FUNDAMENTOS EN PSICOBIOLOGA.

Prcticas

Curso 2013-2014 Sara Uceda Gutirrez Laboratorio de Psicobiologa Universidad de Sevilla

Bibliografa Recomendada
Rodrguez, F. et al (2006). Fundamentos de Neurociencia. Manual de Laboratorio. McGraw-Hill.

Temario de Prcticas
Bloque I
Uso del microscopio. Tcnicas Neurohistolgicas. Tipos celulares. Microestructura de la corteza del cerebelo.

Prctica 1.

USO DEL MICROSCOPIO TCNICAS NEUROHISTOLGICAS

Curso 2012-2013

Sara Uceda Gutirrez Laboratorio de Psicobiologa Universidad de Sevilla

USO DEL MICROSCOPIO PTICO

COMPONENTES
Elementos mecnicos Elementos pticos

Aunque ambas clases de elementos son importantes para el funcionamiento y rendimiento del microscopio, son los componentes pticos los que realmente definen su calidad.

 Los objetivos son sistemas de lentes convergentes dispuestas en el interior del tubo. Los objetivos modernos son parafocales. Diferentes clasificaciones:

Acromticos Apocromticos Secos De inmersin

Los oculares: Sistema de lentes, acopladas en la parte superior del tubo del microscopio, cuya funcin es formar una imagen virtual y amplificada de la imagen real creada por el objetivo.

La mayoria de los oculares son de x8 y x10 aumentos.

Fuente de iluminacin. Condensador y diafragma iris.

Haciendo uso del condensador es posible conseguir una iluminacin que se ajuste a la apertura numrica caracterstica de cada objetivo.

Plano del diafragma del condensador

Plano del diafragma de campo

Reglas para el manejo del MICROSCOPIO

1. 2. 3. 4. 5. Colocar el objetivo de menor aumento en posicin de empleo y bajar la platina completamente. Colocar la preparacin sobre la platina, sujetndola con las pinzas del portaobjetos. Centrar la muestra en el centro de la abertura de la platina (uso de los tornillos de desplazamiento del portaobjetos en el plano horizontal). Realizar el enfoque (tornillo macromtrico-micromtrico). Una vez enfocada la imagen, para explorar otras regiones hacer uso de los tornillos de desplazamiento horizontal.

FOTOMICROGRAFA Y DIBUJO A CMARA CLARA

Aunque la fotomicrografa permite reproducir con mayor exactitud las preparaciones, el dibujo ofrece la posibilidad de representar estructuras tridimensionales mediante enfoques sucesivos.

TCNICAS NEUROHISTOLGICAS

PASOS A SEGUIR en la preparacin del tejido nervioso para su observacin al microscopio:

I. Endurecimiento y conservacin de la pieza mediante el empleo de soluciones fijadoras. II. Corte de la misma en secciones seriadas. III. Tincin.

FIJACIN del tejido nervioso

Sustancias fijadoras: formaldehdo, alcohol, acetona, dicromato potsico, cido smico y dicloruro de sodio. Dos procedimientos diferentes: Inmersin Perfusin transcardaca

Inmersin directa

Perfusin transcardaca

La perfusin transcardaca es la tcnica de fijacin ms eficaz porque proporciona un tejido limpio de clulas sanguneas.

La utilizacin de las vas del sistema circulatorio para la difusin del reactivo permite una fijacin homognea e in situ de todo el tejido nervioso, que reduce el riesgo de deformaciones y facilita la extraccin del cerebro.

PROCEDIMIENTO DE CORTE DEL TEJIDO NERVIOSO I: Microtomo de parafina

Una de sus ventajas es que permite obtener secciones de tejido nervioso muy finas, de hasta 4 micras de grosor. El tejido debe ser previamente deshidratado (parafina: sustancia hidrfoba)

Procesado y corte de tejido

II

III

La calidad de las secciones depende en gran medida del ngulo de incidencia de la cuchilla.

A menor ngulo, menor compresin sufren las secciones y por tanto, MAYOR CALIDAD de las mismas.

La gelatina (diluda en agua caliente) facilita la adherencia de los cortes a la superficie del portaobjetos.

II

III

PROCEDIMIENTO DE CORTE DEL TEJIDO NERVIOSO II: Microtomo de congelacin

El corte mediante este tipo de microtomo requiere la congelacin del tejido para que adquiera la consistencia necesaria y pueda ser seccionado en lminas finas mediante una cuchilla.

Ventajas vs Inconvenientes

V: Este tipo de aparato es muy til para obtener secciones relativamente gruesas (20-200 micras)

I: Los requerimientos de ciertas tcnicas de tincin hacen imprescindible el empleo del microtomo de congelacin. P.e.: tincin inmunohistoqumica.

Detalles del procedimiento de seccin y recogida de un corte desde la superficie de la cuchilla

II

III

IV

TIPOS DE TINCIONES

Cul es el objetivo bsico de todas las tcnicas de tincin? Qu tipos existen? de tinciones

Qu objetivo especfico poseen cada una de ellas? Utilidades

PROCEDIMIENTO de TINCIN
Tras la seccin del tejido nervioso y una vez montados los cortes en el portaobjetos, puede procederse a la tincin de las muestras. La deshidratacin del tejido incrementa la transparencia de la preparacin y contribuye a su conservacin.

II

III

TINCIN DE NISSL

Tincin de los somas de todas las neuronas de la muestra del tejido.

Colorantes empleados: violeta

de cresilo, rojo neutro o azul de toluidina. Se obtienen preparaciones que ofrecen panormica general de la distribucin de las neuronas y de su organizacin citoarquitectnica.

Fotomicrografas a diferentes aumentos de tejido nervioso realizados con la tincin de Nissl

20

40

100

100

TINCIN DE KLVER-BARRERA
Permite observar tanto los cuerpos neuronales como los axones mielinizados. Uso combinado de dos colorantes diferentes: azul luxol y rojo neutro. Proporciona una visin integrada de la distribucin y relacin entre la sustancia gris y la sustancia blanca del sistema nervioso.

Fotomicrografas a diferentes aumentos de tejido nervioso realizados con la tincin de Klver-Barrera

40

100

TINCIN DE GOLGI
Permite observar la imagen completa de las clulas del sistema nervioso. Base del mtodo de tincin: impregnacin con nitrato de plata. til para la caracterizacin morfolgica de los diferentes tipos celulares del SN, as como de los circuitos neurales. Tincin selectiva (bajo nmero de clulas). Variabilidad de los resultados.

10

FASES DE TCNICA DE GOLGI

1.

Fijacin tejido.

estructural

del

2. Mordentado, induracin, cromacin o fase preimpregnadora (dicromtico potsico). 3. Impregnacin con nitrato de plata. 4. Corte del tejido (previa encastracin en parafina).

Variantes del procedimiento general:

Golgi-colonier Golgi rpido Golgi-hidrato de cloral Triple impregnacin de Golgi

Aplicacin de la tcnicas de Golgi para la caracterizacin morfolgica de las clulas del Sistema Nervioso

11

MICROESTRUCTURA DEL SISTEMA NERVIOSO: TIPOS CELULARES

Curso 2012-2013

Sara Uceda Gutirrez Laboratorio de Psicobiologa

Tipos celulares en la CORTEZA CEREBRAL

Qu son las neuronas? Cmo las podemos clasificar? Qu es la gla?

Clasificaciones de tipos celulares

En base al NMERO DE PROCESOS que parten del soma:

PSEUDOUNIPOLAR

BIPOLAR

MULTIPOLAR

12

 En base a LA MORFOLOGA DEL SOMA Y ESTRUCTURA DEL ARBOL DENDRTICO: - C. Piramidales, estrelladas, fusiformes (corteza cerebral). - C. de Purkinje, de Golgi, de los granos, en cesta (cerebelo).

En base a CONEXIONES, su PAPEL y POSICIN en los circuitos nerviosos: - Neurona sensorial primaria. - Interneuronas. - Motoneuronas.

En base a LONGITUD DEL AXN

- Clulas tipos I de Golgi. - Clulas tipo II de Golgi.

CLULAS GLIALES La neurogla no interviene en el procesamiento y transmisin de la informacin en el sistema nervioso. Tipos: Astrocitos, oligodendrogla, clulas de Schwann o microgla.

La neurogla proporciona sostn estructural a las neuronas, as como los nutrientes necesarios.

13