Universidad Tcnica de Ambato Ciencias de la Salud Laboratorio Clnico Mdulo: Bacteriologa Docente: Dra.

Vanessa Gavilanez Alumnas: Jenny Panata Johanna Orozco Semestre: Sexto Septiembre-Enero 2014

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NORMAS QUE SE DEBEN OBSERVAR EN EL LABORATORIO DE BACTERIOLOGIA MEDICA DIAGNOSICA

1. Usar siempre un mandil, preferentemente de mangas largas, que cubra la mayor parte del cuerpo. 2. Se trabaja con material contaminado y patgeno, por lo tanto todo descuido por parte del alumno, puede ser causa se peligro para l y las personas que estn en contacto con l. 3. Al salir del laboratorio, lavarse las manos con agua y jabn. 4. No introducir al laboratorio objetos personales, nicamente el equipo necesario de trabajo. 5. No fumar, ni comer, no llevarse las manos en la boca. Humedecer las etiquetas con agua, no con saliva. 6. Si un cultivo o muestra se derrama poner inmediatamente un desinfectante y luego de 10 minutos limpiar el rea contaminada. 7. Para evitar producir aerosoles peligrosos: Trabajar sobre un papel toalla empapado en desinfectante. Si el asa contiene material microbiolgico esterilizar en la llama con cuidado Nunca topar material microbiolgico con un asa caliente. 8. Todo material sucio y contaminado (portaobjetos, algodones, hisopos, etc.), se deben colocar en recipientes con desinfectante y luego esterilizar en la autoclave. 9. El microscopio debe limpiarse al comienzo, y al final de cada clase. Se debe apagarlo y cubrirlo. 10. Al terminal la prctica las mesas deben limpiarse con un desinfectante. Los reactivos y medios de cultivo se colocaran en un lugar apropiado. 11. La ltima persona en salir debe desconectar estufas, cerrar las llaves de gas y de agua. 12. Cada estudiante debe tener: Lpiz demogrfico. Asa microbiolgica. Pinza metlica. En caso de duda o accidente, por favor consultar al instructor. El material contaminado d desecho poner en los recipientes que tener el rtulo PARA ESTERILIZAR.

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CULTIVO DE MICROORGANISMOS MEDIOS DE CULTIVO:

El xito al cultivar microorganismos artificialmente est en reproducir las condiciones naturales en las que los microrganismos viven. Poco a poco se ha ido descifrando las necesidades: nutritivas, de temperatura, humedad, potencial redox, oxigeno, especficas de cada microorganismo; por lo que actualmente se cultiva casi todos los microorganismos excepto a los intracelulares que dependen del metabolismo directo de la clula a la que parasitan. Los primeros medios de cultivo utilizados fueron tejidos de animales y plantas o efusiones de estos tejidos pero que resultaban difciles de estandarizar. La evolucin en la determinacin de un medio de cultivo apropiado, especialmente en forme solida se debe a Walter y Liana Hesse que trabajando en el laboratorio de Robert Kock, en 1876 lograron aislar en cultivo puro al agente causal del ntrax bovino: Bacillus anthracis. Estudios del metabolismo bacteriano han permido una mejor comprensin de las necesidades de nutricin de la bacterias, de esto, a su vez, ha surgido la creacin e medios de cultivo que permiten el aislamiento y estudio de microorganismos. Naegeli entre 1868 y 1880, realizo una serie de investigaciones para determinar los compuestos nutricionales de ms fcil utilizacin por las bacterias; as, este investigador determin que las peptonas (protenas hidrolizadas) constituyen la mejor fuente de aminocidos para ser asimilados por las bacterias. Actualmente los medios de cultivo son fabricados a escala industrial con frmulas especficas que requieren que requieren nicamente de hidratacin, homogenizacin y esterilizacin. Los medios de cultivo deshidratados se fabrican en forma de polvo o de granulados. La disponibilidad de medios de cultivo producidos comercialmente ha permitido la estandarizacin y la elevada calidad en el aislamiento e identificacin de los microorganismos. La mayora de microrganismos necesitan para su crecimiento de carbono, oxigeno, hidrgeno nitrgeno, azufre, fsforo, potasio, calcio, hierro y magnesio. Los oligoelementos como el manganeso, zinc, cobre cloro, molibdeno son requeridos por algunos microorganismos.

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Los microrganismos exigentes o fastidiosos (difciles de crecer in vitro) necesitan de factores de crecimiento especficos como sangre, suero, aminocidos, vitaminas, purinas u otras sustancias que no pueden sintetizar por s mismos y es necesario aadir a los medios de cultivo donde creceran estos microrganismos. Al igual que todo ser vivo, todos los microorganismos necesitan de agua para su crecimiento. Los compuestos orgnicos son la mejor fuente de carbono y de energa, tambin pueden suplir las necesidades de hidrogeno; aunque ciertos microorganismos requieren compuestos inorgnicos como fuente de hidrogeno (bacterias auttrofas). El oxgeno se toma principalmente del medio ambiente. El nitrgeno se asimila mejor a partir de sales inorgnicas: nitratos, nitritos, compuestos de amino o de aminocidos, pptidos o protenas. Las peptonas son los compuestos inorgnicos ms usados en los medios de cultivo, son sustancias hidrosolubles que se obtienen de protenas sometidas a procesos enzimticos. De acuerdo a la protena de origen y a la enzima utilizada, las peptonas son mezclas de composicin especfica de pptidos, hidratos de carbono y vitaminas. En ciertos medios de cultivo los componentes especiales son los hidrolizados, que son mezclas de aminocidos y pptidos obtenidos por procedimientos inorgnicos a partir de protenas, los hidrolizados no tienen vitaminas ni sustancias que favorecen el crecimiento. Los extractos utilizados para enriquecer los medios de cultivo son ricos en protenas de bajo peso molecular, contiene vitaminas y otros factores de crecimiento, se obtiene por maceracin acuosa, calentamiento y evaporacin de sustancias naturales, por ejemplo a partir de levaduras, malta, carne, etc. El agar de agalactan, un carbohidrato completo, compuesto de molculas de galactosa y no hidrolizado por la mayora de las bacterias, es un solidificante extrado de algas rojas de las especies Gledium y se utilizan para la produccin de medios de cultivo solidos a una concentracin de 1.5% a 1.8%, se funde a 90C y permanece liquido hasta una temperatura de 40C. La gelatina es otro agente solidificante utilizado a concentraciones de 12 a 15%, es liquido sobre los 25C y es hidrolizable por varias bacterias. La silica-gel se la utiliza como solidificante para cultivos auttrofos. Ciertas sustancias (aditivos) se aaden a los medios de cultivo para obtener selectividad y diferenciacin en la identificacin de los microrganismos. Las sustancias selectivas van a permitir el crecimiento de determinados microorganismos inhibiendo a otros. Las sustancias diferenciales permiten

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distinguir a otros grupos de microorganismos en base de propiedades metablicas especficas sin interferir con el crecimiento de microorganismos. Los aditivos ms bien reaccionan con los productos del metabolismo que se obtiene solo por determinados organismos, lo que se puede determinar en cambios en el medio de cultivo, como cambio de color, formaciones de gas, etc. O tambin influir en el color de las colonias. Es importante que los medios de cultivo contengan indicadores de pH y redox, cuyo cambio de color sea caracterstico para un determinado intervalo de pH. El pH es la funcin logartmica, definida por la ecuacin:

log 1 (H+)

pH= -log (H+)

El nmero de iones hidrogeno (H+) es una solucin acuosa depende del grado de disociacin de los cidos presentes; as un pH de 7 representa una concentracin de iones hidrogeno (H+) de 1x10-7, siendo esta la concentracin de iones hidrogeno (H+) del agua pura de 25C e indica neutralidad en la escala de pH. Cualquier pH sobre 7 seala que la solucin es ms alcalina que el agua, por lo tanto cualquier pH bajo 7 indica que la solucin es ms acida que el agua. El pH de la mayora de los medios de cultivo es neutro, favoreciendo as el crecimiento de la mayora de los microorganismos. Se recomienda medir el pH de los medio de cultivo despus de esterilizarlos mediante peachimetros (mtodo potencimetro) o utilizando indicadores de pH de papel (mtodo colorimtrico). De acuerdo a lo que se necesite para ajustar el pH deseado se debe aadir soluciones estriles acidas o alcalinas aspticamente. Indicadores de pH ms utilizados: Azul timol (rango cido) Azul bromo fenol Verde bromo cresol Rojo metilo Rojo cloro fenol Purpura bromocresol Azul bromo timol Rojo fenol cido Rojo Amarillo Amarillo Rojo Amarillo Amarillo Amarillo Amarillo Alcalino Amarillo Azul Azul Amarillo Rojo Prpura Azul Rojo

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Prpura metacresol Azul timol Fenolftalena Cresoltalena

Amarillo Amarillo Sin color Sin color

Prpura Azul Rojo Rojo

FUENTE: Seeley, H, VanDemark, P, Microbes in action. A Laboratory Manual of Microbiology, Octava Edicin, 1992. Estos indicadores se utilizan especialmente para detectar la produccin de cido poa la degradacin d los hidratos de carbono del medio de cultivo por accin de las bacterias. El azul de metileno y la resazurina son los indicadores redox ms utilizados, su cambio de color indica la presencia o ausencia de oxgeno. Ciertos medios de cultivo contiene sustancias inhibidoras para determinados microorganismos, por ejemplo las bacterias Gram positivas son inhibidas por los colorantes: violeta cristal y verde brillante. En cambio muchas sales: cloruro de sodio, citrato sdico, telurito de potasio, laurilsulfato sdico, cloruro ltico, desoxicolato sdico se utilizan como agentes de seleccin y diferenciacin de microrganismos. Los antibiticos tambin se utilizan como sustancias selectivas los termoestables se pueden aadir al medio de cultivo antes de la esterilizacin en le autoclave, los termolbiles se aaden aspticamente a los medio de cultivo ya esterilizados y a una temperatura de 40C El cultivo de microrganismos anaerbicos requiere valores bajos de potencial redox, para lo cual se necesita aadir cido ascrbico, tioglicolato sdico, hidrosulfito sdico y/o cistena. Las sustancias selectivas o aditivos pueden ser toxicas para ciertos microorganismos por lo que se recomienda ensayar antes de su uso. Los medio de cultivo por su composicin y finalidad de uso, pueden ser: De transporte: Permiten la preservacin de los microorganismos de una muestra clnica. Nutritivos: Sirven para el aislamiento de toda clase de bacterias. Crecen con caractersticas inconfundibles. Ej. : Medio de Loefler, LowensteinJensen. Especficos: Destinados para determinado tipo de bacterias, las cuales crecen con caractersticas inconfundibles. Ej. : Medio de Loefler, Lowenstein-Jensen.

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Diferenciales: Estos medios contienen elementos orgnicos e indicadores inorgnicos que permiten distinguir el metabolismo de las bacterias y de este modo es posible clasificarlas Ej.: MacConkey Agar, para distinguir bacterias fermentadoras de lactosa de las no fermentadoras. De Enriquecimiento: Favorecen el crecimiento de cierto tipo de bacterias, inhibiendo el desarrollo de otras. Ej.: Medio de Selenite F. Medios con Antibiticos: Se los utiliza para favorecer el crecimiento de ciertos tipos de bacterias patgenas al estar mezcladas con bacterias normales. Ej.: Thayer Martin Agar.

La seleccin de los medios de cultivo se hace a base de la experiencia, el ensayo y las facilidades econmicas; es de utilidad saber que la presencia de glucosa en el medio de cultivo ayuda al crecimiento de la mayora de bacterias, pero la fermentacin de glucosa disminuye el pH y puede producir daos a bacterias sensibles a pH cidos. No se recomienda glucosa en el agar base de sangre porque su fermentacin puede alterar la hemolisis alfa o beta producidas por los estreptococos. Los medios de cultivo-de acuerdo a su consistencia pueden ser:

LIQUIDOS: Utilizados generalmente para obtener crecimiento rpido y

masivo; en estos medios las bacterias conservan su morfologa celular caracterstica.

SEMISOLIDOS: tiles para investigar motilidad y conservar las bacterias por

periodos largos, contienen 1% de agar.

SLIDOS: Especialmente tiles para el aislamiento de bacterias y observacin

de colonias, contienen del 12 al 15% de agar.

PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO

La fabricacin a escala industrial de los medios de cultivo permite la manipulacin racional y fcil en el laboratorio particular, adems se garantiza la reproducibilidad de los resultados. Sin embargo en la preparacin de los medios de cultivo en cada laboratorio se debe tomar en cuenta lo siguiente: 1. Se debe seguir fielmente las instrucciones de preparacin especificadas en el envase del medio de cultivo. Siempre se debe guardar los medios de cultivo en tos envases originales y con las tapas muy bien cerradas. Al pesar se debe utilizar papel no absorbente, depositar inmediatamente en el recipiente y aadir el agua destilada mezclando bien para obtener una suspensin homognea. Si se obtiene una solucin homognea como en la mayora de medios de cultivo lquidos se esteriliza directamente. LABORATORIO CLINICO

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Los medios de cultivo que contienen agar necesitan de ebullicin y constante agitacin para obtener una solucin homognea para luego esterilizarlos. Los recipientes en los que se van a esterilizar los medios de cultivo deben estar limpios. Al esterilizar se produce ebullicin de los medios de cultivo, por lo que se recomienda utilizar como mximo las 3/4 partes de los Erlenmeyer o botellas de esterilizacin. Adems cantidades grandes de medios de cultivo en un mismo recipiente no se esterilizan bien. Se recomienda utilizar tapones de gasa o de papel aluminio para los Erlenmeyer. Si se utiliza botellas las tapas no deben cerrarse hermticamente. Se debe utilizar para cada esterilizacin una cinta de control de esterilizacin y por lo menos una vez al mes utilizar controles biolgicos de esterilizacin (Bacillus stereathermophilus) 2. Los medios de cultivo estriles se deben depositar en recipientes tambin estriles (cajas Petri, tubos, botellas, etc.) 3. Los medios de cultivo lquidos se pueden preparar, depositarlos en recipientes limpios no estriles (tubos, botellas) y llevarlos al autoclave para la respectiva esterilizacin en conjunto. 4. Si los medios de cultivo no se utilizan el mismo da se pueden almacenar en fundas plsticas y en la refrigeradora, as se evita el deterioro y la deshidratacin. 5. Es importante que los medios de cultivo guardados en refrigeracin adquieran la temperatura ambiente antes de hacer las siembras pues algunas bacterias no crecern si los medios de cultivo estn muy fros. Los medios de cultivo granulados tienen ciertas ventajas sobre los medios en polvo: - Se conservan mejor por tiempos prolongados, los componentes del medio no se separan ni humedecen. - Se disuelven mejor en el agua destilada, no se adhieren a las paredes de los recipientes. No producen aerosoles cuando se los manipula, evitndose reacciones alrgicas e inhalacin de sustancias txicas. - Todos los medios de cultivo son sensibles al calor y pueden perder sus propiedades nutricionales, no se debe sobrecalentarlos.

METODOS DE ESTERILIZACION

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Se entiende por esterilizacin al proceso fsico o qumico capaz de destruir toda forma de vida microbiana. Se puede esterilizar por calor seco, calor hmedo, filtracin, exposicin a gases, rayos de luz ultravioleta, radiaciones beta.

CALOR SECO: Material de vidrio y ropa se pueden esterilizar por calor seco,
sometindolos a estufas de 100 C. Durante 1 a 2 horas.

FILTRACION: Muchos medios de cultivo que contienen carbohidratos, suero,

plasma, liquido asctico, urea, se deterioran a temperaturas altas, por esta razn, el mejor mtodo de esterilizacin es hacindolos pasar por filtros que retienen a los microorganismos o absorben a los microbios al filtro por la diferencia de su carga elctrica. Previamente, los recipientes en los que se depositarn estos medios de cultivo, se deben esterilizar por calor seco.

METODOS QUIMICOS: Se consigue esterilizar al aadir a los medios de

cultivo soluciones tales como timol, fenol o exponindolos a gases como el xido de etileno. Este gas se utiliza para esterilizar plsticos, toma ciclos de varias horas y luego es necesario exponer al aire para que el xido de etileno se evapore.

CALOR HUMEDO: Mediante el uso de autoclave o esterilizador de vapor

bajo presin. Consiste en un recipiente cerrado en el cual se pone a hervir agua bajo una presin mayor que la normal, creando as un ambiente ideal de esterilizacin. As, a una presin de 15 libras por pulgada cuadrada (psi) el vapor de agua tendr una temperatura aproximada a 12l*C. (250F) y si esta temperatura se aplica por un tiempo adecuado, 15 minutos por lo menos, se destruir toda forma de vida microbiana, inclusive las esporas. Los autoclaves proporcionan estos tres factores esterilizantes: temperatura, presin y humedad; sin embargo es necesario enfatizar que la temperatura es el factor determinante en la destruccin de los microorganismos, la presin y la humedad son factores accesorios. El aire contenido en el autoclave debe ser reemplazado por vapor, as se obtendr la debida temperatura. En la tabla siguiente se expresa la relacin entre temperatura y presin. Presin (psi) 5 10 15 Temperatura C 109 115 121 F 228 240 250 LABORATORIO CLINICO

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20 25 30

126 130 135

259 267 275

TINDALIZACION: La tindalizacin es un mtodo de esterilizacin

intermitente por calor seco o calor hmedo. El material se somete a la esterilizacin por 30 minutos por 3 das consecutivos dejando a temperatura ambiente luego de cada esterilizacin, de este modo se eliminara a las esporas.

LUZ ULTRAVIOLETA: La luz solar generalmente es letal para la mayora de

microorganismos, esto se debe principalmente a los rayos ultravioleta en longitudes de onda entre 240 y 300 manmetros (nm) con el pico de toxicidad mayor a 265 nm. cidos desoxirribonucleicos absorben rayos ultravioletas a 265 nm. Estas radiaciones producen la formacin de dmeros (puentes qumicos entre bases pirimidnicas adyacentes en un mismo cordn de DNA o entre varios cordones de DNA), lo que interfiere con la replicacin y funcin adecuada de la molcula de DNA. De all que una bacteria irradiada con luz ultravioleta no puede reproducirse y morir. La irradiacin con lmparas que emanan luz ultravioleta sirve para esterilizar ambientes y se debe utilizar cuando no hay personas alrededor.

RADIACIONES BETA: Las radiaciones beta son electrones acelerados,

tienen una masa menor a las radiaciones alfa y son de mediana penetracin. Las radiaciones beta se obtienen en un acelerador lineal de electrones, aplicando un campo elctrico que genera diferencia de potenciales lo que produce aceleracin de los electrones a una velocidad semejante a la de la luz. Los electrones acelerados se los conduce por un tnel de trayectoria lineal y al vaco para evitar la disipacin de la energa. El haz de electrones acelerados se aplica al material que se desea esterilizar. La aplicacin de radiaciones beta tiene utilidad en la eliminacin de bacterias no esporuladas, esporuladas. Aerbicas, anaerobias, mohos, levaduras y parsitos. Constituye un procedimiento, una alternativa para mejorar las condiciones de agua de deshecho. El agua al pasar por fracciones de segundo por el acelerador de electrones disminuye la sobrepoblacin bacteriana y lo ms ventajoso se ha comprobado en el laboratorio que dosis de 3 KGY (dosis de irradiacin) eliminan a los microorganismos patgenos que se transmiten en aguas contaminadas. Las radiaciones beta se utilizan tambin para esterilizar material de plstico que son sensibles al calor. LABORATORIO CLINICO

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AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS
En la naturaleza los microorganismos viven en poblaciones mixtas. Sin embargo, el conocimiento de la microbiologa se realiza por el estudio sistemtico de cada microorganismo aislado en cultivo puro libre de contaminantes; por lo tanto es necesario realizar siembras para aislar (separar) en cultivo puro cada microorganismo para luego identificarlo. Los medios de cultivo slidos son indispensables para el aislamiento de los microorganismos en colonias. La colonia es el conjunto de grmenes con idnticas caractersticas hereditarias, tintoriales y metablicas que se desarrollan generalmente en un medio slido. La morfologa de las colonias es caracterstica particular de cada especie bacteriana, por lo tanto se hace indispensable determinar el tamao, forma, color, consistencia, densidad, etc., para tener una pauta presuntiva en la identificacin de cada microorganismo. Se reconocen varias tcnicas de aislamiento de siembra, las ms utilizadas se describen a continuacin: Aislamiento por estriacin o agotamiento: Consiste en aislar colonias en diferentes planos a partir de un inoculo. Al realizar esta tcnica se debe tomar en cuenta: 1. Los medios de cultivo antes de ser sembrados deben adquirir la temperatura ambiente, el fro puede inhibir el crecimiento de ciertas bacterias, el ejemplo ms clsico: N, gonorrhoeae no crece en medios de cultivo fros. 2. Para realizar la siembra se utiliza el asa bacteriolgica que consiste en una aguja de platino o alambre nicromado sostenido por un mango. El platino y alambre nicromado tienen la caracterstica de calentarse y enfriarse rpidamente. 3. Se debe esterilizar el asa bacteriolgica hasta la incandescencia (rojo) a la llama del mechero de bunsen. antes y despus de cada siembra; tambin es necesario esterilizar el asa en cada cambio de rea de estriacin, cuando se siembra cultivos mixtos. Muchos problemas de contaminacin se deben a asas que no se esterilizaron adecuadamente, tambin un asa no estril puede ser fuente de infeccin 4. Nunca se debe topar el inculo, estriaciones previas, colonias o residuos despus de una siembra con un asa cerque se puede destruir a los microorganismos o pero crear aerosoles, se evita estos problemas introduciendo el asa en un borde del medio de cultivo LABORATORIO CLINICO

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5. No se debe inocular un medio de cultivo hmedo o contaminado porque l aislamiento ser deficiente y las colonias no sern tpicas 6. Siempre se debe etiquetar las cajas con el nmero, nombre, etc.; en la base de la caja NO en la tapa. 7. Una vez realizadas las siembras se deben incubar en posicin invertida.

SIEMBRAS PROCEDIMIENTO:
1. Inocular la muestra con un hisopo o con el asa (estril y fra) en un lado superior de la caja con medio de cultivo. Evite inocular reas grandes, se necesita espacio para estriar y aislar las colonias

2. Estriar con el asa estril y fra sobre el inoculo de extremo a extremo hasta 1/3 de la caja

3. Esterilizar y enfriar el asa. 4. A partir de la estriacin anterior, estriar otra parte del medio de cultivo, topando de 3 a 4 veces el inoculo anterior.

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5. Repetir los pasos 3 y 4 usando la parte que queda del medio de cultivo. Realizar estras ms separadas para separar mejor a las colonias.

6. Si se siembra en agar sangre, se debe realizar con el asa, corles en el agar para observar mejor la hemolisis bacteriana. 7. Al estriar en tres reas diferentes en el medio de cultivo se puede cuantificar a grosso modo los microorganismos presentes en esa siembra: a) si crecen nicamente en la primera rea de estriacin: escasos. b) si crecen hasta la segunda rea: moderados. c) si crecen hasta la tercera rea: abundantes.

RECOMENDACIONES:
Al estriar se debe utilizar toda la superficie del medio de cultivo. No es necesario esterilizar el asa en cada estriacin, si se trabaja con cultivos puros o cuando el primer inoculo es escaso. Es mejor realizar estras ms separadas al final de la siembra, para aislar ms adecuadamente a las colonias. Nunca estriar sobre una estriacin previa. Para determinar la morfologa de las colonias, coloraciones, subsiembras y/o pruebas de identificacin, trabajar con COLONIAS AISLADAS.

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Aislamiento por siembra en profundidad (Pour Plate) La siembra en profundidad permite obtener colonias aisladas a partir de inculos que contienen mezclas de microorganismos. Se diferencia de la siembra por estriacin porque se mezcla el inoculo y el agar mientras est liquido (no fro - 45C) por lo que las colonias crecen no solamente en la superficie sino en profundidad en el medio de cultivo. Esta disposicin constituye una ventaja por ejemplo cuando se trata de aislar estreptococos ya que la hemolisis se observar ms claramente. La siembra en profundidad tiene otra ventaja, se puede cuantificar los microorganismos, partiendo de inculos en diluciones conocidas y luego contando el nmero de colonias en el medio de cultivo despus de la incubacin; el nmero total de colonias del microorganismo ser el nmero de colonias en el medio de cultivo multiplicado por el factor de dilucin. Esta tcnica de siembra se la utiliza en el anlisis microbiolgico de aguas, leche, alimento.

PROCEDIMIENTO:
1.

Se preparan diluciones de la muestra que se va a sembrar. Es importante predecir el nmero viable de colonias para sembrar las diluciones correctas. Por ejemplo realizar:

dilucin 10-1 => a 9 ml de caldo aadir 1 ml de muestra. MEZCLAR dilucin 10-2 => a 9 ml de caldo aadir 1 ml de la dilucin anterior. MEZCLAR. dilucin 10-3 => a 9 ml de caldo aadir 1 ml de la dilucin anterior. Mezclar bien, si es posible en un vortex.
2.

3.

Aspticamente transferir 1 ml de cada dilucin a una caja Petri estril. Rotular en la tapa de la caja Petri con la dilucin correspondiente. No se rotula en la base de la caja porque puede interferir con la observacin de las colonias. Aadir aspticamente, aproximadamente 15 ml de agar fundido, estril y fro (40 -45C) Mezclar para aislar las colonias, realizando los siguientes estandarizados de las cajas: cinco movimientos en crculos cinco a la izquierda, cinco de arriba hacia abajo y cinco rectos de derecha a izquierda. Dejar en reposo las cajas solidifique el agar. movimientos a la derecha, movimientos para que se

4.

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5.

Aadir una capa sellante de agar fundido (2ml). Dejar solidificar nuevamente. Incubar las cajas en posicin invertida por 18 - 24 horas a 35 - 37a C. Contar las colonias, para determinar el nmero total, multiplicar por el factor de dilucin. Reportar el nmero de colonias como Unidades Formadoras de Colonia: UFC/ml

6. 7.

8.

RECOMENDACIONES:
- Una lectura ms precisa del nmero de colonias se obtiene con cajas que contengan entre 30 y 300 colonias por caja. A veces resulta difcil predecir el nmero de diluciones necesarias para obtener estos nmeros. Siembras en medios de cultivo lquidos Existen varios medios de cultivo lquidos que permiten el crecimiento bacteriano, se reconoce que las bacterias al multiplicarse en medios lquidos conservan ms tpicamente su morfologa celular; los estreptococos aparecen como cocos Gram (+) en cadenas, los estafilococos como cocos Gram (+) en racimos por ejemplo. El crecimiento en los medios de cultivo lquido o caldos aparece de diferentes maneras: 1) Turbidez: ms o menos densa en todo el caldo 2) Formacin de pelcula: en la parte superior del caldo 3) Sedimento: depsito denso en el fondo del caldo 4) Presencia de gas como burbujas.

PROCEDIMENTO:
1. Rotular los tubos con caldo, anotar el nmero o el tipo de muestra que se va a sembrar 2. Destapar el tubo utilizando el dedo meique 3. Flamear la parte superior del tubo 4. Tomar con el asa o con el hisopo la muestra e inocular en el caldo. 5. Flamear la parte superior del tubo 6. Tapar el tubo 7. Esterilizar el asa 8. Incubar 18 - 24 horas a 35 - 37C

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Siembras en medios de cultivo en tubos inclinados Los medios de cultivo en tubos inclinados se obtienen al enfriar a los medios de cultivo slidos en tubos, en ngulo; de tal manera que hay un fondo cerrado y una parte inclinada abierta en una superficie. Se recomienda utilizar este tipo de siembra para conservar ceparios y en la determinacin de ciertas pruebas bioqumicas, por ejemplo siembras en TSI (Triple Sugar Iron Agar) para determinar la fermentacin de glucosa, lactosa y sucrosa; formacin de H2S y de gas. PROCEDIMIENTO:

1. Rotular los tubos con el nmero o tipo de muestra que se va a sembrar 2. Esterilizar el asa. enfriarla y tomar la colonia que se va a sembrar 3. Destapar el tubo utilizando el dedo meique Flamear la parte superior del
tubo. 4. Inocular con el asa el fondo (por picadura) y luego estriar la superficie en zigzag de abajo hacia arriba 5. Tapar el tubo 6. Esterilizar el asa 7. Incubar los tubos en posicin vertical por 18 - 24 horas a 35 - 37C.

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SUBCULTIVOS PARA EL AISLAMIENTO DE CULTIVOS PUROS

Se reconoce como: Cultivo puro: misma especie cuando los microorganismos aislados son todos de la

Cultivo mixto: cuando dos o ms especies de microorganismos crecen en el medio de cultivo Cultivo contaminado: si una siembra contiene, accidentalmente (introducida por error durante el procesamiento) ms de una especie bacteriana. Se reconoce porque las bacterias aparecen fuera de las estras o lejos del inoculo inicial. La identificacin exitosa de un microorganismo est en trabajar con cultivos puros. Coloraciones, pruebas bioqumicas se observan mejor con colonias aisladas, puras. Para determinar la sensibilidad antimicrobiana es requisito INDISPENSABLE trabajar con cultivos puros. Un cepario se mantiene en subcultivos puros.

PROCEDIMIENTO:
1. Seleccionar 1 colonia aislada de siembras por estriacin o profundidad 2. Con el asa estril y fra tomar la colonia seleccionada y transferirla a un medio de cultivo lquido, tubo inclinado o slido. 3. Observar siempre las precauciones de asepsia y rotulacin en el procedimiento de las siembras. 4. Incubar 18 - 24 horas a 35 -37C

PRESERVACION DE CEPAS BACTERIANAS

Un cultivo microbiano se puede preservar sin la necesidad de subcultivarlo con frecuencia. La preservacin trata de mantener a las bacterias en un estado de latencia sin crecimiento ni reproduccin, as no se producirn cambios genticos, especialmente mutaciones. La preservacin por perodos cortos por meses se consigue con la refrigeracin de las cepas. Las bacterias aerbicas se conservan bien si se siembran y refrigeran en tubos inclinados. Para algunas bacterias anaerobias facultativas lo mejor es sembrarlas y refrigerarlas en medios semislidos sellados con aceite mineral estril. Bacterias anaerobias estrictas se cultivan y preservan en tioglicolato.

La LIOFILIZACIN es el mejor mtodo de preservacin para perodos largos (aos). En este mtodo el cultivo microbiano se inocula en leche y/o suero

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estriles, en tubos pequeos o ampollas de vidrio. Se congelan utilizando hielo seco y alcohol y al mismo tiempo se desecan al vaco. Luego se sellan los tubos y se mantienen a temperatura ambiente. La congelacin de bacterias en leche descremada estril, mezcladas con una solucin estril de glicerol (dilucin 1:20) y conservadas a -20C permite preservar cepas bacterianas por perodos

REQUERIMIENTOS DE OXIGENO
De acuerdo a las necesidades del oxgeno las bacterias se clasifican en: Aerobios estrictos: Necesitan de oxgeno para vivir. Aerobios estrictos: No pueden vivir en presencia de oxgeno Aerobios, anaerobios facultativos: Son indiferentes a la presencia o ausencia de oxgeno. Microaeroflicos: Crecen en bajas tensiones de oxgeno

MANERAS DE OBTENER ATMOSFERAS ANAEROBICAS:

1. Sistema de Gas Pak.- Consiste en una jarra de vidrio con tapa de caucho provista de un recipiente de malla que contiene cristales de paladio que sirven como catalizadores; les sobres generadores de H2 y C02 se fabrican en papel aluminio y contienen sales generadoras de estos gases cuando se aaden 10 ml de agua. Estos sobres se introducen junto con los medios de cultivo inoculados en la jarra de vidrio. Siempre se debe usar juntamente con este equipo un indicador de anaerobiosis que permita demostrar que en la jarra de vidrio no existe oxgeno libre. Los indicadores de anaerobiosis tambin se fabrican comercialmente y son parte de este sistema. Hay que tener cuidado con los catalizadores de paladio; es necesario reemplazarlos cada 20 usos o calentarlos antes de usarlos. 2. Utilizando sustancias qumicas reductoras de oxgeno. Segn el mtodo de Brewer se colocan las sustancias qumicas reductoras en cajas petri diseadas con este propsito. 3. El uso de Tioglicolato: este es un medio de cultivo que favorece el crecimiento de aerobios, microaeroflicos y anaerobios estrictos. Si a ste se lo enriquece con el 10 o 25% de lquido asctico o suero de conejo, constituye un excelente medio para bacterias difciles de cultivar. Hay que tener cuidado que el indicador de oxgeno no sobrepase el 1/3 del tubo con el medio, en este caso es necesario someter al medio a ebullicin y evitar la presencia de oxgeno. 4. Cubrir el medio de cultivo con una sustancia que impida el paso de 02 por ejemplo aceite mineral, glicerina o parafina.

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5. La produccin del 5 al 10% de C02, que favorece el crecimiento de ciertas bacterias; se obtiene mediante la combustin de una vela en un recipiente cerrado, sin embargo este mtodo no sirve para el crecimiento de bacterias anaerobias estrictas.

COLONIAS:

PREPARACION DE FROTIS.LABORATORIO CLINICO

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Robert Koch y Ehrlich fueron los pioneros en determinar los mtodos de fijacin y coloracin de las bacterias. Las bacterias son generalmente transparentes, esto dificulta el estudio de su morfologa, actualmente existen muchos procedimientos de coloracin que son de gran ayuda en el reconocimiento de bacterias, estas coloraciones se deben realizar siempre con cultivos jvenes (24 horas). En todo procedimiento de coloracin el primer paso es la preparacin del frotis. a) A partir de un medio lquido: 1. Sobre un portaobjetos limpio y sin grasa, colocar con el asa previamente estril y fra, una a dos gotas de cultivo, extendindolas para que forme una pelcula delgada y se pueda visualizar mejor. 2. Dejar secar al medio ambiente y luego fijar el frotis al calor. b) A partir de un medio slido: 1. Sobre el portaobjetos colocar con el asa una gota de agua destilada 2. Esterilizar el asa, enfriarla, tomar una colonia bacteriana, extendindola en la gota de agua hasta que se forme una pelcula delgada. 3. Dejar secar al medio ambiente y luego fijar el frotis al calor. c) Directamente: 1. Con un hisopo tomar la muestra clnica a examinarse. 2. Con este hisopo realizar el frotis teniendo cuidado de obtener capas finas. 3. Dejar secar al medio ambiente y luego fijar el frotis al calor. Tener presente que siempre se debe esterilizar el asa antes y despus de utilizarla con cultivos.

COLORACION DE MICROORGANISMOS
Se puede observar la morfologa bacteriana en preparaciones en fresco, especialmente si se desea determinar la motilidad, en este caso las clulas bacterianas estn vivas, son incoloras y difcilmente se distinguen del medio en el que estn suspendidas. La coloracin de clulas bacterianas muertas fijadas en un frotis presenta ventajas: 1. Permite observar un contraste entre la morfologa de la clula bacteriana y el medio en el que se encuentra. 2. Utilizando colorantes especficos se puede distinguir estructuras celulares como flagelos, esporas, ncleo, pared celular, cpsula, etc.

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3. Permite utilizar la magnificacin ms alta del microscopio (objetivo 100X de aceite de inmersin). Existen varios colorantes y mtodos utilizados en la observacin de las clulas bacterianas:

1. COLORACIONES SIMPLES
Los colorantes son sales-en las que uno de los iones cargados positiva o negativamente est coloreado. Por ejemplo, el Azul de Metileno, qumicamente es el Cloruro de Azul de Metileno que se disocia en Azul de Metileno + y Cloruro - . El ion positivo coloreado es el Azul de Metileno. Las clulas bacterianas suspendidas en un medio neutro tienen una carga negativa. La diferencia de cargas produce una afinidad entre el colorante y la clula bacteriana permitiendo la coloracin de la bacteria. Los colorantes pueden ser bsicos y cidos. Si el color est en el ion cargado positivamente el colorante es bsico, por ejemplo el Azul de Metileno. Si el color est en el ion cargado negativamente el colorante es cido, por ejemplo la Eosina, la Nigrosina (tinta china).

COLORACIN DIRECTA CON COLORANTES BSICOS

Al utilizar los colorantes bsicos la clula bacteriana se tie directamente, sin embargo existe diferencias en el grado de coloracin con cada colorante bsico; Azul de Metileno reacciona lentamente y se necesita aplicarlo por 30 a 60 segundos para que la clula bacteriana se coloree. Cristal violeta y Carbol Fuchsina reaccionan ms rpidamente, se obtienen buenas coloraciones aplicando 10 segundos con Cristal violeta y 5 segundos con Carbol Fuchsina.

PROCEDIMIENTO
1. Realizar y fijar el frotis de la suspensin bacteriana a colorearse. 2. Cubrir el frotis con uno de los colorantes y tomar el tiempo: Azul de Metileno 30 segundos, Cristal violeta 10 segundos, Carbol Fuchsina 5 segundos. 3. Lavar delicadamente con agua de la llave o destilada 4. Secar a medio ambiente 5. Ver al microscopio con lente de inmersin 100X

COLORACIONES NEGATIVAS O INDIRECTAS CON COLORANTES ACIDOS

Los colorantes cidos, coloreados en el ion negativo no se combinan con la clula bacteriana porque sta tambin est cargada negativamente y ms bien

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forman depsitos alrededor de la clula; es decir la bacteria no se colorea directamente, pero se visualiza con ms precisin su forma y tamao, al estar libres rodeadas del colorante. La Nigrosina o tinta china se la utiliza para visualizar las cpsulas de muchos microorganismos, especialmente Cryptococcus neoformans. La tinta china forma un fondo oscuro donde se visualizan las levaduras del Cryptococcus rodeadas de espacios transparentes que corresponden a las cpsulas.

PROCEDIMIENTO:
1. Sobre un portaobjetos limpio, mezclar 2 gotas de la suspensin bacteriana con 1 gota de tinta china 2. Cubrir la mezcla con un cubreobjetos 3. Ver al microscopio con lente de inmersin. Reducir la luz del microscopio bajando el condensador 4. Las clulas bacterianas no se colorean, estn rodeadas de una zona negra del colorante.

COLORACION GRAM
La Coloracin Gram permite diferenciar a las bacterias en dos grupos: Las Gram (+) que retienen el primer colorante utilizado el cristal violeta porque su pared es menos permeable y resiste la decoloracin y las Gram (-), bacterias que tienen una pared celular ms permeable, se decoloran y se tien con el segundo colorante: safranina.

Gram negativa

Gram positiva

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Fuente: fai.unne.ar/biologa/bacterias/micro4.html

Todas las BACTERIAS GRAM (+) tienen: 1. Una pared celular gruesa de peptidoglucano (60 - 100%), 2. Algunas bacterias Gram (+) tienen cidos teicoicos que pueden constituir el 40% del peso de la pared celular y estn covalentemente unidos al cido murmico del peptidoglucano. Tambin pueden estar presentes cidos teicoicos que se originan en la membrana celular y estn unidos a glucolpidos. Los cidos teicoicos son antignicos. LABORATORIO CLINICO

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La pared celular de las BACTERIAS GRAM (-) consiste de: 1. Una capa de peptidoglucano que no contiene cidos teicoicos sino lipoprotenas elpticas pequeas llamadas lipoprotenas murmicas, encargadas de unir la capa de peptidoglucano con la membrana externa 2. La membrana externa, compuesta de una doble capa de fosfolpidos en la parte ms externa de la doble capa estn los lipopolisacridos Los lipopolisacridos contienen 3 compuestos covalentemente unidos: a) Cadena especfica O Ag O, formada de 1 a 50 azcares que difieren de una bacteria a otra y son antignicas. b) Una parte central soluble en agua llamada Core, formada de cadenas cortas de dos polisacridos, estructura constante en las bacterias Gram () c) Lpido A, un glucolpido: disacrido con cadenas cortas de cidos grasos. El lpido A es txico para los humanos y se lo conoce con el nombre de Endotoxina Entre la membrana externa se encuentran las porinas (protenas) que permiten el paso de los nutrientes. Entre la membrana citoplasmtica y la capa de peptidoglucano est el espacio periplasmtico lleno de un gel que contiene protenas y enzimas. El peptidoglicano de las bacterias (c) Gram (+) y Gram (-) consiste en un polisacrido formado por molculas alternadas de N-acetil glucosamina y N-acetil cido murmico con cadenas cortas de pptidos (aminocidos) unidos al N-acetil cido murmico. Las cadenas de pptidos juntan a otros aminocidos vecinos formando una estructura entrelazada y estable.

REACTIVOS: 1. CRISTALES DE VIOLETA

Solucin A: Cristales de violeta Alcohol etlico 95% 20 g 100 ml

Esta solucin se puede mantener en una botella oscura durante perodos largos de tiempo. Solucin de trabajo:

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Diluir la solucin de cristal violeta 1:10 (100 ml en 1000 ml) con agua destilada y mezclar con cuatro volmenes de la solucin de Oxalato de amonio. Guardar en una botella oscura. Por ejemplo a 100 ml de Solucin de trabajo de Cristal violeta se aade 400 ml de Oxalato de amonio. Solucin B: Oxalato de amonio Agua destilada 1g 100 ml

2. SOLUCION IODADA DE GRAM

Cristales de iodo Ioduro de potasio Bicarbonato de sodio al 5% Agua destilada Mezclar bien y guardar en botella oscura. 1g 2g 60 ml 240 ml

3. DECOLORANTE
Etanol 95% Acetona Mezclar bien y guardar en botella oscura. 250 ml 250 ml

4. SAFRANINA
Cristales de safranina Etanol 95% Solucin de trabajo: Diluir la solucin anterior a 1:5 o 1:10 con agua destilada; guardar en botella oscura. 0 100ml 2.5 g 100 ml

PROCEDIMIENTO.- (Mtodo rpido)

Realizar y fijar el frotis de la muestra a colorearse. Cubrir el frotis con el colorante de violeta por pocos segundos, desechar el colorante del frotis Colocar la solucin iodada de Gram, desechar, volver a poner la solucin yodada, lavar delicadamente con agua corriente o con agua destilada Tomar por un extremo a la placa y dejar chorrear la solucin alcoholacetona hasta que no tenga color

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Lavar inmediatamente con agua corriente o con agua destilada. Colocar la safranina, desechar, volver a poner por 10 segundos Lavar y dejar secar. Ver al microscopio con lente de inmersin 100 X

(Mtodo tradicional) a) b) c) d) e) f) Cristal violeta 1 minuto lavar Solucin iodada 1 minuto lavar Alcohol-acetona 50 segundos lavar Safranina 1 minuto Lavar y dejar secar Ver al microscopio con lente de inmersin 100 X

RESULTADOS:
Gram (+) = morados (color de la violeta) Gram (-) = rosados (color de la safranina)

COLORACION ALCOHOL- ACIDO- RESISTENTE:

Mtodo Ziehl - Neelsen

FUNDAMENTO: Esta tcnica diferencial de coloracin es usada para la

identificacin de Mycobacterias y Nocardia. Estos microorganismos poseen una lipoprotena que fija la fucshina bsica, una pared celular muy resistente que evita la decoloracin con alcohol-cido.

REACTIVOS:
1. CARBOLFUCSHINA: Cristales de fucshina bsica Alcohol etlico 95% Fenol (cristales diluidos) Agua destilada 100 50 950 3 ml ml ml g

2. ALCOHOL - ACIDO:
Diluya 30 ml de HC1 (concentrado) en 970 ml de alcohol etlico 95%

3. AZUL DE METILENO:
Disuelva 3 g de azul de metileno en 1000 ml de agua destilada.

PROCEDIMIENTO:
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Hacer y fijar el frotis Colocar carboifucshina y dar vapores por 5 minutos con una llama tenue Lavar con agua corriente o agua destilada Con alcohol-cido decolorar a un rosado plido, hasta que no se desprenda ms colorante Lavar bien con agua Colocar azul de metileno por 1 minuto Lavar y secar Ver al microscopio con lente de inmersin

RESULTADOS:
BAAR = toman el color rojo-rosado Los dems organismos y clulas toman el color del azul de metileno.

COLORACION DE ESPORAS
Mtodo de Moeller

FUNDAMENTO: Las esporas son cuerpos fuertemente refractarios y

resistentes al calor, desecacin y desinfectantes. Son difciles de teir, pero una vez teidos son difciles de decolorar

REACTIVOS:
Fucshina carblica de Ziehl Neelsen cido sulfrico al 1%: cido sulfrico concentrado agua destilada Azul de metileno 1 ml 99 ml

PROCEDIMIENTO:
1. Hacer el frotis y fijar al calor 2. Cubrir el frotis con fucshina (Ziehl-Neelsen), suministrar calor hasta que se desprendan vapores.

COLORACION DE ESPIROQUETAS:
Mtodo Fontana- Tribondeau

FUNDAMENTO:
Las espiroquetas son microorganismos difciles de colorear, sin embargo tienen afinidad por colorantes que contienen Nitrato de plata

REACTIVOS:
1. Solucin Fijadora: LABORATORIO CLINICO

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cido actico Agua destilada 2. Solucin Mordiente Acido Tnico Fenol Agua destilada 3. Solucin impregnadora: Nitrato de Plata NH4OH 10% Agua Destilada

10 ml 100 ml

5 1

g g 100

ml

5 10 100

gr ml ml

A 60 ml de la solucin de nitrato de plata aadir gota a gota el hidrxido de amonio hasta que el precipitado que s e forma se disuelva. Aada la solucin restante de nitrato de plata hasta que aparezca una turbidez que no se pierda aunque se agite.

PROCEDIMIENTO:
1. Hacer los frotis (heces, sangre, exudados de encas). Estos frotis deben ser gruesos. 2. Colocar la solucin fijadora por 90 min. 3. Lavar con agua corriente (si existe grasa en el frotis se debe lavar con ter o alcohol). 4. Colocar la solucin mordiente y suministra vapores por 30 seg. 5. Lavar con agua corriente. 6. Colocar la sustancia impregnadora, suministre vapores por 30 seg. El frotis se torna color caf. 7. Lavar con agua corriente. 8. Secar y ver al microscopio con lente de inmersin.

RESULTADOS:
Las espiroquetas se ven como espirales de un color marrn oscuro en un fondo marrn claro.

TAXONOMIA BACTERIANA

Se considera a la Taxonoma como la ciencia de la clasificacin y comprende dos subdisciplinas principales: la identificacin y la nomenclatura.

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La taxonoma bacteriana se ha basado en anlisis fenotpicos para la clasificacin, los anlisis fenotpicos han tenido un papel destacado en la identificacin y la clasificacin especialmente en situaciones prcticas, por ejemplo, en el diagnostico microbiolgico clnico. Sin embargo actualmente se estn introduciendo inclusive en la microbiologa clnica tcnicas genotpicas para la identificacin. La unidad taxonmica bsica es la especie y se la puede definir como una coleccin de cepas similares que difieren de otros grupos de cepas asegurando su reconocimiento. Los grupos de especies se renen en gneros, por lo tanto un gnero puede definirse como un grupo de especies distintas pero comparten propiedades principales que definen dicho gnero. Los gneros se agrupan en familias, las familias en rdenes, las ordenes en divisiones, hasta alcanzar el nivel taxonmico ms alto que es el dominio. La familia es el taxn superior que se emplea de manera rutinaria en estudios taxonmicos de procariotas. Siguiendo el Sistema Binomial de Nomenclatura a todas las bacterias se les asigna un nombre de gnero y otro de especie. El nombre del gnero se puede abreviar e indicarse con una sola letra mayscula: el nombre correspondiente a la especie no se abrevia nunca, Ej. Escherichia coli se escribe normalmente E. coli. Los nombres de especies y gneros son derivados griegos o latinos relacionados con alguna propiedad de la bacteria en cuestin y siempre se debe escribir con la letra cursiva. El manual de Bergeys es un compendio de informacin clsica y molecular sobre todas las especies reconocidas de procariotas, es un trato taxonmico, consta de cuatro volmenes, en su ltima edicin. El volumen 1 contiene las bacterias Gram negativas de importancia mdica o industrial; el volumen 2, las bacterias Gram positivas de importancia mdica o industrial, el volumen 3, las restantes Gram negativas, las arqueas y las cianobacterias; y el volumen 4, las bacterias Gram positivas filamentos y formadoras de esporas (actinomicetos). A continuacin se describen las pruebas bsicas bioqumicas y enzimticas utilizadas en la identificacin de microorganismos en nuestros laboratorios clnicos, logran una diferenciacin aceptable.

PRUEBA DE CATALASA
Finalidad: Esta prueba se utiliza primordialmente para diferenciar los siguientes gneros microbianos:

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1 Estafilococo (+) y/o Micrococo (+) de Estreptococos (-) 2 Bacillus(+) de Clostridium (-) 3 Listeria monocytogenes (+) y/o Corynebacterium (+) de Erysipelothrix(-). Excepciones: Corynebacterium pyogenes (-) Corynebacterium haemoliticum (-)

Fundamento: La catalasa fue una enzima (hemoprotena) que se encuentra en la mayora de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas. Esta enzima cataliza la rotura del agua oxigenada, liberando oxigeno libre. 2H2O2 catalasa 2H2O + O2 Bacteria Reactivo: H2O2 al 3%

PROCEDIMIENTO:
Mtodo A: Poner una gota de H2O2 al 3% sobre la colonia que ha crecido en agar nutritivo o a un a cultivo puro crecido en medio lquido que se quiere probar que tiene la enzima catalasa. Una produccin inmediata de burbujas indica una reaccin positiva.

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Mtodo B: En un portaobjetos poner una a tres colonias, o una gota de cultivo lquido a examinarse. Anadir una gota de H2O2 al 3% y observar por la produccin inmediata de burbujas.

RECOMENDACIONES:
La actividad de la catalasa puede ser inhibida en medios fuertemente cidos. Hay que tener mucho cuidado si la prueba se hace sobre medios que contiene sangre ya que en los eritrocitos tambin posee la enzima catalasa, por lo que hay que tomar en cuenta que la produccin de burbujas se produce a partir de las colonias y no del medio de cultivo.

PRUEBA DE COAGULASA
Finalidad: Identificacin y diferenciacin de Staphylococus aureus coagulasa positiva de Staphylococus coagulasa negativa.

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Fundamento: La coagulasa es una protena dotada de una actividad que convierte el fibringeno en fibrina. Existen dos tipos de coagulasa: libre y ligada; cada una con caractersticas especficas asi como diferentes procedimientos para detectar. Coagulasa ligada (prueba en placa): llamada tambin factor de agregacin, se encuentra pegada a la pared celular bacteriana; la fibra se forma entre las paredes de las clulas bacterianas al contacto con el plasma, un resultado positivo es la formacin de cmulos. La actividad de la coagulasa ligada no es inhibida por los anticuerpos anti-coagulasa libre.

Coagulasa libre (prueba en tubo) es extracelular y tiene una actividad semejante a la trombina, utiliza los factores de coagulacin del plasma para formar un coagulo visible. En la prueba en tubo se detecta sin embargo los tipos de coagulasa.

PROCEDIMIENTO:
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Prueba en la Placa (coagulasa ligada) 1 Sobre un portaobjeto limpio colocar una gota de agua destilada o solucin salina 0.8% estriles. 2 Con un aplicador o asa estriles tomar 4 a 5 colonias de la bacteria a examinar, depositarla en la gota de agua destilada o solucin salina 0,8% y emulsificarlas hasta que se forme una suspensin homognea. 3 Con una pipeta Pasteur estril aadir una gota de plasma fresco a la suspensin anterior. 4 Mezclar con una aplicador por 5 segundos.

Resultados:
Las bacterias coagulasa (+) forman grumos visibles en 20 segundos Se considera un resultado (-) si no aparecen grumos dentro de 4 minutos Todo resultado negativo debe chequearse con la prueba en tubo. Prueba en tubo (coagulasa libre y ligada) 1. Poner con una pipeta Pasteur estril 0.5 ml de plasma fresco en un tubo fresco y estril 2. Con un aplicador 0 asa estril tomar 4 a 5 colonias de la bacteria a examinar y depositar en un tubo con plasma anterior. 3. Incubar el tubo en un bao Mara a 37oC. 4. Despus de 4 horas chequear la formacin de un coagulo visible que indicara un resultado positivo. Si no se observa el coagulo volver a incubar el tubo y chequear a las 8-12 y 18 horas. Recomendaciones: Siempre se debe usar controles (+) y (-) Siempre se debe trabajar con cultivos puros El plasma puede ser de conejos o humanos El plasma debe ser fresco y a partir de EDTA Plasma citratados pueden incurrir en resultados falsos positivos por que ciertas bacterias como S. faecalis pueden crecer en estos plasmas produciendo grumos de calcio que se confunden con cogulos.

PRUEBA DE OXIDACION Y FERMENTACION DE LA GLUCOSA

Finalidad: Diferenciar el gnero Estafilococo (0+, F+) del genero Micrococos (O+, F+). Fundamento: Los estafilococos son anaerbicos facultativos y pueden utilizar la glucosa por va oxidativa y fermentativa; los micrococos son aerobios estrictos y utilizan la glucosa nicamente por va oxidativa.

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Reactivos: Medios de cultivo OF (Oxidacin/Fermentacin) de 1% de glucosa Aceite mineral estril

PROCEDIMIENTO:
a) Con un asa recta sembrar por picadura las colonias a examinarse en dos tubos OF b) A un tubo OF una vez sembrado , aadir 1 ml de aceite mineral estril c) Incubar los dos tubos OF aerbicamente a 36oC por 24 a 48 horas.

Resultados: La utilizacin de glucosa se manifiesta por el cambio de color del medio de cultivo de azul verdoso a amarillo debido a la produccin de cido a partir de la glucosa y el cambio de pH del medio de cultivo. Si los dos tubos no cambian de color se debe incubar nuevamente.

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RECOMENDACIONES:
La solucin de glucosa al 1% se debe aadir al medio base OF ya esterilizados y luego distribuir 2 ml en tubos estriles.

PRUEBA DE RESISTENCIA A LA NOVOBIOCINA

Finalidad: Diferenciar S. saprophyticus (R) con S. epidermis (S). Fundamentos: Los S. saprophyticus son resistentes a 5 mcg de novobiocina y esta propiedad es de gran utilidad para diferenciarlo de S. epidermis.

PROCEDIMIENTO:

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1. Sembrar las colonias sospechosas de S. saprophyticus en estras muy juntas y sobre la superficie de Mueller Hinton Agar. 2. Poner en el centro de la siembra un disco de papel filtro que contenga 5 mcg de novobiocina 3. Incubar aerbicamente a 36oc por 24 horas Resultados: Se considera resistente si no aparece zona de inhibicin junto al disco de novobiocina

Resistente

Sensible

RECOMENDACIONES:
Los discos de novobiocina tienen que ser 5 mcg de lo contrario se alteran los resultados. Hay que asegurar que son cocos Gram (+), ciertos bacilos Gram (-) pueden tambin ser resistentes a la novobiocina.

PRUEBA DE SENSIBILIDAD A LA BACITRACINA

Finalidad: Identificacin de Streptococcus beta hemoltico Grupo A (S. pyogenes). Fundamento: La mayora de Streptococcus beta hemoltico Grupo A son sensibles a la bacitracina a concentraciones de0.04 unidades. Reactivo: Taxo A disco de papel filtro impregnado con 0.04 unidades de bacitracina.

PROCEDIMIENTO:

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1. Con un asa estril sembrar las colonias sospechosas de Streptococcus beta hemoltico Grupo A sobre la superficie de un agar sangre fresco de cordero, la siembra debe ser densa. 2. Colocar en el centro de la siembra un Taxo A con bacitracina 0.04 unidades. 3. Incubar 24 horas a 360C y aerbicamente. Resultados: Cualquier cosa de inhibicin se considera positiva, es decir sensible a la bacitracina.

Resistente

Sensible

RECOMENDACIONES:
El agar sangre debe ser fresco y hmedo para que la bacitracina se difunde en el medio. El crecimiento debe ser denso para abservar5 mejor la zona de inhibicin. Se puede utilizar 1/4 de la caja de agar sangre para una determinacin. Los discos de bacitracina (Taxo A) se debe guardar en el refrigeradory chequear la efectividad con controles + y cada dos semanas. Esta prueba se debe usar nicamente para diferenciar estreptococos betas hemolticos.

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BACTERIOLOGA MDICA

Las pruebas de inmunofluorescencia o serolgicas con antisueros especficos se utiliza para confirmar la determinacin de Streptococcus beta hemoltico Grupo A.

PRUEBA DE CAMP
Finalidad: Identificacin presuntiva del Streptococcus beta hemoltico Grupo B. Fundamento: En esta prueba se detecta el fenmeno ltico de los eritrocitos de cordero que ocurre por accin de la toxina extracelular del Streptococcus grupo B y la toxina beta del S. aureus (cepa 681). PROCEDIMIENTO: 1. Estriar S. aureus (cepa 681) en el centro de una caja bipetri de agar sangre de cordero, en lnea horizontal recta. 2. Las colonias sospechosas de Streptococcus grupo B se estran en lnea vertical recta (2-3 cm de longitud), en ngulo recto a la estra S. aureus teniendo cuidado de no topar la estra S. aureus. de CO2 (3-5%) O 3. Incubar 18-24 horas a 360C en atmosferas aerbicamente Resultados: Positivo Se distingue una zona clara de beta hemolisis en forma de punta de flecha, entre las estriaciones del S. aureus y el Streptococcus grupo B.

Negativo No se distingue ninguna punta de flecha.

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RECOMENDACIONES:
Siempre se debe usar agar sangre de cordero. Se debe usar controles + y -. Algunos Streptococcus grupo D pueden presentar resultados +. Se debe confirmar la identificacin del Streptococcus grupo B con la prueba de hidrlisis del hipurato de sodio o con pruebas serolgicas.

Streptococcus grupo B

S. aureus (cepa 681)

HIDRLISIS DEL HIPURATO DE SODIO (Mtodo rpido)

Finalidad: Identificar Streptococcus beta hemoltico grupo B. Fundamento: El Streptococcus beta hemoltico grupo B tiene una enzima la Hipuricasa hidrolasa, que tiene la capacidad de hidrolizar el hipurato de sodio con la formacin de benzoato de sodio y glicina. La presencia de glicina (compuesto alfa amino) se detecta al aadir ninhidrina que es un oxidante fuerte que de amina los grupos alfa aminos con liberacin NH3 y CO2. El NH3 liberado reacciona con la ninhidrina para formar una solucin de color purpura. Reactivo: 0.4 ml de hipurato de sodio acuosa el 1%.

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3.5% de ninhidrina en una mezcla de acetonametanol a volmenes iguales (50 ml acetona, 50 ml metanol).

PROCEDIMIENTO:
1. Incubar una asa llenas de colonias sospechosas de Streptococcus grupo B en un tubo que contiene 0.4 ml de hipurato de sodio al 1%. 2. Incubar a bao Mara por 2 horas a 350C 370C. 3. Con una pipeta Pasteur aadir 0.2 ml (5-6 gotas) de ninhidrina e incubar por 10 minutos en el mismo bao Mara. Resultados: Positivos: Color purpura intenso

Negativo: incoloro

RECOMENDACIONES:
El Tiempo de incubacin de 2 horas se considera apto para que se observe la reaccin. Con incubacin a temperatura ambiente se necesita 4 horas para que se observe la reaccin. Se debe usar controles + y -.

HIDRLISIS DE BILIS ESCULINA

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Medios sin inocular

Finalidad: Identificar Streptococcus grupo D (+). Identificar Listeria monocytogenes (+). Fundamento: La esculina es un glucsido (acetal) que por accin de una enzima del Streptococcus grupo D, y Listeria monocytogenes se descompone en esculetina y glucosa. La esculetina reacciona con sales de hierro presentes en el medio del cultivo para formar un precipitado negro o caf oscuro. Citrato frrico (0.05%) se incorpora al medio de cultivo de bilis esculina como el indicador de hidrlisis de la esculina y la formacin de esculetina. Reactivos: Bilis Esculina Agar

PROCEDIMIENTO:
1. Estriar las colonias sospechosas de Streptococcus grupo D o Listeria monocytogenes en el fondo y superficie del medio de Bilis Esculina Agar. 2. Incubar aerbicamente por 18-24 horas a 360C. Resultados: Positivo: Precipitado negro, cambio de color de amarillo a negro.

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Negativo: Ningn cambio de color.

TOLERANCIA A CONCENTRACIONES DEL 6.5% DE CLORURO DE SODIO

Finalidad: Identifica Enterococcus grupo D (+). Fundamento: Los Enterococcus son resistentes a cambios fsicos y qumicos; as pueden crecer a 100C, como tambin a 450C, en altas concentraciones de ClNa e inclusive en MacConkey. Reactivos: Caldo nutritivo con 6.5% de ClNa.

PROCEDIMIENTO:
1. Sembrar las colonias sospechosas de Enterococcus en un caldo de ClNa. 2. Incubar por 18 24 horas a 360C aerbicamente. Resultados: Positivo: Crecimiento (medio turbio).

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Negativo: No crecimiento.

RECOMENDACIONES:
Confirmar que son Streptococcus, S. aureus puede crecer en este medio de cultivo.

SENSEBILIDAD A LA OPTOQUINA
Finalidad: Diferenciar Streptococcus pneumoniae (sensible) de otras especies de Streptococcus alfa hemolticos (resistentes). Fundamento: La optoquina (Clorhidrato de etilhidrocupreina), un derivado del alcaloide hidroquinona, en concentraciones de 5mcg inhibe el crecimiento del Streptococcus pneumoniae. Reactivos: Discos de optoquina 5mcg (Taxo P).

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BACTERIOLOGA MDICA

PROCEDIMIENTO:
1. Estriar las colonias sospechosas de S. pneumoniae sobre la superficie de un agar fresco; la siembra se debe realizar de tal manera que se obtenga un crecimiento denso. (Se puede utilizar 1/4 de la caja de agar sangre para una determinacin). 2. Colocar en el centro de la siembra un disco de optoquina de 5mcg. 3. Incubar 18 24 horas a 360C y en atmosfera con CO2 (3 5%). Resultados: Sensible: Si existe una zona de inhibicin por lo menos de 14 mm de dimetro.

Resistente: No hay zona de inhibicin.

PRUEBA DE OXIDASA
Finalidad: Ayuda a la identificacin de: Neisserias (+) Aeromonas (+) Pseudomonas (+ la mayora) Alcaligenes (+) Branhamella (+) Moraxella (+)

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Enterobacterias (-) Yersinia (-) Fundamento: Las bacterias oxidasa (+) posee la enzima oxidasa que acta como catalizador en reacciones de xido reduccin de citrocromos. La presencia de esta enzima se puede detectar por el cambio de color de la bacteria cuando se aade reactivos que son receptores y donadores de electrones. Estos substratos son sin color o coloreados dependiendo del estado de oxidacin, la reaccin final de la oxidasa presenta un producto coloreado (colonia se vuelve negra). Reactivos: Reactivo de kovacs: 1% clorhidrato de tetra metil-p fenilendiamina (no muy estable). Reactivo de Carpenter, Suhrland y Morrison: 1% Oxalato de p-amino dimetil anilina (estable hasta 6 meses). BBL: Taxo N (P-aminodimethylaniline ca 0.9 mg).

PROCEDIMIENTO:
1. Sobre las colonias sospechosas poner 1 2 gotas de uno de los reactivos o un Taxo N, la reaccin se dar entre 10 y 15 segundos con el reactivo de Carpenter y con el Taxo N se demora hasta 10 minutos. Resultados: Positivo: Cambio de color de la colonia a rosado y luego a negro.

Directamente sobre las colonias Con inoculo

Taxo N

RECOMENDACIONES:

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No se debe realizar la prueba de oxidasa sobre colonias que crecen en medio de glucosa ya que la fermentacin de esta inhibe la accin de la oxidasa. No se debe tomar en cuenta el cambio de color del medio de cultivo, sino el de la colonia para reportar una prueba (+). Estudios espectrofotomtricos han demostrado que la citocromooxidasa e indofenol-oxidasa son las mismas.

FERMENTACION DE CARBOHIDRATOS
Fundamento: La mayora de microorganismos al igual que los humanos utilizan varios carbohidratos: como principal fuente de energa. La utilizacin de los carbohidratos y los productos formados de esa fermentacin son especficos para cada especie de microorganismos, siendo producto de fermentacin los cidos orgnicos como: lctico, actico, butrico, propionico, etc.; productos neutrales como acetona, alcohol butrico, alcohol etlico y varios gases como metano, hidrogeno y CO2. Entre los tpicos de carbohidratos ms utilizados por los microorganismos se pueden anotar los siguientes: Monosacridos Hexosas (C6H12O6) Glucosa (dextrosa) Fructosa (levulosa) Galactosa Manosa Sorbosa Pentosas (C5H10O5) Arabinosa Xilosa Ramnosa (C6H12O6) Alcoholes Polihdricos Manitol Pentosa (C5H8O4) Araban Xilan Glucsidos Salicin Disacridos (C12H22O11) Maltosa Sucrosa Lactosa Celobiosa Melibiosa Trisacridos (C18H32O16) Rafinosa Melicitosa Polisacridos Hexosas (C6H10O5)n Almidn Inulina Dextrina Glucgena Galactan Celulosa

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Glicerol Adonitol Dulcitol Sorbitol

Amigdalin Esculina

FUENTE: Seeley, H, VanDermark, P, Microbes in action. A. Laboratory Manual of Microbiology, Octava Edicin, 1992 En el laboratorio se determina la utilizacin de un carbohidrato por la acidez del medio y la presencia de gas. El indicador de pH ms utilizado es el rojo fenol, siendo rojo a pH 8.5 y amarillo a pH 6.9. La presencia de gas se detecta por los espacios vacos en los tubos durham. Medios de cultivos: Rojo fenol con tubo durham conteniendo por separado un solo tipo de carbohidrato de 0.5 al 1%.

PROCEDIMIENTO:
Con el asa estril y fra tomar e inocular la colonia a examinarse en 5ml de rojo Fenol (varios tubos con diferentes carbohidratos) Incubar de 24 48 horas a 350C. Leer los resultados.

Resultados: Positivo: Color amarillo y presencia o ausencia de gas en el tubo durham.

Positivo con produccin de gas gas Negativo: Color rojo.

Positivo sin produccin de

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Negativo

Medio sin inocular

RECOMENDACIONES:
En casos de duda incubar ms tiempo (3 das).

FERMENTACION DE CARBOHIDRATOS EN CISTINA TRIPTICASA AGAR (CTA)

Fundamento: La diferencia de especies de Neisseria se puede determinar por la produccin de cido en la fermentacin de carbohidratos en el CTA. El CTA es un medio de cultivo semislido que favorece el crecimiento de muchos microorganismos incluyendo las Neisserias. Varios carbohidratos como glucosa, maltosa, sucrosa, fructuosa y lactosa se aade por separado al medio de CTA a una concentracin del 1% para observar la utilizacin del carbohidrato. Medios de cultivo: CTA conteniendo por separado un solo tipo de carbohidrato al 1%.

PROCEDIMIENTO:
a) Con el asa estril y fra tomar e inocular de un cultivo puro varias colonias al tubo de CTA varios tubos con diferentes carbohidratos o prepara una suspensin densa del subcultivo puro en solucin salina estril o en caldo tripticasa y con una pepita estril depositar una pocas gotas de esa suspensin en la superficie del CTA, luego con una asa estril y fra introducir la suspensin hasta un tercio del medio. b) Tapar bien los tubos si es posible con parafina o en atmosfera de CO2. c) Incubar 24 48 horas a 350C. d) Leer los resultados. Resultados:

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Positivo: Color amarillo

Negativo: Color rojo

RECOMENDACIONES: En caso de dudas incubar ms tiempo (3 das). La incubacin en atmosferas de CO2 puede producir acidez del medio causando resultados falsos positivos. Por eso se recomienda inocular hasta la tercera parte del medio porque el fondo debe permanecer rojo.

UTILIZACION DE FACTORES DE CRECIMIENTO X Y V

Finalidad: Esta prueba se utiliza para diferenciar especies de Haemophylus . Fundamento: El factor X (Hemina o Hematina) es un derivado sanguneo por digestin o degradacin. El factor V (Coenzima I o NAD) se obtiene por extraccin de levaduras o patatas y tambin es producido por algunas bacterias

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como el S. aureus. Estos factores se requieren individualmente o en combinaciones por las varias especies de Haemophylus y de all su utilizacin para la diferenciacin de estas especies. Medios de cultivos: Mueller Hinton Caldo BHI Factores X,V y X-V en papel filtro

PROCEDIMIENTO:
1. Tomar colonias aisladas y sospechosas de Haemophylus para preparar una suspensin en el BHI. 2. Con un hisopo, sembrar la suspensin anterior sobre la superficie de una caja de Mueller Hinton, la siembra debe ser densa. 3. Colocar los discos de papel filtro con los factores X, V y X-V sobre la siembra anterior y separados entre s por 20 mm de distancia. 4. Incubar de 18 24 horas a 35 370C con 10% de CO2. 5. Observar crecimiento visible junto a los discos que contienen los factores. Resultados: Crecimiento junto al disco con el factor X y X- V requerido El factor X es

Crecimiento junto al disco con el factor V y X-V requerido

El factor V es

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Crecimiento junto al disco con el factor X-V: son

Los factores X-V

Requeridos.

PRUEBAS BIOQUMICAS UTILIZADAS EN LA DIFERENCIACIN DE ENTEROBACTERIAS

1.- Fermentacin de carbohidratos en TSI (Triple sugar iron agar) o en KIA (Kliger iron agar) 2.- Produccin de H2S 3.- Produccin de indol 4.- Rojo de metilo 5.- Voges Proskauer

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6.- Utilizacin de Citrato 7.- Utilizacin de Malonato 8.- Hidrlisis de urea 9.- Motilidad 10.- Decarboxilacin y/o deaminacin de amino cidos 11.- Fermentacin de carbohidratos como: manitol, dulcitol, salicina, adonitol, inositol, sorbitol, arabinosa, rafinosa, oramnosa. 12.- Licuefaccin de gelatina 13.- DNAsa 14.- ONPG 15.- KCN

REACCIONES EN TSI O EN KLIGER IRON AGAR

Fundamento: Estos medios de cultivo contienen 4 tipos de protenas que proporcionan los nutrientes ms adecuados para la mayora de bacterias (excluyendo los anaerobios); TSI contiene tres azcares: glucosa, lactosa y sucrosa, Kliger tiene glucosa y lactosa; el Rojo fenol se aade como indicador de fermentacin y el Sulfato ferroso para indicar la produccin de H2S (precipitado negro). Estos medios se los preparan en tubos que proporcionan una parte profunda (3cm) y una inclinada. Al inocularlos, las bacterias utilizan las protenas por oxidacin por lo tanto este metabolismo se realizar en la parte inclinada del tubo, en cambio la fermentacin de carbohidratos (proceso anaerobio) se realizar en el fondo del tubo. La concentracin de glucosa con respecto a los otros azcares es de 1/10; esto permite identificar que las bacterias catabolizan y consumen la glucosa en primer lugar. Las bacterias al oxidar las protenas generan aminas y hacen que el medio sea alcalino (rojo), en tanto que la fermentacin de carbohidratos genera cidos y el medio cambia a amarillo. Si la bacteria solo fermenta glucosa (1/10 de la concentracin de los otros azcares) produce poca cantidad de cido que se observa solo en el fondo del tubo. En cambio s una bacteria fermenta todos los azcares, la cantidad de cidos producida se manifiesta en todo el tubo, se logra tapar la alcalinidad producida en la parte inclinada del tubo. Procedimiento:

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1. Con el asa en punta estril y fra tomar la parte central de la colonia preferentemente sembrar por picadura en el fondo y estril en zigzag en la superficie del tubo. 2. Incubar a 35 37C por 24 horas (la tapa de os tubos debe estar floja) Resultados: El cambio de color rojo a amarillo en el fondo del tubo significa fermentacin de la dextrosa o glucosa: K/A El cambio de color en todo el tubo demuestra la fermentacin de los tres azucares: A/A El gas /G) se detecta por espacios o grietas en el agar El H2 S se reconoce por el precipitado negro

Recomendaciones:

Los resultados se deben leer hasta 48 horas despus de la siembra para evitar falsas interpretaciones. Las lecturas se hacen en base de tablas.

PRODUCCIN DE S
Fundamento: Ciertas bacterias por accin enzimtica pueden liberar 2 S a partir de compuestos qu contienen azufre. Pueden ser compuestos orgnicos peptonas, cistena, cistina y de compuestos inornicos: tiosulfato. El 2 S es un gas incoloro por lo que es necesario aadir al medio de cultivo indicador (sales ferroces o iones de metales como plomo, hiero o bismuto), estos en contacto con 2 S, forman precipitados negros (sulfitos) en el medio de cultivo. Procedimiento: 1. Sembrar la bacteria en el medio del cultivo que contiene una fuente de azufre y un indicador de H2 S La sensibilidad de la deteccin de 2 S varia con el tipo de indicador usado, ejemplo el medio de SIM es ms que el KIA y este es ms sensible que el TSI. El acetato de plomo es el mejor indicador.

Recomendaciones:

Resultados: Positivo: Presencia de precipitado negro

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Negativo: Ningn precipitado

PRODUCCIN DE INDOL
Fundamento: El triptfano es un amino cido que puede ser oxidado por ciertas bacterias y dar tres metabolitos indlicos: indol, skatole (metil-indol) e indolacticos. Las enzimas encargadas de estas reacciones son las triptofanasas. El cido indol pirvico es el compuesto intermedio de mayor importancia en la degradacin del triptfano y a partir del cual el indol se puede formar por deaminacin. La presencia de indol se puede detectar al aadir un compuesto qumico (para-dimetil-amino-benzaldehido) al cultivo de bacterias (incubadas previamente 24 horas) y observar la formacin de una sustancia coloreada en la superficie del medio de cultivo. Triptofanasa Triptfano Deaminacin Para dimetil amonio-benzaldehido LABORATORIO CLINICO Indol + cido pirvico y amonio

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= sustancia coloreada Medios de cultivo: Caldo de triptfano SIM MIO Reactivos de Ehrlich: Alcohol etlico 95% Paradimetil amino benzaldehido HCI concentrado

190 ml 2g 40 ml

Disolver el aldehdo en el alcohol y lentamente aada el cido. Guardar en botella oscura en el refrigerador. Procedimiento: 1. Sembrar por picadura la bacteria a examinarse en el medio de cultivo por 24 horas e incubar a 35C. 2. Aadir 0.5 ml de reactivo de Ehrlich. A veces es necesario aadir ter antes del reactivo de Ehrlich para que se observe mejor la reaccin. Resultados: Positivo: anillo rojo en la superficie del medio despus de 5 minutos de haber aadido el reactivo de Ehrlich.

PRUEBA DE ROJO DE METILO

Fundamento:

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El rojo de metilo es un indicador de pH (rojo = acido, amarillo = alcalino) que permite identificar la concentracin de los iones hidrogeno presentes cuando un microorganismo fermenta la glucosa. Las bacterias rojo de metilo (+) fermentan la glucosa con la produccin de cidos estables: lctico, succnico, actico y frmico, manteniendo una alta concentracin de iones hidrogeno (pH 4.2 o menor). Medio de cultivo: Clark and Lubs Medium (MRVP) pH6.9 Reactivo: Rojo de metilo Rojo de metilo Alcohol etlico 95% Agua destilada

0.1 g 300 ml 200 ml

Disolver el colorante en el alcohol, luego aadir el agua destilada. Procedimiento: 1. 2. 3. 4. Sembrar la bacteria a examinarse en 0.5 ml de MR VP. Incubar a 35C por 24-48 horas Aadir 5 a 6 gotas de rojo de metilo Leer inmediatamente

Resultados: Positivo: color rojo brillante

Negativo: amarillo, o colores intermedios se consideran negativos

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Recomendaciones: No se utiliza mucha cantidad de medio MRYP para facilitarle a la bacteria a tiempo suficiente para que consuma toda la glucosa del medio. En caso de duda incubar hasta 5 das y ver la reaccin.

PRUEBA DE VOGES-PROSKAUER
Fundamento: Esta prueba se utiliza para detectar la habilidad de ciertas bacterias de producir acetona (un producto final, neutral) a partir de la fermentacin de glucosa. La glucosa es metabolizada a cido pirvico, un producto intermedio, clave en la gliclisis; a partir de cido pirvico las bacterias toman diferentes vas de degradacin de la glucosa y la produccin de acetona (acetil-metil-carbinol) puede ser una va. En la presencia de oxigeno atmosfrico y un lcali (KOM) la acetona es oxidada a diacetilo, el cual, produce el color rojo caracterstico de la prueba (+) de Voges-Proskauer. El alfa naftol que tambin se aade al realizar la prueba sirve de catalizador en la oxidacin de acetona a diacetilo. Mtodo de cultivo: MRVP pH 6.9 Reactivo N 1 Alfa naftol Alcohol etlico absoluto Reactivo N 2 Hidrxido de potasio Agua destilada 5g 100 ml

40 g 100 ml

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Disolver los solutos en los disolventes Procedimiento: 1. 2. 3. 4. Sembrar la bacteria a examinar en 1.0 ml del medio MRVP Incubar 24-48 horas a 35C. Aadir 0.6 ml de alfa naftol y 0.2 ml de KOM 40% Agitar suavemente el tubo y exponer el medio a2 atmosfrico para que se produzca la oxidacin de la acetoina y as observar el color rojo de la reaccin (+) 5. Leer los resultados despus de 10 a 15 minutos.

Resultados: Positivo: color rojo

Negativo: color amarillo

Recomendaciones: LABORATORIO CLINICO

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Se puede utilizar NaOH 40%, en lugar de KOM 40%. En casos de duda incubar ms tiempo (5 das)

UTILIZACIN DE CITRATO
Fundamento: Ciertas bacterias pueden utilizar el citrato como nica fuente de carbono con la produccin de alcalinidad. El citrato es degradado primero a piruvato y luego a acetato, acetona, lactato. Estos productos hacen que el pH del medo de cultivo se vuelva alcalino y el indicador de pH del medio (Azul de bromotimol) cambie de color verde (pH 6.9) a un azul Prusia (pH 7.6) Medio de cultivo: Simmons Citrato agar Procedimiento: 1. Sembrar la bacteria a examinarse en la parte inclinada del medio de cultivo 2. Incubar 24 horas a 35C Resultados: Positivo: Cambio de color a un azul prusia Negativo: no hay cambio de color

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MOTILIDAD
Fundamento: La presencia de flagelos hace que una bacteria sea motil. Existen colaboraciones especiales que permiten observar estos flagelos, sin embargo en la rutina se siembra la bacteria en un medio semislido o se observa la motilidad en suspensin al microscopio con lente 4oX. En el medio semislido si la bacteria solo crece en el lugar de inoculacin la bacteria ser no motil pero si se extiende hacia los lados y superficie la bacteria ser motil. En suspensin cuando la bacteria es no mtil solo sigue en movimiento browniano; si es mtil se mueve a todos los lados. Medios de cultivo: SIM (motilidad, indol y H2S)

MIO (motilidad, indol, ornitina) Procedimientos: 1. Sembrar la bacteria a examinarse por picadura (asa recta) en el medio 2. Incubar 24 horas a 35 C Resultados: Positivo: Crecimiento extendido, el medio se vuelve a turbio

Negativo: Crecimiento nico en el sitio de inoculacin

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UTILIZACION DE MALONATO
Fundamento: Ciertas bacterias pueden utilizar malonato sdico como la nica fuente de carbono, con la produccion de alcalinidad. El indicador azul de bromo timol a un pH 6.7 es de color verde (medio sin inocular) y a un pH 7.6 cambia a un color azul prusia. Medio de cultivo: Malonato broth pH 6.7 Procedimiento: 1. Sembrar la bacteria a examinarse en 1 ml de Maldonado broth 2. Indicar 24 horas a 35C Resultados: Positivo: Cambio de color de verde a azul prusia

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Negativo: No cambia de color

HIDRLISIS DE LA UREA
Fundamento: Ciertas bacterias tienen enzimas ureasa que descompone a la urea en amonio y CO2 con la produccin de alcalinidad. El medio de cultivo tiene como indicador de pH el roo fenol, siendo de color amarrillo- rosado a un pH de 6.8-7

Procedimiento: 1. Sembrar la bacteria en tubos inclinados de urea agar 2. Incubar 24 horas a 35C LABORATORIO CLINICO

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Resultados: Positivo: Cambio de color a rosado intenso o rojo, determina la hidrolisis de la urea

Negativo

Positivo

LICUEFACCIN DE LA GELATINA
Fundamento: La gelatina es incorporada a un medio de cultivo para determinar la habilidad de una bacteria de hidrolizar la gelatina con la utilizacin de enzimas llamadas gelatinasas. Medio de cultivo: Tioglicolato - gelatina pH7.0 Procedimiento: 1. Sembrar la bacteria en el medio (4 a 5 m) a 1 pulgada en forma densa 2. Incubar a 22 25C o 35C, 24 horas hasta 14 das Resultados: Positivos: Crecimiento y licuefaccin positiva si despus de introducir el tubo en el Refrigerador por 2 horas se mantiene lquido.
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Negativo: medio slido Positivo: Medio licuado (estado lquido)

DECARBOXILACION Y DEAMINACION DE AMINOCIDOS

Fundamento: Las bacterias pueden degradar los aminocidos mediante enzimas decarboxilasas (degradan a partir del grupo carboxilo COOH) o por enzimas deaminasas (degradan a partir del grupo amino NH2 ). Para la identificacin de enterobacterias se utiliza con ms frecuencia la decarboxilacin de los amincidos: orniitina y arginina. De la decarboxilacin de estos aminocidos se obtienen las siguientes aminas: Lisina Ornitina Arginina cadaverina putrecina citrulina

La arginina puede convertirse por el sistema enzimtico arginina-hidrolasa en citrulina, luego la citrulina en ornitina y la ornitina en putrecina: y por el sistema arginina-decarboxilasa en agmantina y luego en putrecina. Sin embargo para que se activen las enzimas decarboxilasas necesitan de energa para lo cual se hace necesario aadir al medio de cultivo a ms del aminocido: glucosa, para que la bacteria al fermentar la glucosa obtenga energa. Como estas reacciones implican cambios de pH es necesario que el medio de cultivo tenga un indicador de pH que permita detectar la fermentacin de glucosa con la produccin de cido y luego la decarboxilacin del aminocido con la produccin de alcalinidad.

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Por otro lado, la decarboxilacin se realiza en anaerobiosis para la cual se hace necesario aadir aceite mineral o parafina al medio de cultivo semislido MOELLER o en medios solidos como LysinaIron Agar, preparar tubos inclinados con un fondo de por lo menos 3 cm: en los cuales la decarboxilacin de lisina se observar solo en el fondo del tubo y la deaminacin, una reaccin aerbica, solo en la parte inclinada. El indicador de pH del LIA es le prpura de bromocresol (pH cido 5.2 = color amarillo: pH alcalino 6.8 = color prpura). El medio LIA contiene Tiosulfato de sodio y Amonio frrico que permiten observar la produccin de H2S. Medio de cultivo: LysinaIron Agar en tubos inclinados Procedimiento: 1. Con el asa en punta estril y fra tomar la parte central de la colonia preferentemente, sembrar por picadura en el fondo y estriar en zigzag en la superficie del tubo. 2. Incubar a 35 37 C por 24 horas (la tapa de los tubos debe estar floja) Resultados: Positivo: El NO cambio de color en el fondo del tubo indica decarboxilacin de lisina (produccin de la amina cadavrica).

Negativo: El cambio de color de purpura a amarrillo en el fondo del tubo indica ausencia de decarboxilacin.

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DEAMINACION DE FENILALANINA
Fundamento:

La presencia de un precipitado negro indica produccin de 2 S

El amino fenilalanina puede ser denominado en cido fenil pirvico, un ketoacido de color verde presencia de cloruro frrico al 10%. Medio de cultivo: Fenilalanina agar en tubos con superficie inclinada Reactivo: Solucin acuosa de Cloruro frrico al 10% Procedimiento: 1. Con el asa en punta estril y fra tomar la parte central de la colonia preferentemente sembrar por picadura en el fondo y estriar en zig zag en la superficie de tubo. 2. Incubar a 35.37C por 24 horas (La tapa de los tubos debe estar floja) 3. Incubar 4 a 5 gotas de cloruro frrico directamente sobre el crecimiento bacteriano. Resultados: Positivo: Presenta de color verde sobre el crecimiento bacteriano indica deaminacin de fenilalanina

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Negativo: Ausencia de color verde

ONPG
Fundamento: En esta prueba se determina la presencia o ausencia de la enzima bacteriana galactosidasa, al utilizar un sustrato orgnico: orto-nitrofenil-piranosidegalactosido (ONPG). Las bacterias fermentadas de lactosa tienen dos enzimas la galactosidasapermeasa y la D-galactosidasa. La - galactosidasapermeasaest localizada en la membrana celular y se encarga del paso de la lactosa al interior de la clula, en cambio la D-galactosidasa est en el interior de la clula y se encarga de la hidrlisis de la lactosa para dar galactosa y glucosa. Las bacterias fermentadoras lentas de lactosa necesitan concentraciones del 1% de este carbohidrato y un tiempo ms prolongado para demostrar la presencia de la -galactosidasapermeasa. Esta dificultad se soluciona en el laboratorio al

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utilizar el ONPG, un sustrato orgnico muy parecido a la lactosa. Que al ser hidrolizado presenta un compuesto amarrillo de O- nitrofenol (ONP). Reactivo: Disco de papel filtro impregnados con ONPG Procedimiento: 1. Hacer una suspensin bacteriana densa en tubos con 1 ml de solucin salina estril 2. Aadir a esta suspensin un disco de ONPG 3. Incubar en bao mara a 36C hasta 4 horas Resultados: Positivos: Presencia de una suspensin de color amarrillo

Negativo:

No hay cambio de color

Recomendaciones:

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El tiempo de incubacin mxima es de 4 horas, algunas bacterias dan reacciones positivas en menos tiempo Se puede utilizar ONPG en solucin, en este caso se recomienda que el pH debe ser alcalino.

RECAUDACIN DE NITRATOS
Fundamento: Las bacterias varan en su capacidad de reducir los nitratos a nitritos, inclusive a gas nitrgeno o amonio. Todas las enterobacterias reducen nitratos as como C. disphteriae y Acynetobacter spp. Las bacterias que poseen la enzima nitrato reductasa dan reacciones positivas, en las cuales los nitratos se combinan con un sustrato acidificado de naftilamina para formar un producto final coloreado de rojo, pero si la bacteria ha producido gas de nitrgeno o amonio no se presentara este producto coloreado, por lo que es necesario comprobar la presencia de gas nitrgeno o amonio aadiendo Zinc metlico en polvo: si despus de aadir Zinc en polvo no se presenta este producto coloreado, por lo que es necesario comprobar la presencia de gas nitrgeno o amonio aadiendo Zinc metlico en polvo: si despus de aadir el zinc en polvo no se presenta cambio de color la reaccin es positiva ; si se presenta el producto coloreado significa que el Zinc reduce el nitrato a nitrito y no la bacteria. La reaccin de nitratos a nitritos se realiza en condiciones de anaerobiosis. Reactivos: Reactivo A: cido sulfanilico cido actico (5M) Reactivo B: N,N-dimetil-l-naftilamino 3 ml cido actico (5M) 500ml Reactivo C: Zinc en polvo Medio de Cultivo: inclinados Nitrato de Agar (contiene Nitrato de potasio) en tubos con un fondo de por lo menos 3 cm. O nitrato Caldo con tubos Durham. 4g 500ml

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Procedimiento: 1. Inocular el medio de cultivo 2. Incubar a 35C por 24-48 horas 3. Aadir 3 gotas del reactivo A y 3 gotas del reactivo B al crecimiento bacteriano 4. Esperar 30 minutos para observar el cambio de color 5. Si no se observa cambio de color aadir una pizca de Zinc en polvo y observar la presencia o ausencia de color Resultados: Positivos: Presencia de gas por agrietamiento del agar o espacios en los tubos Durham, desarrollo de color rojo despus de aadir los reactivos A y B. Ausencia de color rojo despus de aadir el zinc en polvo

Negativo: Ausencia de color despus de aadir los reactivos A y B. Presencia de Color rojo despus de aadir el Zinc.

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BIBLIOGRAFIA:
KONEMAN, Diagnostico bacteriolgico, texto y atlas a color, 6ed, Panarmericana, Argentina, 2006. MACFADIN, Pruebas bioqumicas para la identificacin de bacterias de importancia clnica, 3ed, Panarmericana, Argentina, 2003. BAILEY Y SCOTT, Diagnostico bacteriolgico, 12ed Panamericana, Argentina, 2007. GONZALEZ MELENDES Roberto, Atlas de Pruebas Bioqumicas para identificar bacterias, Universidad Autnoma de Mxico, Pg. 12-175, Mxico D.F, 2003 KISER Karen M., Clinical Laboratory Technology/Phlebotomy St. Louis, MO USA, 2008 SOSA Mara de los ngeles, Pruebas bioqumicas de Identificacin; Universidad de Santiago de Chile, Santiago de Chile, 2012 PHILLIPS EA, Tapsall JW, SMITH DD, Prueba de CAMP para la identificacin de Streptococcus agalactiae (grupo Lancefield B)". Pg.: 135-198. Washington D.C, 2007

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