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INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGA Laboratorio de Biotecnologa Molecular

4BM1

Prctica 6 y 4: Extraccin de DNA plasmdico por lisis alcalina y electroforesis

Equipo 2: UPIBIOS
Garduo Acevedo Jessica Belen Rosas Rodrguez Belen Estefana

Profesores: Durn Figueroa No Valentn Flores Gmez Estela Gutirrez Hernndez German Fernando

Contenido

1 OBJETIVOS
Objetivo General Extraer ADN plsmido. Determinar la cantidad de ADN plsmidico por densitometra de las bandas en un gel de agarosa. Conocer la metodologa bsica para la extraccin de ADN Objetivos especficos Determinar la integridad del ADN por electroforesis en gel de agarosa Llevar a cabo la cuantificacin de ADN plsmidico por mtodos espectrofotomtricos Adquirir destreza en el corrimiento de muestras de ADN en geles de agarosa Cuantificar el ADN en geles de agarosa por densitometra

2 INTRODUCCIN
ENZIMAS DE RESTRICCIN

Las enzimas de restriccin, tambin conocidas como endonucleasas son enzimas que cortan los enlaces fosfodiester del material gentico a partir de una secuencia que reconocen. Las mismas permiten cortar DNA de hebra doble, donde reconocen secuencias palindrmicas (secuencias que se leen igual en ambas direcciones). Son extradas de organismos procariticos (bacterias), donde actan como un mecanismo de defensa, para degradar material gentico extrao que entre en la clula. Las bacterias tienen la capacidad de metilar su DNA, lo cual sirve para distinguir entre el DNA extrao y el DNA propio. Las enzimas de restriccin no pueden cortar DNA metilado, de este modo solo afectan el DNA extranjero y no el DNA bacterial. Existen 3 tipos de enzimas de restriccin: 1. Tipo I y Tipo III: a. Tienen actividad de restriccin (cortan) y modificacin (metilan). b. Cortan a cierta distancia de la secuencia de reconocimiento, las Tipo I cortan lejos de la secuencia de reconocimiento, ya sea ro arriba o ro abajo. Las Tipo III cortan de 5-8 bases antes o despes de la secuencia que reconocen. c. Necesitan ATP para moverse a travs de la molcula de DNA, desde el lugar de reconocimiento hasta el sitio del corte. 2. Tipo II: a. Slo tienen actividad de restriccin.

b. Cortan de manera consistente y predecible dentro de la secuencia que reconocen. c. Slo requieren Mg++ como cofactor. d. No necesitan ATP. Aplicaciones de las enzimas de restriccin: 1. Hacer mapa de restriccin de un plsmido o bacterifago. 2. Fragmentar DNA genmico para separacin de electroforesis y Southern Blot. 3. Generacin de fragmentos para ser usados como sondas marcadas en Southerny Northern blotting. 4. Generacin de fragmentos para ser subclonados en los vectores apropiados, creacin de DNA recombinante. Las endonucleasas se nombran a partir de las bacterias de las que son extradas, su nombre est dado segn el gnero y la especie de la bacteria de donde se aisl por primera vez esta enzima. La primera letra representa el gnero de la bacteria, las prximas dos indican la especie, una cuarta letra indica la cepa, y un nmero al final indica la cantidad de enzimas que se han aislado de esa cepa. Las enzimas de restriccin al cortar el DNA pueden producir 2 tipos de cortes:
1. Cohesivos o pegajosos como el de HindIII:

GAATTC CTTAAG EcoRI 2. Abruptos:

GGATCC CCTAGG BamHI

AAGCTT AACGAA HindIII

AATATT TTATAA SspI

CCCGGG GGGCCC SmaI

REACTIVOS PARA LA EXTRACCIN DE ADN PLSMIDICO


GLUCOSA Realiza una diferencia de presin en la membrana. TRIS Mantiene el pH y los lpidos de la membrana restos acumulados o deja juntos haciendo una micela reventados por la presin osmtica HCL-EDTA Mantiene la integridad de las clulas ya que rompe la membrana, las homogeniza y separa los ncleos. NaOH-SDS Provoca la lisis celular, desnaturalizar el ADN cromosmico y de las protenas as mismo libera los plsmidos Acetato de potasio Precipita proteinas ISOROPANOL Precipita las sales adicionadas. FENOL CLOROFORMO Ayuda a la pureza del ADN

INHIBIDORES DE ENZIMAS DE RESTRICCIN


EDTA, que inhibe la accin de nucleasas que pueden copurificar con el ADN, altas temperaturas y concentraciones grandes de sales, pirocarbonato de dietilo.

RELACIN Proporciona una estimacin de la pureza del acido nucleico en preparaciones puras de ADN y ARN. ADN PLSMIDICO El DNA es un polmero de nucletidos unidos a travs de enlaces fosfodiester. A pH >4 los grupos fosfatos son ionizados y cada nucletido contribuye con una carga negativa a la carga total de la molcula. Por lo tanto, los cidos nuclicos son molculas polianinicas con una carga neta igual al nmero de nucletidos. Las bases aromticas de los nucletidos en el DNA, que tienen carcter hidrofbico, estn orientadas a la parte interna de la molcula, perpendiculares a la cadena de azcar y fosfato y estn apiladas una sobre la otra en el eje de la hlice.

Los plsmidos son replicones que son heredados establemente en un estado extracromosomal y se encuentran regularmente en una gran variedad de bacterias. El pDNA es altamente isomrfico, sus diferentes formas aisladas corresponden a estructuras moleculares distintivas e interconvertibles. La mayora de los plsmidos existen como molculas circulares de DNA de doble cadena. Si ambas cadenas de DNA son crculos intactos, las molculas son descritas como crculos covalentemente cerrados o CCC pDNA. Si solamente una cadena est intacta, entonces las molculas se describen como crculos abiertos OC pDNA (de sus siglas en ingls). Cuando son aislados de las clulas, los plsmidos covalentemente cerrados, presentan frecuentemente una deficiencia de giros en la doble hlice, y su configuracin es superenrollada. No todos los plsmidos existen como molculas circulares, pueden presentarse como molculas lineales.

La purificacin de DNA es un paso clave en la experimentacin en Biologa Molecular. Los mtodos de purificacin de DNA se clasifican en dos grandes categoras, segn pretendan purificar DNA cromosmico o DNA plasmdico. La purificacin de DNA plasmdico es la base de cualquier experimento de clonacin molecular. El problema principal que hay que resolver es la separacin del DNA plasmdico y DNA cromosmico. En esta prctica se llevo a cabo el mtodo de lisis alcalina, por su simplicidad, bajo coste y reproducibilidad. El genoma bacteriano se organiza en un nico cromosoma circular con un solo origen de replicacin. Las bacterias pueden contener informacin gentica adicional en forma de plsmidos. Los plsmidos son molculas circulares de DNA extracromosmico que se replican de forma autnoma, a partir de su propio origen de replicacin. La informacin gentica que portan los plsmidos no es generalmente vital para la supervivencia celular. No obstante, dicha informacin puede resultar imprescindible en determinadas circunstancias ambientales, como en nuestro caso resistencia a antibiticos, los cuales no tienen esa habilidad por si mismos, Las bacterias pueden llegar a tener un gran nmero de copias de un mismo plsmido (plsmidos multicopia), facilitando enormemente su purificacin. Hay distintos procedimientos para la purificacin de DNA plasmdico, aunque todos incluyen los tres pasos siguientes: (i) Crecimiento de las bacterias en un medio selectivo de aquellas que

llevan el plsmido. (ii) Lisis de las bacterias para la liberacin del plsmido. (iii) Purificacin del DNA plasmdico. El problema principal que hay que resolver es la separacin del DNA plasmdico y DNA cromosmico. Como se menciono anteriormente en esta practica se utilizo para la purificacin del DNA el mtodo de lisis alcalina, este mtodo explota las diferencias en las propiedades de desnaturalizacin y renaturalizacin entre el DNA plasmdico (pequeos crculos de DNA cerrados covalentemente) y el DNA cromosmico (fragmentado). La alcalinizacin con NaOH en presencia de un detergente fuertemente aninico (SDS), provoca la lisis celular, la desnaturalizacin del DNA cromosmico y de las protenas, y la liberacin de los plsmidos. Los plsmidos se ven menos afectados por su pequeo tamao y estructura superenrollada. La neutralizacin del medio en presencia de una concentracin alta de sal (acetato potsico), provoca la precipitacin de las protenas (por el tratamiento con el detergente y la insolubilidad de la sal potsica del dodecil sulfato) y la del DNA cromosmico (por reasociaciones aleatorias intracatenarias). Los agregados insolubles de protenas y DNA cromosmico se separan por centrifugacin del DNA plasmdico que queda en el sobrenadante y conserva mayoritariamente su estructura nativa. ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA La calidad de las purificaciones de cidos nucleicos se comprueba rutinariamente mediante electroforesis en geles de agarosa. Cuando se aplica un campo elctrico a una solucin de molculas, stas se separan de acuerdo con su tamao y carga neta. Los cidos nucleicos son polianiones que se mueven hacia el polo positivo. Las molculas y fragmentos de molculas de cidos nucleicos se separan de acuerdo con su tamao y conformacin, mediante electroforesis en geles de agarosa. La agarosa es un polmero de residuos alternos de D-galactosa y 3,6anhidro-L-galactosa unidos por enlaces glicosdicos, que forma geles con poros de gran tamao. Los cidos nucleicos que emigran a mayor velocidad en los geles de agarosa son los que encuentran menos resistencia en su avance (los de menor tamao y de conformacin ms compacta). Al gel de agarosa se le aade bromuro de etidio, un compuesto que se une a los cidos nucleicos y que fluoresce cuando se ilumina con luz UV. Cuantificacin de DNA por espectrofotometra.

El ADN, el ARN, los oligonucletidos e incluso los mononucletidos pueden cuantificarse directamente en soluciones acuosas, en forma diluida o sin diluir, midiendo la absorbancia A (o densidad ptica, DO) de luz ultravioleta (tambin puede hacerse en el intervalo visible). Si la muestra es pura, es decir, no contiene cantidades significativas de contaminantes como protenas, fenol o agarosa, la medicin espectrofotomtrica de la irradiacin ultravioleta absorbida por las bases es sencilla y exacta. La concentracin de cidos nucleicos suele determinarse midiendo a 260 nm y comparando con un blanco. La interferencia de contaminantes puede determinarse calculando un cociente. Dado que las protenas absorben a 280 nm, se emplea el cociente A260/A280 para calcular la pureza de los cidos nucleicos. Los cocientes respectivos del ADN y el ARN puros son aproximadamente de 1,8 y 2,0. Una absorcin a 230 nm significa que la muestra est contaminada con hidratos de carbono, pptidos, fenoles, compuestos aromticos u otras sustancias. El cociente A260/A230 de las muestras puras es de 2,2 aproximadamente

3 METODOLOGA
Evidenciamiento de colonias transformantes (26 septiembre 2013)

De la caja petri transformante obtenida en la prctica 9, tomar una asada y transferir por duplicado a otra caja petri con medio LB + amp 100g/mL

Incubar durante 24 hrs a 37C

*Se incubaron durante 72 hrs a 37C

Preparacin de soluciones stock para extraccin de DNA plasmdico por lisis alcalina (01 octubre 2013) Solucin I: 50 mM Glucosa/25mM trisHCl pH 8.0/10mM EDTA pH 8.0, volumen total: 50mL. Solucin II: 0.2 N NaOH/ 1% SDS, volumen total: 50mL. Solucin III: 5M de acetato de Potasio y cido actico glacial Inculo de clulas transformantes en medio LB con antibitico (02 octubre 2013)

De las ateriores cajas inoculadas con medio LB+amp 100 g/mL, tomar una asada

Inocular en 2 tubos falcon con medio LB+ amp a la misma concentracin e incubar a 37C durante 24 hrs.

Lisis alcalina para purificacin de DNA plasmdico (03 octubre 2013)

Centrifugar los tubos falcon inoculados a 13 Krpm durante 1 min

Desechar en cloro el sobrenadante

Resuspender pastilla en 100 L sln I fra y mezclar en vortex

Agregar 200 L sln II recien preparada e invertir 5 veces

Agregar 150 L sln III fra e invertir 5 veces a temperatura ambiente

Incubar en hielo durante 5 minutos

Centrifugar a 13 Krpm 5 minutos

Transferir sobrenadante a un tubo Eppendorf

*Adicionar 1 volumen fe F:C:I

Mezclar en vortex

*Centrifugar a 13 Krpm durante 2 minutos a 4C

Transferir sorenadante y fase acuosa sin fenol.

Precipitar con 2 volmenenes de Isopropanol

Incubar -20C durante 20 minutos

Digestin de DNA plasmdico con enzima de restriccin Hind III (08 octubre 2013)
Del tubo Eppendorf anterior con isopropanol y DNA plasmdico centrifugar a 14 Krpm 5 minutos

Decantar sobrenadante y poner tubo en hielo

Secar pastilla invertida en un papel

Resuspender en 15 L agua destilada

En otro tubo Eppendorf limpio agregar 5 L de la solucin anterior, 1 L de buffer 2 de invitrogen, 1 L de HindIII y 3 Lde agual miliQ

Incubar a 37C durante 1 hr

Inactivar reaccin a 65C

Cuantificacin de DNA plasmdico por espectrofotometra

1 L de sln DNA + 999 L de agua miliQ

Leer a 280 y 260 nm en espectrofotmetro con celdas de cuarzo


1 L de sln DNA + 999 L de agua miliQ

Electroforesis en gel de agarosa

Cmara electrofortica

Correr electroforsis hasta 3/4 del gel

Observar resultados con un Transiluminador/ Fotodocumentad or

Agarosa al 1% Buffer TAE 1X Marcador de peso molecular 1kpb/10kpb Buffer de corrida (Rojo Texas 10,000X 1L/100L gel= 7L

4 RESULTADOS
Electroforesis en gel de agarosa

Figura . Esquema de la cmara de electroforesis.

Cabe mencionar que nuestra cmara de electroforesis trabajo con dos peines, uno con pozos mas grandes que el otro.

Figura . Electroforesis en gel de agarosa teido con rojo texas, se muestra la corrida de ADN plsmidico. (Esta imagen se establece con el fin de comparar el trabajo realizado en el laboratorio por los diferentes equipos que conforman el grupo de trabajo en clase).

4 RESULTADOS

Figura . Electroforesis en gel de agarosa al %, teido con rojo texas, mostrando el corrimiento del ADN plsmidico. Esta imagen es 100% los resultados que se obtuvieron del trabajo de los 7 equipos del Laboratorio de Biotecnologa Molecular en la sesin de electroforesis.

Es necesario sealar que se debi de haber utilizado un blanco en la cmara de electroforesis para as realizar la comparacin pertinente y poder concluir adecuadamente. Sin embargo, durante la realizacin de la practica no se mostro, ni menciono ningn detalle acerca de este.

4 RESULTADOS
Los geles se comportan como un tamiz molecular y permiten separar molculas cargadas en funcin de su tamao y forma. As, molculas de DNA de diferente tamao van a emigrar de forma distinta en el gel de agarosa, durante cierto tiempo obteniendo una separacin tal que la distancia migrada por una molcula es inversamente proporcional a su longitud en pares de bases (Crommelin y Sindelar, 2002). En base a lo anterior, los resultados esperados se ilustran en la siguiente figura:

Figura . Representacin de la electroforesis en gel de agarosa esperado para la extraccin de ADN plsmidico, el carril derecho representa el caso de que el DNA se haya sometido a DNAsas

5 DISCUSIN

6 CONCLUSIN

7 REFERENCIAS
Benjamn Lewin, (1996), Genes, Barcelona, 2 Edicin, Revert. ngel Herrez, (2001), Biologa molecular e ingeniera gentica, Barcelona Espaa, Elsevier. Mathews k. Holde, Bioquimica, 3 Edicin, Espaa, Addison Wesley: