CTEDRA: BIOQUMICA Carreras: Farmacia Profesorado en Qumica Licenciatura en Qumica Licenciatura en Alimentos

METABOLISMO DE HIDRATOS DE CARBONO 1) Se incuba glucosa marcada en el 14C1 con las enzimas glucolticas y los cofactores necesarios. Cul es la distribucin de 14C en el piruvato? Realice el mismo seguimiento con glucosa marcada en C2, C3, C4, C5 y C6. 2) En dos tubos diferentes se incubaron extractos celulares de msculo de conejo (tubo A) y de levaduras (tubo B) con fosfato y glucosa marcada isotpicamente ( 14C) en forma uniforme en un medio anaerbico (con NaN 3) a pH 5 y 30C. Las medidas de radioactividad, en alcuotas iguales de medio, a tiempo cero (antes de agregar las clulas) y luego de 1 h de incubacin se muestran en la siguiente tabla: Tiempo (min) 0 60 % Radiact. Tubo A 100 98 % Radiact. Tubo B 100 65

a) Qu explicacin encuentra para estos resultados? b) Construya una tabla con los valores tericos de % de radioactividad que esperara encontrar si el experimento se realizara en idnticas condiciones pero con ( 14C1) glucosa. c) Igual que en b pero con (14C3) glucosa. 3) Un experimento de pulso y caza usando fuentes de carbono marcadas radioactivamente es llevado a cabo en un extracto de levaduras mantenido bajo estrictas condiciones de anaerobiosis para producir etanol. El experimento consiste en incubar una pequea cantidad de sustrato marcado radioactivamente (el pulso) con el extracto de levaduras el tiempo necesario para que cada intermediario en la ruta metablica resulte marcado. La marca es luego cazada durante la ruta metablica por la adicin de un exceso de sustrato no marcado. El propsito de la caza es prevenir el reciclaje de los productos marcados y su ingreso a otras rutas metablicas. a) Cul es la localizacin del 14C en el etanol producido si la glucosa usada como sustrato estaba marcada en C1? b) Dnde se encontrara inicialmente la marca en la glucosa si todo el 14C se liberara como CO2? 4) En uno de sus clsicos experimentos Harden y Young, estudiando la fermentacin anaerbica de glucosa a etanol y CO 2 por levaduras, observaron que el fosfato era esencial para la fermentacin, y cuando ste se eliminaba o era consumido, la fermentacin cesaba an en exceso de glucosa. En estas condiciones se acumulaba etanol, CO2, y una hexosa bisfosfato. Adems, si se agregaba arseniato en estas condiciones, no se acumulaba la hexosa bifosfato y la fermentacin prosegua hasta terminar la glucosa. Explique. 5) Calcule la eficacia de recuperacin energtica en la gluclisis del eritrocito en base de los siguientes datos:
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Glucosa 2 Lactato ATP + H20 ADP + Pi

G0 = -47,0 Kcal/mol G,0 = -7,3 Kcal/mol Concentracin intracelular (mM) 5 1 0,14 1,85 2,90

Glucosa Pi ADP ATP Lactato

6) Se prepararon varios tubos de ensayo que contenan 1 ml de levaduras (2.10 7 clulas/ml) + 1 ml de una solucin reguladora + 3 ml de una solucin de glucosa 5 mM. A tiempo 0 se pusieron a incubar a 30C (la reaccin se dispar por el agregado de la glucosa). A los 3 min se les hicieron los agregados (1 ml en total) que se detallan en la columna A de la tabla y se tom una alcuota de 1 ml de la mezcla, se centrifug y a 0,5 ml de sobrenadante se lo hizo reaccionar por el mtodo de la glucosa oxidasa, obtenindose los valores de concentracin de glucosa que se indican en la columna B de la tabla. A los 30 min. se repiti la operacin (los datos obtenidos figuran en la columna C). Una con flechas los datos de la columna C a los de la columna B segn lo esperado para el consumo de azcar en cada condicin. Determine en cada caso la velocidad de consumo de glucosa en mol/min. A AGUA Pi 50 mM Pi + NaN3 Pi + NaF ARSENIATO 50 mM Pi + ARSENIATO ARSENIATO + NaN3 SACAROSA + Pi SACAROSA B C 2,5 mM 2,5 mM 1 mM 2,5 mM 0,32 mM 0,625 mM 1,5 mM 1,5 mM 0,90 mM

2.5 mM

7) Un cultivo bacteriano respirando activamente es incubado con glucosa- 14C1 y posteriormente se aislan los intermediarios del ciclo del cido ctrico, Dnde estar el 14C en cada una de las sustancias listadas abajo? Considerar slo la incorporacin inicial de 14C en estos compuestos: a) Fructosa-1,6-bisP, b) Acetil-SCoA, c) Gliceraldehdo-3-P, d) Fosfoenolpiruvato, e) Citrato, f) alfa-cetoglutarato, y g) Oxalacetato. 8) La respiracin celular puede ser estudiada usando preparaciones de mitocondrias aisladas y midiendo su consumo de O 2 bajo diferentes condiciones. Si 10 mM de malonato de sodio se agrega a mitocondrias que se encuentran respirando activamente usando piruvato como fuente combustible, se detiene la respiracin rpidamente y se acumula un intermediario metablico. a) Cul es la estructura del metabolito acumulado? Explique por qu se acumula. b) Por qu se detiene el consumo de O 2?
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9) Las rutas metablicas de compuestos orgnicos han sido estudiadas utilizando sustratos marcados radioactivamente. a) Cmo puede usted determinar si la glucosa agregada a una suspensin de mitocondrias aisladas es metabolizada a CO2 y agua? b) Suponga que usted agrega piruvato marcado con 14C en el metilo, despus de una vuelta del ciclo del cido ctrico, Cul es la posicin del 14C en el oxalacetato, y en cada uno de los intermediarios? c) Cuntas vueltas del ciclo son necesarias para que el 14C empiece a desprenderse como CO2? 10) Es posible obtener sntesis neta de oxalacetato agregando acetil-CoA a un extracto que contiene las enzimas y cofactores del ciclo del cido ctrico? 11) Supngase que se aade acetato marcado con 14C en el grupo metilo a cada una de las siguientes preparaciones celulares que respiran: a) Clulas hepticas b) Clulas hepticas a las que se ha adicionado malonato c) Plntulas de arveja A continuacin se aisla cido succnico de cada una de las preparaciones. Cules sern los tomos de C del cido succnico que se espera estn marcados?. Fundamente brevemente. 12) El fluoracetato, preparado comercialmente para el control de roedores, es tambin producido naturalmente por una planta de Sudamrica. Despus de entrar en la clula, el fluoracetato es convertido en fluoracetil-SCoA en una reaccin catalizada por la enzima acetato tioquinasa: F-CH2-COO- + CoA-SH + ATP -----> F-CH2-CO-S-CoA + AMP + PPi Para estudiar el efecto txico del fluoracetato se realiz un experimento sobre corazn de rata aislado. Despus que el corazn fue perfundido con una solucin 0,22 mM de fluoracetato, la velocidad de la captura de glucosa y la gluclisis disminuy, y se observ acumulacin de glucosa-6-P y fructosa-6-P. Un examen de los intermediarios del ciclo del cido ctrico indic que sus concentraciones eran inferiores a las normales, excepto para el citrato, cuya concentracin intracelular, era 10 veces mayor que lo normal. a) Dnde ocurrira el bloqueo del ciclo del cido ctrico? Qu caus la acumulacin del citrato y el agotamiento de los otros intermediarios? b) El fluoracetil-SCoA es enzimticamente transformado en el ciclo del cido ctrico. Cul es la estructura del producto metablico final del fluoracetato? c) Por qu la captura de la glucosa y la gluclisis disminuyen al perfundir fluoracetato? Por qu ste bloquea el ciclo del cido ctrico? Por qu se acumulan hexosas monofosfato? d) Por qu el fluoracetato es un veneno fatal? 13) Se incubaron a 37C 0,5 ml de un extracto de levaduras libres de mitocondrias (conteniendo 1 mg/ml de protena) con 2 ml de una solucin de glucosa 0,5 M en un volumen final de 3 ml. A los 30 minutos se sacaron 2 alcuotas de 0,1 ml cada una, determinndose en una de ellas 13,3 moles de glucosa y en la otra 30 moles de etanol. a) Determine la velocidad de consumo de glucosa y de produccin de etanol
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expresndolas en moles/min. mg prot. b) Nombre la/s va/s involucradas en la utilizacin de la glucosa y diga qu porcentaje de glucosa es degradada por cada una. c) Si se agrega glucosa marcada radioactivamente en el carbono 1, qu cantidad de 14CO2 se desprende en 10 minutos? d) Si se agrega glucosa marcada uniformemente, qu cantidad de 14CO2 se desprende en 10 minutos? Suponga que no se acumula ningn carbohidrato intermediario ni metabolito fosforilado. 14) En un experimento se incubaron 2. 10 5 eritrocitos en un medio con glucosa uniformemente marcada con 14C, a pH 7,3 y a 37C, en un volumen final de 7 ml. A tiempo 0, se tom una alcuota, se centrifug y en el sobrenadante se determin glucosa por el mtodo de Glucosa Oxidasa. Para esta determinacin se emplearon 200 l de sobrenadante y se obtuvo 0,65. Este procedimiento se repiti a los 30 minutos y result una Abs 505 nm = 0,20. Un testigo de glucosa 1 g/l produjo una Abs 505 nm = 0,30 empleando una alcuota de 100 l. Todas las medidas se realizaron llevando a 100 % de transmitancia con el blanco. La velocidad media de aparicin de 14 CO2 durante ese mismo lapso fue de 5,80 moles/min. 10 6 clulas. Las clulas no acumulan carbohidratos ni derivados fosforilados. Calcule la velocidad de consumo de glucosa, la velocidad de aparicin de lactato y la velocidad de produccin NADPH. 15) Se incub glucosa-14C6 con una suspensin de eritrocitos en presencia de un potente inhibidor de la fosfoglucoisomerasa. Al cabo de un tiempo se detect la presencia de piruvato 14C. Mediante qu va metablica se lleg a la produccin del piruvato marcado? Detalle la va e indique qu carbono del piruvato espera encontrar marcado. 16) Puede utilizarse un experimento con istopos para determinar qu fraccin del catabolismo de la glucosa procede va gluclisis vs va de las pentosas. Las clulas se dividen en dos fracciones; una se incuba con glucosa 14C1 y la otra con glucosa 14 C6. Se comparan las velocidades iniciales por las cuales la marca aparece como CO2. Prediga qu valor puede alcanzar en clulas hepticas asumiendo que la velocidad de degradacin de la glucosa es igual por ambas vas. 17) a) Se incubaron 10 l de un extracto de msculo de conejo (conteniendo 1,4 mg/ml prot) con 0,4 ml de una solucin de glucosa 1 g/l, en un volumen final de 4 ml (PM Glucosa=180). Al cabo de 10 minutos se extrajo una alcuota de 0,5 ml y se determin la presencia de 0,10 moles glucosa por el mtodo colorimtrico. Exprese la velocidad de consumo de glucosa en moles/min. mg prot.
b) En otra serie de experimentos se incubaron distintos extractos tisulares, en condiciones tales que el consumo de glucosa fue de 10 moles/min.mg prot. Si el 25 % de la misma fue degradada por el shunt de las pentosas, indique los moles de 14CO2 producidos por mg de protena al cabo de 30 minutos, para cada uno de los siguientes casos. (Tenga en cuenta que no se acumulan carbohidratos intermediarios ni metabolitos fosforilados).
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C-Gluc

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C1-Gluc

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C1-14C3-Gluc

Extracto de Levaduras libre de mitocondrias Extracto de Msculo de conejo libre de mitocondrias 18) Se estudiaron cuatro casos clnicos cuyos exmenes se exponen ms abajo. Para cada caso determine cul es la enzima que est en defecto y elija un apropiado
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tratamiento de la lista. Justifique su eleccin y resuelva las preguntas contenidas en cada caso estudiado. Caso A: El paciente tiene vmitos y diarrea inmediatamente despus de ingestin de leche. Se le hizo una prueba de tolerancia a la lactosa que consiste en que el paciente ingiera una cantidad estandarizada de lactosa midiendo luego la concentracin de glucosa y galactosa en sangre a tiempos definidos. En un paciente normal los niveles aumentan hasta un mximo en una hora y luego disminuyen. En este paciente la concentracin de los azcares no aument y permaneci constante. Explique por qu los niveles de azcar aumentan y luego disminuyen en individuos normales. Por qu estos azcares no aumentaron su concentracin sangunea en este paciente? Caso B: Un paciente retardado mental tiene vmitos y diarrea despus de la ingestin de leche. El paciente presenta una baja concentracin de glucosa en sangre, pero uno de los azcares reductores es superior a lo normal. Se encontr galactosa en orina. Por qu la concentracin de azcares reductores en sangre es alta? Por qu la galactosa aparece en la orina? Caso C: El paciente presenta fuertes calambres musculares cuando hace ejercicio violento. Una biopsia muscular indic que la concentracin de glucgeno en el msculo es muy superior a la de individuos normales. Por qu se acumula glucgeno? Caso D: El paciente letrgico, presenta hepatomegalia y una biopsia del hgado mostr exceso de glucgeno, tambin present baja concentracin de glucosa sangunea. Defectos enzimticos: 1.Fosfofructoquinasa muscular 2.Fosfomanoisomerasa 3.Galactosa-1-P uridil transferasa 4.Fosforilasa heptica Tratamientos: i.Correr 3 km por da iiDieta pobre en grasas iiiDieta con baja lactosa 5.Triosa quinasa 6.Lactasa en mucosa intestinal 7.Maltasa en mucosa intestinal

iiiiProhibicin de ejercicios extenuantes iiiiiAlimentacin frecuente y regular

19) Si en un extracto de hgado de rata que lleva a cabo gluconeognesis se adiciona HCO3- marcado (14C), Cul o cules carbonos de la glucosa resultarn marcados? 20) Si en el experimento anterior se suprime el HCO 3- marcado y se adiciona piruvato marcado uniformemente con 14C, Qu tomos de la glucosa resultarn marcados? 21) Un homogenado de hgado fue incubado en un medio que contena 10 mM de lactato como nica fuente de carbono y 20 mM ATP, en un volumen final de 3 ml. Al cabo de 30 minutos, la concentracin de lactato fue 0,13 mM. a) Por qu va metablica se obtuvo glucosa a partir de lactato? b) Calcule la velocidad de consumo de lactato expresndola en moles/min. En base a este dato, qu velocidad de produccin de glucosa esperara encontrar? c) Cuando se proces por el mismo mtodo una alcuota de 0,2 ml de la muestra se observ una velocidad de

produccin de glucosa de 0,18 moles/min. En base a los datos obtenidos qu destinos metablicos tuvo el resto del lactato consumido? 22) Se realiza un experimento con el objeto de caracterizar el efecto de 3 sustancias desconocidas A, B y C, sobre el metabolismo glucoltico heptico. Para ello se trabaj con homogenados de hgado, incubados en un medio apropiado al cual se adicionaron las sustancias a probar. Luego de someter distintas muestras a cada uno de los tratamientos se midieron en cada homogenado las concentraciones de metabolitos intermediarios de inters, cuyas concentraciones (M) se encuentran indicadas ms abajo. Asuma que los valores estn relacionados directamente con las concentraciones citoslicas hipotticas en clulas intactas.
Metabolito Control homogenado sin agregados A B C

Glucosa-6-P Fructosa-6-P Fructosa-1,6-P2 Gliceraldehido-3-P + Dihidroxiacetona-P 1,3 bisPglicerato 3-P-glicerato 2-P-glicerato P-enolpiruvato Piruvato

20 19 10 8 10 13 13 12 14

19 9 16 12 12 13 13 7 18

25 24 6 13 8 7 8 18 5

20 19 10 8 10 14 12 12 14

Adicionalmente, cuando se ensayaron sobre hepatocitos intactos, se comprob que ni A ni B posean efecto sobre la concentracin de metabolitos citoslicos; C en cambio, provoc efectos similares en magnitud a los de la sustancia A. Se considera que existe efecto cuando la concentracin de un metabolito vara en ms del 10%. En base a estos datos responda lo siguiente: a)A qu nivel actan estas sustancias? b) Con qu sustancias activas in vivo que Ud. conozca podra relacionar a A, B, y C? Mencione al menos una en cada caso y fundamente su respuesta. Respuestas 1) C1 C2 C3 -------------------------------------------- C4 C5 C6 corresponde a H3C1- C2O C3OOH (msculo y hemate) H3C1- C2 H2OH + (levaduras) C3O2 y y HOOC4 C5O C6H3 del piruvato de la glucosa

C4O2 + OH H2C5 - H3C6 del etanol y CO2

2) a) En la fermentacin alcohlica, el C3 y C4 en el tubo B se liberan como CO2 marcado, disminuyendo la radioactividad final. b) No hay liberacin de CO2 marcado; la radioactividad es igual a 0 y 60min para los 2 tubos.
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c) Slo se libera el C3 como CO2. El tubo B tendra a los 60 min (aprox) 83 % de la radioactividad. 3)a) En el metilo del etanol. B) C3 y C4 de la glucosa. 4) Se acumula 1,6 bisfosfoglucosa, pues no hay fosfato que continue la reaccin de la gliceraldehdo-3-fosfato deshidrogenasa. Al agregarle arseniato a la muestra continua la fermentacin, se regenera el NAD + y puede ingresar nuevamente a oxidar al gliceraldehdo 3 P por la gliceraldehdo 3 P deshidrogenasa. 5) 51 %. 6) Se resuelve 1 slo caso: tubo B 2,5 mM y tubo C 1,0 mM : 9 moles consumidos/30 min = 0,3 moles/min. En A: agua, Pi + NaF y sacarosa ----------en C 2,5 mM En A: Pi 50mM y sacarosa + Pi--------------en C 1,5 mM En A: Pi + arseniato-----------------------------en C 1,0 mM En A: Arseniato 50 mM-------------------------en C 0,9 mM En A: Pi + NaN3-----------------------------------en C 0,625 mM En A: Arseniato + NaN3-------------------------en C 0,32 mM 7) a) C1; b) C2; c) C3; d) C3; e) C2; f) C5; g) OAA 50% C2 y 50 % en C3 8) a) Se acumula succinato. El malonato es un inhibidor competitivo de la succinato deshidrogenasa por su semejanza estructural con el succinato. b) Se detiene el ciclo de Krebs, no se forma NADH, no se necesita O 2. 9) a) Usando glucosa marcada con 14C. Ver si aparece 14CO2 en cantidades estequiomtricas. b) OAA, MAL y FUM C2-C3; SUCC C2; SUCC CoA C3; Alfa Oxo GLUT C4; CIT e ISOCIT C4 c) 3 10) No. Porque en el ciclo de Krebs se producen 2 descarboxilaciones previas a la sntesis de OAA. Slo en aquellos organismos que posean el ciclo del glioxilato. 11) a) C1,C2,C3; b) C2; c) C1,C2,C3 12) a) El fluorocitrato inhibe a la aconitasa, aumentando la cantidad de citrato. b) OOC-CHF-COHCOO-CH2-COOc) La acumulacin de Glc 6 P y Fru 6 P se debe a que el citrato inhibe a la enzima fosfofructoquinasa (PFK) d) Por la citrato sintasa se transforma en un inhibidor de la aconitasa. Es fatal pues tambin inhibe la sntesis de ATP a partir de la gluclisis. 13) a) Glc: 40 moles/min mg de prot.; etanol: 60 moles/min mg prot b) 75 % gluclisis; 25 % ciclo de las pentosas. c) 50 moles; d) 600 moles. 14) Consumo de glucosa: 4,9 moles/min 106 cl; aparicin de lactato: 7,94 moles/min 106 cl; produccin de NADPH: 11,6 moles/min 106 cl
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15) Ciclo de las pentosas; el C3 del piruvato. 16) C1 el doble que C2. 17)a) 10 moles/min mg prot. 900 450 18) Defectos:1C; 3B; 4D; 6 A Tratamientos: iii A y B; iiii C; iiiii A 19) En ninguno. 20) En los 6. 21) a) Gluconeognesis; b) 0,987 moles de lactato/min ; 0,4935 moles de glucosa/min c) Se oxid. 22) A: Fructosa 2,6 bis fosfato; B ATP- Citrato; C: Insulina.

75 75

375 150

Gluclisis

Fermentacin homolctica.

Fermentacin alcohlica

Destino de los carbonos de la glucosa

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Entrada de glucgeno, almidn, disacridos y hexosas en la gluclisis.

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Gluclisis y gluconeognesis. La primer etapa a partir de piruvato (y lactato) se muestra en la siguiente imagen.

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Inicio de gluconeognesis a partir de piruvato y lactato

Gluconeognesis. Destino del CO2 en la carboxilacin del piruvato.

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Ciclo de Krebs

Esquema del ciclo de las pentosas

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Fase oxidativa del ciclo de las pentosas. El C1 de la glucosa se pierde como CO2.

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Fase no oxidativa del ciclo de las pentosas

Ciclo del glioxilato

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Sntesis del glucgeno ( siempre a partir del extremo no reductor)

Degradacin del glucgeno ( siempre a partir del extremo no reductor)

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