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TOPICO 4: DETERMINACION DE GRASAS I. INTRODUCCION

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El trmino extracto etreo se refiere a las sustancias extradas con ter etlico que incluyen el grupo de nutrientes llamados grasa bruta o lpidos y son todos los steres de los cidos grasos con el glicerol a los fosfolpidos, las lecitinas, los esteroles, las ceras, los cidos grasos libres, vitaminas liposolubles, los carotenoides, la clorofila y otros pigmentos. En el proceso de digestin estas sustancias son transformadas en sustancias semejantes, pero caractersticas del organismo que las ingiere, por eso se consideran precursores dietticos; la grasa es un componente necesario de los tejidos vivos y es esencial en la nutricin humana. Debido a que puede almacenarse y movilizarse, es el principal material de reserva corporal, son la fuente ms concentrada de energa en la dieta, dando aproximadamente 9.3 caloras por gramo; su ingesta equilibrada es tambin esencial para asegurar el aporte diettico de cidos grasos esenciales y vitaminas liposolubles A, D y E. Las grasas se clasifican con las protenas y carbohidratos, como sustancias alimenticias fundamentales y se consumen en gran cantidad, actan como lubricantes, plastificantes y buenos conductores del calor, comunicando sabores y texturas especiales a los alimentos que se cuecen con ellas. Los lpidos son compuestos insolubles en agua pero solubles en solventes orgnicos tales como el ter, acetona, alcohol, cloroformo o benceno, generalmente se encuentran distribuidos ampliamente en la naturaleza como steres de cidos grasos de cadena larga. Es decir, que una propiedad suya predominante radica en su escasa o nula solubilidad en compuestos tpicamente polares, con el agua en primer trmino, frente a una alta solubilidad en lquidos caracterizados por su pobre polaridad y su significativa capacidad para establecer enlaces hidrfobos II. MTODOS DE DETERMINACIN DE GRASAS

Los aceites y grasas (llamados lpidos genricamente), son sustancias de origen vegetal o animal compuestas mayoritariamente (97-98%) de triglicridos, los cuales son estructuras constituidas por la esterificacin de tres cidos grasos superiores de la cadena aliftica a un alcohol poliatmico de tres tomos de carbono llamado glicerol o glicerina.

En menor cuanta forman parte de los lpidos, estructuras ms complejas que adems de contener cidos grasos poseen nitrgeno y fsforo, y otros en los cuales los cidos grasos se encuentran en formas de amidas. As mismo integran el grupo de los lpidos otras molculas que no poseen cidos grasos en su estructura y constituyen la materia insaponificable de las grasas. Todos los lpidos tienen la propiedad comn de ser solubles en solventes orgnicos (metanol, etanol, acetona, cloroformo, ter, benceno, etc.) e insolubles en agua. El trmino grasa se utiliza para referirse a lpidos de consistencia slida o semislida a temperatura ambiente, en tanto se denomina aceite aquellos que son lquidos a la misma temperatura. El tejido adiposo de los animales est formado principalmente por lpidos, la leche y sus derivados y las semillas de muchas plantas contienen tambin gran cantidad de estos. Las frutas y los vegetales no son generalmente fuentes de lpidos aunque algunos como el aguacate y la aceituna madura los contienen en proporcin de alrededor de un 20%.

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En la alimentacin los lpidos desempean fundamentalmente la funcin de suministrar energa al organismo. Las grasas y los aceites proporcionan 2,3 veces ms kilocaloras que los carbohidratos y las protenas (9,2 Kcal/g de lpidos, por solo 4 Kcal/g de protenas y 4 Kcal/g de carbohidratos). El organismo acumula energa principalmente, almacenando los excesos de grasas que consume. En los alimentos, los lpidos juegan un importante papel, puesto que inciden de forma directa en las caractersticas organolpticas de los productos en los cuales estn presentes, sobre todo en el sabor y la textura. As mismo, el contenido lipdico en los alimentos determina muchas veces su estabilidad, dado que estos nutrientes son sensibles a sufrir procesos de oxidacin (conocidos como enraciamiento) cuyos productos finales de reaccin (aldehdos y cetonas) comunican a los alimentos olores y sabores desagradables. Los mtodos de determinacin de grasa se fundamentan en la separacin de la fraccin lipdica del resto de los componentes de la matriz y la posterior medida de la fraccin separada. En general, pueden clasificarse en dos grandes grupos: mtodos de extraccin con solventes orgnicos y mtodos butiromtricos. 2.1. METODOS GRAVIMETRICOS: 2.1.1. METODOS DE EXTRACCION DIRECTA CON DISOLVENTES Estos mtodos se fundamentan en una extraccin slido-lquido basado en las diferencias de solubilidad de los componentes de la muestra slida o semislida (matriz) en un solvente particular dado. Aprovechando la naturaleza apolar de los lpidos se lleva a cabo la extraccin con un solvente orgnico que solubiliza grasas dejando un residuo slido con los componentes menos solubles, aunque nunca la separacin es total ya que no existe un lmite exacto entre las solubilidades. Debe sealarse que la fraccin extrada no solo est compuesta por cidos grasos y glicridos, sino que tambin se extraen los esteroles, fosfolpidos, vitaminas liposolubles, y otros compuestos que son tambin solubles en solventes apolares. Los solventes empleados en la extraccin de grasas, deben reunir un conjunto de requisitos, tales como: 1. Alta capacidad de solubilizar las grasas. 2. Bajo punto de ebullicin 3. No debe dejar residuos al evaporarse 4. No debe ser inflamable 5. No debe ser txico en estado lquido o de vapor 6. Debe penetrar completamente en la muestra Es difcil encontrar un solvente que rena todas las condiciones arriba relacionadas. En la prctica, los solventes ms empleados son el ter etlico y el ter de petrleo, aunque no se descarta la utilizacin de hexano y cloroformo, entre otros. En los mtodos de determinacin de grasas basados en la extraccin con solventes orgnicos, deben observarse algunos cuidados para la preparacin de la muestra, en funcin de las caractersticas de la matriz analizada.
1. 2.

Los slidos deben estar divididos y homogenizados para permitir que el solvente tenga una mayor rea de contacto con la muestra. Para productos con un contenido de humedad superior al 15-20%, debe realizarse un previo secado de la muestra para facilitar la penetracin del solvente en los tejidos, puesto que se conoce que si el material est hmedo, el solvente penetra ms lentamente y la extraccin es menos eficiente. Por otra parte, si el producto posee altos contenidos de humedad, el agua puede acumularse gradualmente en la solucin extractora haciendo difcil su posterior eliminacin dada la necesidad de aplicar mayores temperaturas, pudindose introducir errores en los resultados.

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3.

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Los productos que contienen cantidades apreciables de almidones y protenas requieren de una previa digestin cida si se desea cuantificar la grasa total. Esto se explica por el hecho de que en muchos alimentos, particularmente los productos crnicos y otros con altos contenidos en almidn, Parte de la grasa se encuentra atrapada y comprometida en estructuras proteicas y almidonosas que impiden su total extraccin con solventes orgnicos; de ah que en estos casos sea necesario realizar una hidrlisis cida previo a la extraccin, con el objetivo de liberar las fracciones lipdicas comprometidas y difcilmente extrables. Cuando en un producto alimenticio con estas caractersticas se realiza la extraccin con solventes orgnicos sin realizar un previo tratamiento cido a la muestra se cuantifica solo la llamada grasa libre. Los mtodos de extraccin con solventes orgnicos ms empleados para la determinacin de grasas en los alimentos son el mtodo de extraccin intermitente (mtodo de Soxhlet) y el mtodo de Rose Gottlieb. a) MTODO DE EXTRACCIN INTERMITENTE :MTODO SOXHLET En este procedimiento se emplea un equipo diseado de modo que una porcin fresca del solvente est en contacto con la muestra por un tiempo relativamente largo. Uno de los aparatos ms usualmente empleados para realizar esta determinacin es el llamado equipo Soxhlet (figuras 1 ), el cual consta de un tubo extractor provisto de un sifn y una tubuladura lateral. Dicho extractor est conectado por su extremo inferior, a travs de uniones esmeriladas a un baln en el cual se coloca el solvente (generalmente ter de petrleo o ter etlico); mientras que en el extremo superior se ajusta un condensador vertical que acta como refrigerante. En el tubo extractor se coloca un dedal poroso que contiene la muestra y permite la entrada del ter al tiempo que un tapn de algodn impide la salida del slido. El equipo se coloca en una fuente de calor a la temperatura de ebullicin del solvente, el cual se evapora, asciende por la tubuladura lateral del extractor, se condensa en el refrigerante y cae sobre la muestra acumulndose en el tubo extractor y atravesando las paredes porosas del dedal para hacer contacto con la muestra y solubilizarlas grasas presentes. Cuando el nivel del solvente en el tubo extractor sobrepasa el nivel del sifn, el extractor se descarga y pasa al baln el ter conteniendo la grasa extrada, para a partir de ese instante, dar comienzo nuevamente el ciclo de evaporacin del solvente, condensacin, cada sobre la muestra, acumulacin en el aparato de extraccin y descarga. Una vez que el equipo ha estado funcionando el tiempo especificado para cada tipo de alimento (nunca menor de 2 horas), el solvente se elimina del baln por evaporacin, quedando entonces en este ltimo el residuo lipdico extrado, el cual se determina por diferencia de pesada entre la masa del baln que contiene el residuo y la masa del baln vaco, previamente tarado.

Figura 1. Esquema del equipo de extraccin Soxhlet

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Los resultados se expresan en porciento segn:

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El mtodo Soxhlet se emplea para determinacin de grasa en productos slidos, tales como crnicos, cereales, frutas y vegetales y otros de naturaleza similar. b) METODOS DE EXTRACCION POR SOLUBILIZACION: Mtodo de extraccin de rose-gottlieb. Este mtodo se basa en la extraccin de la grasa a partir de una solucin alcohlico amoniacal con ter etlico y ter de petrleo, seguido de una evaporacin del solvente y posterior pesada del residuo lipdico. El mtodo de extraccin de Rose-Gottlieb se emplea para muestras lquidas y encuentra su mayor aplicacin en la determinacin de grasas en leches naturales, pasteurizadas, esterilizadas, evaporadas, condensadas, concentradas y leche en polvo. Los solventes utilizados y el nmero de extraccin que se realiza pueden variar en funcin del tipo de producto. As mismo en casi todos los casos suele realizarse un ensayo en blanco, cuya magnitud debe restarse al peso del residuo lipdico obtenido durante la extraccin en la muestra. Las diferencias fundamentales entre este procedimiento y la extraccin con el equipo Soxhlet radican en que aqu no se recircula el solvente de extraccin y el tiempo de anlisis se reduce considerablemente. Los procedimientos de determinacin de grasas basados en la extraccin con solventes orgnicos son tpicos mtodos gravimtricos de amplia aplicacin en el anlisis de los alimentos, sin embargo no son los nicos. 2.2. METODOS VOLUMETRICOS METODO GERBER El mtodo Gerber consiste en separar la grasa dentro de un recipiente medidor, llamado butirmetro, medir el volumen e indicarlo en un tanto por ciento en masa. La grasa existe en la leche en forma de pequeos glbulos de diferente dimetro, que oscila entre 0,1 y 10 micrmetros. Los glbulos grasos forman una emulsin permanente con el lquido lcteo. Todos los glbulos de grasa estn rodeados por una capa protectora, la membrana de los glbulos de grasa compuesta por fosfolpidos, protenas de envoltura de los glbulos de grasa y agua de hidratacin. La envoltura de los glbulos de grasa evita la coalescencia de los mismos y estabiliza el estado emulsionado. La separacin completa de la grasa precisa la destruccin de la envoltura protectora de los glbulos grasos. Ello se lleva a cabo por medio del cido sulfrico concentrado, de entre el 90 y el 91 % de masa. El cido sulfrico oxida e hidroliza los componentes orgnicos de la envoltura protectora de los glbulos de grasa, las fracciones de las albminas de leche y la lactosa. Se produce calor por la dilucin y tambin un fuerte calor debido a la reaccin. El butirmetro se calienta considerablemente. Los productos de la oxidacin tien la solucin resultante de color marrn. La grasa liberada de esta forma se separa a continuacin por la centrifugacin. Aadiendo alcohol amlico se facilita la separacin de la fase y, al final, resulta una lnea divisoria clara entre la grasa y la solucin cida. En la escala del butirmetro se puede leer el contenido en grasa de la leche como contenido de masa en un tanto por ciento.

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PRACTICA 4: DETERMINACION DE LIPIDOS METODO MTODO SOXHLET I. OBJETIVOS

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a) Determinar gravimtricamente el contenido graso de una muestra alimenticia de origen animal o vegetal. b) Escoger un alimento cuyos resultados se puedan comparar con datos tericos encontrados en la bibliografa. II. MATERIALES Baln de 250 mL y tapn Beaker de 100 mL Cartucho de extraccin o papel filtro Equipo de extraccin Soxhlet Erlenmeyer de 250 mL Esptula III. REACTIVOS n-Hexano Solucin de NaOH al 10% IV. PROCEDIMIENTO Dada la insolubilidad de las sustancias grasas en el agua y su inmiscibilidad con ella, la extraccin de la grasa a partir de las materias primas que la contienen se debe llevar a cabo justamente prescindiendo de la intervencin del agua. La grasa se extraer basndose en su miscibilidad en disolventes orgnicos, que a su turno, son insolubles en agua e inmiscibles con ella. La extraccin de una muestra previamente deshidratada en estufa, se hace en un equipo Soxhlet con n-Hexano. Posteriormente, se elimina el disolvente y se determina gravimtricamente el extracto seco que representa los lpidos de la muestra. El baln de extraccin junto con las perlas de ebullicin debe lavarse con la solucin de soda al 10%, enjuagarlo bien con agua destilada, luego con ter, secarlo en la estufa por 30 minutos a 100oC y enfriarlo en un desecador. El equipo Soxhlet, el cartucho de extraccin y el algodn deben lavarse previamente con n Hexano. Pesar exactamente el baln con las perlas de ebullicin. En un papel filtro pesar de 2.0 a 5.0 g de la muestra previamente secada en la estufa (utilizar la muestra secada en la determinacin de humedad), y colocar todo el conjunto dentro del cartucho y luego en la cmara de extraccin del Soxhlet. Conectar el baln al aparato de extraccin segn la Figura y agregar suficiente cantidad de n Hexano para llenar dos veces y media la cmara de extraccin. Extraer la muestra durante 3 horas con un reflujo de 5 o 6 gotas por segundo. Recuperar el n- Hexano mediante destilacin fraccionada y luego desecar el residuo en una estufa de aire a 100 oC durante 30 minutos. Enfriar en un desecador hasta temperatura ambiente y pesar. Con los resultados obtenidos, calcular el porcentaje de grasa. 1 1 1 1 1 1

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V. MTODOS BUTIROMTRICOS

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Los mtodos butiromtricos se fundamentan en la liberacin de la grasa presente en la muestra por adicin de cido sulfrico que hidroliza las sustancias proteicas. La fraccin lipdica as liberada se separa por centrifugacin y se mide directamente la altura de la columna de grasa separada en la escala graduada de un instrumento. El instrumento empleado para realizar el anlisis recibe el nombre de butirmetro. Existen varios tipos de butirmetros pero uno de los ms empleados en la actualidad es el ideado por Gerber y consiste en un frasco de vidrio formado por un vstago graduado cerrado permanentemente en la parte superior y que en el extremo inferior se ensancha en forma de vulvo, el cual lleva una abertura en su extremo que sirve para llenar el instrumento, siendo cerrada por un tapn de goma mientras se realiza el ensayo. El procedimiento de determinacin consiste en aadir al butirmetro, que contiene la muestra previamente medida, cido sulfrico concentrado y alcohol isoamlico. El butirmetro se cierra con un tapn de goma y se agita vigorosamente hasta la total disolucin de la fase proteica. Se calienta entonces la mezcla en bao de agua (60-70C) durante 15-20 minutos y se centrifuga por espacio de 3-5 minutos a 800-1000 rpm para separar la fase lipdica. Finalmente se coloca de nuevo el instrumento en bao de agua (60- 70C) durante 5 minutos y se lee directamente el porciento de grasa en la escala del butirmetro. TCNICA OPERATIVA PARA LA LECHE ENTERA a. TOME 10 cc. DE ACIDO SULFURICO EN EL BUTIROMETRO El cido sulfrico debe ser del tipo comercial con una densidad de 1.820 a 1.825 y una concentracin de 91%.Para ajustar la densidad del cido debe disponer de un buen densmetro para cido calibrado entre 1.810 a 1.850, luego segn la lectura del densmetro agregue agua en la cantidad que le indique la tabla. Cuidado el agregado de agua al cido tiene su tcnica, primero diluya un poco de cido agregando el cido al agua y la mezcla la aplica al cido por corregir. Tenga cuidado al efectuar la mezcla, la regla es aadir el cido al agua, poco a poco. Agregue 11 cc. de leche con precaucin Agregue 1 cc. de alcohol amlico Al agregar la leche y el alcohol lo debe hacer con cuidado de modo que los lquidos queden sobrepuestos. El alcohol amlico impide la formacin de espuma y consigue que la separacin de grasa sea ms ntida. Sin embargo, se debe tener especial cuidado en comprobar que sea el correcto pues de los varios alcoholes conocidos, slo el apropiado es el alcohol amlico o isoamilico con un punto de ebullicin 128 C y una densidad de 0.815. Este alcohol debe cumplir con la condicin de no incorporarse a la grasa. De ocurrir esto, el tenor graso de la leche se lee con un valor ms alto. Una forma de comprobar si el alcohol es el apropiado, el cargando el butirmetro con 10 cc. de cido 11 cc. de agua, 1 cc. de alcohol amlico ensayado, se agita y se centrfuga. En la espiga del butirmetro, no debe presentarse la ms mnima separacin de algo que parezca grasa. d. Tapar el butirmetro Los butirmetros presentan tapas de goma alargada o tapas Fibus que se manejan con un mandril.

b. c.

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e.

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Mezclar el contenido del butirmetro mediante sucesivas inversiones Esta operacin se puede hacer manual o mecnicamente conviene recordar que al efectuar la mezcla se produce una reaccin exotrmica muy fuerte, por lo cual conviene coger el butirmetro con un pao hmedo. f. Centrifugar por 5 minutos a 1200 rpm Al igual que la tcnica Babcook es necesario mantener el butirmetro caliente, para facilitar esto algunos centrfugas tienen calefaccin. g. Efectuar la lectura La grasa se aloja en la espiga del butirmetro como un aceite ligeramente dorado, luego con la ayuda del tapn se hace coincidir el menisco inferior de la columna de grasa en cero y se procede a efectuar la lectura entre el nivel ms bajo y la parte inferior del menisco superior. MTODO PARA LA DETERMINACIN DE GRASA EN QUESO SEGN VAN GULIK Materiales Butirometro para queso segn Gerber Reactivos. cido sulfrico con una densidad de 1,52. Alcohol amlico o de Drawin. Procedimiento. a. Pesar 3 gramos de queso rallado en el vasito del butirmetro, se cierra el butirmetro por debajo y se vierte por encima cido sulfrico, hasta que est sobre el nivel del vasito. b. Colocar el butirmetro al bao mara a 70C - 80C, hasta que la muestra est totalmente diluida. Durante el calentamiento se tiene que agitar varias veces el butirmetro. c. Luego se agrega 1 mL, de alcohol amlico y cido sulfrico hasta que el lquido est en 15% de la escala. Se mezcla el contenido del butirmetro por inversin y se coloca otra vez 5 minutos al bao mara de 65C. d. Terminado sta etapa, se lleva a la centrfuga por 5 minutos de 1000 a 1200 r.p.m., Luego se pone en bao mara de 65 C y se determina el porcentaje de grasa en la escala del butirmetro, Para el efecto se pesan 10 g de leche, se le agrega 1 cc. de amoniaco al 10% (0.96 densidad) 10 cc. de alcohol absoluto de 96 y se agita. Luego se agregan 25 cc. de ter etlico (punto de ebullicin 34.9 C) y se vuelve a agitar. Finalmente se agregan 25 cc. de ter de petrleo (punto de ebullicin 30 - 50 C) y se agita. El amoniaco y el alcohol disuelven la sustancia proteica que protege al glbulo graso, con lo cual el ter puede disolver la grasa. Despus de haber dado tiempo para la accin se observa sobrenadar a la grasa y se procede a evaporar los solventes. Luego el residuo (grasa) se seca a 105 C durante una hora y se pesa el resultado y se lleva a una expresin porcentual. Finalmente el erlenmeyer conteniendo la grasa se pesa en balanza analtica y los resultados se expresan en porciento segn:

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Cuestionario
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

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Por qu es necesario que la muestra est deshidratada antes de realizar la extraccin de grasa? Mencione tres tipos de solventes orgnicos (diferentes al ter de petrleo) en los cuales sean solubles los lpidos? Cul es la funcin de los tubos externos que forman parte del extractor del equipo Soxhlet? Cul es la funcin del refrigerante dentro del equipo Soxhlet? Qu otros tipos de extractores pueden usarse para determinaciones de grasa? Cul es la diferencia entre ellos? Cmo podemos clasificar los lpidos? Cul es el papel de los lpidos en los alimentos?

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