EVALUACIN DEL EFECTO DEL OZONO Y DE LA RADIACIN ULTRAVIOLETA SOBRE LA ESTRUCTURA Y VIABILIDAD DE HUEVOS DE HELMINTOS Ma.

Neftal Rojas Valencia y Teresa Orta de Velsquez Instituto de Ingeniera, UNAM, Ciudad Universitaria. Apdo. Postal 70-472, Coyoacan 04510, Mxico, D.F. Tel: 622-33-20 ext. 14, Fax 616-21-64

RESUMEN

Como parte de un estudio sobre diversos mtodos de tratamiento y desinfeccin de las aguas residuales para reusarse en el riego, se evalu experimentalmente el efecto del ozono (O 3) y de las radiaciones ultravioleta (UV) sobre la estructura y viabilidad de los huevos de helminto, bajo diferentes tiempos de contacto (5, 10, 15, 20, 25 y 30 min, con tres repeticiones cada uno) en medio lquido y exposicin directa. Se utilizaron muestras sintticas preparadas con una suspensin de huevos recientemente extraidos de una hembra grvida de Ascaris suum. Los huevos despus de haber sido ozonados o en su caso expuestos a radiaciones UV fueron observados y posteriormente incubados, en obscuridad a 26 C durante 21 das (al igual que el testigo que no fue expuesto ni al ozono ni a las radiaciones UV), para ver si se habia afectado la viabilidad de los huevos en los diferentes tiempos de contacto. Los resultados obtenidos bajo condiciones de ozonacin y radiaciones UV en medio lquido y exposicin directa muestran que dichos desinfectantes no ocasionan ningn efecto sobre la estructura y viabilidad de los huevos frtiles de A. suum ya que se observarn larvas mviles dentro del huevo y su eclosin, al igual que en el testigo.

INTRODUCCIN En nuestro pas la reutilizacin segura de las aguas residuales en agricultura es una necesidad urgente ya que dichas aguas contienen agentes patgenos como virus, bacterias, protozoarios y huevos de helmintos que producen infecciones gastrointestinales, por lo que su reciclaje para riego agrcola presenta un riesgo potencial para la salud pblica. Por ello se ha tenido que estudiar la posibilidad de aplicar sistemas de tratamiento eficientes y desinfectantes efectivos, que produzcan efluentes con calidad bacteriolgica y helmintolgica requerida para riego segn la normatividad mexicana. Dentro de los agentes qumicos que han sido empleados como desinfectantes de las aguas residuales se encuentra el cloro (hipocloritos y cloraminas), y otros compuestos como

bromina, iodo, fenol, alcoholes, metales pesados, jabones, detergentes sintticos, compuestos de amonio,y varios cidos (como el clorhdrico, nitrco, actico y sulfrico). Si bin el empleo de dichos desinfectantes han sido efectivos para eliminar bacterias y virus entre otros microorganismos, no lo son para los huevos de helmintos (parasitos intestinales, que ocupan los primeros lugares dentro de los problemas de salud pblica en Mxico), ya que los huevos sobreviven muy bien bajo las sustancias mencionadas y otras inhspitas similares (Odda, 1987; Schmidt y Roberts, 1981; Schmidt y Roberts, 1984; Shephard, 1987 y Orta et al ., 1990). Por lo que respecta al estudio de otros desinfectantes ms potentes, como el ozono y las radiaciones ultravioletas, el primero se ha considerado desde hace muchos aos como un desinfectante eficaz, agente bactericida y un oxidante qumico poderoso tanto en reacciones orgnicas como innorgnicas (Tebbut, 1990; Orta et al ., 1995). Por otra parte las radiaciones UV han mostrado tener efectos fotoqumicos sobre el material gnetico de bacterias y virus, las investigaciones ms recientes se han enfocado a estudiar la inactivacin y tiempos de reactivacin de bacterias, virus y quistes de protozoarios (Harris et al ., 1987 y Mechsner et al., 1991). Hasta la fecha no se han encontrado datos en la literatura sobre accin que ejercen estos desinfectantes sobre los parsitos intestinales presentes en las aguas residuales. De aqu que en este estudio se evalu experimentalmente el efecto del ozono y las radiaciones UV sobre la estructura y viabilidad de los huevos de helmintos.

MATERIALES Y MTODOS Dado que en Mxico la ascariasis es la parasitosis de mayor incidencia, adems de tener distribucin cosmopolita y que las formas infectivas de Ascaris son sumamente resistentes a las condiciones ambientales adversas, se seleccion a este helminto como modelo en nuestro estudio. Sin embargo, para disminuir el riesgo de infeccin durante su manipulacin se decidi utilizar la variedad Ascaris suum, debido a que es especficamente infectante para cerdos y no para humanos, an cuando es morfolgicamente indistingible de la variedad lumbricoides de humanos (Schmidt y Roberts, 1984).

Obtencin de la suspensin de huevos de Ascaris suum (A. suum) Se recolectarn hembras de A. suum del rastro de Zumpango, Estado de Mxico. Las hembras fueron trasladadas al laboratorio en solucin salina isotnica, en el laboratorio se sometiern a diseccin para extraccin de los teros grvidos, de los cuales se extrajern los huevos por molienda y lavados con solucin salina isotnica. Con esta suspensin se iniciaron pruebas para determinar el efecto del ozono y de las radiaciones ultravioleta sobre la estructura y viabilidad de los huevos de helmintos.

Preparacin de experimentos para evaluar el efecto del ozono sobre la estructura y viabilidad de los huevos de helmintos Se prepararon muestras testigo (por triplicado) en un recipiente de plstico de 2 litros, de la siguiente manera: se aadi 1 litro de solucin salina isotnica ms 0.1 ml de una suspensin de huevos (aproximadamente 500 huevos) se homogeniz con la ayuda de un agitador magntico y se dej en agitacin sin ozonar el mismo tiempo de contacto al que se sometieron las muestras tratadas con ozono (5, 10, 15, 20, 25 y 30 min). Paralelamente a las muestras testigo se realizaron pruebas de desinfeccin en medio lquido (por burbujeo) y exposicin directa de ozono (a partir de aire enriquecido con oxgeno), variando tiempos de contacto en un generador de O3 para laboratorio "Trailigaz, LABO 76".

Pruebas de desinfeccin con ozono de huevos de A. suum en medio lquido Las muestras en medio lquido sometidas al generador de ozono (fig. 1), a diferentes tiempos de contacto, se prepararon as: en un recipiente de plstico de 2 litros, se le aadi 1 litro de solucin salina isotnica ms 0.1 ml de una suspensin de huevos (aproximadamente 500 huevos), se homogeniz con la ayuda de un agitador magntico e inmediatamente se paso a un sistema continuo de ozonacin mediante burbujeo y se les aplic un flujo constante de gas "O3" durante 5, 10, 15, 20, 25 y 30 minutos (con 3 repeticiones por cada tiempo). Para todos los casos, el flujo de ozono a la salida del generador se mantuvo constante en 0.61 l/min. aplicando una concentracin promedio de 31.3 mg O3/l en fase gas.

Figura 1. Sistema continuo de ozonacin en laboratorio. Despus de haber sido sometidas las muestras a diferentes tiempos de contacto con azono, as como el testigo sin ozonar, se aplicarn dos mtodos para concentrar los huevos y para poder observarlos en el microscopio y ver si el ozono causaba algn efecto sobre la estructura de los huevos de A. suum. Mtodo para concentrar los huevos de helmintos Las muestras con huevos de Ascaris suum despus de haber sido ozonadas se pasaron solamente por un filtro de membrana de 47 mm de dimetro y poros de 8.0 mm, aplicando vaco mximo de 40 cm Hg; al termino se lavaron las paredes del recipiente que se meti al ozonador y el embudo de filtracin con solucin salina isotnica y se pasaron estos lavados por el mismo filtro.

Se coloc la membrana sobre la pared interna de un vaso de precipitados y se raspo perfectamente con una esptula; se lavo la membrana y la esptula con solucin salina, recibiendo todos los lavados en el mismo vaso e inmediatamente se coloc una gota del concentrado en cada uno de cinco portaobjetos y se observaron los huevos en un microscopio ptico para ver si se presentaba alguna alteracin en la estructura de los mismos. Pruebas de desinfeccin con ozono de huevos de A. suum en exposicin directa Se sometieron los huevos de A. suum a exposicin directa (en un sistema similar a la figura 1 con la modalidad que en este caso no se utilizo medio lquido) de la siguiente manera: una gota (aproximadamente 500 huevos) de la suspensin de huevos recientemente extrados fue colocada en un porta objetos, la gota se distribuy homogeneamente y se meti hasta el fondo de un matraz de quitazato y se ozono aplicando una dosis constante de 60 mg O3/l en fase gas, con un difusor de O3 muy cercano al portaobjetos, durante 5, 10, 15, 20, 25 y 30 minutos (con 3 repeticiones por cada tiempo). La muestra testigo se prepar igual que la tratada, slo que se dej al aire libre por un lapso de tiempo igual al que se metieron al ozonador las muetras tratadas. Despus de observar si el ozono provocaba algn efecto o no, a la estructura de los huevos de A. suum tanto en medio lquido como exposicin directa, los huevos fueron incubados por 21 das (al igual que el testigo que no fue expuesto al ozono) en cido sulfrico 0.1 N, para ver si se habia afectado la viabilidad de los huevos, segn lo recomendado por la tcnica de incubacin in vitro de la US EPA, (1992). Preparacin de experimentos para evaluar el efecto de las radiaciones UV sobre la estructura y viabilidad de los huevos de A. suum Para evaluar el efecto de las radiaciones UV se siguieron igual que para el ozono dos pruebas: Pruebas de desinfeccin con radiaciones UV de huevos de A. suum en medio lquido La primera prueba consisti en mezclar (por duplicado) aproximadamente 3,000 huevos (0.5 ml de una suspensin de huevos recientemente extraidos de una hembra grvida de A. suum) en 20 litros de agua de la llave. Una de las suspensiones se dejo bajo agitacin magntica y en luz natural, esta correspondio a la muestra testigo. La segunda suspensin se metio a desinfectar (en un generador de luz ultravioleta "URMINUS") bajo radiacin UV a una longitud de onda de 254 nm, entre lmparas de arco de mercurio-argn y tubos reflectores de metal pulido durante 10 minutos, este mismo procedimiento se sigui, para los tiempos de exposicin de 15, 20 y 30 minutos. Al emplear solamente agua de la llave y la suspensin de huevos de helmintos, se asegur que no hubiera turbidez y que los huevos estuvieran expuestos libremente a la radiacin.

Las muestras con huevos de A. suum despus de haber sido sometidas a radiaciones ultravioleta se les aplic el mismo mtodo para concentrar los huevos de helmintos, empleado en los anlisis de ozono.

Pruebas de desinfeccin de huevos de A. suum por radiaciones UV en exposicin directa Se sometieron los huevos de helmintos a la accin desinfectante de los rayos UV a exposicin directa de la siguiente manera: una gota (aproximadamente 500 huevos) de la suspensin de huevos recientemente extrados fue colocada en un porta objetos, la gota se distribuy homogeneamente y se meti al equipo de radiacin ultravioleta a una longitud de onda de 254 nm sin ningn medio lquido, durante 10, 15, 20, 25 y 30 minutos (con 3 repeticiones para cada tiempo). Los huevos despus de haber sido expuestos a radiaciones UV, tanto en medio lquido como exposicin directa fueron observados y posteriormente incubados en obcuridad a 26 C durante 21 das (al igual que el testigo que no fue expuesto a las radiaciones UV), para ver si se habia afectado la viabilidad de los huevos en los diferentes tiempos de contacto. Los criterios para determinar si un huevo permanecia viable o no despus de ser ozonado o en su caso expuestos a las radiaciones UV fue la movilidad de las larvas dentro del huevo y la eclosin de las mismas despus de incubarlas in vitro.

RESULTADOS Y DISCUSIN Los resultados obtenidos en este trabajo fueron los siguientes: Los resultados obtenidos al pasar inmediatamente las muestras ozonadas (en los diferentes tiempos de contacto por un filtro de membrana de 47 mm de dimetro y poros de 8.0 mm), e inmediatamente observadas, mostraron que algunos huevos de A. suum, presentaban vacuolacin en el citoplasma, destruccin de una porcin de la parte externa de la cubierta protica, perdida de la cubierta externa y desintegracin del huevo por completo (fig. 2), por lo que se pens inicialmente, que el ozono si provocaba efectos sobre los huevos de helmintos. Debido a que tambin se observaron una buena cantidad de huevos ntegros (fig. 3) despus de todos los tratamiento con ozono, se procedio a verificar el efecto sobre su viabilidad (ya que los huevos viables son los que determinan la capacidad de un huevo de desarrollarse asta etapa infectiva), para ello se incubaron (segn la US EPA, 1992) y se observaron cada ocho das durante un mes y medio, hasta comprobar si se llegaban a formarse larvas despus de aplicarles el desinfectante.

Figura 2. Huevo de Ascaris suum no viable, en donde se observa la perdida de la cubierta externa y la desintegracin completa al ponerlo en contacto con el ozono por 30 minutos. Figura 3. Huevo de Ascaris suum sin ningn dao aparente despus de ver estado expuesto al ozono por 30 minutos. Por lo que respecta a los resultados de las radiaciones UV se observo que apesar que la longitud de onda de 253 nm es considerada muy fuerte para la inactivacin microbiana no muestra daos aparentes sobre los huevos de A. suum, podra ser que hubiera algn dao fotoqumico del ADN Y ARN como en otros casos, slo que no se tuvo la infraestructura para evaluar si se presentaba este efecto, por lo que lo ms conveniente fue evaluar el efecto sobre la viabilidad de los huevos. Despus de una observacin exhaustiva (mes y medio), se pudo constatar que las alteraciones provocadas por el ozono sobre los huevos de A. suum (como la prdida de la cubierta externa, vacuolacin en el citoplasma y destruccin de una porcin de la parte externa de la cubierta protica) slo se presentaban en los huevos no viables ya que los huevos viables se mantenian ntegros y llegaron a formar larvas (fig.4) aunque en un perodo mayor a los 21 das, por lo que se podra decir que la embrionacin se retardo por el empleo de los desinfectantes, ms no destruyo a los huevos viables ya que al final de la embrionacin las larvas eclosionaron (fig. 5) an despus de haber sido expuestos al ozono y las radiaciones ultravioleta por 30 minutos tanto en medio lquido como exposicin directa. Figura 4. Huevo de Ascaris suum en fase larval mvil (ozonado por 30 minutos) observado despus de un ms y medio de incubacin. Figura 5. Eclosin de un huevo de Ascaris suum (expuesto a radiaciones ultravioleta por 30 minutos) observado despus de un ms y medio de incubacin. Segn Rogers (1958) y Clark (1981) cuando un huevo se desarrolla hasta su fase larval y la larva eclosiona an despus de que se le agrege cualquier desinfectante qumico quiere decir que esta viable y en este caso se demuestra que el ozono y las radiaciones UV no les causa efecto alguno a los huevos viables. La resistencia extraordinaria a los desinfectantes qumicos, desecacin y penetracin de sustancias polares es el resultado de la capa de lpidos de la cubierta de los huevecillos de helmintos. Al menos en Ascaris, esta capa esta compuesta del 25 % de protenas y 75 % de ascarsidos . Los ascarsidos son glucsidos muy interesantes y nicos (compuestos con azcar y alcohol unidos por un puente glucosdico). En los ascarsidos, el azcar es ascarilosa (3, 6-didesoxy- L - arabinohexosa), y los alcoholes son una serie de manoles y dioles secundarios que contienen de 22 a 37 tomos de carbono. Los ascarsidos hacen que la cubierta del huevecillo sea virtualmente impermeable a todas las sustancias que no sean solventes de lpidos (Hinck, 1972;Schmidt y Roberts, 1981; Schmidt y Roberts, 1984).

Es de suma importancia recalcar que la concentracin de ozono de 31.3 mg/l y la de 60 mg/l en fase gaseosa empleadas en este trabajo, seran rpidamente fatales para conejillos de india y para el humano, por lo que es necesario continuar con este tipo de investigaciones sobre estos indestructibles parasitos intestinales hasta que se logre encontrar, la manera de destruirlos y as disminuir los riesgos de infeccin.

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES Los resultados muestran que el ozono y las radiaciones ultravioleta no ocasionan ningn efecto sobre la estructura y viabilidad de los huevos frtiles de helmintos an exponiendolos durante 30 minutos a los desinfectantes, ya que se observarn larvas mviles dentro del huevo y su eclosin, al igual que en el testigo. Aunque los huevecillos viables son extremadamente resistentes a la desinfeccin por ozono y a las radiaciones ultravioleta, la embrionacin se retarda por dichos factores. Los resultados obtenidos son la respuesta de huevos de Ascaris suum (parasito intestinal de cerdo), debido a que las respuestas son diferentes segn el tipo de microorganismo, no es conveniente generalizar los resultados observados, para todas las especies de helmintos, ya que posiblemente en otras especies si se presente algn efecto sobre los huevos por el empleo de dichos desinfectantes, es algo que faltara probar. Es importante determinar la viabilidad de los huevos de helmintos despus de aplicar cualquier tipo de desinfectante ya que esta caracterstica es la que demuestra que un huevo tiene vida o no y por lo tanto si el desinfectante es efectivo o no.

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