B I O TEGN OLO GI A V E G ETAL PRACTICA 4: CULTIVO IN

VITRO DE HOJAS

CARDENAS HURTADO, ROSMERY

PRACTICA N 4 Cultivo in vitro de hojas

1. OBJETIVOS: o Micropropagacion, mejoramiento gentico, conservacin del germoplasma y la sanidad vegetal. o El objetico de estos cultivos ha sido el conocer hasta donde se llega en el desarrollo de dicho rgano en condiciones in vitro y que propiedades contribuyen a su desarrollo. 2. RESUMEN:
En el presente trabajo se estudi el desarrollo de organognesis indirecta en rosas (Phyllis Bide) para la obtencin de brotes. La metodologa utilizada durante este estudio consisti en tomar explantes de hoja de rosas, los cuales fueron desinfectados con una solucin etanol al 70% durante 30 segundos. Para la siembra se utiliz medio MS enriquecido c on 0,5 M de ANA, 10M de BAP y 8 M de GA3. Despus de una semana de incubacin en luz natural y a temperatura ambiente se observ la presencia de contaminacin fngica en uno de los frascos utilizados en este ensayo.

3. MARCO TEORICO: ORGANOGNESIS Es una tcnica de la biotecnologa vegetal que permite la formacin de tallos adventicios, yemas, y de races a partir de explantes directamente (hojas, tallos y flores, etc.), cultivo de callos, de meristemos o de clulas en suspensin. Estos rganos inducidos a partir de una clula o de un grupo de clulas que segn la condiciones de cultivo, tienen la propiedad de mantenerse en activa divisin (Jarret, 1993, citado por Roca, 1993).
Se da normalmente en dos fases, la produccin y crecimiento de tallos a partir de callo, hojas, cotiledones, hipoctilos, etc. y como segunda fase su posterior enraizamiento (Mansouri et al., 2006). Existen dos tipos de organognesis in vitro: directa e indirecta. La forma directa son sistemas mediante los cuales a partir de la siembra in vitro de diferentes explantes relativamente grandes y en condiciones adecuadas, puede inducirse la formacin de nuevos

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brotes, races o flores directamente de una parte de la planta, sin la formacin de callo (Polci y Friedrich, 2004). Segn Pati et al., (2005) , se ha realizado organognesis directa en cultivos de rosa en: Rosa persica_x xanthiana a partir de hojas y races en medio MS con BAP (Lloyd et al., 1988), Rosa hybrida cvs. Madelon, Only Love, Presto, Sonia, Tinekel, a partir de hojas y peciol os en un medio de induccin formulado con medio MS, TDZ, ANA, casena, Nitrato de Plata y sales hidrosolubles; y en un medio de regeneracin a base de MS, BAP, NAA y FeEDDAH (Dubois and de Vries, 1995). La forma indirecta en cambio es que a partir de la siembra de un explante in vitro se observa la proliferacin de clulas en forma desordenada y sin ninguna funcin predeterminada, se iniciar la produccin de callos o suspensiones celulares; esta diferenciacin de rganos, estar condicionada a la previa formacin de los meristemoides; este sistema es el ms utilizado y el que ms investigaciones ha tenido debido a su importancia en la micropropagacin clonal (Roca, 1993). Ventajas de la Organognesis La organognesis como sistema de propagacin de plantas presenta una serie de ventajas frente a otros sistemas (Lpez, 2003) entre las principales tenemos: Una enorme capacidad de multiplicacin aplicable industrialmente, permite obtener en un solo proceso estructuras completas con pice y raz, que pueden ser almacenadas y encapsuladas perfectamente con las condiciones ambientales requeridas y la calidad y sanidad deseables. Permite desviarse de los procesos sexuales norm ales y producir posteriormente una poblacin de plantas con las caractersticas de la planta original de la cual derivaba el explante primario, y proporciona informacin para una mejora de plantas en lo relacionado al saneamiento de enfermedades, conservac in de germoplasma y seleccin de especmenes transformados Fases de la Regeneracin u Organognesis La regeneracin es un proceso que comprende diferentes fases, de acuerdo con de Klerk et al., (1997) denominaron a estas diferentes fases como fase de ad quisicin de la competencia, fase de induccin y fase de realizacin (Polci y Friedrich, 2004). En la primera fase las clulas no responden al estmulo organognico pero adquieren esa competencia durante una fase de desdiferenciacin. En la segunda fase l lamada fase de induccin, las clulas son receptivas al estmul o morfognico y hay una relacin directa entre el tipo, concentracin y combinacin de reguladores del crecimiento agregados al medio de cultivo y el rgano a desarrollar, y por ltimo la fase de realizacin, la clula sufre sucesivas divisiones para formar el rgano determinado (Polci y Friedrich, 2004).

Factores que Afectan la Organognesis Los factores que afectan la organognesis son: los tipos de explante, el medio de cultivo, los regulad ores de crecimiento, entre otros factores tanto fsicos como qumicos. Explante Virtualmente todas las partes de la planta se han utilizado como explantes para la iniciacin de callo, no obstante los tejidos juveniles poseen un alto grado de actividad m eristemtica.

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Los explantes que se han utilizado exitosamente son ramas en floracin, pednculos florales, embriones inmaduros, meristemas, epicotil os, yemas florales, partes de rizomas, caquis, bulbos, hojas de conferas, tubrculos y races ( Jarret, 1993, citado por Roca, 1993). Puede haber variacin en los requerimientos de los reguladores de crecimiento para la organogensis segn el tipo de tejido usado como explante, as como tambin el tamao del explante, ya que los explantes grandes poseen un pot encial regenerador mayor. Adems el estado de la planta madre y la estacin durante la cual el explante es extrado tambin pueden afectar notablemente el potencial organognico (Jarret, 1993, citado por Roca, 1993). Medio de cultivo Los medios usados m s frecuentemente para promover la organognesis son los de Murashige et al., (1962), White (1963), Gamborg et al., (1968), Linsmaier et al., (1965), Schenk et al., (1972) y Heller (1953). Pero Murashige es el ms usado para cualquier tipo de planta (Linz, 1993, citado por Roca, 1993). La sacarosa es generalmente la fuente carbonada que se usa en los estudios de organognesis. Este elemento puede favorecer la formacin de yemas y de callos, como tambin cambiar la textura de los mismos (Linz, 1993, citado por Roca, 1993). Otros tipos de compuestos que pueden afectar la organognesis, son los fenoles sustituidos y los alcaloides. Lee et al., (1965) informaron que los fenoles monohidrxidos sustituidos en las posiciones 2 o 4 estimulan la formacin de yemas (Linz, 1993, citado por Roca, 1993).

V entajas de la O rganognesis La organognesis como sistema de propagacin de plantas presenta una serie de ventajas frente a otros sistemas (Lpez, 2003) entre las principales tenemos: Una enorme capacidad de multiplicacin aplicable industrialmente, permite obtener en un solo proceso estructuras completas con pice y raz, que pueden ser almacenadas y encapsuladas perfectamente con las condiciones ambientales requeridas y la calidad y sanidad deseables. Permit e desviarse de los procesos sexuales normales y producir posteriormente una poblacin de plantas con las caractersticas de la planta original de la cual derivaba el explante primario, y proporciona informacin para una mejora de plantas en lo relacionado al saneamiento de enfermedades, conservacin de germoplasma y seleccin de especmenes transformados

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4. METERIALES: i. Material vegetal: Hojas de ROSA (Phyllis Bide). ii.Medios de cultivo: Medio de Murashige y Skoog, a. suplementado con ANA 0,5 M BAP, 10M y GA3, 8 M. iii.Material de vidrio: a. Beakers, 250 mL. b. Matraz, 100 mL. c. Tubo de ensayo. iv. Insumos: Agua destilada estril. v.Reactivos: a. Etanol (70%). b. Hipoclorito de sodio (2.5%). vi. Instrumentos: a. Bistures. b. Mechero Bunsen. c. Pinzas.

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5. METODOLOGIA: 5.6. DES INFESTACIN DEL MATERIAL VEGETAL:

o Recolectar hojas jvenes y sanas. Lavar cuidadosamente el haz y el envs de las hojas con agua corriente o En un matraz, colocar el material vegetal en inmersin con etanol al 70% durante 30 segundos. o Eliminar por decantacin el etanol al 70%. o Colocar en inmersin con Hipoclorito de sodio al 2.5% por 3 min. o Antes de finalizar los 3 min, introducir el matraz con el material vegetal inmerso en el Hipoclorito de sodio en la cmara de flujo laminar. 4.3. AISLAMIENTO DE LOS EXPLANTES : o En la cmara de flujo laminar, decantar el Hipoclorito de sodio y proceder a realizar tres enjuagues con movimientos rotatorios utilizando agua destilada estril. Las pinzas y bistures se mantienen sumergidos en etanol al 70% hasta el momento de su uso, y se esterilizan conforme se van empleando, por medio de frecuentes inmersiones en alcohol, seguidas por flameo y enfriamiento. Despus de la esterilizacin y utilizando las pinzas colocar el explante sobre placas de vidrio estril o papel secante estril. Utilizando un bistur estril retirar el peciolo y todo el margen de la hoja, as como las superficies cortadas que han estado en contacto con leja. Eliminar la nervadura central y cortar la lmina en secciones de aproximadamente 1 cm2.

o o o

4.4. INOCULACIN DE LOS EXPLANTES: o o o o o Durante la inoculacin, el cuello del recipiente que contiene el medio slido debe ser flameado rpidamente. Las secciones de hojas se colocan ligeramente en el agar de manera que el envs se ponga en contacto con el medio de cultivo. Colocar cinco secciones de hoja por frasco de cultivo. Tapar el frasco con plastic wrap, sujetndolo con ligas a la boca del frasco. Reponer el papel secant e sobre el cual se trabaj y dejar los instrumentos inmersos en etanol al 70%.

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6. PROCEDIMIENTO: Limpieza con hipoclorito de sodio y etanol ya mencionado en las prcticas pasadas.

Desinfeccin de las plantas o material vegetal a usar.

Lavado con agua corriente. Y luego En un matraz colocar en inmersin con etanol 70% por 30 (segundos), luego decantar

En este paso se busca romper la tensin superficial.

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Aadir una solucin de hipoclorito de sodio 2,5 % (leja) por 3 minutos

Antes de finalizar los tres minutos hay que introducir el matraz en la cmara de flujo laminar

Enjuagar con agua destilada (tres veces a ms). luego decantar.

Realizar el corte a material vegetal seleccionado en este caso a las hojas de rosa

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Colocar los trozos de hojas en el medio (mushirague & skoog) y observar los resultados obtenidos.

7. RESULTADOS Y DISCUSIN: los callos obtenidos formados en el tratamiento realizado y en las diferentes epocas de evaluacion presentan color verde claro y una consistencia compacta, aparente desarrolados a partir de mesofilo del tejido foliar. Se formaron mayormente en el brote del explante aunque tambin se encontraron en la superficie del mismo, sobre nervaduras.

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Se observo la presencia de contaminacion microbiana, principalmente por hongos es una de las limitantes en el xito del establecimiento aseptico de los cultivos in vitro. La
presencia de microorganismos contaminantes ocurre principalmente cuando la planta donante crece directamente en el campo y est expuesta a plagas, enfermedades, polvo y otros agentes, sin ningn tipo de control ambiental.

8. CONCLUCIONES:
Se determin que la contaminacin fngica tuvo una incidencia del 25% en la induccin de organognesis directa utilizando explantes tomados de las hojas de rosas Los resultados obtenidos en este trabajo indican la necesidad de atender esta problemtica en el cultivo in vitro de plantas y de desarrollar estrategias para su control, como la utilizacin de muestras producidas en condiciones in vitro.

9. CUESTIONARIO: Enumera cinco especies vegetales micropropagadas por la tcnica de cultivo in vitro de hojas. I. II. III. IV. V. Girasol (Helianthus sp.) Tabaco (Nicotiana s.p) Helechos de canela (Osmunda cinnamonea) Hoja de violeta africana (Saintpaulia ionantha) Hojas de begonia

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Describe y comenta la importancia del proceso de obtencin de shikonina a partir del cultivo de clulas vegetales la shikonia es un pigmento que se extrae de las raices de Lithospermum erythorohyzon, la planta perenne nativa de Japon, China y el Suereste asiatico. Esta planta esta sufriendo una rapida disminucion de en su poblacion , ademas su rendimiento en shikonina depende de la distribucion geografica y del clima, lo que hace muy variable la disponibilidad de este pigmento. Aunque este no se puede sintetizar quimica, el proceso es economica inpracticable ya que se requiere de doce pasos y tiene un rendimiento de 0.7% . La de la shikonina por medio de cultivos celulares de L.erythrorhyzon es el mejor ejemplo que se puede dar sobre aplicabilidad de la tecnologia para la produccion y la sisntesis quimica del pigmento caracterizan el tipo de problemas que el cuntivo in vitro puede resolver, y por otro lado, la shikonia ya entro en la etapa de produccion a gran escala. La estrategia para la produccion de shikonina por celualas cultivadas in vitro consistio primero en el desarrollo de un sistema de cultivo de dos fases, una de rapido crecimiento celular y la otra de produccion de pigmento; las dos fases dieron dieron un incremento cuatro veces mayor que el obtenido en el sistemas de una sola fase. biosisntesis

10.BIBLIOGRAFIA: Alvarado, Y. 1998. Contaminacin microbiana en el cultivo in vitro de plantas. En: Prez Ponce, J.N. (Ed), Propagacin y Mejora Gentica de Plantas por Biotecnologa. Instituto de Biotecnologa de las Plantas. Santa Clara, Cap 5 pp 81 -104 Baker, P. Fossard, R. y Bourne, R. 1979. Progress towards clonal propagation of Eucalyptus species by tissue culture techniques. Bianchini, F. y Pantano, A. 1991. Tudo verde, Gua de plantas e flores. S ao Paulo: Mehloramentos. 135 p.

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