CV MB 042011

COMISIN DE CONTROL ANALTICO Y AMPLIACIN DE COBERTURA
GUIA PARA LA EVALUACIN DEL DESEMPEO DE MTODOS DE PRUEBA MICROBIOLGICOS.

Rev. No.: 0 FECHA: 2011-03-28 CLAVE: CCAYAC-P-062

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Exactitud relativa recuperacin:
Es la aproximacin entre un resultado de la prueba y el valor de referencia aceptado. Para el
propsito de esta gua, es la cantidad de microorganismo recuperado entre la cantidad de
microorganismo inoculado o nivel de fortificacin.

Fase estacionaria.- Es el intervalo de tiempo en donde la curva de crecimiento microbiana se
hace constante y antecede a la muerte microbiana. En esta etapa se puede conocer con cierta
seguridad y durante un lapso corto de tiempo la concentracin microbiana.

Fortificacin de la muestra. Inoculacin de una cantidad conocida del o los microorganismos de
prueba.

Incertidumbre de medida: Parmetro, asociado al resultado de una medicin, que caracteriza la
dispersin de los valores que podran ser razonablemente atribuidos al mesurando.

Intervalo de trabajo: Intervalo comprendido entre las concentraciones superior e inferior, en el
cual el analito puede cuantificarse con un nivel satisfactorio de repetibilidad y recuperacin.

Lmite de deteccin: Es el numero ms pequeo de microorganismos en una muestra que puede
ser detectado bajo las condiciones de anlisis. El limite microbiolgico de una prueba determina la
presencia o ausencia de microorganismos por ejemplo ausencia de Salmonella spp. en 25 g de
muestra.

Matriz: Es la muestra de alimento en la que potencialmente se encuentra el analito.

Mtodo Normalizado: Proceso de medicin robusto donde pequeas variaciones en el
procedimiento no deben producir de forma imprevista grandes variaciones en los resultados.
Mtodos internacionalmente aceptados y validados.

Nivel de fortificacin o tamao del inculo: Es la cantidad conocida de microorganismos
inoculados a una muestra.

Protocolo para la evaluacin del desempeo: Documento que describe los pasos a seguir
durante la evaluacin del desempeo de un mtodo analtico microbiolgico, cuyo fundamento se
encuentra descrito en el presente documento.

Resultado Aberrante: Corresponde a cualquier valor extremo que ocurra durante la ejecucin de
la prueba. En menos de 1% de las pruebas esos resultados pueden ocurrir aleatoriamente en
situaciones normales.

Evaluacin del desempeo: Es el proceso que realiza un laboratorio para demostrar que un
mtodo normalizado produce consistentemente resultados confiables en las condiciones
particulares del laboratorio. Confirmacin mediante la aportacin de evidencia objetiva de que un




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mtodo analtico validado internacionalmente cumple con su propsito en las condiciones
particulares del laboratorio donde se realiza el anlisis.

Repetibilidad: Es el grado de concordancia entre los resultados analticos individuales obtenidos
por la aplicacin de un mismo procedimiento analtico, a diferentes porciones de la misma matriz,
en las mismas condiciones de anlisis (analista, equipamientos, laboratorio) en intervalos cortos
de tiempo.

Reproducibilidad: Es el grado de concordancia entre los resultados analticos individuales
obtenidos por la aplicacin de un mismo procedimiento analtico, a diferentes porciones de la
misma matriz, realizadas bajo distintas condiciones de medicin (personal) y en diferentes
tiempos (o a intervalos de tiempos ms largos).

4 DOCUMENTOS APLICABLES

4.1 USP 32, <1223> Validation of Alternative Microbiological Methods.

4.2 USP 32, <1225> Validation of Compendial Procedures

4.3 USP 32, <1227> Validation of Microbiological Recovery from Pharmacopeical Articles

4.4 Dulce Toccheto S. Curso-terico-prctico Validacin de Mtodos Microbiolgicos bajo un
Sistema de Aseguramiento de la Calidad. Santa Cruz de la Sierra Bolivia. Proyecto TCC/
Bolivia-Mxico. 2007.

4.5 European Cooperation for Accreditation EA-04/10 Accreditation for Microbiological
laboratories. 2002.

4.6 G.A. Leotta, I. Chinen. Validacin de una tcnica de PCR mltiple para la deteccin de
Escherichia coli productor de toxina shiga. Revista Argentina de Microbiologa. Vol.37, No. 1
2005.

4.7 Gua de Validacin de Mtodos Analticos. Colegio Nacional de Qumicos Farmacuticos
Bilogos de Mxico, A.C. Edicin 2002.

4.8 ISO/IEC. 2003. International Standard ISO 16140:2003 (E). Microbiology of food and animal
feeding stuffs Protocol for the validation of alternative methods. First Edition.

4.9 ISO/TR 13843:2000 - Water Quality Guidance on Validation of Microbiological methods.
First Edition.




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4.10 ISO 17994:2004 Water QualityCriteria for Establishing Equivalence between Microbiological
methods. First Edition.

4.11 The Fitness for Purpose of Analytical Methods. A Laboratory Guide to Method Validation and
Related Topics. Eurachem Guide. 1998. Disponible en http://www.eurachem.org/guides/pdf/valid.pdf
(febrero 2011)

4.12 Philip Feldsine, Carlos Abeyta, Wallace H. Andrews. AOAC International Methods Committee
Guidelines for Validation of Qualitative and Quantitative Food Microbiological Official Methods
of Analysis. 2002. Disponible en http://www.aoac.org/vmeth/omamanual/Microbiology-Guidelines-
Appendix-X.pdf (febrero 2011)

5 DESCRIPCIN DE LA ACTIVIDAD.

5.1 Estrategia para la evaluacin del desempeo de los mtodos de prueba
microbiolgicos.

Para cada mtodo de prueba a evaluar se deber contar con protocolo para la evaluacin del
desempeo particular que describa el mtodo a evaluar, la estrategia particular de evaluacin,
los materiales y reactivos y las especificaciones.

Durante la ejecucin del protocolo de evaluacin se debern documentar las actividades y los
resultados.

Verificar que todos los materiales, medios y reactivos cumplen con los criterios de calidad
conforme se establece en el sistema de gestin de calidad y conforme a la NMX-EC-17025-
IMNC-2006. Antes de cada validacin deber comprobarse que el equipo utilizado, cumple con
el calendario de mantenimiento y/o calibracin de cada laboratorio.

Con base en el protocolo de evaluacin se deber verificar que se cuenta con todos los
materiales y reactivos, es conveniente contar con un cronograma de las actividades y los
analistas que participaran en la evaluacin del desempeo.

La preparacin del inculo debe ser realizada por un solo analista durante el desarrollo de la
evaluacin del desempeo del mtodo.

5.2 Seleccin y obtencin de la matriz.

Los criterios de seleccin de la matriz se debern describir en el protocolo para la evaluacin
del desempeo de cada mtodo, considerando los siguientes lineamientos:




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Se debern elegir las matrices representativas que tenga el alcance de la metodologa
a evaluar, una vez elegida, se deben hacer pruebas previas de ella para conocer su
microbiota. Se deber contar con cantidad suficiente de muestra para hacer todos los
anlisis. Las matrices elegidas y su justificacin deben mencionarse en el protocolo de
validacin.

Cuando el mtodo analtico a ser verificado se destina al anlisis de varios tipos de
alimentos, la matriz se escoge con base al cuadro de categoras que aparece en la ISO
16140, y ser aquella donde se esperan las mayores dificultades para la recuperacin
del microorganismo de prueba con respecto de las matrices ms analizadas en el
laboratorio.

5.3 Preparacin del inculo

5.3.1 Determinacin de la concentracin de la cuenta bacteriana en la Fase estacionaria.

Este procedimiento es general y adecuado para la mayora de los microorganismos de prueba,
pueden aplicarse variaciones en este, siempre que se obtengan inculos constantes.

Inocular una colonia tomada a partir de un cultivo puro del microorganismo de prueba en 9ml de
caldo BHI o cualquier otro caldo de enriquecimiento, incubar a 35C +/- 2C, por 22h a 24h,
(este tiempo puede ser diferente dependiendo de la experiencia en el laboratorio y el tipo de
microorganismo del que se trate) del cultivo transferir un mililitro a 90ml de BHI e incubar a
35C +/- 2C, por 22h a 24h, a partir del cultivo hacer diluciones decimales, de cada una de
ellas transferir por duplicado un mililitro a cajas de Petri y adicionar agar cuenta estndar,
incubar a 35C +/- 2C, por 18h a 24h, realizar el conteo en cada dilucin para conocer la
concentracin de microorganismos.

Registrar los resultados indicando la concentracin de microorganismos en cada dilucin. Estos
resultados servirn de referencia para la estimacin de la dilucin adecuada a utilizar durante la
fortificacin de las muestras en la evaluacin del desempeo del mtodo de prueba.

Antes de cada prueba deber repetirse la preparacin del inculo de forma idntica que en la
determinacin de concentracin de la cuenta bacteriana en la fase estacionaria y cada inculo
deber ser verificado por vaciado en placa utilizado al menos dos cajas.

Nota 1: Con la prueba previa de fase estacionaria se fija el tiempo de incubacin, volumen necesario que lleve la concentracin
microbiana, para fortificar cada una de las alcuotas de acuerdo al protocolo de evaluacin de desempeo del mtodo en
particular. Durante su manipulacin se recomienda sumergir el recipiente que contiene la FE en agua fra.
Nota 2: Cuando la matriz sea slida, fortificar las alcuotas. Si es lquida se puede fortificar la matriz completa o las alcuotas.




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5.4 Preparacin de muestras

Registrar la muestra con la siguiente informacin:
Fecha y hora de muestreo,
Tipo de muestra,
Procedencia lugar de muestreo,
Cantidad.

Homogeneizar perfectamente y separar la muestra que se utilizar para el anlisis. Si es
perecedera, el sobrante se debe guardar en refrigeracin. Se recomienda iniciar el anlisis
inmediatamente.

5.4.1 Fortificacin de la muestra.

En condiciones aspticas dividir la muestra cuantitativamente siguiendo el mtodo de prueba.
Inocular la muestra con una concentracin conocida del microorganismo de prueba.

5.5 MTODOS CUALITATIVOS.

5.5.1 Criterios de Aceptacin

Parmetro Criterio de aceptacin
Lmite de deteccin
Demostrar que el mtodo es capaz de recuperar
menos de 5 UFC por lo menos en el 80 % de las
repeticiones.
Repetibilidad
No ms del 20 % de las repeticiones con
resultados negativos al inocular menos de 5 UFC
Reproducibilidad
Inoculando menos de 5 UFC, 2 analistas obtienen
resultados negativos en no ms del 20 % cuando
realizan al menos 10 repeticiones cada uno.
Incertidumbre
Mencionar las fuentes de incertidumbre asociadas a
las mediciones.

5.5.2 Lmite de deteccin
Demostrar que el mtodo es capaz de recuperar menos de 5 UFC por lo menos en el 80 % de
las repeticiones.

Microorganismo de Prueba: Utilizar al menos aquellos microorganismos indicados como
control positivo en el mtodo de prueba, el tamao del inculo deber ser menor de 5 UFC.




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Matriz seleccionada: Verificar por sextuplicado la ausencia del microorganismo de prueba.

Repeticiones: 30 repeticiones.

Clculos:

Ejemplo:

Se desea validar el mtodo para aislamiento de un patgeno; para la determinacin del lmite
de deteccin deber prepararse un inculo de menos de 5 UFC del patgeno.

Al realizar la estimacin de la curva microbiana se determina que en la dilucin 10
-7
, se obtienen
150 UFC/mL. Antes de la prueba deber preparar un inculo fresco, y realizar diluciones
decimales hasta 10
-9
, a partir de esa dilucin transferir dos mililitros a cada una de las 30
porciones de muestra. En paralelo verificar el inculo, transfiriendo 1 mililitro de la suspensin a
6 cajas de Petri.

Para la verificacin del inculo, incubar en condiciones adecuadas y hacer los clculos para
determinar la cantidad de microorganismos inoculados a la muestra. La prueba es vlida si se
inoculan menos de 5 UFC.

Para las muestras inoculadas proceder como se indica en el mtodo de prueba. Registrar los
resultados de ausencia y presencia.

Ausencia. 5
Presencia 25

Entonces:
83.33% Lectura 100
30
25
Lectura = =

Conclusin:
Se cumple con el criterio de aceptacin

100
es repeticion de

No.
positivos de

No.
Lectura =




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5.5.3 Repetibilidad

Los resultados de mtodos cualitativos se registran comnmente como positivo negativo
presencia-ausencia por lo que la repetibilidad se calcula utilizando los datos obtenidos en la
prueba de limite de deteccin. El criterio de aceptacin es igual o menor al 20%.

Ejemplo:

Usando los datos del ejemplo de lmite de deteccin.

Supongamos que:
Ausencia 5
Presencia 25

Entonces:
Lectura =
5
30
100 Lectura =16.66%

Conclusin:
Se cumple con el criterio de aceptacin

5.5.4 Reproducibilidad
Inoculando menos de 5 UFC, 2 analistas obtienen resultados negativos menores o iguales al 20
% cuando realizan al menos 10 repeticiones cada uno.

Las repeticiones debern suceder en momentos diferentes.
Ejemplo:

Analista Uno
Ausencia: 1
Presencia: 9

Lectura =
1
10
100 Lectura =10%
Cumple el
criterio de
repetibilidad
Se cumple el
criterio de
reproducibilidad Analista Dos
Ausencia: 2
Presencia: 8
Lectura =
2
10
100 Lectura = 20%
Cumple el
criterio de
repetibilidad

5.5.5 Incertidumbre del mtodo Microbiolgico (Eurachem:2002)

El concepto de incertidumbre no puede ser aplicado directamente a resultados cualitativos en
pruebas microbiolgicas por lo que solo se mencionan las siguientes:




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Fuentes de Incertidumbre
Distribucin de los microorganismos en la muestra;
Efecto de la matriz;
Personal operativo;
Mediciones (pesada o medicin de la muestra);
Diluciones y volmenes;
Homogeneizacin;
Calidad de los medios;
Tiempo hasta la inoculacin;
Temperatura de incubacin;

5.6 MTODOS CUANTITATIVOS.

Repetibilidad r < 30 %
Reproducibilidad R < 30 %
Recuperacin Entre el 90% y el 110% log
Sesgo
La diferencia absoluta
de lo recuperado y lo inoculado es < 0.3 log
Incertidumbre
a) Especificar el mensurando.
b) Identificar las fuentes de incertidumbre

5.6.1 Seleccin de Matrices

Muestras naturalmente contaminadas. Para evaluar la capacidad de un mtodo para
recuperar de forma consistente un microorganismo o grupo de microorganismos de inters, es
importante contar con muestras naturalmente contaminadas, estas debern de ser
comprobadas por el mtodo de prueba por duplicado. Estas muestras debern ser utilizadas
para la comparacin de muestras.

Muestras no contaminadas. Se debe contar con matrices no contaminadas, es decir, que no
cuenten con el microorganismo de inters (en algunos casos pueden producirse artificialmente
mediante esterilizacin).
Se deber comprobar usando el mtodo de prueba por duplicado.

Los resultados de las matrices debern registrarse e incluirse en el informe de validacin.




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5.6.2 Repetibilidad.
La determinacin de la repetibilidad (r) sirve para verificar el grado de concordancia entre los
resultados obtenidos en diferentes repeticiones realizadas por el mismo analista, en las mismas
condiciones, en la misma muestra, en intervalos cortos de tiempo.

Analito: Usar una cepa del microorganismo de inters asociado a la prueba.
Nmero de repeticiones: 30 (a excepcin NMP 10 repeticiones)
Nivel de fortificacin: 1 nivel (valor medio)

5.6.2.1 Muestras no contaminadas.

Fortificacin de la muestra. Inocular una concentracin conocida de microorganismos tal que al
concluir el anlisis se recuperen cuentas de aproximadamente el valor medio del intervalo de
lectura.

5.6.2.2 Muestras naturalmente contaminadas.
Verificar por duplicado la concentracin de los microorganismos.

Ejemplo

Cuando el mtodo de prueba indica que se deben contar cajas con cuentas entre 25 y 250 UFC,
se utilizan 25 g de muestra y se coloca 1 ml de cada dilucin por placa. El inculo en la muestra
debe ser tal que despus del mtodo de anlisis se recuperen aproximadamente 80 UFC

Lmite Inferior log(25) La diferencia
entre log(250) y log(25)
Diferencia
entre 2
log(25) + 0.5 UFC
25 1.40
Lmite Superior log(250)
1 0.5 1.90 79
250 2.40

Lmite Inferior log(15) La diferencia
entre log(150) y log(15)
Diferencia
entre 2
log(15) + 0.5 UFC
15 1.18
Lmite Superior log(150)
1 0.5 1.68 47
150 2.18

Si se considera que se realizar una sola dilucin entonces la concentracin del microorganismo
en la dilucin 10
-1
deber ser de aproximadamente 800 UFC, pero considerando que el tamao
de la muestra es de 25 g entonces se deberan inocular aproximadamente 2000 UFC

Nota 3: Todos los inculos deben ser verificados utilizando la tcnica de vaciado en placa,
empleando para el clculo 6 cajas.




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Desarrollo
Partiendo de 30 porciones inoculadas de la muestra o de muestras naturalmente contaminadas,
proceder como se indica en el mtodo de prueba.

Clculos
Calcular el log de las UFC contadas por placa en cada repeticin

A B C D E
1
Repeticin Placa 1 Placa 2 log(Placa 1) log(Placa 2)
2
Repeticin 1 70 UFC 90 UFC 1.85 1.95
3
4
5
6
7
8
9
10
Excel
texto # "UFC" # "UFC" =LOG(B2) =LOG(C2)

Calcular la desviacin estndar relativa (DSR) y elevar al cuadrado

D E F G H I
1 log(Placa 1) log(Placa 2) Desviacin Estndar MEDIA DSR DSR
2

2 1.85 1.95 0.077 1.900 0.0406 0.001651
3 1.85 1.96 0.076 1.905 0.0400 0.001600
4 1.90 1.90 0.000 1.903 0.0000 0.000000
5 1.88 1.91 0.023 1.897 0.0123 0.000151
6 1.89 1.91 0.015 1.903 0.0081 0.000065
7 1.89 1.94 0.041 1.915 0.0214 0.000458
8 1.75 1.90 0.110 p1.826 0.0600 0.003600
9 1.94 1.90 0.026 1.921 0.0134 0.000180
10 1.89 1.93 0.034 1.910 0.0178 0.000316
Excel =LOG(B2) =LOG(C2) =DESVEST(D2:F:2) =PROMEDIO(D2:E2) =(F2/G2) =H2^2

Calcular la media cuadrtica de la DSR usando la siguiente frmula

RSD
A
=
RDS1
2
+ RDS2
2
+... + RDSn
2
n

RSD=
s
x




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Para determinar la repetibilidad del mtodo se multiplica la RSD por 2.8 que es el valor de la distribucin
normal de Z con 95% de confianza.

Repetibilidad (r)= 2.8 X RSD de repetibilidad

I J K
DSR
2
DSR(a) r
0.001651
0.0299 0.0836
0.001600
0.000000
0.000151
0.000065
0.000458
0.003600
0.000180
0.000316
"=H2^2 "=RAIZ((SUMA(I2:I10)/CONTAR(I2:I10))) "=J2*2.28

5.6.3 Reproducibilidad

La determinacin de la reproducibilidad (R) sirve para verificar el grado de concordancia entre
los resultados obtenidos en diferentes repeticiones realizadas por diferentes analistas, en las
mismas condiciones, en la misma muestra, en diferentes tiempos.

Desarrollo.
Utilizando el mtodo de referencia, al menos dos analistas en momentos diferentes
procedern como se describi para repetibilidad hasta el clculo del cuadrado de la DSR

Ejemplo:

A B C D E F G H I
1 Analista
Repeticin Placa 1 Placa 2
Log
(Placa 1)
Log
(Placa 2) D.E. MEDIA DSR DSR2
2
A
Repeticin 1 79 UFC 80 UFC 1.90 1.90 0.004 1.900 0.0020 0.000004
3 Repeticin 2 60 UFC 67 UFC 1.78 1.83 0.034 1.802 0.0188 0.000354
11 Analista
Repeticin Placa 1 Placa 2
Log
(Placa 1)
Log
(Placa 2) D.E. MEDIA DSR DSR2
12
B
Repeticin 1 70 UFC 79 UFC 1.85 1.90 0.037 1.871 0.0198 0.000394




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Calcular la media cuadrtica utilizando la siguiente frmula:

RSD
AB
=
RDS1
2
+ RDS2
2
+... + RDSn
2
n

Para determinar la reproducibilidad del mtodo se multiplica la RSD por 2.8 que es el valor de la
distribucin normal de Z con 95% de confianza.

Reproducibilidad (R) = 2.8 X RSD

I J K
1 DSR2 DSR(ab) R
2 0.000004
0.0309 0.0865
3 0.000354
4 0.000316
5 0.000246
6 0.001511
7 0.001703
8 0.000038
9 0.000000
10 0.000100
11 DSR2
12 0.000394
13 0.000289
14 0.000038
15 0.000246
16 0.001511
17 0.001703
18 0.000038
19 0.000000
20 0.000100
J K
"=RAIZ((SUMA(I2:I10,I12:I20)/CONTAR(I2:I10,I12:I20))) "=J2*2.28

5.6.4 Recuperacin
Es la cantidad de UFC que el mtodo de prueba es capaz de recuperar cuando es inoculado un
numero conocido de microorganismos.

Con los datos obtenidos en repetibilidad en muestras fortificadas calcular la cantidad de UFC,
en cada repeticin y calcular el logaritmo de cada cuenta, promediar los logaritmos. Calcular el
logaritmo del inculo verificado.

Finalmente calcular el % de recuperacin

% Recuperacin= Media de la cuenta de logaritmo de las cuentas x100
Logaritmo de las UFC inoculadas

A B C D E F G H I J
1 Analista Repeticin Placa 1 Placa 2 Cuenta log(Cuenta ) Media (log(Cuenta )) Inculo log (Inculo) % Recuperacin
2
A
Repeticin 1 79 UFC 80 UFC 80 UFC 1.90
1.89 80 UFC 1.90 99%
3 Repeticin 2 60 UFC 67 UFC 64 UFC 1.80

=PROMEDIO(B2:C2) =LOG(E2) =PROMEDIO(F2:F10) "=LOG(H2) "=G2/I2




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5.6.5 Sesgo

El sesgo es la diferencia absoluta entre el valor conocido como verdadero y el valor obtenido
experimentalmente.

A partir de los clculos de recuperacin, calcular el valor absoluto de la diferencia de la media
de los logaritmos de las cuentas menos el logaritmo del inculo utilizado.

Sesgo= J
Donde Ve= valor esperado
Vo= valor obtenido
5.6.6 Incertidumbre.

Especificar el mensurando.
Identificar las fuentes de incertidumbre

5.7 Criterios de aceptacin para la evaluacin de mtodos microbiolgicos.

Cuantitativos

Repetibilidad r < 30 %
Reproducibilidad R < 30 %
Recuperacin Entre el 90% y el 110% log
Sesgo
La diferencia absoluta
de lo recuperado y lo inoculado es < 0.3 log
Incertidumbre
a) Especificar el mensurando.
b) Identificar las fuentes de incertidumbre

Cualitativos

Lmite de deteccin
Demostrar que el mtodo es capaz de recuperar
menos de 5 UFC por lo menos en el 80 % de las
repeticiones.
Repetibilidad
No ms del 20 % de las repeticiones con
resultados negativos al inocular menos de 5 UFC
Reproducibilidad
Inoculando menos de 5 UFC, 2 analistas obtienen
resultados negativos menores o iguales al 20 %
cuando realizan al menos 10 repeticiones cada uno.
Incertidumbre
Mencionar las fuentes de incertidumbre asociadas a
las mediciones.




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5.8 Elaboracin del protocolo

Elaborar un protocolo de validacin que incluya lo siguiente:

Ttulo
Protocolo para la evaluacin del desempeo del mtodo: el nombre y clave
del mtodo que se pretende evaluar.
1.Objetivo
Considerar los parmetros de desempeo a evaluar y el analito a
determinar

2. Campo de aplicacin
Indicar el tipo de producto (s) para los cuales aplica la validacin
3. Mtodo de ensayo Elaborar un diagrama de flujo del mtodo en cuestin
4. Equipo
Mencionar el equipo a utilizar y las condiciones que requiere (verificacin
y/o calibracin, si aplica)
5. Materiales Indicar los materiales a utilizar
6. Reactivos y Medios de
Cultivo
a) Indicar el nombre de los reactivos a utilizar y su grado.
b) Indicar los medios de cultivo a utilizar
c) Indicar las cepas que se usaran y la forma de preparar los inculos

7. Muestras
Indicar las caractersticas, forma de almacenamiento y cantidades de
muestra estimadas para llevar a cabo la validacin.
Detallar la preparacin de los blancos de muestra o muestras adicionadas.
8. Desarrollo
experimental
Detallar las instrucciones para cada uno de los parmetros de desempeo
a ensayar.
9. Resultados Formato para el registro de resultados
10. Anlisis estadstico
Establecer para cada parmetro de desempeo la herramienta estadstica
a utilizar para su evaluacin.
11. Criterios de
aceptacin
Establecer los criterios de aceptacin que deben cumplirse con su
respectiva referencia bibliogrfica.
Nota: El protocolo debe incluir firmas de quien elabor, revis y aprob.

5.9 Ejecucin del protocolo
Debern documentarse todos los resultados en los formatos descritos en sus protocolos, todos
los registros debern estar firmados por el personal que realiza la actividad y mostrar evidencia
de supervisin.

Cuando se realice un cambio con respecto al protocolo establecido, este deber estar
documentado y autorizado.




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5.10 Elaboracin del Informe

Elaborar un informe de resultados de validacin que incluya lo siguiente:

Ttulo
Informe de resultados de la evaluacin del desempeo del mtodo: el
nombre y clave del mtodo que se evalo.
1.Objetivo
Considerar los parmetros de desempeo evaluados y el analito
determinado.
2. Campo de aplicacin Indicar el tipo de producto (s) para los cuales aplic la validacin
4. Equipo
Listado de los equipos utilizados y su estado de
calibracin/verificacin/mantenimiento
5. Materiales Listado de los materiales utilizados.
6. Reactivos y Medios de
cultivo
Listar los reactivos y medios utilizados y su estado de calidad.

7. Muestras
Indicar las caractersticas, forma de almacenamiento, marca, presentacin,
caducidad y cantidades de muestra utilizadas para llevar a cabo la
validacin.
Detallar la preparacin de los blancos de muestra o muestras adicionadas
utilizadas.
8. Mtodo de ensayo

Incluir el diagrama de flujo del mtodo.

9. Desarrollo
experimental
Detallar como se llevaron a cabo los ensayos de cada uno de los
parmetros de desempeo.
10. Resultados
Presentacin de resultados en forma de tablas, sealando fechas de inicio
y trmino, analistas, laboratorio, microorganismo(s) de prueba, matriz,
unidades y clave de bitcora o registro primario
11. Anlisis de resultados
Presentar en forma de tabla los criterios de aceptacin considerados y los
resultados obtenidos y hacer las observaciones correspondientes.
12. Conclusin
Efectuar una conclusin final en donde se seale que el mtodo se ajusta al
uso propuesto (Numeral 5.4.3 17025)
13. Bibliografa Referencias utilizadas.
14. Anexos
Los que aplique:
Registros primarios,
Bases de datos utilizadas
Certificados de equipos,
Medios de cultivo
Cepas
Formatos de verificacin,
Grficos de control, etc.
Nota: El informe de resultados debe incluir firmas de quien elabor, revis y aprob.




17/23

6.0 NOTIFICACIN DE VIGENCIA

Se otorga un periodo de transicin de 180 das contados a partir de la fecha de publicacin para que
los laboratorios que se encuentren autorizados o en proceso del mismo se apeguen a stos criterios.

Para los laboratorios que soliciten autorizacin posterior a la fecha de publicacin, debern cumplir
stos criterios de inicio.

Estos criterios se aplicarn en todos los procesos de evaluacin que se realicen a los 180 das
naturales, a partir de la fecha de publicacin del documento en la pgina web de la COFEPRIS.




18/23

Anexo Informativo 1
Gua Informativa para la fortificacin de una matriz

La fortificacin de muestras se hace por medio de la adicin de diluciones conocidas del
microorganismo a prueba, a partir de su Fase Estacionaria (FE), en la matriz en cuestin, como sigue:

Estimacin de la dilucin de trabajo
A partir de un cultivo del microorganismo de inters en BHI (o cualquier otro medio de enriquecimiento).
Hacer diluciones decimales hasta 10
-9
en agua peptonada amortiguada al 0.1%; o el diluyente que
utilice el laboratorio.

Hacer recuento por triplicado de las diluciones, 10
-6
, 10
-7
, 10
-8
y 10
-9
en agar soya tripticaseina o Agar
cuenta estndar.

Realizar las lecturas y clculos de los nmeros de clulas en cada una de las diluciones para establecer
la dilucin que ser usada en la fortificacin de la matriz y registrar los resultados de los recuentos y
clculo.

Preparacin del Inculo
Preparar un nuevo cultivo en caldo BHI, preparar las diluciones necesarias con base en los resultados
obtenidos en la estimacin de la dilucin de trabajo, verificar la concentracin del inculo por
sextuplicado.




19/23

Anexo Informativo 2
Gua informativa de formatos
Cuadro 1: VALIDACIN PARCIAL DE:

FASE ESTACIONARIA
Analista: Fecha:
Nombre del microorganismo:

Caldo: Volumen de caldo: Temperatura y tiempo total de incubacin:

Intervalos de tiempo de lectura: FE en UFC/mL=

Horas vol. de inculo
en placa
Dilucin Cuenta UFC
Placa 1
Cuenta UFC
Placa 2
Promedio de
cuentas
UFC/mL

Clculos:

Cuadro 2: VALIDACIN PARCIAL DE:

CLCULO DE INCULOS
Analista: Fecha:
Nombre del microorganismo:

Parmetro de desempeo:

FE en UFC/mL=

Dilucin
de FE
Concentracin
de UFC/mL
Dilucin Nivel y concentracin a la
que se quiere llegar en
UFC/g mL
Dilucin
seleccionada
Volumen
necesario

Clculos:




20/23

Cuadro 3: Anlisis de la matriz en estudio (prueba de ausencia del analito).
Matriz:

Mtodo de prueba:

Analito:
Fecha:

UFC/mL en FE: _________________
Analista:


Alcuotas de 25 g Resultado del anlisis Observaciones
1
2
3
4
5
6

Cuadro 4: Clculos para la obtencin de los datos de la dilucin y el volumen seleccionado de la FE para
fortificar las alcuotas de la matriz en estudio del LD.
Matriz: Analista(s):
Fecha: Mtodo de prueba:
Lmite de deteccin
Analito: ________________________________________

No. de UFC/mL en FE: ____________________________
Nivel a confirmar:
LD no declarado: _______ UFC/25g
LD declarado:_______

Niveles que se prueban:

No. de alcuotas: _____________

Cantidad de muestra por alcuota: _________
Nivel: ________
Dilucin seleccionada de la FE:
Concentracin en UFC/mL que corresponde a la dilucin seleccionada:
Clculos:

RESULTADOS:
Dilucin de FE:___________

Volumen de FE:___________




21/23

Cuadro 5: Resultados del parmetro de Lmite de Deteccin
Matriz:

Mtodo de prueba:

Analito:
Fecha:

UFC/mL en FE:
________
No. de replicas del nivel
declarado: 30
Analista:

Nivel de
fortificacin (N1)
Concentracin
esperada en
UFC/25g
Resultado
(registrar (+) o (-) )
No. total de positivos x 100 /
No. total de alcuotas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15.30
R= resultado, en esta tabla se registran 3 porque se hace la determinacin por nivel para 3 medios de cultivo en el caso de
Salmonella.
N1= nivel declarado en el mtodo de prueba.




22/23

Anexo Informativo 3
Gua informativa para la construccin de hojas de clculo
Porcentaje de recuperacin
Analista
Repeti
cin
Placa
1
Placa
2 Cuenta
=CONCATENAR("log(",E
1,")")
=CONCATENAR("Media
(",F1,")") Inculo
=CONCATENAR("log
(",H1,")")
%
Recuperacin

=PROMEDIO(C2:D2) =LOG(E2)
=PROMEDIO(F2:F10)

=LOG(H2) =G2/$I$2

Sesgo
Analista
Repeti
cin
Placa
1
Placa
2 Cuenta
=CONCATENATE("log(",E
1,")")
=CONCATENATE("Media
(",F1,")") Inculo
=CONCATENATE("log
(",H1,")") SESGO

=AVERAGE(C2:D2) =LOG(E2)
=AVERAGE(F2:F10)

=LOG(H2)
=ABS(G2-
I2)

Reproducibilidad
Analista
R
ep
eti
ci
n
Plac
a 1
Plac
a 2
=CONCATENAR("log(
",C1,")")
=CONCATENAR("log(
",D1,")")
Desviacin
Estandar MEDIA DSR
DSR
2 DSR(ab) R

=LOG(C2) =LOG(D2)
=DESVEST(E2
:F2)
=PROMEDIO(E
2:F2)
=G2/H
2
=I2^
2
=RAIZ((SUMA(J2:J10,J12:J20)/CO
NTAR(J2:J10)))
=K2*
2.8
=LOG(C3) =LOG(D3)
=DESVEST(E3
:F3)
=PROMEDIO(E
3:F3)
=G3/H
3
=I3^
2
=LOG(C4) =LOG(D4)
=DESVEST(E4
:F4)
=PROMEDIO(E
4:F4)
=G4/H
4
=I4^
2
=LOG(C5) =LOG(D5)
=DESVEST(E5
:F5)
=PROMEDIO(E
5:F5)
=G5/H
5
=I5^
2
=LOG(C6) =LOG(D6)
=DESVEST(E6
:F6)
=PROMEDIO(E
6:F6)
=G6/H
6
=I6^
2
=LOG(C7) =LOG(D7)
=DESVEST(E7
:F7)
=PROMEDIO(E
7:F7)
=G7/H
7
=I7^
2
=LOG(C8) =LOG(D8)
=DESVEST(E8
:F8)
=PROMEDIO(E
8:F8)
=G8/H
8
=I8^
2
=LOG(C9) =LOG(D9)
=DESVEST(E9
:F9)
=PROMEDIO(E
9:F9)
=G9/H
9
=I9^
2
=LOG(C10) =LOG(D10)
=DESVEST(E1
0:F10)
=PROMEDIO(E
10:F10)
=G10/
H10
=I10
^2
Analista
R
ep
eti
ci
n
Plac
a 1
Plac
a 2
=CONCATENAR("log(
",C11,")")
=CONCATENAR("log(
",D11,")")
Desviacin
Estandar MEDIA DSR
DSR
2

=LOG(C12) =LOG(D12)
=DESVEST(E1
2:F12)
=PROMEDIO(E
12:F12)
=G12/
H12
=I12
^2
=LOG(C13) =LOG(D13)
=DESVEST(E1
3:F13)
=PROMEDIO(E
13:F13)
=G13/
H13
=I13
^2
=LOG(C14) =LOG(D14)
=DESVEST(E1
4:F14)
=PROMEDIO(E
14:F14)
=G14/
H14
=I14
^2
=LOG(C15) =LOG(D15)
=DESVEST(E1
5:F15)
=PROMEDIO(E
15:F15)
=G15/
H15
=I15
^2
=LOG(C16) =LOG(D16)
=DESVEST(E1
6:F16)
=PROMEDIO(E
16:F16)
=G16/
H16
=I16
^2
=LOG(C17) =LOG(D17)
=DESVEST(E1
7:F17)
=PROMEDIO(E
17:F17)
=G17/
H17
=I17
^2
=LOG(C18) =LOG(D18)
=DESVEST(E1
8:F18)
=PROMEDIO(E
18:F18)
=G18/
H18
=I18
^2
=LOG(C19) =LOG(D19)
=DESVEST(E1
9:F19)
=PROMEDIO(E
19:F19)
=G19/
H19
=I19
^2
=LOG(C20) =LOG(D20)
=DESVEST(E2
0:F20)
=PROMEDIO(E
20:F20)
=G20/
H20
=I20
^2




23/23

Repetibilidad
Repetici
n
Placa
1
Placa
2
=CONCATENAR("log(",
B1,")")
=CONCATENAR("log(",
C1,")")
Desviacin
Estandar MEDIA DSR DSR2 DSR(a) r
=LOG(B2) =LOG(C2)
=DESVEST(D2:E
2)
=PROMEDIO(D2:
E2) =F2/G2
=H2^
2
=RAIZ((SUMA(I2:I10)/CONTAR
(I2:I10)))
=J2*2
.8
=LOG(B3) =LOG(C3)
=DESVEST(D3:E
3)
=PROMEDIO(D3:
E3) =F3/G3
=H3^
2
=LOG(B4) =LOG(C4)
=DESVEST(D4:E
4)
=PROMEDIO(D4:
E4) =F4/G4
=H4^
2
=LOG(B5) =LOG(C5)
=DESVEST(D5:E
5)
=PROMEDIO(D5:
E5) =F5/G5
=H5^
2
=LOG(B6) =LOG(C6)
=DESVEST(D6:E
6)
=PROMEDIO(D6:
E6) =F6/G6
=H6^
2
=LOG(B7) =LOG(C7)
=DESVEST(D7:E
7)
=PROMEDIO(D7:
E7) =F7/G7
=H7^
2
=LOG(B8) =LOG(C8)
=DESVEST(D8:E
8)
=PROMEDIO(D8:
E8) =F8/G8
=H8^
2
=LOG(B9) =LOG(C9)
=DESVEST(D9:E
9)
=PROMEDIO(D9:
E9) =F9/G9
=H9^
2
=LOG(B10) =LOG(C10)
=DESVEST(D10:
E10)
=PROMEDIO(D10:
E10)
=F10/G
10
=H10
^2

CV MB 042011

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