aspecto fundamental no controlo de microrganismos no laboratrio e na Indstria, Farmacutica e Alimentar. A esterilizao pode ser atingida por processos fsicos e qumicos. Entre os processos fsicos pode utilizar-se o calor, a filtrao e as radiaes.

Objectivos: Avaliar o efeito letal de alguns agentes fsicos - temperatura e radiaes UV.

Material necessrio -Culturas de microrganismos -Placas com meio de cultura - Tubos com meio de cultura lquido

Procedimento 1- Efeito da temperatura Inocular cada uma das culturas numa srie de tubos com um meio de cultura; Introduzir os tubos num banho-maria a 70 C durante 5, 10 e 15 minutos; Aps o tempo referido, semear 0,1 ml de cada uma das culturas submetidas a temperaturas diferentes para uma placa; Incubar as placas a 30C durante 3 dias; Observar o crescimento do microrganismo nas trs condies.

2- Efeito das radiaes UV Semear 3 placas com o mesmo microrganismo; Retirar as tampas e colocar as placas sobre uma lmpada UV, protegida com cartolina; Retirar uma placa ao fim de 10, 20 e 30 minutos; Incubar as placas 30C durante 3 dias; Comparar o crescimento em cada placa.

Resultados Verificar os efeitos da alta temperatura e do tempo no crescimento de cada um dos microrganismos. Verificar o efeito das radiaes no crescimento de cada um dos microrganismos.

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Trabalho prtico 8 Actividade enzimtica dos microrganismos As enzimas so protenas promotoras de reaces qumicas especficas na clula. Estes catalisadores permitem o transporte e utilizao de nutrientes indispensveis sntese de material celular e obteno de energia. A utilizao de um determinado substracto pode ser caracterstica de uma dada espcie, permitindo a sua identificao. Algumas bactrias fermentam hidratos de carbono simples, produzindo cidos, lcoois e gs como produtos finais. Outros utilizam molculas mais complexas como a celulose e o amido. A capacidade de utilizao de substratos especficos, pela anlise dos metabolitos finais produzidos ou pela pesquisa de determinada enzima, associada observao morfolgica das clulas microbianas e s suas caractersticas culturais em meios de cultura slidos e/ou lquidos, so alguns indicadores utilizados em Microbiologia na identificao de microrganismos.

Objectivos: Avaliao de actividades enzimticas em alguns microrganismos. Apresentao de alguns testes bioqumicos usados na deteco e ou identificao de alguns microrganismos

1- Hidrlise de polmeros Amilases Proteases 2- Reaces de fermentao Fermentao de acares Produo de sulfetos Reaces ImVic 3- Reaces respiratrias Catalase Citocromo oxidase 4- Outras reaces Urease

1- Pesquisa de amilase Alguns microrganismos hidrolizam molculas orgnicas de elevado peso molecular, como por exemplo o amido, utilizando os seus componentes (glucose e maltose) nos diversos processos metablicos. Ao juntar-se uma soluo de iodo a um meio de cultura com amido forma-se um complexo com cor azul se no tiver sido hidrolizado. Caso contrrio, no h reaco com o iodo.

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Material necessrio -Culturas de Escherichia coli e Bacillus subtilis -Soluo de iodo -Placas de Petri com meio de agar de amido

Procedimento Inverter uma placa de Petri e dividi-la em duas seces com um marcador. Semear uma das seces com E. Coli e a outra com Bacillus subtilis; Identificar as seces; Incubar as placas a 37C durante 24 a 48 horas;

Resultados: Aps o aparecimento das colnias, colocar algumas gotas de soluo de iodo e verificar o aparecimento ou no da cor azul.

2- Fermentao de acares simples Os principais critrios fisiolgicos de identificao de microrganismos assentam na fermentao e na assimilao de fontes de carbono. A fermentao de acares simples avaliada em tubos com meio de cultura lquido, aos quais se adiciona o acar a testar. Para verificar a produo de gs introduzido (antes da esterilizao), um tubo Durham invertido. A produo de cidos confirmada pela alterao da cor do indicador.

Material necessrio -Culturas de Escherichia coli e Proteus vulgaris; -Tubos de Caldo com vermelho de fenol e glucose (Com tubos Durham); -Tubos de Caldo com vermelho de fenol e lactose (Com tubos Durham); -Tubos de Caldo com vermelho de fenol e sacarose (Com tubos Durham);

Procedimento Inocular separadamente cada uma das culturas nos tubos com os diferentes meios; Identificar cada um dos tubos com a espcie inoculada e com acar adicionado; Incubar as placas a 37C durante 24 horas;

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Resultados: Tomar nota das reaces obtidas no quadro com base nos seguintes smbolos: A- produo de cido; B- alcalinizao do meio G- produo de gs N- sem modificao de cor do indicador

Espcie Glucose

Modo de utilizao dos acares Lactose Sacarose

3- Reaces respiratrias Pesquisa de Catalase Este teste bioqumico utilizado para comprovar a presena de catalase, enzima que destri o perxido de hidrognio, originando H2O e O2. A maioria dos seres vivos possui catalase.

Material necessrio -Lminas; -Culturas de Bacillus sp; -Culturas de Lactobacillus sp.; -gua oxigenada (3%);

Procedimento: Colocar numa lmina uma poro de cultura; Adicionar uma gota de gua oxigenada a 3%;

Resultados: Verificar se h ou no desprendimento gasoso; Tomar nota dos resultados obtidos em cada uma das espcies.

Pesquisa do Citocromo oxidase A citocromo oxidase uma enzima que transfere electres para o O2 no final da cadeia de transporte de electres. A deteco desta enzima particularmente til para fazer a distino entre algumas espcies Gram negativo. Pseudomonas aeruginosa de Escherichia coli, por exemplo.

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A presena de citocromo oxidase detectada pela oxidao de um receptor artificial de electres (p-fenilenodiamina).

Material necessrio -Cultura microbiana a testar -Papel de filtro -Tetrametil-parafenildiamina.HCl (1% W/V em gua).

Procedimento Misturar a cultura em estudo com uma soluo de tetrametil-parafenildiamina.HCl numa folha de papel de filtro. Resultados: Verificar a alterao da cor. Este indicador incolor na forma reduzida e adquire uma cor prpura na forma oxidada (resultado positivo)

4- Pesquisa de outras enzimas Pesquisa de Urease Alguns microrganismos utilizam a ureia como fonte de azoto. A sua hidrlise origina duas molculas de amnia e a libertao de uma molcula de CO2. A enzima detectada pela modificao da cor do indicador provocada pelo aumento de pH (vermelho de fenol, a pH 6,4 tem cor amarela e a pH 8,2 tem cor violcea).

Material necessrio -Culturas de Proteus vulgaris e Escherichia coli; -Tubos com Agar de ureia;

Procedimento Inocular um tubo com ureia agar com Proteus vulgaris e outro com Escherichia coli ; Incubar a 37 C durante 24 horas. Resultados: Verificar a alterao da cor do meio e preencher o quadro: Espcie Cor inicial do meio Cor final do meio Urease

Considera-se reaco positiva o aparecimento de uma cor rosa forte.

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Trabalho prtico 9 Avaliao da contaminao fecal de guas A pesquisa peridica de microrganismos fecais numa rede de abastecimento de guas essencial para se verificar a pureza da gua. Escherichia coli um bom indicador da contaminao fecal fcil de identificar, hospedeiro habitual do intestino e no aparece normalmente na gua.

Escherichia coli pertence ao grupo dos coliformes que se apresentam como bacilos noesporulados, Gram negativo, anerbios facultativos que fermentam a lactose com produo de gs.

Objectivos: Pesquisa de coliformes em guas e determinao do NMP de coliformes Pesquisa de Escherichia coli

Material necessrio: -Tubos com caldo de lactose -Placas com Agar Endo -Tubos com caldo MR-VP -Tubos com gua peptonada -Tubos com Agar de Citrato-Simmons -Filtros de 0,45

1- Pesquisa de Coliformes: 1.1 Teste presuntivo: pesquisa de fermentadores de lactose

Procedimento Pipetar 1 ml da amostra de gua para cada um dos tubos com caldo de lactose, com tubo Durham invertido. Incubar a 35 C durante 24 a 48 horas.

Resultados: Observao dos tubos ao fim de 24 a 48 horas. A presena de gs em pelo menos 1/4 do tubo Durham indicativa da presena de coliformes. Neste caso fazer a determinao do NMP de coliformes por 100 ml de gua com base nas tabelas de MacGrady.

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1.2 Pesquisa de Escherichia coli (membrana filtrante) Procedimento Filtrar 100 ml da amostra de gua para placas de Agar Endo; Incubar a 44 C durante 24 a 48 horas.

Resultados: O aparecimento de colnias carmim indicativo da presena de Escherichia coli. Devero ser efectuados os testes IMViC.

2- Teste de confirmao de fermentadores de lactose

Procedimento Semear 0,1 ml dos tubos positivos para placas com Agar Endo; Incubar a 35 C durante 24 horas;

Resultados: O aparecimento de colnias carmim indicativo da presena de coliformes no ficando estabelecido contudo que seja Escherichia coli. Poder ser Enterobacter aerogenes.

3- Testes IMViC A distino entre as duas espcies, Escherichia coli e Enterobacter aerogenes pode ser feita efectuando um conjunto de testes designados por IMViC: o I de Indol, o M de Methyl-red, o V de Voges-Proskauer e o C de Citrato.

Espcies

Indol + -

Methyl-red + -

Voges-proskauer +

Citrato +

Escherichia coli E. aerogenes

3.1- Pesquisa da formao de indol a partir do triptofano Num meio de cultura contendo triptofano, algumas bactrias com triptofanase produzem indol. O indol detectado pelo reagente de Kovacks. Este teste permite distinguir Escherichia coli, que tem reaco positiva, de Enterobacter que tem reaco negativa.

Procedimento Pipetar 0, 1 ml da amostra de gua para um tubo com gua peptonada;

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Incubar a 30 C durante 48 horas;

Resultados: A reaco positiva quando aparece um anel vermelho superfcie resultante da reaco do p-dimetil-aminobenzaldedo (reagente de Kovacs) com o indol; a reaco negativa quando aps a adio do reagente o anel se mantm amarelo/alaranjado.

3.2- Formao de cidos por fermentao da glucose Num meio de cultura contendo glucose, as Enterobacteriaceae produzem cidos a partir do piruvato, cido actico, frmico, lctico e etanol (fermentao cido-mista), o que vai provocar uma acidificao do meio. A fermentao da glucose com produo de cidos provoca a reduo de pH e a alterao da cor do indicador de vermelho de metilo (MR - Methyl red).

Procedimento Pipetar 0,1 ml de amostra de gua para um tubo com caldo MR-VP; Incubar a 37C durante 5 dias.

Resultados: Confirmar o crescimento no meio de cultura. Adicionar ao meio inoculado, algumas gotas de vermelho de metilo. Se houver produo de cidos, h um abaixamento de pH para valores inferiores a 4,4. Quando se adiciona o indicador de pH (vermelho de metilo), a pH 4,4 fica vermelho e a pH 6,2 amarelo.

3.3- Fermentao da glucose e produo de acetona a partir do piruvato (Teste Voges Proskauer) No mesmo meio de cultura contendo glucose, algumas espcies de Enterobacteriaceae produzem a partir do piruvato, para alm dos cidos referidos anteriormente, outros metabolitos como a acetona. Se existir acetona no meio, a adio de -naftol e hidrxido de potssio (10%), tornam o meio avermelhado - teste Voges Proskauer (VP) positivo.

Procedimento Pipetar 0,1 ml da amostra de gua para um tubo com caldo MR-VP Incubar a 37 C durante 5 dias.

Resultados: Confirmar o crescimento no meio. Adicionar ao meio, -naftol a 6% e hidrxido de potssio (40%). Misturar bem. Se existir acetona no meio, a adio de -naftol e hidrxido de potssio,

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tornam o meio avermelhado (reaco positiva). Se o meio de cultura mantiver a cor original a reaco negativa.

3.4- Utilizao do citrato como fonte de carbono e energia O meio de Citrato-Simmons contm citrato e azul de bromotimol como indicador de pH. Nas

Enterobacteriaeceae o desprendimento de CO2, reagindo com os caties Na+ existentes no meio,


vai provocar um aumento do pH visvel pela modificao da cor do indicador.

Procedimento Repicar a amostra para placa com Agar de Citrato-Simmons; Incubar a 37 C durante 5 dias;

Resultados: A utilizao de citrato provoca uma alcalinizao do meio que detectada pela modificao da cor do indicador (azul de bromotimol). Verificar se houve ou no modificao da cor do meio (verde para azul).

Escherichia coli - reaco negativa; Enterobacter, Salmonella - reaco positiva


Notas: A identificao de Enterobacteriaceae pode ser efectuada atravs de galerias API 20E que uma verso miniaturizada dos testes convencionais. Este sistema utiliza uma estrutura plstica com 20 compartimentos separados que consistem em micro tubos contendo meios desidratados. A inoculao efectuada por introduo da suspenso do organismo nos microtubos com uma pipeta de Pasteur. Para se obter anaerobiose colocam-se algumas gotas de leo mineral em cada um dos tubos. Aps 18 a 24 horas registam-se os resultados positivos, obtm-se um nmero com 7 a 9 dgitos a partir do qual, atravs de um programa informtico, se determina o nome do microrganismo em causa.

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Trabalho prtico 10
Avaliao da eficcia a antibacterianos: antibiticos

Os antibiticos so compostos qumicos que podem ser administrados em doses sub-teraputicas ou de forma teraputica em Medicina Humana e Animal. Uma vez que a clula bacteriana uma clula procariota, os antibiticos usados na teraputica devem explorar as diferenas bioqumicas entre as clulas bacterianas e as clulas hospedeiras. Os antimicrobianos so um grupo bastante heterogneo, existindo antibiticos que actuam na parede celular e outros durante a sntese proteica, provocando a lise das clulas e, portanto, matando as bactrias (efeito bactericida) ou inibindo a sua multiplicao (efeito bacteriosttico).

Objectivos: Determinar o fentipo a diferentes grupos de antibiticos Analisar o perfil de susceptibilidade segundo as normas do CLSI

Material necessrio: - Zaragatoas - Pinas estreis - Ansas - Rgua - Discos de antibiticos (Oxoid) - Meio de Cultura (Muller-Hinton agar) - Soro fisiolgico - Para testar a eficcia aos antibiticos sero utilizadas trs espcies bacterianas (E. coli,

Pseudomonas spp. - Gram-negativo e Enterococcus faecalis - Gram-positivo).


Procedimento Tcnica de Kirby-Bauer Preparar uma suspenso bacteriana de cada uma das espcies em estudo, a partir de 3 4 colnias em soro fisiolgico estril (A suspenso deve ter uma turvao equivalente a 0,5 da escala de
MacFarland)

Mergulhar uma zaragatoa na suspenso bacteriana retirando o excesso; Semear placas de agar Mueller-Hinton; Aplicar os discos dos antibiticos a testar (utilizar o dispenser como se representa na Figura) sobre a superfcie do meio de cultura, aps a secagem do inculo; Incubar a 37 C, durante 24 horas.

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Resultados: Com uma rgua ou craveira medir os dimetros dos halos de inibio para cada antibitico. Classificar de acordo com as normas do CLSI, 2006 (ex: NCCLS National Committee for Clinical

Laboratory Standards). Assim, a medida do halo de inibio ser comparada com os valores da
tabela, onde a bactria classificada, nas categorias de sensvel (S), intermdia (I) ou resistente (R).

Figura 11 Representao da aplicao de discos de antibiticos num meio de cultivo inoculado com uma estirpe em anlise ( esquerda). Resultados obtidos aps crescimento bacteriano ( direita).

Avaliao da susceptibilidade a antibiticos


Amostra A (Gram -)_________________________________________________________

Antibitico

Dimetro do halo

Classificao

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Amostra B (Gram -)_________________________________________________________

Antibitico

Dimetro do halo

Classificao

Amostra (Gram +)____________________________________________________________

Antibitico

Dimetro do halo

Classificao

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Trabalho prtico 11 Simbiose de microrganismos com plantas A disponibilidade de azoto no solo o maior factor limitante na Agricultura, apesar da atmosfera ser constituda por 80% de azoto. A molcula de azoto quimicamente muito estvel e apenas alguns procariotas tm capacidade de a reduzir a uma forma biologicamente assimilvel. A associao Rhizobium x leguminosa o mais eficiente sistema de fixao de azoto atmosfrico. As espcies do gnero Rhizobium so bactrias do solo capazes de provocarem o aparecimento de rgos especializados nas razes das plantas, os ndulos, nos quais ocorre a reduo do azoto (Figura 12). As espcies do gnero Rhizobium apresentam a forma de bacilos curtos, isolados ou aos pares, no esporulados, Gram negativo, mveis por flagelos polares ou peritriquiais, apresentando grnulos de poli--hidroxibutirato nas culturas mais envelhecidas. No interior do ndulo as clulas apresentam formas diversificadas designando-se por bacterides.

Mecanismo de infeco e formao do ndulo

Legohemoglobina no ndulo

Figura 12 Mecanismo de formao do ndulo nas leguminosas

Objectivos: Observao da nodulao em diferentes leguminosas. Observao dos bacterides. Isolamento de Rhizobium a partir dos ndulos.

Material necessrio -Microscpio -Lminas e lamelas -Caixas de Petri esterilizadas -Ansa, Pina e tesoura -lcool a 70%

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-gua esterilizada distribuda em tubos com 20ml -Soluo de lixvia a 1% -Placas com Agar de Manitol-levedura

1- Observao da nodulao em diferentes leguminosas Identificar as plantas; Cortar a parte area da planta; Lavar o sistema radicular em gua corrente; Colocar sobre uma folha de papel; Observar e tomar nota:

Plantas

Forma dos Ndulos

Disposio ao longo do sistema radicular

Constituio interna

Observaes

2- Observao dos bacterides Cortar com uma tesoura vrias seces da raiz de 1cm que contenham ndulos saudveis (rosa); Mergulhar as seces dentro de uma caixa de Petri com lixvia a 1%, durante 15 min.; Retirar as seces da soluo e mergulhar em 20 ml de etanol a 70% durante 1 min.; Retirar as seces do etanol e mergulhar em 20 ml de gua estril durante 1 min.; Repetir as lavagens com gua estril pelo menos 3 vezes; Transferir um dos ndulos para uma caixa de Petri estril e esmagar com uma vareta de vidro; Observar o suco extrado ao microscpio; Semear por riscado superfcie de uma placa de Petri com meio de Manitol levedura; Incubar as placa de Petri a 25C durante 3 a 5 dias.

Resultados: Tomar nota e desenhar as formas das clulas observadas ao microscpio directamente do ndulo; Registar as caractersticas das colnias formadas no meio de manitol levedura simples e com adio dos indicadores - vermelho do Congo e azul de Bromotimol; Retirar uma poro de uma colnia para uma lmina e misturar com uma gota de gua estril;

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Fazer o esfregao e proceder colorao de Gram; Observar as preparaes ao microscpio; Registar a morfologia celular e a reaco colorao;

BIBLIOGRAFIA Benson, H. 1994. Microbiological applications. 6th ed. WCB Publishers, Dubuque, IA 52001. Martinko, J. Madigan, M. 2006. Brock Biology of microorganisms. 11th edition. Prentice-Hall Inc., New Jersey. Canas-Ferreira, W. e J.C.F. de Sousa, 1998. microbiologia. Vol 1. Lidel Editora, Lisboa. Schelegel, H. 1993. General Microbiology. 7th ed. Cambridge University Press, Cambridge Stanier, R., E. Adelberg,J. Ingraham e M. Wheelis 1979. Introduction to the microbial world. Prentice-Hall Inc., New Jersey. Wheelis, M. e W.Segel 1979. Introduction to the microbial world Laboratory manual. PrenticeHall Inc., New Jersey.

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ANEXO 1 - Meios de cultura Meio de agar nutritivo: Extracto de carne ..................................... Peptona ................................................... Agar ........................................................ gua destilada ....................................... 3g 5g 15 g 1000 ml

Acertar a pH 6,8-7,0. Esterilizar a 121C durante 15 minutos

Caldo nutritivo: Extracto de carne ..................................... Peptona ................................................... gua destilada ....................................... 3g 5g 1000 ml

Acertar a pH final 6,8-7,0. Distribuir em tubos. Esterilizar a 121C durante 15 minutos

Agar de dextrose Sabouraud Peptona ................................................... Dextrose .................................................. Agar ........................................................ gua destilada ..................................... 10 g 40 g 15 g 1000 ml

Acertar a pH 5,6. Esterilizar a 121C durante 15 minutos.

Y Malte Agar Extracto de malte ..................................... Extracto de levedura ................................. Peptona ................................................... Glucose ................................................... Agar ......................................................... gua destilada ....................................... 3g 3g 5g 10 g 20 g 1000 ml

Acertar a pH 5,0. Esterilizar a 121C durante 15 minutos.

Y Malte Caldo Extracto de malte ..................................... Extracto de levedura ................................. Peptona ................................................... Glucose ................................................... gua destilada ..................................... 3g 3g 5g 10 g 1000 ml

Acertar a pH 5,0. Distribuir em tubos. Esterilizar a 121C durante 15 minutos.

Agar de amido Extracto de carne ..................................... Amido solvel ........................................... 3g 10 g

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Agar ........................................................ gua destilada ..................................... 15 g 1000 ml

Acertar a pH 7,0. Esterilizar a 121C durante 15 minutos.

Caldo com vermelho de fenol meio base Peptona ................................................... Extracto de carne ..................................... Cloreto de sdio ....................................... Vermelho de fenol ..................................... gua destilada ..................................... 10 g 1g 5g 0,018 g 1000 ml

Acertar a pH 7,2. Distribuir em tubos. Esterilizar a 121C durante 15 minutos. Nota: para avaliar a fermentao de acares adicionar, separadamente, 5 g/l de glucose, lactose ou sacarose.

Agar de ureia Peptona ................................................... Dextrose ................................................... Cloreto de sdio ....................................... Fosfato de potssio .................................... Ureia ....................................................... Vermelho de fenol ..................................... gua destilada ..................................... 1g 1g 5g 2g 20g 0,012 g 100 ml

Acertar a pH 6,8. Esterilizar a mistura por filtrao (A). Esterilizar a mistura de 15 g de agar com 900 ml de gua a 121C durante 15 minutos (B). Deixar arrefecer B e adicionar os 100 ml de Distribuir em tubos e inclinar.

Caldo de lactose Extracto de carne ...................................... Peptona .................................................... D-lactose ................................................. gua destilada ..................................... 3g 5g 5g 1000 ml

Acertar a pH 6,9. Distribuir em tubos. Esterilizar a 121C durante 15 minutos.

gua peptonada Peptona .................................................... Cloreto de sdio ....................................... gua destilada ..................................... 10 g 5g 1000 ml

Acertar a pH 7,2. Distribuir em tubos. Esterilizar a 121C durante 15 minutos. Nota: Para pesquisar a fermentao de acares adicionar 1,8 ml de vermelho de fenol.

Agar Endo Peptona ................................................... 10 g

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D-lactose .................................................. Sulfito de sdio ........................................ Fosfato de potssio .................................... Agar ........................................................ Fucsina bsica ........................................... gua destilada ..................................... 10 g 2,5 g 3,5 g 15 g 0,5 g 1000 ml

Acertar a pH 7,5. Esterilizar a 121C durante 15 minutos.

Agar de Citrato- Simmons Sulfato de magnsio .................................. Cloreto de sdio ........................................ Fosfato de amnio .................................... Fosfato de potssio .................................... Citrato de sdio ......................................... Agar ........................................................ gua destilada ..................................... 0,2 g 5g 1g 1g 2g 15 g 1000 ml

Acertar a pH 6,8-7,0. Esterilizar a 121C durante 15 minutos.

Caldo MR-VP Peptona .................................................... Fosfato de potssio .................................... Dextrose ................................................... gua destilada ..................................... 7g 5g 5g 1000 ml

Acertar a pH 6,8-7,0. Distribuir em tubos. Esterilizar a 121C durante 15 minutos.

Agar de Manitol-levedura Fosfato de potssio .................................... Sulfato de magnsio .................................. Cloreto de sdio ........................................ Manitol ..................................................... Extracto de levedura ................................. Agar ........................................................ gua destilada ..................................... 0,5 g 0,2 g 0,1 g 10 g 0,4 g 15 g 1000 ml

Acertar a pH 6,8-7,0. Esterilizar a 121C durante 15 minutos. Nota: Podero ser adicionados, separadamente, os seguintes corantes: Vermelho do Congo (1%) ou Azul de Bromotimol (0,5%).

Meio de LB (Luria-Bertani Medium) Triptona Extracto de levedura NaCl gua destilada

10 g 5g 10 g 1000 ml

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Agitar at completa dissoluo. Ajustar o pH a 7,0 com 5N NaOH (~0.2ml). Esterilizar em autoclave durante 15 minutos a 121C. Meio de LBss (Luria-Bertani semi-slido) Triptona 10 g Extracto de levedura 5g NaCl 10 g Agar 7g gua destilada 1000 ml LBss = LB + 0.7% Agar Meio de LBs (Luria-Bertani slido) Triptona Extracto de levedura NaCl Agar gua destilada LBs = LB + 1.5% Agar

10 g 5g 10 g 15 g 1000 ml

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ANEXO 2 Corantes e solues Soluo de azul de metileno azul de metileno ....................................... lcool etlico a 95 % ............................... Hidrxido de potssio 1% ........................ 0,3 30 ml 1 ml

Soluo de Cristal de violeta Cristal de violeta ....................................... gua destilada ....................................... 0,5 g perfazer a 100 ml

Soluto de Lugol Cristais de iodo ......................................... Iodeto de potssio .................................... gua destilada ....................................... 1,0 g 2,0 g 300 ml

Soluo de Safranina Safranina .................................................. lcool etlico a 95% ........................... 2,5 g 10 ml

Dissolver a safranina em etanol. Perfazer a 100ml em gua destilada.

Soluo de Fucsina Fucsina bsica ........................................... Etanol ..................................................... Fenol 5% (soluo aquosa) ..................... 1g 10 ml 100 ml

Distribuir em frascos e esterilizar a 121C durante 15 minutos.

Soluo de Nigrosina Nigrosina ................................................. 10 g

gua destilada .................................. perfazer a 100 ml Filtrar.

Soluo de verde malaquite Verde malaquite ....................................... 5g

gua destilada .................................. perfazer a 100 ml Filtrar.

Soluo de iodo Cloreto de sdio ....................................... Cloreto de clcio ....................................... Cloreto de potssio .................................... Bicarbonato de sdio ................................ 2,25 g 0,12 g 0,105 g 0,05 g

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gua destilada ....................................... perfazer a 1 L

Soluo de tetrametil-parafenildiamina.HCl Tetrametil-parafenildiamina.HCl ............. gua destilada ....................................... 0,1 g at 10 ml

Soluo de vermelho de metilo Vermelho de metilo ................................... etanol ....................................................... gua destilada ....................................... 0,1 g 300 ml 200ml

Reagente de Kovacs lcool amlico .......................................... p- dimetil-aminobenzaldedo ....................... cido clordrico ....................................... 150 ml 10 g 50 ml

Dissolver o aldedo no lcool, a 60 C, deixar arrefecer e adicionar o cido gota a gota. Guardar no frigorfico.

Soluo de -Naftol -Naftol .................................................... 5 ml

lcool etlico a 95% ........................... perfazer a 100 ml

Soluo salina de Ringer Cloreto de sdio ....................................... Cloreto de clcio ....................................... Cloreto de potssio .................................... Bicarbonato de sdio ................................ gua destilada ....................................... 2,25 g 0,12 g 0,105 g 0,05 g perfazer a 1 L

Distribuir em frascos e esterilizar a 121C durante 15 minutos.

Soluo de lactofenol-azul de algodo lactofenol cido lctico ............................................. fenol ....................................................... glicerol ..................................................... gua destilada ....................................... 100 ml 100 g 100 ml 100 ml

Dissolver o fenol em gua, sem aquecer. Adicionar depois o cido lctico e o glicerol.

azul de algodo sol. Saturada de azul de algodo ................ glicerol ..................................................... gua destilada ....................................... 10 ml 10 ml 80 ml

Misturar em partes iguais o lactofenol e o azul de algodo.

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Corantes (Colorao de Gram variante de Chan) A - Soluo de cristal de violeta Cristal de violeta ........................................... 10 g Oxalato de amnio ......................................... 4g

Etanol ........................................................... 100 ml gua destilada ............................................... 400 ml

B - Soluo de iodo Iodo ............................................................ 1 g Iodeto de potssio ........................................ 2 g Etanol .......................................................... 25 ml gua destilada .............................................. 100 ml

C - lcool iodado Soluo de iodo ............................................ 5 ml Etanol .......................................................... 95 ml

D - Safranina 2,5% de safranina em lcool .......................... 10 ml gua destilada .............................................. 100 ml

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