LA ENDOSPORA BACTERIANA Y LA ESPORULACIN

1.1 INTRODUCCIN A LA ESPORULACIN BACTERIANA

Algunas especies de bacterias Gram positivas (principalmente de los gneros Bacillus, Clostridium, Sporosarcina y Thermoactinomyces), disponen de una notable estrategia adaptativa cuando se ven sometidas a privacin de nutrientes en su medio ambiente: si los niveles de fuentes de C, N, o P caen por debajo de un umbral, esto constituye una seal a la clula de que se avecina un largo perodo de privacin de nutrientes. Entonces, la clula se implica en una serie de complejos cambios genticos, metablicos, estructurales, etc. (proceso de esporulacin o esporognesis), que conducen a la diferenciacin, en el interior de la clula vegetativa original, de una clula durmiente (la endospora). La clula-madre (o sea, la clula vegetativa original que gener la endospora) finalmente se autolisa, liberando la espora, que es capaz de permanecer en estado criptobitico, durmiente, varios decenios, -incluso siglos. Las esporas son fcilmente diseminadas por el aire; cuando caen en medios ricos en nutrientes, se desencadena su germinacin, se reinicia la actividad metablica, de modo que cada espora genera una nueva clula vegetativa, capaz de divisn binaria, etc. O sea, la esporulacin se puede considerar como un proceso de supervivencia en ltima instancia, la ltima carta que se juegan ciertas bacterias Gram positivas cuando se enfrentan a condiciones severas de hambre de nutrientes. Significado adaptativo: Estas bacterias suelen vivir en medios nutricionalmente pobres (suelos, hierba seca, etc.). La esporulacin es un proceso muy refinado que ha aparecido evolutivamente en una lnea filogentica de bacterias Gram-positivas, y que les permite sobrevivir largos perodos de carencia nutricional. (Atencin: NO son estrictamente formas de resistencia). Las endosporas son formas de reposo (y no formas reproductivas), que representan una etapa del ciclo de vida de ciertas bacterias, y que se caracterizan por una estructura peculiar, diferenciada respecto de las clulas vegetativas, por un estado metablico prcticamente detenido, y por una elevada resistencia a agentes agresivos ambientales. La esporulacin bacteriana es un sistema modelo donde se pueden estudiar, con relativa sencillez, determinados problemas biolgicos ms generales: qu bases moleculares y genticas tiene la diferenciacin de un tipo de clula a otro tipo distinto?, cmo se regula el proceso en funcin del tiempo y del espacio?, cmo se reparten los papeles los tipos celulares implicados?, etc. Por esta razn, presenta un enorme inters para los bilogos, interesados en escudriar las bases ntimas de este tipo de importantes cuestiones, tan frecuentes en los organismos superiores.

1.2 OBSERVACIN DE LAS ESPORAS

Al microscopio ptico, en fresco (sin teir), aparecen como cuerpos esfricos, ovoides e incluso en algunas especies, cilndricos, muy refringentes, libres, o an incluidos en la clula vegetativa (clula madre). Esporangio = clula madre + espora El tamao relativo de la espora, y su situacin en el esporangio, son criterios taxonmicos importantes en las bacterias esporulantes. Segn que el dimetro de la espora sea o no mayor que el de la clula vegetativa: Esporas deformantes Esporas no deformantes Segn la localizacin de la espora dentro del esporangio: Terminal Subterminal Central Los esporangios deformantes de Clostridium son caractersticos: en forma de cerilla o palillo de tambor (plectridios) en huso (clostridios) Tincin: No se tien por los colorantes normales. Hay que forzar por calor y/o mordientes (por ejemplo, tras teir reforzadamente con fuchsina, resisten decoloracin por alcoholClH). Otra tincin muy empleada es la reforzada con verde de malaquita (que es la que el alumno realiza en nuestras prcticas de laboratorio).

1.3 ESTRUCTURA Y COMPOSICION QUIMICA DE LA ENDOSPORA

Partes que comprende la endospora: Protoplasto o ncleo (core, en ingls), con la membrana citoplsmica de la espora (membrana esporal interna). Pared de la espora (= Germen de la pared de la futura clula vegetativa). Corteza o crtex, rodeado externamente de la membrana esporal externa. Cubiertas Exosporio (no universal: las esporas de algunas especies carecen de l).

Micrografa electrnica que muestra las partes principales de una endospora

1.3.1

PROTOPLASTO O NCLEO

El citoplasma de la espora est muy deshidratado. Sus componentes estn inmovilizados en una matriz de quelatos de iones Ca++ y cido dipicolnico. El citoplasma de la espora contiene altas concentraciones de ion Ca++ (1-3% del peso seco de la espora), y de cido dipicolnico (DPA) (10% en peso); ambos estn formando un quelato, llamado dipicolinato clcico (DPC), una sustancia exclusiva de las esporas bacterianas. Papel del DPC: Como veremos, es una reserva de Ca2+, que durante la esporulacin secuestra este in, lo que tendr un papel importante en la deshidratacin del protoplasto; durante la germinacin, la liberacin del Ca2+ ser fundamental en este proceso. El protoplasto contiene un cromosoma completo, condensado, y todos los componentes indispensables para reiniciar el crecimiento vegetativo cuando la espora germine, pero carece de muchos componentes tpicos de la clula vegetativa: posee una pequea dotacin de ribosomas, junto con componentes estables de la maquinaria de sntesis de protenas (ARNt, cofactores, etc.) ARN polimerasa. nuclesidos mono- y difosfatados, pero no NTP (no hay ATP) carece de componentes inestables: no hay ARNm, ni enzimas biosintticas, ni aminocidos ni bases nitrogenadas libres, ni cofactores reducidos (NADH; CoA) pero en cambio, existe una gran cantidad de una serie de pequeas protenas especiales (llamadas SASP, del ingls small acid-soluble

proteins). Cuando se produzca la germinacin, estas protenas sern hidrolizadas rpidamente, y los aminocidos resultantes sern empleados en la sntesis de nuevas protenas necesarias en la germinacin y crecimiento ulterior. Adems, las SASPs estn acomplejando al ADN (induciendo en l un cambio conformacional hacia la rara forma A, en vez de la B habitual), protegindolo del dao por luz UV. la moneda energtica de la espora es el 3-fosfoglicerato, otra molcula estable del protoplasto, que ser convertido rpidamente a 2-fosfoglicerato, y de l a PEP (fosfo-enol-pirvico) al germinar la espora (el PEP es donador de P para generar ATP). Rodeando al protoplasto est la membrana citoplsmica (membrana interna de la espora), una bicapa lipdica carente de fluidez, posiblemente como resultado de su estructura policristalina.

1.3.2

PARED DE LA ESPORA

Situacin: inmediatamente por encima de la membrana interna de la espora (ver micrografa a microscopio electrnico, o el esquema de la ultraestructura). Composicin: a base de un peptidoglucano (PG) similar al de la clula vegetativa, con sus caractersticos enlaces entre los tetrapptidos. Funciones: al germinar la espora, dar lugar a la pared celular de la nueva clula vegetativa, confirindole, mientras tanto, resistencia osmtica. Origen: se sintetiza a partir de la prespora, atravesando los precursores la membrana interior que hemos citado arriba.

1.3.3

CORTEZA O CRTEX

(Obsrvese su aspecto a microscopio electrnico: transparente a los electrones, relativamente gruesa, a base de lminas concntricas). Composicin: un peptidoglucano (PG) especial, diferente en composicin al PG de la clula vegetativa: 30% del NAM tiene tetrapptidos normales, pero el grado de entrecruzamiento es muy bajo (6%). 15% del NAM tiene solo la L-ala inicial, en lugar de tetraptido. 55% de una modificacin del cido murmico (lactama del cido murmico), producida por condensacin del -COOH lactilo con el -NH2, para formar la lactama correspondiente). Origen: Se sintetiza a partir de la clula madre, con sus intermediarios ensamblados a nivel de la membrana externa que rodea a la corteza. Propiedades de la corteza:

1) Tiene un bajo grado de puentes entre tetrapptidos (slo un 6%). Ello condiciona: a) una estructura ms laxa, floja y flexible que el peptidoglucano normal, capaz de expandirse en ausencia de cationes que neutralicen sus grupos negativos (sobre todo del mDAP y del glutmico de los tetrapptidos). Esto es la base de su apariencia de gel. b) su rpida autolisis, durante la germinacin de la espora. 2) la lactama del murmico condiciona una gran resistencia a la lisozima. La corteza est limitada por la membrana esporal externa, procedente de invaginacin de la membrana citoplsmica de la clula vegetativa madre. Posee una polaridad opuesta a la de la membrana esporal interna.

1.3.4

CUBIERTAS

Composicin y estructura: la composicin depende de las especies, pero en general, a base de una o varias protenas de tipo queratina, todas muy ricas en cistena y en aminocidos hidrfobos, y que llegan a constituir el 60% en peso seco de la espora. Buena parte de la cistena se aade post-traduccionalmente, por modificacin de la protena inmadura. A microscopio electrnico se puede comprobar el gran grosor (volumen) de las cubiertas, y su aspecto relativmante denso a los electrones. Propiedades: son muy insolubles e impermeables, e impiden la entrada de numerosos agentes qumicos, incluyendo sustancias txicas. La abundancia de puentes S-S las hace muy compactas y muy estables qumicamente.

1.3.5

EXOSPORIO

En B. cereus es una estructura membranosa transparente, a modo de saco cerrado, delgado y flojo, envolviendo al resto de la espora de una forma suelta, despegado en principio respecto de las cubiertas (tras la liberacin de la espora, al perderse el contenido acuoso que haba entre exosporio y cubiertas, aquel se pega a stas). En B. subtilis y B. megaterium, el exosporio est envolviendo a la espora de una forma ms estrecha, estableciendo algunos contactos fsicos con la superfie de las cubiertas. Composicin qumica: mezcla de protenas, polisacridos complejos, y lpidos. Propiedades: muy resistente a enzimas proteolticas, lo que sugiere (pero no prueba directamente) que el exosporio puede representar algn papel como barrera de defensa externa de la espora.

1.4 DESENCADENAMIENTO DE LA ESPORULACIN

Para que se produzca la esporulacin, se necesitan dos condiciones previas: 1) los cultivos bacterianos han de estar en buenas condiciones; 2) cuando cesa el crecimiento exponencial, la mayora de las clulas entran en esporulacin, aunque el proceso no es sincrnico (hay desfases entre unas clulas y otras), de modo que en un lapso de tiempo relativamente breve (5,5-8 horas en Bacillus subtilis) casi todo el cultivo aparece en forma de esporas, habiendo desaparecido las clulas vegetativas. La divisin celular tpica de la fase de crecimiento exponencial y la esporulacin son procesos mutuamente excluyentes. Qu estmulo es el responsable de desencadenar la esporulacin? Lo que detiene el crecimiento de estas bacterias y dispara la esporulacin es un estado de inanicin, de carencia de nutrientes. El nutriente limitante que puede desencadenar la esporulacin puede ser: la fuente de carbono, la fuente de nitrgeno o incluso la carencia de fosfatos.

1.5 FASES DE LA ESPORULACIN

Vamos a estudiar la esporulacin en Bacillus subtilis o en B. megaterium, dos de las bacterias esporuladas mejor investigadas, y que completan la esporulacin al cabo de unas 7-8 horas de su inicio, a 37C. Se pueden distinguir siete fases consecutivas (adems de la fase 0 anterior a la esporulacin). Cada fase se denota con un nmero romano, y su duracin en horas se expresa como subndice de t, p. ej., t2. Como veremos enseguida, cada fase se distingue por un(os) evento(s) citolgico(s) peculiar(es) y por una serie de cambios bioqumicos propios: Fase 0 (clula vegetativa): Al final del periodo de crecimiento exponencial, la clula vegetativa contiene dos cromosomas. Fase I (t0-t1): El material gentico (los dos cromosomas) se condensa constituyendo un filamento axial ancho, que ocupa el centro de la clula, segn su eje longitudinal. Cada nucleoide est unido a uno de los extremos de la clula. En vez de iniciarse una divisin celular simtrica (con septo central), se forman dos espculas de la pared celular cerca de los polos hacia el interior, rodeadas de la correspondiente invaginacin de la membrana citoplsmica. Cada espcula est sealando una zona donde se est formando el anillo de FtsZ (protena contrctil de tipo tubulina: vase el tema 5) Se sintetizan y se liberan al medio antibiticos y varias exoenzimas. Una serie de proteasas se encargan del turnover de protenas intracelulares, cuyos aminocidos constituyentes sern empleados para sintetizar nuevas protenas especficas de la esporulacin. Fase II (t1-t2): Se termina por formar un septo transversal acntrico, cerca de un polo de la clula, por invaginacin de la membrana citoplsmica, y deposicin de nuevo peptidoglucano entre las dos membranas adyacentes. Cada nucleoide queda segregado en uno de los dos compartimentos que se han formado: un cromosoma va al compartimento pequeo (compartimento de la preespora); la otra copia del cromosoma va al compartimento grande (clula madre). En esta fase contina la sntesis de los antibiticos y de las exoenzimas (serina-proteasas, metalo-proteasas, ribonucleasas, a-amilasa, etc). Fase III (t2-t3): Independizacin del protoplasto de la preespora respecto de la clula madre. Para ello, lo primero que ocurre es la degradacin selectiva del peptidoglucano del septo que se haba depositado en la fase II (esta degradacin comienza por el centro, es decir, por donde se haba cerrrado, y

sigue hacia la periferia, y en ella intervienen los productos de varios genes). Entonces, la membrana citoplsmica de la clula madre va creciendo unidireccionalmente alrededor de la preespora, hasta que sta queda libre en el citoplasma del esporangio. Obsrvese que el citoplasma de la preespora queda rodeado por dos membranas de polaridad opuesta: la interior tiene la polaridad normal, pero la exterior, derivada del crecimiento de la membrana de la clula madre, tiene polaridad invertida A partir de esta fase el turnover (renovacin) de protenas slo tendr lugar en la clula madre, detenindose en el compartimento de la preespora. Fase IV (t3-t4): Se forma casi por completo la corteza de la espora, por deposicin de peptidoglucano entre las dos membranas. Sin embargo este PG an no est maduro (no tiene todava las caractersticas que estudiamos en el apartado 1.3.3). Tambin se deposita el peptidoglucano de la pared celular (que constituye el germen de la pared celular de la futura clula vegetativa). Coincidiendo con esto, la preespora adquiere su aspecto refrctil al microscopio ptico en fresco. Comienza la sntesis del cido dipicolnico (DPA), as como la acumulacin de Ca2+. En las bacterias que lo poseen, en esta fase comienza la sntesis del exosporio. Fase V (t4-t5,5): Los materiales de las cubiertas (que se haban ido sintetizando durante las fases II y III en el compartimento de la clula madre), comienzan a depositarse por fuera de la membrana esporal externa. Al final de esta fase se adquiere la resistencia al octanol. Contina la acumulacin de DPA, que sigue secuestrando iones Ca2+ (formacin del quelato de dipicolinato clcico, DPC). Fase VI (t5,5-t7): La preespora madura hasta espora. Madura la corteza (para generar el caracterstico PG cortical, ms laxo, con su bajo porcentaje de entrecruzamientos -por actuacin de endopeptidasasy la lactama del NAM). Maduran las cubiertas. El citoplasma de la espora se hace ms homogneo y ms denso a los electrones. Por una serie de razones an no totalmente aclaradas, la espora se hace resistente al calor y al cloroformo. Se adquiere resistencia a las radiaciones ultravioleta (UV). Se adquiere resistencia a la lisozima. Fase VII (t7-t8):

Liberacin de la espora madura por autolisis de la clula madre. las bacterias que han producido exosporio, cuando la espora sale al exterior, este exosporio pierde su contenido de citoplasma (procedente de la clula madre), quedando como un saco vaco y plegado, unido a las cubiertas. La parte superior de la figura muestra un grfico de los principales cambios que acabamos de comentar, expresados en funcin del tiempo transcurrido desde el inicio de la esporulacin.

1.6 GENTICA MOLECULAR DE LA ESPORULACIN

Las clulas pueden detener el proceso de la esporulacin si durante las 4 primeras fases se les suministra el nutriente que estaba limitando y que fue responsable del desencadenamiento (efecto de desbloqueo metablico). Pero a partir de la fase V el aporte de nutrientes no tiene ya ese efecto inhibidor: el proceso de la esporulacin ya es irreversible, y se dice que la clula est comprometida (= obligada) a esporular. El proceso de la esporulacin es muy ordenado en el tiempo y en el espacio. En su base gentica existe un conjunto de varios operones especficos de la esporulacin (operones spo), sometidos a un finsimo control gentico espacial y temporal. El conjunto de estos operones (que se encuentran en cuatro zonas distintas del cromosoma), se denomina esporuln, y comprende ms de 125 genes. Las principales caractersticas de los operones del esporuln son: Los operones estn inactivos durante el crecimiento vegetativo; se van activando de modo ordenado y secuencial, para luego ser reprimidos (una vez han actuado); estn sometidos a interacciones pleiotrpicas unidireccionales; existe una comunicacin regulatoria entre el compartimento de la espora y de la clula madre (interacciones espaciales); dentro de los mecanismos genticos implicados en la expresin y regulacin de los distintos operones correspondientes a fases distintas de la esporulacin, un papel muy importante es el jugado por las subunidades sigma () alternativas de la ARN-polimerasa.

1.7 CUERPOS PARASPORALES

Algunas bacterias esporuladas, como Bacillus thuringiensis, B. popiliae y algunas especies de Clostridium, forman cristales proteicos en el esporangio simultneamente a la formacin de la endospora: son los llamados cuerpos parasporales. Cada clula madre exhibe una sola inclusin, que se puede presentar libre en el citoplasma, o bien englobada en el exosporio de la espora. Los cuerpos parasporales pueden ser amorfos, pero los ms tpicos son pseudocristales octadricos (bipiramidales). Estn compuestos de la

agregacin regular de subunidades de una glucoprotena de unos 120 kDa, sintetizada durante la fase IV. La funcin de estos cuerpos parasporales en la esporulacin es desconocida (e incluso puede que de hecho, no tenga tal tipo de funcin). Bajo condiciones alcalinas, se disuelven y la protena se convierte en una poderosa toxina para larvas de lepidpteros y otros insectos, cuando las ingieren va oral (pero no por va parenteral). Veamos cmo se produce el proceso de la toxicidad: 1. La oruga come materia vegetal que lleva bacterias esporuladas. El cuerpo parasporal se libera junto con la espora, cuando la clula madre se autolisa. 2. Los cuerpos parasporales se disuelven en el tracto digestivo de la oruga (que es alcalino), la protena sufre proteolisis, lo que la transforma en una toxina. 3. Esta toxina altera la permeabilidad del epitelio intestinal de la oruga, de modo que los lquidos alcalinos del intestino pasan a la hemolinfa, que incrementa su pH por encima de 8, lo cual termina provocando la parlisis rpida del insecto, y finalmente su muerte. El significado biolgico ms probable de este fenmeno es que la produccin de cuerpos parasporales sea una variante de la esporulacin que evolucion durante la adaptacin de estas bacterias a sus nichos ecolgicos, como una manera de asegurar la germinacin de las endosporas: la oruga ingiere los cristales junto con las esporas. Los cristales parasporales matan a la oruga, que se pudre. La oruga muerta y en putrefaccin asegurara un entorno adecuado en nutrientes para que se alimentaran y multiplicaran las clulas vegetativas que surgieran de la germinacin de esas esporas. Desde hace tiempo ciertos grupos de agricultores vienen usando inculos de bacterias esporuladas de las especies productoras de cuerpos parasporales para rociar sus plantas y protegerlas de insectos: estamos ante un autntico insecticida biolgico, biodegradable, selectivo hacia las plagas e inofensivo para los seres superiores. La moderna Ingeniera Gentica ha logrado insertar y expresar genes codificadores de las toxinas parasporales de Bacillus thuringiensis en plantas de cultivo. Hoy da existen millones de hectreas de cultivo de plantas transgnicas "Bt" (sobre todo algodn, maz, y patata) que dependen menos de los insecticidas qumicos merced a estos genes bacterianos (aunque ello no ha evitado las crticas de ciertos grupos ecologistas opuestos por sistema a todo lo que suene a manipulacin gentica por tcnicas de ADN recombinante).

1.8 PROPIEDADES BIOLGICAS DE LAS ESPORAS: SU FUNDAMENTO

Las endosporas son clulas en estado de dormancia, con una bajsima tasa metablica (hipometabolia, la menor que existe en el mundo vivo), y capaces de conservar su vitalidad durante largusimos perodos. Son muy resistentes a la accin de diversos agentes qumicos (octanol, cloroformo) y fsicos (altas temperaturas, congelacin, desecacin, radiaciones). 1) Hipometabolia: Poseen la ms baja tasa respiratoria de todos los seres vivos. Por ello son capaces de sobrevivir en ausencia de nutrientes durante largos perodos de tiempo. 2) Dormancia: Esta propiedad se refiere al hecho de que la espora tiene una gran inercia a los sustratos exgenos. Como veremos, la espora slo perder la dormancia cuando se haya activado para la germinacin. 3) Resistencia al calor: Las esporas de ciertas especies resisten el calor hmedo de 120oC durante 10 min, lo cual condiciona los parmetros para esterilizar materiales (vase el captulo 13 titulado Accin de agentes fsicos sobre las bacterias). Esta elevada resistencia a las altas temperaturas es un subproducto de los cambios evolutivos que condujeron a la deshidratacin como medio para lograr la hipometabolia y la dormancia. Por lo tanto, la deshidratacin es la clave de las anteriores propiedades. (En cambio, como dijimos antes, al menos parte de la resistencia al calor seco, es decir, en ausencia de vapor de agua, se debe a las protenas SASP, que protegen al ADN de los daos oxidativos de este tipo de calor). 4) Deshidratacin: El muy bajo contenido en agua de la espora (0.3 g de agua/g de peso seco frente a los 3-4 g de agua/g de peso seco de la clula vegetativa) hace que la espora sea muy refrctil al microscopio ptico en fresco. Ello condiciona las propiedades 1, 2 y 3. Cul es el mecanismo de la deshidratacin, base a su vez de tantas propiedades biolgicas de las endosporas? El tema es an objeto de debate. Vamos a exponer brevemente una hiptesis (1989), segn la cual habra 3 etapas en la consecucin de la espora deshidratada y resistente al calor: a) En las fases III y IV el cido dipicolnico va entrando al protoplasto de la prespora. Simultneamente el Ca2+ entra desde el exterior a la clula madre por transporte activo, y de ella al protoplasto de la prespora por difusin facilitada. Se forma el correspondiente quelato de dipicolinato clcico (DPC). Este es un proceso con retroalimentacin positiva, ya que conforme el Ca2+ queda secuestrado en forma de quelato (lo que significa que no hay de hecho iones Ca2+ libres en el interior de la prespora), se facilita ms la entrada de mayores cantidades de Ca 2+. Parte del Ca2+ y de otros cationes se acomplejan tambin con macromolculas del protoplasto. Todo ello redunda en que la corteza se queda sin cationes; por lo tanto, no hay posibilidad de neutralizar las cargas negativas del peptidoglucano cortical las cargas negativas de la corteza se repelen se produce la expansin del peptidoglucano cortical en su expansin, la corteza se topa con las cubiertas

rgidas, por lo que presiona sobre el protoplasto sale ms agua del protoplasto. b) Resultado final: termoestabilizacin (= termorresistencia) del protoplasto. La gran prdida de agua hace que los diversos compuestos del protoplasto se compacten entre s, lo que facilita sus interacciones con los cationes. El resultado es la formacin de un gel a base de una matriz constituida por complejos supramoleculares, macromolculas y pequeas molculas densamente empaquetados, unidos entre s e inmovilizados. Parece ser que esta es la base principal de la enorme resistencia al calor hmedo por parte de la endospora. 5) Resistencia a los rayos UV: Parece que depende de varios componentes: a) absorcin de luz UV por las cubiertas; b) por el DPC; c) pero cada vez est ms claro que las protenas SASP tienen un papel central en esta resistencia a los UV. Como ya dijimos, las SAPS de tipo / acomplejan al ADN y favorecen su configuracin de tipo A, lo cual a su vez provoca un cambio en su fotoqumica (ver apartado siguiente); d) cambio en la fotoqumica del ADN de la espora: se puede explicar parcialmente por la misma deshidratacin del protoplasto, que impide que se formen dmeros de pirimidina entre pirimidinas adyacentes de una misma cadena del ADN. Como veremos en el captulo 13, estos dmeros de pirimidina constituyen el principal tipo de fotoproductos generados por rayos UV en el ADN de la clula vegetativa, base de la mayor parte de los efectos deletreos de estas radiaciones. Por otro lado, las SASP de tipo / que acomplejan el ADN hacen que en la espora la luz UV provoque otro tipo de alteracin, llamada fotoproducto de la espora (que consiste en 5-timinil-5,6-dihidrotimina) que se produce en menor cantidad. Aunque la acumulacin de fotoproductos de la espora puede ser igual de letal que la de los dmeros de pirimidina, cuando germina la espora se pone inmediatamente en marcha un eficiente sistema de reparacin especfico de ese fotoproducto. 6) resistencia a agentes qumicos: La resistencia de la endospora a agentes como octanol, cloroformo, etc. se debe a la impermeabilidad de las cubiertas, gracias a su gran grosor y su peculiar composicin a base de protenas ricas en aminocidos hidrfobos y con abundantes puentes disulfuro (cistinas). La resistencia a la lisozima se debe por un lado a la propia impermeabilidad de las cubiertas, y a la resistencia de la corteza.

1.9 GERMINACIN DE LA ENDOSPORA

La germinacin es el proceso por el cual una espora se convierte al estado vegetativo. Es mucho ms rpida que la esporulacin (dura unos 90 minutos). Podemos considerar en ella cuatro etapas, segn el modelo de Foster y Johnstone (1990): 1. preactivacin 2. activacin 3. iniciacin (o germinacin en sentido estricto) 4. crecimiento ulterior (entrada en fase vegetativa)

1.9.1

PREACTIVACIN

Antes de que la espora est en condiciones de germinar se requiere que sus cubiertas se alteren. En la naturaleza esto ocurre por erosin por envejecimiento progresivo. Artificialmente, en laboratorio, se puede recurrir a algn procedimiento para alterar esas cubiertas: tratando las esporas a altas temperaturas, pero inferiores a su inactivacin (100oC durante unos minutos); por radiaciones ionizantes; por pH bajos; por tratamiento con sustancias que posean grupos -SH libres (p. ej., mercaptoetanol).

1.9.2

ACTIVACIN

La activacin es una etapa an reversible, desencadenada por un agente qumico externo (germinante) presente en el medio. Este agente es variable segn las especies: iones inorgnicos (Mn2+, Mg2+); L-alanina en B. subtilis; glucosa u otros azcares; adenina u otras bases nitrogenadas.

INTRODUCCIN

Las caractersticas de calidad del huevo estn estrechamente relacionadas entre s y a nivel comercial determinadas por el peso, la forma, el color de la cscara, la solidez de la cscara y el grado de limpieza, as como los parmetros internos directamente relacionados con el grado de frescura y envejecimiento del huevo. Para determinar esta calidad podemos recurrir de modo rutinario a la inspeccin de ciertos elementos del huevo tanto en su exterior como interior. Desde el punto de vista de la evaluacin de calidad del huevo atendiendo a propiedades que podemos visualizar

externamente y con el huevo cerrado, hay que mencionar el peso, la forma, la integridad de la cscara y la presencia e integridad de la cutcula externa que recubre toda la cscara, protegiendo al huevo de contaminaciones. Estas caractersticas se pueden visualizar externamente mediante la observacin de los huevos al ovoscopio o con la ayuda de una lmpara de luz ultravioleta que ponga en evidencia la cutcula. En la actualidad los grandes centro de produccin realizan esta clasificacin con equipos automatizados (tal y como se muestra en la imagen). Las tcnicas de calidad interior, necesitan de la destruccin del huevo, y aunque sean ms precisas no permiten reutilizar este alimento. Estas tcnicas se basan en observar la calidad del huevo de acuerdo al aspecto que presenta la yema y la clara y en concreto se relaciona con ndices morfolgicos que varan como consecuencia de los procesos de envejecimiento. Adems, el estudio de calidad del huevo abierto nos permite medir otra serie de parmetros de inters para determinar su calidad como son el color de la yema, que determina la aceptacin organolptica de los huevos, el valor de pH de la clara, la presencia de manchas de carne o sangre en la clara y el espesor de la cscara.