MSTER EN PRODUCCIN ANIMAL

DESARROLLO Y VALIDACIN DE UN MTODO ANALTICO DE CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA EFICACIA CON DETECCIN POR ESPECTROMETRA DE MASAS PARA LA DETERMINACIN DE ANTIINFLAMATORIOS NO ESTEROIDEOS EN LECHE Y TEJIDO MUSCULAR DE ORIGEN ANIMAL

Tesis de Mster Valencia, Septiembre 2012

Ana Gimnez Prez

Director:

Dr. Francisco Moragues Ribes

Directora:

Dra. Pilar Hernndez Prez

NDICE

RESUMEN

INTRODUCCIN 1. Descripcin del Centro Superior de Investigacin en Salud Pblica (CSISP) Laboratorio de Salud Pblica de Valencia (LSPV).

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2. Residuos de medicamentos veterinarios. 15 2.1. Legislacin y normativas sobre residuos de medicamentos de uso veterinario. 15 2.2. Anlisis y controles realizados en la Unidad de Residuos de medicamentos veterinarios del LSPV. 19 3. Antiinflamatorios no esteroideos (AINEs). 3.1. Clasificacin de los antiinflamatorios no esteroideos. 3.2. Legislacin y control de la utilizacin de antiinflamatorios no esteroideos. 3.3. Metodologas para el anlisis de antiinflamatorios no esteroideos. 4. Cromatografa lquida rpida de alta eficacia asociada a espectrometra de masas (UPLC-MS/MS). 4.1. Tcnica de cromatografa lquida (LC). 4.2. Introduccin a la espectrometra de masas (MS). 4.3. Acoplamiento LC-MS. 4.4. Equipos de espectrometra de masas tipo MSn o MS/MS. 21 23 24 27 30 30 31 33 35

OBJETIVOS

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MATERIALES Y MTODOS 1. Procedimiento para la validacin de mtodos analticos. 1.1. Introduccin. 1.2. Definiciones. 1.3. Determinacin y clculo de los parmetros de validacin. 2. Descripcin del mtodo analtico desarrollado para la determinacin de antiinflamatorios no esteroideos (AINEs) en msculo y leche por UPLC-MS/MS. 2.1. Alcance del mtodo. 2.2. Materiales, reactivos y equipos. 2.3. Preparacin de los patrones, la muestra y el cromatgrafo. 2.4. Realizacin del mtodo. 2.5. Tratamiento y expresin de los resultados. 2.6. Control de calidad.

41 43 43 44 46 48 48 48 50 52 56 58

RESULTADOS Y DISCUSIN 1. Desarrollo de un mtodo analtico para la determinacin de antiinflamatorios no esteroideos (AINEs) no autorizados en sanidad animal en leche.

59 61

2. Determinacin de carboxiibuprofeno, piroxicam, naproxeno, oxifenilbutazona, cido niflmico, flurbiprofen, suxibuzona, indometacina, fenilbutazona, cido mefenmico, cido flufenmico y cido meclofenmico, en leche y tejido muscular por UPLCMS/MS. 64 2.1. Validacin del mtodo. 77 2.2. Comparacin de los lmites establecidos con los de otras metodologas analticas. 84 2.3. Control del factor respuesta. 85 2.4. Control de los patrones internos de las muestras. 85 2.5. Confirmacin. 89

CONCLUSIONES

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BIBLIOGRAFA

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ANEXO

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RESUMEN

Se ha desarrollado un mtodo analtico para la determinacin de 12 antiinflamatorios no esteroideos (AINEs) en leche y tejido muscular de origen animal. Los AINEs investigados son los siguientes: carboxiibuprofeno (CXIBP), piroxicam (PIR), naproxeno (NPX), oxifenilbutazona (OPBZ), cido niflmico (NFL), flurbiprofen (FBP), suxibuzona (SBZ), indometacina (IND), fenilbutazona (PBZ), cido mefenmico (MEF), cido flufenmico (FFA) y cido meclofenmico (MCF). Los 12 AINEs determinados son frmacos no autorizados en animales productores de alimentos y no tienen Lmite Mximo de Residuos (LMR), pero se han tenido en cuenta los Lmites mnimos de funcionamiento exigidos (MRPL) que se recomiendan para 4 de ellos (MEF, PBZ, NPX y OPBZ). Las principales dificultades para la extraccin y determinacin de AINEs de matrices biolgicas son la presencia de grasa y las estrechas interacciones de estos frmacos con las protenas. Se han probado varios procedimientos para la extraccin y purificacin de las muestras de leche, obteniendo las mejores recuperaciones de los analitos mediante una extraccin con metanol y la utilizacin de cartuchos de SPE (Extraccin en Fase Slida). El procedimiento de preparacin de las muestras de tejido muscular se realiza mediante una hidrlisis qumica y una purificacin de las muestras con los mismos cartuchos de SPE utilizados para las muestras de leche. Los anlisis se han llevado a cabo con la utilizacin de un equipo de cromatografa lquida rpida de alta eficacia asociado a un espectrmetro de masas (UPLC-MS/MS). Se han estudiado los parmetros de selectividad/especificidad, lmite de decisin (CC) y capacidad de deteccin (CC) del mtodo para validarlo de acuerdo con la Decisin de la Comisin 657/2002/EC y acreditarlo por la Entidad Nacional de Acreditacin (ENAC), con la finalidad de ponerlo en funcionamiento en los anlisis de muestras oficiales del Laboratorio de Salud Pblica de Valencia (LSPV). Con los procedimientos de extraccin y purificacin de ambas matrices se han conseguido unas buenas recuperaciones de todos los analitos. El mtodo es sensible y selectivo, y los lmites de decisin (CC) establecidos se encuentran entre un mnimo de 2.5 g/Kg para cido niflmico, fenilbutazona y piroxicam, y un mximo de 20 g/Kg para flurbiprofen.

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INTRODUCCIN

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1. Descripcin del Centro Superior de Investigacin en Salud Pblica (CSISP) Laboratorio de Salud Pblica de Valencia (LSPV).
El Centro Superior de Investigacin en Salud Pblica (CSISP) es una institucin pblica de la Generalidad de la Comunidad Valenciana y se encuentra adscrito a la Consejera de Sanidad. Su objetivo es desarrollar y coordinar los proyectos cientficos que se propongan en la Direccin General de Salud Pblica (DGSP). El centro se cre a partir de la Ley 4/2005, de 17 de junio, de Salud Pblica de la Comunidad Valenciana [1] y se rige por el Decreto del Consejo 120/2008, del 5 de Septiembre [2]. Presenta como finalidad coordinar los proyectos de investigacin orientados al soporte cientfico de las polticas de salud pblica comunitarias y desarrollar nuevos mtodos, de modo que estos se apliquen en el mbito de Salud Pblica, permitiendo incrementar el nivel de salud de los ciudadanos. En el CSISP se incluyen diferentes reas de investigacin: Ambiente y Salud. Cncer y Salud Pblica. Desigualdades en Salud. Enfermedades Raras. Genmica y Salud. Investigacin en vacunas. Seguridad Alimentaria. Servicios de Salud. Salud Global.

El rea en la que he realizado las prcticas es la de Seguridad Alimentaria, que se compone de un jefe de rea y 14 investigadores, personal de la Direccin General de Salud Pblica (DGSP) y, a su vez, del Laboratorio de Salud Pblica de Valencia (LSPV). El rea de Seguridad Alimentaria tiene la funcin de controlar y prevenir los principales peligros que pueden causar los productos alimenticios en la salud del consumidor, estos pueden ser debidos a una contaminacin microbiolgica, la presencia de toxinas bacterianas, el uso de aditivos, la presencia de contaminantes ambientales o industriales y los residuos procedentes de medicamentos, de plaguicidas o de sustancias qumicas procedentes de la fase de envasado del producto alimenticio. Esta rea se compone de 4 lneas de investigacin: - Desarrollo de nuevos mtodos de extraccin de contaminantes orgnicos (PAHs, PCBs, PBDEs,) en alimentos y matrices ambientales. - Desarrollo de nuevos mtodos analticos, mediante cromatografa lquida de alta eficacia acoplada a la espectrometra de masas en tndem (HPLC-MS/MS), para la determinacin de contaminantes orgnicos y residuos de medicamentos veterinarios. - Desarrollo de mtodos analticos y de muestreo para el control de plaguicidas en aire ambiental, y evaluacin de los impactos en los alimentos.

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- Evaluacin del riesgo derivado de la presencia de contaminantes en los alimentos. Mi tutor, el Dr. Francisco Moragues Ribes, trabaja como veterinario investigador en la lnea de investigacin sobre el desarrollo de nuevos mtodos analticos, mediante HPLC-MS/MS, para la determinacin de residuos de medicamentos veterinarios. A travs de la investigacin en esta lnea de trabajo se ha alcanzado el desarrollo de nuevas metodologas analticas de gran sensibilidad, especificidad y con capacidad de confirmacin basados en el uso de la cromatografa lquida de alta eficacia (HPLC) acoplada a la espectrometra de masas en tndem (MS/MS), para el anlisis de contaminantes de gran inters en seguridad alimentaria y cuyo control ha sido establecido en los ltimos aos por la Unin Europea mediante distintos Reglamentos. Los anlisis rutinarios para la determinacin de residuos de medicamentos veterinarios se realizan en la Unidad de Residuos de Medicamentos Veterinarios del Laboratorio de Salud Pblica de Valencia (LSPV), donde adems se trabaja en esta lnea de investigacin del CSISP. Los Laboratorios de Salud Pblica se crearon para realizar el control y la prevencin de los problemas sanitarios que pueden presentarse en la poblacin, en el caso de los productos alimenticios, para asegurar la calidad y seguridad alimentaria tanto en el sector de qumica como en el de microbiologa. Segn el Programa de Vigilancia Sanitaria de Alimentos y de acuerdo con los principios del Reglamento (CE) 882/2004 [3], se procesa el control oficial de los alimentos mediante la toma de muestras y sus anlisis. El objetivo general de los laboratorios es garantizar la verificacin del cumplimiento de la normativa dirigida para prevenir, eliminar o reducir a niveles aceptables los riesgos para la salud de las personas y los animales. El Laboratorio de Salud Pblica de Valencia (LSPV) se encuentra situado en la Avda. Catalua n 21 de Valencia (C.P. 46 020). Los responsables son: el jefe de seccin D. Pedro Mart, y las jefas de negociado D. Carmen Igualada, D. Carmen Gonzlez, y D. Marisa Camar. Este laboratorio se divide en diferentes unidades, que se nombran a continuacin: Unidad de Registro (D. Pedro Martn). Unidad de Garanta y Calidad (D. Pedro Mart). Unidad de Microbiologa (D Marisa Camar). Unidad de Contaminantes Orgnicos (D Carmen Gonzlez). Unidad de Residuos de Medicamentos Veterinarios (D Carmen Igualada). Unidad de Qumica de Aguas y Alimentos (D Carmen Igualada). Unidad de Anlisis de Metales (D Carmen Gonzlez).

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2. Residuos de medicamentos veterinarios.

En animales productores de alimentos se utiliza una gran variedad de productos farmacolgicos para diferentes fines, ya sean teraputicos o zootcnicos. La utilizacin de la mayora de estos frmacos puede repercutir en la presencia de residuos medicamentosos (principio activo del frmaco o sus metabolitos) en los alimentos procedentes de animales tratados. En la mayora de los casos, la utilizacin de medicamentos en ganadera es necesaria para garantizar la salud y el bienestar de los animales, pero cuando se utilizan de manera fraudulenta, indiscriminada y abusiva, la entrada de residuos en la cadena alimentaria puede suponer un grave riesgo para la salud de los consumidores [4]. Las Buenas Prcticas de Manejo en produccin animal, la utilizacin racional de los medicamentos de uso veterinario y respetar los tiempos de espera, permiten disminuir o eliminar los residuos hasta niveles aceptables en el organismo animal antes del ordeo o del sacrificio. La presencia de residuos veterinarios en los alimentos de origen animal constituye una preocupacin creciente en el mbito de la Salud Pblica y los consumidores. Existen estudios que demuestran que estos residuos pueden ser perjudiciales dando lugar a diversos trastornos en los consumidores, como alergias, inhibiciones teraputicas, daos fisiolgicos, teratogenicidad, mutagenicidad, carcinogenicidad, cambios morfo-fisiolgicos y resistencias microbianas [4], por lo que se establecen parmetros que garanticen que aun consumiendo durante toda la vida de una persona alimentos con cierto nivel de residuos, en lmites inferiores a los establecidos, no produzcan ningn riesgo, y se prohben aquellos residuos medicamentosos que puedan ser considerados sustancias de elevado riesgo. El objetivo principal de la vigilancia de residuos de medicamentos de uso veterinario en alimentos, es evitar que lleguen al consumidor alimentos con residuos de sustancias que puedan tener consecuencias negativas para la salud.

2.1. Legislacin y normativas sobre residuos de medicamentos de uso veterinario.

La base de la normativa legal vigente que regula los medicamentos se encuentra en la Ley 29/2006 de 26 de julio, de garantas y uso racional de los medicamentos y productos sanitarios [5], donde se define: - Medicamento de uso veterinario como toda sustancia o combinacin de sustancias que se presente como poseedora de propiedades curativas o preventivas con respecto a las enfermedades animales o que pueda administrarse al animal con el fin de restablecer, corregir o modificar sus funciones fisiolgicas ejerciendo una accin farmacolgica, inmunolgica o metablica, o de establecer un diagnstico veterinario. Tambin se considerarn medicamentos veterinarios las premezclas para piensos medicamentosos elaboradas para ser incorporadas a un pienso. 15

El principal objetivo de la legislacin es que los productos alimenticios obtenidos de animales tratados con medicamentos veterinarios no contengan residuos o metabolitos de los mismos que puedan constituir un peligro para la salud del consumidor. Para ello, la Comisin elabor el Reglamento (UE) n 37/2010 de 22 de diciembre, relativo a las sustancias farmacolgicamente activas y su clasificacin por lo que se refiere a los lmites mximos de residuos (LMR) en los productos alimenticios de origen animal [6]. En este Reglamento se definen los siguientes trminos: - Residuos de medicamentos veterinarios como todas las sustancias farmacolgicamente activas, ya sean principios activos, excipientes o productos de degradacin, y sus metabolitos que permanezcan en los productos alimenticios obtenidos a partir de animales a los que se les hubiere administrado el medicamento veterinario de que se trate. - Lmite Mximo de Residuos (LMR) como el contenido mximo de residuos resultante de la utilizacin de un medicamento veterinario, expresado en mg/Kg (ppm) o en g/Kg (ppb) sobre la base del peso en fresco, autorizada en la Comunidad Europea o reconocida en la Comunidad Europea o reconocida como admisible en un producto alimenticio. Este Reglamento tiene un Anexo, en el que se muestran: - Las sustancias autorizadas en produccin animal: lista de sustancias farmacolgicamente activas para las que se establecen LMRs segn la especie y la matriz analizada. - Las sustancias prohibidas en produccin animal: lista de sustancias farmacolgicamente activas para las que no puede establecerse lmite mximo alguno debido a su elevado riesgo en la poblacin. Las sustancias de prohibida utilizacin en ganadera que se nombran en este apartado, son las siguientes: Aristolochia spp. y sus formulaciones. Cloranfenicol. Cloroformo. Clorpromacina. Colchicina. Dapsona. Dimetridazol. Metronidazol. Nitrofuranos (incluida la furazolidona). Ronidazol.

El Anexo de este Reglamento se modifica continuamente para cambiar o introducir valores de Lmite Mximo de Residuos de medicamentos utilizados en animales productores de alimento, as como para introducir sustancias farmacolgicamente activas que sean consideradas de alto riesgo y hasta el momento se desconoca su peligrosidad.

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En la Directiva 96/23/CE del Consejo de 29 de abril, relativa a las medidas de control aplicables a determinadas sustancias y sus residuos en los animales vivos y sus productos [7], se clasifican las sustancias farmacolgicas en dos grupos, A y B: GRUPO A: Sustancias con efecto anabolizante y sustancias no autorizadas 1. 2. 3. 4. 5. 6. Estilbenos, derivados de los estilbenos, sus sales y steres. Compuestos antitiroideos. Hormonas esteroides. Lactonas del cido resorclico (incluido el zeranol). Agonistas -adrenrgicos. Las sustancias que debido a su peligrosidad, como los nitrofuranos y el cloranfenicol, no se les puede asignar un lmite mximo de residuos en los alimentos de origen animal. GRUPO B: Medicamentos veterinarios y contaminantes 1. Frmacos antibacterianos, incluidas las sulfamidas, quinolonas. 2. Otros medicamentos veterinarios: Antihelmnticos. Anticoccidianos, incluidos los nitroimidazoles. Carbamatos y piretroides. Tranquilizantes. Antiinflamatorios no esteroideos (AINEs). Otras sustancias con actividad farmacolgica.

3. Otras sustancias y contaminantes medioambientales: Compuestos organoclorados. Compuestos organofosforados. Elementos qumicos. Micotoxinas. Colorantes. Otros.

En el presente estudio, se desarrolla un mtodo para determinar antiinflamatorios no esteroideos (AINEs), un tipo de sustancias farmacolgicas que pertenecen al Grupo B segn esta Directiva. Este tipo de frmacos se desarrolla ms detalladamente en el apartado 3 de la introduccin del presente trabajo. En el Real Decreto 1749/1998, de 31 de julio, por el que se establecen las medidas de control aplicables a determinadas sustancias y sus residuos en los animales vivos y sus productos [8]. En este Real Decreto se crea la Comisin Nacional de Coordinacin de Investigacin y Control de Residuos o Sustancias en Animales Vivos y sus Productos, se regulan aspectos relativos a las infracciones y sanciones aplicables en caso de incumplimiento, ya que la administracin ilegal de sustancias a animales de abasto se considera un delito contra la Salud Pblica. Tambin se designan los Laboratorios Nacionales de Referencia (LNR). 17

Segn el Real Decreto 1945/83, de 22 de junio, por el que se regulan las infracciones y sanciones en materia de defensa del consumidor y de la produccin agroalimentaria [9], en concreto en el Artculo 13 (Inspeccin), y en el Artculo 16 (Anlisis), se detalla como debe realizarse la toma de una muestra oficial y los diferentes anlisis que se pueden realizar (inicial, contradictorio y dirimente), como se indica a continuacin: Inicialmente el inspector toma una muestra oficial, de la siguiente forma: 1) Levanta un acta formalizada, por triplicado. 2) Toma 3 muestras (precintndolas y etiquetndolas adecuadamente, y firmando cada una de ellas). En el laboratorio se realiza el anlisis inicial con el primer ejemplar de la muestra, segn mtodos acreditados, si en el resultado de este anlisis se deduce una infraccin a la normativa vigente, se realiza un expediente sancionador, pudiendo ocurrir dos cosas: 1) Que el expedientado est de acuerdo con los resultados, por lo tanto se le aplique la sancin correspondiente. 2) Que el expedientado no est de acuerdo con los resultados y solicite, por su cuenta, la realizacin de otro anlisis, el llamado anlisis contradictorio, con el segundo ejemplar de la muestra. Si el resultado de este anlisis coincide con el del inicial se aplica la sancin. Si hay un desacuerdo entre los dictmenes de los dos primeros anlisis, el rgano competente designa otro laboratorio oficial que realizar, con el tercer ejemplar de la muestra, un tercer anlisis con carcter urgente que ser un anlisis dirimente y definitivo. La Decisin de la Comisin 657/2002/CE, de 12 de agosto, por la que se aplica la Directiva 96/23/CE del Consejo en cuanto al funcionamiento de los mtodos analticos y la interpretacin de resultados, trata sobre el anlisis y control de las sustancias medicamentosas [10]. En esta Decisin se indica el perodo de adaptacin del mtodo segn el grupo al que pertenece la sustancia (las sustancias del grupo A tienen un perodo de adaptacin de 2 aos mientras que las del grupo B de 5), y se especifican los mtodos e instrumentos adecuados para la identificacin de los diferentes residuos orgnicos o contaminantes. Por ltimo, es necesario indicar que para la puesta en funcionamiento de un nuevo mtodo desarrollado para la determinacin de residuos de medicamentos, ste debe ser validado, segn las recomendaciones de la Decisin 657/2002 de la Comisin Europea [10], y acreditado por la Entidad Nacional de Acreditacin (ENAC), segn la Norma UNE EN-ISO/IEC 17025 sobre evaluacin de la conformidad.

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2.2. Anlisis y controles realizados en la Unidad de Residuos de medicamentos veterinarios del LSPV.
Actualmente, en el LSPV se realizan anlisis para la determinacin de los residuos de medicamentos que se nombran en la Tabla 1.1, todos los ensayos estn acreditados por la Entidad Nacional de Acreditacin (ENAC), y se encuentran detallados en el Anexo Tcnico Rev. 15 del LSPV [11]. Este Anexo se modifica y amplia tras las auditorias realizadas por ENAC. La prxima auditoria del departamento de Residuos de Medicamentos del LSPV se va a realizar en octubre de 2012, en la que se va a acreditar el mtodo desarrollado en el presente estudio. Como se puede observar en la Tabla 1.1 de la pgina siguiente, hasta la actualidad se determinaban 4 AINEs en msculo. Tras el desarrollo y validacin del mtodo propuesto en este estudio, se ha ampliado la cantidad de analitos a analizar en tejido muscular, y se ha desarrollado un nuevo ensayo para determinar AINEs en leche. En la auditora que se realizar en octubre de este ao, se acreditar el mtodo para la determinacin de 12 AINEs tanto en msculo como en leche. Las cantidades de muestra por analitos a determinar varan anualmente, y los servicios de inspeccin se encargan de la recogida de las muestras correspondientes. La muestra debe ser aleatoria, representativa y homognea, y debe llegar al laboratorio en perfecto estado y precintada, adems debe tener una etiqueta donde se indique la solicitud del anlisis (parmetros solicitados), la naturaleza de la muestra, el n de muestra, el n de precinto oficial y el n de acta.

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Tabla 1.1. Ensayos realizados en el LSPV. Se nombran en el Anexo Tcnico Rev. 15 del LSPV.
Producto a analizar Orina animal Medicamento determinado en el ensayo Tcnica analtica LC-MS/MS LC-MS/MS

Corticoesteroides (dexametasona, betametasona, flumetasona, metilprednisolona) Hormonas (dienestrol, hexestrol, taleranol, zearalenona, zeranol, -boldenona, dietilestilbestrol, -boldenona, -nortestosterona, stanozolol, stanozolol-OH, -nortestosterona) Tranquilizantes y b-bloqueantes (acepromacina, azaperona, propionilpromacina, carazolol, clorpromacina)

LC-MS/MS

Msculo animal

Tetraciclinas (clortetraciclina, doxiciclina, oxitetraciclina, tetraciclina) Antiinflamatorios no esteroideos (cido mefenmico, fenilbutazona, naproxeno, oxifenilbutazona)

LC-DAD LC-MS/MS

Msculo de ave y pescado Agua de bebida de animales Miel Leche Tejido animal Huevos y ovoproductos Tiroides Msculo Orina animal Orina animal Hgado animal Piensos Agua de bebida de Animales Msculo Rin Msculo Piensos

Quinolonas (cido oxonlico, ciprofloxacina, diflozacina, enroflozacina, flumequina, danoflozacina) Cloranfenicol

LC-MS/MS

LC-MS/MS

Tireostticos

LC-MS/MS

-agonistas (brombuterol, clembuterol, clenpenterol, hidroximetilclenbuterol, mabuterol, mapenterol, ractopamina)

LC-MS/MS

Sulfamidas Nitroimidazoles (dimetridazol, ronidazol, metronidazol, ipromidazol, ipromidazol-OH, dimetridazol-OH, metronidazol-OH)

CL-MS/MS LC-MS/MS

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3. Antiinflamatorios no esteroideos (AINEs).

Los antiinflamatorios se utilizan extensamente tanto en medicina humana como en veterinaria. Son un grupo de medicamentos usados debido a su efectividad para suprimir o prevenir la inflamacin, tratar alergias, reducir la fiebre y el dolor, entre otras funciones. Hay una gran variedad de clases de antiinflamatorios que difieren segn su accin hacia los mediadores bioqumicos que son liberados durante la inflamacin y que provocan la respuesta inflamatoria. Esos mediadores son la histamina, la serotonina, los pptidos, las citoquinas, los eicosanoides, y el factor de activacin plaquetaria. Los antiinflamatorios de dividen en dos categoras principales: antiinflamatorios esteroideos (generalmente corticoides) y antiinflamatorios no esteroideos (AINEs). Tambin existen otros grupos de analgsicos entre los que se encuentran los AINEs como analgsicos no opiceos, junto con otro grupo de frmacos denominados opioides, entre los que se encuentran la morfina o el fentanilo. Entre las principales clases de antiinflamatorios tambin se incluyen los antagonistas de bradicinina y kallidina, y los antihistamnicos. Algunos de estos antiinflamatorios actan antagonizando la accin de los mediadores bioqumicos y otros inhibiendo su produccin. En medicina veterinaria, las clases de antiinflamatorios ms frecuentemente utilizadas son los corticosteroides y los antiinflamatorios no esteroideos (AINEs). A continuacin se explican detalladamente los antiinflamatorios no esteroideos (AINEs), ya que este estudio se basa en la determinacin de residuos de este grupo de medicamentos en productos de origen animal: Los AINEs son un grupo heterogneo de medicamentos con estructura qumica diferente pero con efectos bastante semejantes. Se utilizan extensamente tanto en medicina humana como en veterinaria, debido a sus propiedades antiinflamatorias, analgsicas y antipirticas. Adems, tienen la ventaja de no poseer el efecto inmunosupresor que causan los corticosteroides [12]. Sin embargo, pueden causar efectos adversos en el sistema gastrointestinal, hematopoytico y renal. La lcera gastrointestinal es uno de los efectos secundarios ms frecuente y grave, especialmente en casos de sobredosis y abuso crnico. Adems, como todos los medicamentos, pueden interaccionar con otros medicamentos y pueden causar reacciones alrgicas. Este tipo de medicamentos se utilizan en animales productores de alimentos para el tratamiento de enfermedades msculo esquelticas, mastitis, enfermedades pulmonares, enteritis, entre otras. El mecanismo de accin de los AINEs se basa en la inhibicin de la ciclooxigenasa (COX), una enzima que permite sintetizar prostaglandinas a partir del cido araquidnico. La ciclooxigenasa tiene varias isoformas, las ms conocidas son las isoenzimas COX-1 y COX-2, al inhibirlas se impide la formacin de prostaglandinas y tromboxanos [13]. La COX-1 tiene la funcin de sintetizar prostaglandinas protectoras y es constitutiva, mientras que la COX-2 es inducible y aparece durante el desarrollo de un proceso inflamatorio al sintetizar las prostaglandinas que intervienen en la inflamacin. Por ello los AINEs que inhiben la accin simultneamente de la COX 1 y 2, tienen mayor probabilidad de causar hemorragias y lceras gastrointestinales, 21

mientras que los AINEs con capacidad selectiva para la COX-2 tienen menos efectos secundarios. Sin embargo, algunos AINEs, como la indometacina o el piroxicam, tienen mayor afinidad por la inhibicin de COX-1, por lo que pueden ser todava ms txicos que los que inhiben por igual ambas isoenzimas. Las prostaglandinas son mediadoras de la inflamacin (las prostaglandinas sintetizadas por COX-2) pero tambin tienen funciones protectoras de la mucosa gstrica, el rin y el endotelio (las prostaglandians sintetizadas por COX-1). Debido a estas funciones protectoras de las prostaglandinas cuando se administran AINEs, que inhiben tanto a las prostaglandinas protectoras como a las que influyen en el proceso inflamatorio, no solo obtenemos los efectos antiinflamatorios que deseamos sino que tambin hay efectos adversos por la inhibicin de las funciones protectoras. Por otra parte, tambin se inhibe la sntesis de tromboxanos, lo que disminuye o impide la agregacin plaquetaria, efecto secundario que muchas veces se utiliza para tratar trombos o infartos de miocardio en medicina humana. Hay que destacar que recientemente se han comenzado a utilizar AINEs con accin inhibidora selectiva hacia la COX-2, entre ellos el meloxicam, el firocoxib y la nimesulida, que al tener mayor capacidad para inhibir la COX-2 tienen menos efectos secundarios respecto a los inhibidores no selectivos. Aunque uno de los inconvenientes del uso de este tipo de frmacos selectivos es que se tienen que administrar a dosis ms altas que los no selectivos para conseguir un mismo efecto antiinflamatorio y, por otra parte, con estos nuevos frmacos se han observado otros efectos secundarios como el aumento del riesgo de padecer problemas cardiovasculares [14]. El uso de AINEs en veterinaria se ha incrementado en los ltimos aos [12], sobretodo en el tratamiento de mamitis, administrndolos con o sin antibitico, y su extendida utilizacin presenta un riesgo potencial para los consumidores del alimento procedente de animales tratados, ya que si el alimento contiene residuos, estos entran en la cadena alimentaria humana y pueden ocasionar trastornos en los consumidores debido a los efectos adversos que presentan, a interacciones con otros medicamentos de los que se est tratando el consumidor o alergias al medicamento. Por estas razones, es necesario controlar los residuos de los AINEs en productos de origen animal, y desarrollar nuevos mtodos para monitorizar la conformidad de las muestras a analizar con la legislacin vigente. La gran cantidad de anlisis necesarios y los bajos lmites de residuos de AINEs que se deben detectar, hacen que la tcnica preferible para su anlisis sea la de cromatografa lquida acoplada a espectrometra de masas (LC-MS), tcnica desarrollada en el apartado 4 de la introduccin de este trabajo. Aunque tambin se han desarrollado mtodos por cromatografa de gases y otros tipos de detectores. A pesar de la utilizacin de instrumentos analticos tan sensibles, la correcta preparacin de las muestras es tan necesaria como el correcto funcionamiento del equipo para obtener unos resultados seguros. Sin embargo, el principal cambio en la determinacin de residuos de este tipo de medicamentos es la necesidad de desarrollar procedimientos multi-residuos o multi-analitos, con los que se pueda determinar una amplio nmero de frmacos, ya que existen una gran cantidad de AINEs en el mercado, y los procedimientos que determinan uno o varios AINEs son muy poco prcticos en el trabajo de rutina de un laboratorio. 22

3.1. Clasifica acin de lo os antiinfl lamatorio os no ester roideos.

Los AIN NEs se divid den en difer rentes grupo os segn su u estructura qumica (F Figura 1.1), a continuacin se mue estran los g grupos ms importantes s y algunos s de los frm macos proto otipo de cad da grupo [15 5]: Salicilat tos: cido ac cetilsaliclic co y cido metilsalicli m co. Paraam minofenoles: : paracetam mol. Pirazolo onas: fenilb butazona, ox xifenilbutaz zona, metam mizol y suxib buzona. Derivad dos del cid do indolact tico: indom metacina. Derivad dos del ci ido antran nlico: cido o meclofen nmico, ci ido tolfenm mico, flunixin y diclofena aco. - Derivad dos del cid do arilpropi ionico: ibup profeno, car rprofeno y n naproxeno. - Derivad dos del Oxic cams: pirox xicam y mel loxicam. Figur ra 1.1. Estru uctura qum mica de algu unos AINEs analizados con el mto todo desarro ollado en es ste estudio.

Naproxeno o

c cido mefen mico

F Fenilbutazo ona

ina Indometaci

Piroxicam m

c cido meclof fenmico

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3.2. Legislacin y control de la utilizacin de antiinflamatorios no esteroideos.

En el Anexo del Reglamento n 37/2010 [6], se nombran los AINEs que estn permitidos para el tratamiento de animales productores de alimentos, la mayora tienen establecido un LMR y otros no tienen LMR debido a su inocuidad. Por otra parte, hay muchos AINEs que estn prohibidos en ganadera, generalmente debido a que presentan unos efectos adversos y toxicidad ms graves que los AINEs autorizados. En la Tabla 1.2, se detallan los antiinflamatorios no esteroideos autorizados que tienen LMR establecido en la actualidad, segn la especie animal y el tejido que se analice. Aunque estos niveles podran ser modificados con el tiempo para cambiar o introducir valores de LMR. Tabla 1.2. Lmites mximos de residuos (LMRs) establecidos actualmente para los AINEs autorizados en algunas especies y en diferentes tejidos diana. Se encuentran en el apartado de sustancias autorizadas del Anexo del Reglamento n 37/2010. Sustancia farmacolgicamente activa cido tolfenmico Residuo marcador Especie animal LMR (g/Kg) 50 50 400 100 Carprofeno Suma de carprofeno y glucuronido de carprofeno conjugados. Bovino y quido 500 1000 1000 1000 Diclofenaco Bovino 5 1 5 10 0.1 Porcino 5 1 5 10 Tejido diana Msculo Leche Hgado Rin Msculo Grasa Hgado Rin Msculo Grasa Hgado Rin Leche Msculo Piel y grasa Hgado Rin

Bovino Porcino

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Firocoxib

quido

10 15 60 10

Msculo Grasa Hgado Rin Msculo Grasa Hgado Rin Msculo Piel y grasa Hgado Rin Msculo Grasa Hgado Rin Leche Msculo Hgado Rin Leche Msculo Grasa Hgado Rin Leche Msculo Grasa Hgado Rin

Flunixin

Flunixin

Bovino

20 30 300 100

Porcino

50 10 200 30

quido

10 20 100 200

5-hidroxiflunixin Meloxicam Meloxicam

Bovino Bovino, caprino, porcino, conejo, y quido. Bovino y caprino.

40 20 65 65 15 100 100 100 100 50 50 20 100 1000

Metamizol

4metilaminoantipirina

Bovino, porcino y quido. Bovino

Vedaprofeno

quido

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Hay otros AINEs que estn autorizados para su utilizacin en produccin animal y no tienen establecido un LMR debido a su inocuidad, como por ejemplo el cido acetilsaliclico de uso tpico (excepto en animales productores de leche o huevo) y el ketoprofeno en bovino, porcino y quidos [6]. Los AINEs que se van a determinar en este estudio no estn permitidos en animales productores de alimentos y no tienen un LMR establecido. Sin embargo, algunos frmacos que estn prohibidos y no tienen LMR, tienen un lmite mnimo de funcionamiento exigido (MRPL), este lmite es el contenido mnimo recomendado de un analito en una muestra que podra ser detectado y confirmado. El MRPL sirve para armonizar el funcionamiento analtico de los mtodos aplicables a las sustancias para las que no se ha establecido un lmite permitido. Este trmino se define en la Decisin de la Comisin 657/2002 [10], pero la mayora de MRPL no estn legislados, solo se recomiendan en la gua de los laboratorios comunitarios de referencia que realizan los anlisis de los analitos que tengan establecido algn MRPL, excepto para la determinacin de algunos residuos de medicamentos, como el cloranfenicol (sustancia farmacolgica prohibida en produccin animal) que tiene establecido un MRPL legislado y de obligatorio cumplimiento. Tabla 1.3. Lmites mnimos de funcionamiento exigidos (MRPL), recomendados por los Laboratorios Comunitarios de Referencia de algunos de los antiinflamatorios no esteroideos investigados en el estudio. Sustancia farmacolgicamente activa cido mefenmico Fenilbutazona Naproxeno Oxifenilbutazona Msculo, leche, rin, hgado y plasma Matrices MRPL (ppb) 10 5 10 5

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3.3. Metodologas para el anlisis de antiinflamatorios no esteroideos.

En este apartado se describen algunas de las metodologas analticas que se han desarrollado en los ltimos aos para la determinacin de AINEs en diversas matrices. Los aspectos ms importantes de cada mtodo (AINEs determinados, matrices analizadas, tcnica analtica utilizada, condiciones de separacin, procedimiento de extraccin y rendimiento del mtodo) se muestran en la Tabla del Anexo de este trabajo. Para la determinacin de antiinflamatorios no esteroideos se han utilizado diversas tcnicas analticas, como la cromatografa lquida, la cromatografa de gases, la espectrometra, la fluorometra, etc. En general, en casi todos los mtodos desarrollados recientemente se utiliza la tcnica de cromatografa lquida con deteccin por espectrometra de masas. No obstante, hay varias excepciones en las que se han utilizado otras tcnicas, por ejemplo Gallo et al. [16] utiliz un HPLC con deteccin por fluorescencia, y Fabbrocino et al. [17] desarroll un mtodo cuantitativo para determinar AINEs de plasma sanguneo mediante HPLC asociado a un detector de diodos (DAD), y para confirmar los espectros que obtenan del DAD utilizaron un espectrmetro de masas (MS). Por otra parte, como ya se ha comentado anteriormente, los mtodos desarrollados para la determinacin de AINEs deben ser multi-residuos (abarcar la deteccin de un amplio nmero de analitos en el mismo mtodo), con el fin de ponerlos en funcionamiento en el trabajo rutinario de un laboratorio, aunque todava no existe ningn mtodo publicado capaz de analizar simultneamente todos los AINEs autorizados y no autorizados en la UE. De todos los mtodos consultados solo hay un caso en el que se determin un nico medicamento, el firocoxib en leche de bovino [14], en los dems estudios se determinaron desde 4 [18,19] hasta 30 analitos [20] simultneamente. A continuacin se detalla la metodologa analtica descrita para el anlisis de estos frmacos en leche. Dowling et al. [14], analizaron firocoxib en leche de bovino, un AINE incluido hace pocos aos en el Anexo del Reglamento n 37/2010 debido a que se le ha establecido un LMR nicamente para quidos, en cambio est prohibida su utilizacin en otras especies. Este frmaco es inhibidor de la COX II, por lo tanto, puede dar lugar efectos secundarios cardiovasculares, y tiene una eficacia similar a otros AINEs como el carprofeno, el meloxicam y la fenilbutazona. Se comercializa con el nombre de Equioxx y Previcox. Este fue el primer mtodo en el que se determin firocoxib en leche, y posteriormente Dowling et al. [18] tambin determinaron este medicamento, junto con otros AINEs, en plasma de bovino. Recientemente, Jedziniak et al. [21] incluyeron la determinacin del firocoxib en un mtodo multi-residuos en leche. Malone et al. [19], determinaron 4 analitos en leche de bovino, y en los dems procedimientos de leche se determinaron entre 8 [12] a 19 analitos [21]. DubreiCheneau et al. [22], incluyeron los resultados de probar la extraccin de 12 AINEs con y sin hidrlisis, obteniendo mejores resultados con la extraccin simple lquido-lquido con metanol (sin hidrlisis). En este mtodo casi se consigui alcanzar el nivel tan bajo 27

de LMR (0.10 g/Kg) establecido en el ao 2011 para el Diclofenaco (Reglamento n 37/2010). Recientemente, Jedzaniak et al. [21] fueron los primeros en conseguir detectar el diclofenaco a un nivel igual a su LMR, con un lmite de decisin de 0.10 g/Kg. En este mtodo, Jedzaniak et al. determinaron simultneamente 14 AINEs cidos y 4 AINEs bsicos (metabolitos de metamizol), para ello se extraen los AINEs con acetonitrilo y acetato de amonio, y se separa en dos porciones el sobrenadante obtenido tras centrifugar. Malone et al. [19], desarrollaron un mtodo para la determinacin de 3 corticoides (dexametasona, betametasona y prednisolona) junto con 4 AINEs (cido tolfenmico, meloxicam, y los metabolitos 5-hidroxiflunixin y 4metilaminoantipirina), siendo este el primer mtodo capaz de confirmar y cuantificar simultneamente los corticoesteroides y los AINEs autorizados para su administracin en bovino de leche destinada a consumo humano. En cuanto a los estudios desarrollados para el anlisis de tejido muscular, a continuacin se describen los principales mtodos establecidos. Jedziniak et al. [21] y Hu T et al. [20], determinaron AINEs autorizados con LMR y AINEs no autorizados en tejido muscular. Jedziniak et al. [21], analizaron muestras de msculo de cerdo, caballo y pollo determinando 9 AINEs y un metabolito del Flunixin, el procedimiento para la preparacin de las muestras consisti en una hidrlisis enzimtica del msculo y una extraccin de los analitos con acetonitrilo. Hu T et al. [20], determinaron 30 AINEs en msculo de porcino, para ello realizaron un estudio con el fin de optimizar el procedimiento de extraccin de los analitos, probando diferentes condiciones de extraccin, las mejores recuperaciones las consiguieron con acetonitrilo. Por otra parte, hay mtodos en los que se determinan AINEs en varias matrices, estableciendo un procedimiento de preparacin de muestras diferente para cada matriz y las mismas condiciones para la deteccin y cuantificacin de los analitos en el equipo utilizado. En dos ensayos se analizan plasma sanguneo y leche mediante LC-MS/MS [24,25] y en otro, analizan leche y msculo [26]. Este ltimo mtodo se analizan las mismas matrices que en el mtodo desarrollado en este estudio por ello se resume a continuacin. En este mtodo, Gentili et al. [26] determinaron 15 AINEs por HPLC-MS/MS en leche y tejido muscular. El procedimiento en leche se bas en extraer los analitos con acetonitrilo y purificar las muestras con cartuchos OASIS HLB, concentrar bajo Nitrgeno a 30C y redisolver con fase mvil para transferir a los viales. El procedimiento en msculo consisti en extraer con metanol y acetonitrilo, centrifugar y repetir la extraccin con acetonitrilo, posteriormente se concentra en un bao de agua a 30C, se centrifuga y se purifica en cartuchos OASIS HLB, finalmente se concentra bajo Nitrgeno a 30C y se transfiere a los viales. Otras matrices analizadas para la determinacin de AINEs son rin [27], y orina de caballos deportivos [28] desarrollado para el control del dopaje, en este caso se determinaron una gran cantidad de medicamentos (40 esteroides anabolizantes y corticoesteroides, y 50 frmacos entre los que se incluyen inhibidores de la COX II, oxicams, anti-diabticos, sedantes, diurticos).

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Del conjunto de mtodos, los rangos y niveles establecidos de lmite de decisin (CC) y lmite de deteccin (CC), para las matrices y los antiinflamatorios no esteroideos investigados en este estudio, se muestran en la Tabla 1.4. Tabla 1.4. Rango de lmites de decisin (CC) y lmites de deteccin (CC) establecidos en la metodologa condultada para las matrices analizadas (leche y msculo) y 6 de los 12 AINEs estudiados en este proyecto. AINE CC en leche (g/Kg) CC en leche (g/Kg) CC en msculo (g/Kg) CC en msculo (g/Kg)

Indometacina cido niflmico Suxibuzona Fenilbutazona Oxifenilbutazona Naproxeno cido mefenmico

1.26 2.86 0.55 - 6 2.12 - 6 1.29 - 3.43 0.92 - 4.8

2.15 4.87 0.94 - 8 3.23 - 7 2.19 - 3.78 1.56 - 6.3

2 3.86 3.13 6.36 7.4

5 5.56 5.65 9.3 9.86

Algunos AINEs investigados en el mtodo desarrollado en este estudio (carboxiibuprofeno, piroxicam, flurbiprofen, cido flufenmico y cido meclofenmico) no se determinan ni en leche ni en tejido muscular en ninguno de los artculos consultados, pero la mayora de estos AINEs s se determinan en otras matrices como por ejemplo en plasma sanguneo [18] y en orina [28]. En plasma sanguneo, Dowling et al. [18], establecieron un lmite de decisin (CC) de 1.24 g/ml y un lmite de deteccin (CC) de 2,11 g/ml para el piroxicam. En orina, Ho et al. [28], establieron un lmite de decisin (CC) de 15 g/ml para el flurbiprofen, de 0.25 g/ml para el cido flufenmico, de 0.5 g/ml para el cido meclofenmico y de 1 g/ml para el piroxicam. Por ltimo, hay que indicar que no se han encontrado resultados sobre el carboxiibuprofeno en ninguna de las metodologas que se han consultado.

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4. Cromatografa lquida rpida de alta eficacia asociada a espectrometra de masas (UPLC-MS/MS).

4.1. Tcnica de cromatografa lquida (LC).

La cromatografa lquida (LC) es un procedimiento que permite la separacin, identificacin y cuantificacin, en cortos perodos de tiempo, de sustancias o grupos de sustancias, poco voltiles o trmicamente inestables, o que se transforman en sus derivados voltiles. Es importante que la muestra sea soluble en un disolvente, condicin que no cumplen las sustancias de alto peso molecular, pero si todas las sustancias orgnicas e inorgnicas inicas. Con el LC se pueden obtener tanto resultados cuantitativos como cualitativos. El anlisis cuantitativo se basa en la medida de alturas y reas de los picos cromatogrficos que muestran la concentracin de la sustancia a estudiar, en cambio el anlisis cualitativo se basa en la identificacin del analito en los tiempos de retencin. La muestra se desplaza junto con la fase mvil, los componentes que son fuertemente retenidos por la fase estacionaria de la columna se mueven lentamente con el flujo de la fase mvil, mientras que los componentes que se unen dbilmente a la fase estacionaria se mueven con rapidez. Como consecuencia de la distinta movilidad, los componentes de la muestra se separan en bandas. El equipo de LC lo componen, por orden: 1) Depsito de la fase mvil: es una botella que contiene la fase mvil (si hace falta desgasificarlo se introduce durante un tiempo en ultrasonidos), a parte de la fase mvil se puede tambin introducir, segn el procedimiento, acetonitrilo, metanol o una mezcla de ambos. Las fases mviles se preparan diariamente. 2) Bomba: se encarga de succionar la fase mvil. Tiene una gran capacidad para trabajar a altas presiones, es la que genera el caudal. Para las bombas que realizan la mezcla de las soluciones de los depsitos a baja presin es necesario desgasificar el lquido previamente, en cambio con bombas que realizan la mezcla a alta presin no es necesario. Si la elucin es isocrtica (fase mvil constante) es suficiente una sola bomba y un solo canal de disolvente. Si la elucin es en gradiente (cambia la composicin de la fase mvil a lo largo del tiempo del anlisis) normalmente se necesita una bomba con un sistema de dosificacin de cada uno de los eluyentes, la mezcla se realiza a baja presin y antes de ser impulsados. Tambin se puede realizar con dos o ms bombas mezclndose tras ser impulsados (a altas presiones).

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3) Sistema de inyeccin: se encarga de introducir la muestra sin tener que parar el flujo. Son automticos y de volumen variable, poseen una jeringa capaz de tomar volmenes exactos. 4) Columna: existen muchos tipos de columnas segn el analito que se quiera determinar, las matrices analizadas, y los distintos tipos y tamaos de partcula que se quiere separar. Adems, para un mismo tipo de columna existen distintos tamaos, lo que permite distintos volmenes de carga. 5) Detector: el equipo de cromatografa lquida se puede acoplar a diversos tipos de detectores, en el caso de este estudio se utiliza un espectrmetro de masas. Hay diferentes denominaciones para los equipos de cromatografa lquida segn su eficacia, rapidez o resolucin. En el caso de este estudio, se ha utilizado un equipo de cromatografa lquida rpida de alta eficacia (UPLC).

4.2. Introduccin a la espectrometra de masas (MS).

El fenmeno de la espectrometra de masas fue observado por primera vez gracias al fsico Thomson J J (1899), cuando descubri la desviacin en la trayectoria que sufre un haz de tomos cargados positivamente al pasar a travs de campos elctricos y magnticos. En 1918 y 1919, Dempster A J y Aston F W construyeron los primeros instrumentos capaces de actuar como un espectrmetro de masas, y desde entonces han evolucionado mucho tanto los equipos como los conocimientos sobre esta tcnica. Los espectrmetros de masas se han utilizado principalmente para extraer informacin acerca de la masa molecular y la estructura del compuesto analizado. Estos equipos pueden ser utilizados tanto para anlisis cualitativos como cuantitativos de diversas sustancias. El acoplamiento de la espectrometra de masas a tcnicas separativas se llev a cabo en 1956, cuando se empez a usar el primer cromatgrafo de gases asociado a un espectrmetro de masas (GC-MS). Pero el acoplamiento de esta tcnica a la cromatografa lquida era ms complejo, debido a la dificultad de ionizar a vaco una molcula que se encontraba en un disolvente. Fue casi 20 aos despus, cuando gracias al desarrollo de la ionizacin qumica a presin atmosfrica (API) junto con el "Electrospray" (desarrollado anteriormente para otros fines), se comenz a utilizar la cromatografa lquida asociada a la espectrometra de masas (LC-MS). La espectrometra de masas (MS) utiliza el movimiento de iones en campos elctricos y magnticos para clasificarlos de acuerdo a su relacin masa/carga (m/z). Las sustancias qumicas se identifican separando los iones gaseosos por la desviacin que sufren. El espectrmetro requiere un trayecto de colisin libre para los iones y, por lo tanto, funciona al vaco o en condiciones casi de vaco.

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Los espectrmetros de masas constan de cuatro partes bsicas: un sistema de introduccin de la muestra en el equipo, una fuente de ionizacin, un analizador y un detector. A continuacin se explican, por orden, cada una de las partes: 1) Un sistema de introduccin de la muestra, diseado para una mnima prdida de vaco. La muestra se puede introducir directamente al espectrmetro de masas con una jeringa o a travs de otro equipo cromatogrfico acoplado a este, ya sea de gases o de lquidos (GC-MS o LC-MS). 2) Una fuente de ionizacin, en la cual se produce un haz de partculas proveniente de la muestra y se crean los fragmentos de iones gaseosos de la muestra. Hay dos clases de fuentes de ionizacin: - Fuentes en fase gaseosa (como ionizacin qumica, ionizacin por impacto de electrones e ionizacin por campo), en las que la muestra se volatiliza fuera de la fuente de energa y antes de ionizar los componentes gaseosos. - Fuentes de desorcin (como desorcin por campo, bombardeo de tomos acelerados, Matrix Assisted Laser Desorption y electrospray), en este tipo de fuentes los iones se forman en la fase condensada, y se permite el anlisis de molculas no voltiles y trmicamente inestables. La fuente de ionizacin del equipo utilizado para el mtodo de antiinflamatorios desarrollado en este trabajo, es la fuente de desorcin por electrospray. El electrospray permite el anlisis de molculas de naturaleza polar que puedan cargarse positiva o negativamente en disolucin, es un tipo de tcnica de ionizacin a presin atmosfrica. Las molculas con carga en su estructura interna son muy adecuadas para ser analizadas mediante sta tcnica, en el caso de que la molcula no posea carga en su estructura se adiciona un cido o base voltil con el fin de generarla. En este caso la muestra debe ser soluble, no es posible analizar muestras insolubles. Con esta tcnica se pueden generar iones mltiplemente cargados, lo que permite abordar el estudio de molculas con una masa molecular por encima del lmite del analizador, siempre y cuando se produzca el proceso de multicarga. La presencia de sales en la muestra puede inhibir la ionizacin del producto. El electrospray se puede acoplar a un LC para analizar mezclas de productos polares. Es una tcnica de ionizacin que no produce apenas fragmentacin en la molcula, aportando poca informacin estructural de la misma. Se produce normalmente el ion M+H+ en modo positivo y el ion M-H- en modo negativo. Los iones observados proceden de la muestra en disolucin y no existen iones procedentes de la matriz como en el caso de otro tipo de fuentes. En el apartado 4.3 se explica ms detalladamente este tipo de fuente de ionizacin. 3) Tras la fuente de ionizacin, la siguiente parte del espectrmetro de masas es un analizador, que se encarga de separar los iones que se producen en la fuente de acuerdo a las relaciones de masa/carga (m/z). Hay diferentes tipos de analizadores: de sector magntico, por tiempo de vuelo, por trampa de iones y de cuadrupolo (simple o triple).

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En el equipo que se ha utilizado para este estudio, el analizador es de triple cuadrupolo. Este tipo de analizador est formado por cuatro rodillos paralelos a los que se aplica una corriente continua que afecta a la trayectoria de los iones viajando por el trayecto centralizado entre los 4 rodillos. Para las condiciones de voltaje introducidas en el equipo, solamente los iones de una relacin masa/carga determinada pueden pasar a travs del filtro del triple cuadrupolo, mientras los otros son barridos como molculas descargadas. En el apartado 4.4 se explica el funcionamiento de este tipo de analizador ms detalladamente. Para la obtencin de espectros de masas de forma rutinaria, se trabaja en condiciones de baja resolucin obteniendo espectros de masas en los que se representan las relaciones m/z de los iones obtenidos. 4) Por ltimo, se encuentra el detector, en el cual los iones separados son recogidos y caracterizados.

4.3. Acoplamiento LC-MS.

La asociacin entre la cromatografa lquida y la espectrometra de masas se hizo posible gracias al desarrollo de tcnicas de ionizacin a presin atmosfrica (API). Las tcnicas de API usadas en LC-MS son electrospray y APCI (ionizacin qumica a presin atmosfrica). En ambas tcnicas se utilizan voltajes altos y nebulizacin mecnica para producir iones en fase gaseosa. Producen poca fragmentacin y son tcnicas muy sensibles. Las diferencias entre ellas se observan en la forma que tiene cada una de generar los iones:
-

La ionizacin qumica a presin atmosfrica ioniza en fase gaseosa, por lo que se recomienda para compuestos menos polares y ms pequeos con cierta volatilidad, ya que se aplica un flujo de nitrgeno (gas nebulizador) y altas temperaturas (300 - 600 C), con el fin de evaporar el disolvente procedente del cromatgrafo de lquidos. Tiene la ventaja de que permite trabajar con flujos de trabajo ms altos (hasta 2 mL/min). El electrospray ioniza en disolucin, por lo que est muy indicado para compuestos polares y biomolculas (poco voltiles y termolbiles). El flujo de trabajo no debe superar 1 mL/min.

En el electrospray el efluyente del LC entra en la interfase a travs de la sonda capilar. Aplicando un voltaje alto (2 - 4 KV) y con un flujo coaxial de nitrgeno (gas de nebulizacin), el efluyente se convierte en un aerosol cargado positiva o negativamente (en funcin del potencial aplicado al capilar). Un flujo de nitrgeno calentado (gas de desolvatacin) ayuda a la evaporacin del disolvente a travs de la fuente. Las gotas emitidas por el capilar de electrospray disminuyen su tamao como consecuencia de la evaporacin del disolvente mientras la carga de la gota permanece constante. La 33

disminucin del radio de la gota a carga constante supone un aumento de la repulsin de cargas en la superficie de la gota. Para un radio dado, esta repulsin supera la tensin superficial de la gota, lo que produce la ruptura de sta. Esta secuencia se repite muchas veces formando gotas muy pequeas. Una pequea cantidad del spray es arrastrada a travs del orificio del cono, el resto va a parar al deshecho. Diferencias de presin y voltaje dirigen los iones a travs del cono de muestra, cono de extraccin y las lentes RF (octopolo) hasta el analizador. Los factores que afectan a la respuesta del analito en electrospray son:
-

Concentracin del analito: se produce una saturacin en la seal debido al "apiamiento" de molculas en la gota, no permitiendo a algunas molculas de analito alcanzar la superficie y siendo imposible, por tanto, la ionizacin de stas. Contenido de la matriz: en general la respuesta para el analito disminuye con el aumento de la concentracin de otros electrolitos. Esto se conoce como "supresin inica". Se debe a la competencia entre el analito y el electrolito por la carga y la ocupacin de la superficie de la gota. Actividad superficial del analito: la sensibilidad de un compuesto en la ionizacin electrospray es determinada por su actividad superficial; los iones que la favorecen son los que formarn iones en fase gaseosa con mayor probabilidad. Flujo: la respuesta del analito en electrospray disminuye con el aumento del flujo de fase mvil debido a que el tamao de las gotas aumenta con ste. Las partes integrantes de una interfase API son las siguientes:

1) Sonda: introduce el efluyente del LC en la interfase volatilizado (en el APCI) o nebulizado e ionizado (en el electrospray). 2) Electrodo de descarga de corona: slo en APCI. 3) Cono de muestra: dirige los iones a la primera zona de vaco. La expansin de estos provoca un enfriamiento que se puede traducir en la formacin de "clusters" de los analitos con molculas de disolvente, para evitar esto se aplica calor a esta zona. Es el responsable de la ionizacin de las molculas y de la fragmentacin de las mismas: a mayor peso molecular, mayor voltaje requerido para la ionizacin, ya que el aumento del voltaje produce la fragmentacin. 4) Cono de extraccin: dirige los iones a un segundo estado de vaco donde se encuentran las lentes de enfoque del octopolo. 5) Lentes RF del octopolo: dirige los iones hacia el centro del analizador de masas. Posee una combinacin de voltajes de DC (corriente continua) y RF (radiofrecuencia, una frecuencia de corriente alterna). 6) Analizador de masas (tiempo de vuelo, simple o triple cuadrupolo y trampa de iones).

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7) Detector dinolito: consiste en un fotomultiplicador pticamente alineado con un fsforo emisor de luz y con un dnodo de conversin de alto voltaje para conseguir alta sensibilidad, tanto en modo positivo como en modo negativo.

4.4. Equipos de espectrometra de masas tipo MSn o MS/MS.

Si se tiene en cuenta que una vez volatilizada e ionizada la molcula de inters, va a ser filtrada en relacin a su m/z, la deteccin de sta se llevar a cabo aislada de cualquier otra especie no ionizada o ionizada con m/z diferente. Sumado a este hecho, se tiene en cuenta que podemos fragmentarla obteniendo especies qumicas derivadas de la molcula de inters, podremos decir que la espectrometra de masas es una tcnica con un alto grado de especificidad. Pero existen casos en los que se hace necesario un mayor grado de especificidad (anlisis en los que la concentracin en la que aparece la especie de inters es muy baja y en matrices muy "complejas"). Para ello hay que tratar de "limpiar" la muestra en el analizador antes de que llegue al detector, esto lo hacen los equipos de espectrometra de masas en tndem (MSn o MS/MS). El equipo que he utilizado en las prcticas es un espectrmetro de masas en tndem con analizador de triple cuadrupolo y su funcionamiento consiste en tres etapas: 1) El efluyente previamente volatilizado e ionizado, pasa a travs del primer cuadrupolo (Q1) donde se focaliza un ion en relacin a su m/z (al igual que ocurra en la MS convencional). 2) Este ion (llamado ion precursor) es transferido a un segundo cuadrupolo (Q2) que se comporta como una clula de colisin donde interacciona con un gas de colisin y se fragmenta. 3) En un tercer cuadrupolo (Q3) se focaliza uno o varios de los iones producto proveniente de la fragmentacin del ion precursor. Existen diferentes formas de llevar acabo una medida en un espectrmetro de masas de triple cuadrupolo:
-

Product ion scan: el ion precursor es fijado en Q1 y transferido a Q2 donde se fragmenta. Los iones producto originados son medidos mediante el barrido en Q3. En este modo, se obtiene el tpico espectro MS/MS. Este es el mtodo ms empleado para LC-MS y la ionizacin por electrospray, y es la que se ha utilizado con el equipo UPLC-MS/MS para los mtodos de este estudio. Precursor ion scan: en este caso, en Q3 se fija la medida de un ion producto determinado y se hace el barrido en Q1. El resultado obtenido es el espectro del ion precursor del que proviene el ion producto fijado en Q3. Este mtodo es til para GC-MS y/o ionizacin qumica o por impacto electrnico. 35

Neutra ion scan: se lleva a cabo un barrido tanto en Q1 como en Q3 con el objetivo de obtener el espectro del ion precursor que sufre la prdida de una especie neutra. Est indicado para ionizacin qumica e impacto electrnico.

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OBJETIVOS

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Los objetivos principales de la tesis son los siguientes:

Desarrollar un mtodo analtico para la determinacin de diferentes Antiinflamatorios no esteroideos (AINEs) no autorizados en sanidad animal en leche y tejido mscular de origen animal. Validar el mtodo desarrollado para demostrar que cumple con los requisitos de la Decisin de la Comisin 657/2002/CE, por la que se aplica la Directiva 93/23/CE del Consejo, en cuanto al funcionamiento de los mtodos analticos y la interpretacin de resultados.

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MATERIALES Y MTODOS

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1. Procedimiento para la validacin de mtodos analticos.

A continuacin, se describe el proceso que se ha utilizado para llevar a cabo la validacin del mtodo de anlisis puesto a punto en este estudio. El procedimiento sigue las recomendaciones de la Decisin 657/2002 de la Comisin Europea, por la que se aplica la Directiva 96/23/CE, para el funcionamiento de los mtodos analticos y la interpretacin de los resultados [10]. Este procedimiento se aplica en el Laboratorio de Salud Pblica de Valencia cuando concurre alguna de las circunstancias siguientes:
-

Despus del desarrollo o adaptacin de un mtodo analtico y antes de su aplicacin a muestras analticas reales. Cuando, en la revisin de procedimientos ya validados, se produzcan variaciones significativas como: - Ampliacin de las matrices a las que se aplica. - Ampliacin del rango de medida. - Cambios en las cantidades de muestra empleadas en el anlisis. - Cambios en el proceso de extraccin y/o purificacin. - Cambios en la formulacin de reactivos empleados. - Cambios en los equipos de medida empleados.

1.1. Introduccin.
La validacin de ensayos fsico-qumicos, en el LSPV, se lleva a cabo mediante la sistemtica siguiente: a) Validacin inicial que se realiza empleando: - Material de Referencia Certificado (MRC) o muestras con valores conocidos. - Adiciones de cantidades conocidas de analito a una matriz. - Mediante la valoracin de los ejercicios interlaboratorio y/o controles internos de calidad. b) Revalidacin que se realiza cuando, en la revisin del procedimiento de ensayo, se producen cambios significativos empleando las siguientes tcnicas: - MRC o muestras con valores conocidos. - Adiciones de cantidades conocidas de analito a una matriz. - Mediante la valoracin de los ejercicios interlaboratorio y/o controles internos de calidad. - Comparacin con el procedimiento en revisin anterior.

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1.2. Definiciones.
-

Mtodo cualitativo: es aquel mtodo analtico que identifica una sustancia basndose en sus propiedades qumicas, biolgicas o fsicas. Mtodo cuantitativo: es aquel mtodo analtico que determina la cantidad o la fraccin de la masa de una sustancia de forma que pueda expresarse como valor numrico de unidades apropiadas. Coeficiente de Variacin (C.V.): es la magnitud que caracteriza la dispersin de una serie de n mediciones de un mismo mtodo analtico, expresada como medida relativa a la media aritmtica de los n resultados considerados. Su valor se calcula mediante la ecuacin 3.1. Ecuacin 3.1.
C.V .(%) =

x100

Donde: es la desviacin tpica de la serie de n mediciones y X es la media aritmtica de los n resultados considerados. El C.V. se expresa en %.
-

Exactitud de medida: grado de concordancia entre el resultado de una medicin y el valor de referencia aceptado. El trmino "exactitud" cuando se aplica a un conjunto de resultados de mediciones implica la combinacin de los componentes aleatorios y de un error sistemtico comn o de un componente del sesgo. Incertidumbre de medida: estimacin que caracteriza el intervalo de valores en el que se sita, generalmente con una alta probabilidad dada, el valor verdadero de la magnitud medida. La incertidumbre de medida incluye, en general, varios componentes. Algunos pueden estimarse a partir de la distribucin estadstica de los resultados de series de medicin, y pueden caracterizarse por la desviacin tpica muestral. Las estimaciones de los otros componentes solamente pueden basarse en la experiencia o en otras informaciones. Interferencia: modificacin de la funcin de respuesta del mtodo producida por la presencia de otras sustancias distintas al analito problema. Intervalo de trabajo: el intervalo de trabajo de un mtodo es el intervalo de concentracin en el que puede obtenerse una exactitud y precisin adecuadas al objetivo del mtodo. Lmite mximo de residuo (LMR): nivel mximo u otra tolerancia mxima de sustancias establecidos en la legislacin. Lmite mnimo de funcionamiento exigido (MRPL): contenido mnimo recomendado de un analito que debe ser detectado y confirmado. Sirve para armonizar el funcionamiento analtico de los mtodos aplicables a las sustancias para las que no se ha establecido un lmite permitido. 44

Material de Referencia (MR): material o sustancia en el que uno o ms valores de sus propiedades son suficientemente homogneos y se encuentran suficientemente definidos para permitir emplearlo en la calibracin de un instrumento, en la evaluacin de un mtodo de medida o en la atribucin de valores a un material. Material de Referencia Certificado (MRC): material de referencia, acompaado de un certificado, en el cual uno o ms valores de sus propiedades estn certificados por un procedimiento que establece su trazabilidad a una realizacin exacta de la unidad en la que se expresan los valores de la propiedad, y para la cual, cada valor certificado se acompaa de una incertidumbre con la indicacin del nivel de confianza. Mtodo normalizado: es todo aquel mtodo recogido en una norma, reglamento o publicacin de un organismo sectorial. Muestra: es una cantidad representativa (propiedades de la muestra idnticas a la de la poblacin) y estable (propiedades de la muestra inalterables desde su obtencin hasta la realizacin del ensayo), subconjunto de una poblacin, que se obtiene para determinar en ella los valores de ciertas propiedades, que posteriormente se utilizan para realizar inferencias respecto a las propiedades de la poblacin de la que se obtiene la muestra. Patrn interno (IS o ISTD): sustancia no contenida en la muestra, de propiedades fisicoqumicas lo ms prximas posible a las del analito que ha de identificarse. Esta sustancia se aade a cada muestra. Selectividad/especificidad: grado por el cual un mtodo puede determinar un analito particular dentro de una mezcla compleja, sin ser interferido por otros componentes de la mezcla. Validacin de un mtodo de ensayo: la validacin de un mtodo de ensayo establece, mediante estudios sistemticos de laboratorio, que las caractersticas tcnicas de dicho mtodo cumplen las especificaciones relativas al uso previsto de los resultados analticos. Error alfa (): probabilidad de que la muestra analizada sea realmente conforme, aunque se haya obtenido una medicin no conforme (decisin de falso no conforme). Para las sustancias del grupo A del anexo I de la Directiva 96/23/CE el error debe ser igual o inferior al 1%, para todas las dems sustancias, el error es igual o inferior a 5%. Error beta (): probabilidad de que la muestra analizada sea realmente no conforme, aunque se haya obtenido una medicin conforme (decisin de falso conforme). Lmite de decisin (CC): lmite en el cual y a partir del cual se puede concluir con una probabilidad de error que una muestra no es conforme. El lmite de

45

decisin debe establecerse segn requisitos de identificacin (mtodo cualitativo) o de identificacin ms cuantificacin (mtodo cuantitativo).
-

Capacidad de deteccin (CC): contenido mnimo de la sustancia que puede ser detectado, identificado o cuantificado en una muestra, con una probabilidad de error . En el caso de sustancias para las que no se ha establecido un lmite permitido, la capacidad de deteccin es la concentracin mnima en la que un mtodo puede detectar muestras realmente contaminadas con una certeza estadstica de 1. En el caso de sustancias para las que se ha establecido un lmite permitido, la capacidad de deteccin es la concentracin en la que un mtodo puede detectar lmites de concentracin permitidos con una certeza estadstica de 1.

1.3. Determinacin y clculo de los parmetros de validacin.

La validacin de un mtodo analtico, se reflejar en un informe de validacin y en registros que contengan, al menos, los parmetros del mtodo referentes a su selectividad/especificidad, lmite de decisin (CC), capacidad de deteccin (CC), y confirmacin tanto en mtodos cualitativos como cualitativos. En el caso de la validacin de un mtodo cuantitativo, adems de los parmetros citados, se debe incluir la linealidad/funcin respuesta del mtodo, la veracidad/exactitud/recuperacin, la repetibilidad, y la reproducibilidad intralaboratorio. En este estudio se ha desarrollado un mtodo cualitativo, con el que se identifican sustancias que no tienen LMR establecido. A continuacin se desarrollan los parmetros necesarios para la validacin del mtodo: A) Selectividad/especificidad: Se debe demostrar que el procedimiento de ensayo est libre de interferencias para el rango de concentraciones y las matrices a las que se aplica. Para ello, hay que analizar un nmero apropiado de muestras en blanco representativas, al menos 20, y se verifica la existencia o no de interferencias en la regin de inters en la que cabe esperar la elucin del analito. Se considera que la muestra est libre de interferencias cuando la seal obtenida, si existe, sea menor o igual al 30 % de la seal obtenida en el CC del analito. Cuando la seal obtenida sea mayor al 30 % de la del CC del analito, se evaluar si dicha presencia puede conducir a una falsa identificacin o la identificacin del analito se ve dificultada por la presencia de la interferencia. B) Lmite de decisin (CC): Se establece segn requisitos de identificacin, es decir, en el 100% de veces que se adicione una muestra a ese nivel de concentracin, se debe poder identificar la presencia de dicho analito, con las tolerancias de las intensidades relativas de los iones caractersticos del analito (ion ratio). 46

Se estima analizando al menos 20 materiales blancos por matriz, determinndose cul es la relacin seal-ruido al tiempo de retencin del analito. El lmite de decisin es el valor de concentracin correspondiente a una seal 3 veces superior a la seal-ruido obtenida de los 20 blancos. Tambin se puede estimar experimentalmente utilizando, en primer lugar, soluciones patrn en concentraciones decrecientes y as, tener una idea aproximada de su valor atendiendo a la respuesta obtenida para, posteriormente, realizar adiciones en concentraciones crecientes y en pequeos incrementos sobre material blanco, hasta llegar a una concentracin tal que nos permita identificar el analito en el 100% de las repeticiones. En ambos casos se realiza la comprobacin experimental mediante la adicin del analito en blancos de matriz a dicho nivel al menos 3 veces. Si la identificacin del analito se realiza en las 3 repeticiones, se procede a realizar al menos 10 repeticiones en dicho nivel. Se acepta ste como valor de CC si en la totalidad de las repeticiones se identifica el analito. Si esto no ocurriera, se repetira de nuevo el ensayo con un valor ligeramente superior de adicin. As, paulatinamente, hasta estimar experimentalmente un valor de CC que permita la identificacin en la totalidad de las repeticiones realizadas a un nivel. C) Capacidad de deteccin (CC): Se establecer tambin segn requisitos de identificacin. Se estima investigando el material blanco enriquecido en un valor prximo al lmite de decisin. En el caso de mtodos cualitativos y sin LMR, su valor se considerar igual al CC ya que se exigir que sea una concentracin tal que permita identificar el analito en el 100% de las repeticiones.

47

2. Descripcin del mtodo analtico desarrollado para la determinacin de antiinflamatorios no esteroideos (AINEs) en msculo y leche por UPLC-MS/MS.

2.1. Alcance del mtodo.

Muestras a las que se puede aplicar: El procedimiento puede aplicarse para la determinacin de carboxiibuprofeno (CXIBP), piroxicam (PIR), naproxeno (NPX), oxifenilbutazona (OPBZ), cido niflmico (NFL), flurbiprofen (FBP), suxibuzona (SBZ), indometacina (IND), fenilbutazona (PBZ), cido mefenmico (MEF), cido flufenmico (FFA) y cido meclofenmico (MCF) en msculo de animales de abasto, aves y conejos, y leche de animales de abasto, por cromatografa lquida rpida de alta eficacia acoplada a un espectrmetro de masas en tndem (UPLC-MS/MS). Rango de medida: Este procedimiento se aplicar para la determinacin de PIR, NFL y PBZ a concentraciones superiores o iguales a 2.5 ppb (g/kg), para OPBZ, CXIBP, SBZ, IND, MEF, FFA y MCF a concentraciones iguales o superiores a 5 ppb (g/kg), para NPX a concentraciones iguales o superiores a 10 ppb (g/kg), y para FBP a concentraciones iguales o superiores a 20 ppb (g/kg). Ya que durante la validacin del mtodo, se han establecido los siguientes lmites de decisin (CC): 2.5 g/kg para PIR, NFL y PBZ, 5 g/kg para OPBZ, CXIBP, SBZ, IND, MEF, FFA y MCF, 10 g/kg para NPX y 20 g/kg para FBP. La gua de los laboratorios comunitarios de referencia, del 7 de Diciembre de 2007, recomienda para algunos de estos analitos unos lmites de funcionamiento exigido (MRPLs) a los laboratorios que realicen estos anlisis, aunque estos lmites no son de obligatorio cumplimiento. Los MRPLs que se recomiendan de los 12 AINEs determinados son: 5 ug/Kg para PBZ y OPBZ, y 10 g/Kg para NPX y MEF (Tabla 1.3 del apartado 3.2 de la introduccin del trabajo). Como se puede observar en los niveles de CC que se han establecido para los analitos del mtodo desarrolado, los MRPLs recomendados para 4 de los analitos determinados se cumplen.

2.2. Materiales, reactivos y equipos.

Material - Centrfugas (11.000 r.p.m.) Jouan. - Ultracentrifuga (13.000 r.p.m.) Eppendorf. - Sistema de evaporacin con corriente de nitrgeno Turbo-Vap. 48

Agitatubos y agitadores basculantes. Balanza analtica con resolucin de 0.1 mg. Tubos de centrfuga de polisulfona de 50 ml con tapn enroscable. Tubos falcon de 50 ml. Tubos de polipropileno de 15 ml. Columna Cromatogrfica Acquity UPLC BEH C18 1.7 m (50 x 2.1 mm d.i.). Columnas de extraccin en fase slida C8, 500mg/6cce Applied separations. Tubos eppendorf con filtro (0.22 m) para volmenes inferiores a 500 l. Pipeta automtica 100-1000 l, resolucin 1 l. Pipeta automtica 100-1000 l, resolucin 5 l. Pipeta automtica 10-100l, resolucin 1 l. Pipeta automtica 1000-5000 l, resolucin 5 l. Pipeta automtica 1-10 ml, resolucin 10 l. Pipeta Pasteur de vidrio desechable. Probeta 250 ml. graduada clase A. Probeta 500 ml graduada clase A. Matraz aforado 1 ml. clase A. Matraz aforado 10 ml. clase A. Matraz aforado 50 ml. clase A. Matraz aforado 250 ml. clase A. Matraz aforado 500 ml. clase A. Matraz aforado 1000 ml. clase A. Dosificador 0.5-5 ml. Reactivos:

Agua desmineralizada por sistema Milli-Q (Millipore). Agua para HPLC. cido ascrbico para anlisis. cido clorhdrico al 37%, calidad de anlisis (p.a). Solucin HCl 0.24 M y cido ascrbico 0.02M: llevar 10 mL de HCl al 37% a 500 ml con agua milli Q en un matraz aforado de 500 ml clase A y aadir 1.8 g de cido ascrbico. cido frmico suprapur 100%. cido frmico 0,1 %: llevar 500 l (pipeta automtica 100-1000 l) de cido frmico suprapur a 500 ml con agua para HPLC. cido actico glacial (p.a). Acetonitrilo hypergrade para HPLC. Acetonitrilo con cido frmico al 0.1%: mezclar 500 l (pipeta automtica 1001000 l) de cido frmico suprapur con acetonitrilo hypergrade. Acetato de etilo, calidad HPLC. Metanol calidad para HPLC. Solucin de metanol/agua (30:70): mezclar 60 ml de metanol y 140 ml de agua desmineralizada. Solucin de resuspensin del extracto final: mezclar 50 ml de cido frmico 0,1% con 50 ml de acetonitrilo hypergrade para HPLC. Fenilbutazona (Sigma). 49

Oxifenilbutazona 1-hidrato, (LGC standars (Chemos)). Fenilbutazona-D10 (LGC standars (CIL)). Naproxeno (Sigma). cido mefenmico (Sigma). Carboxiibuprofeno (Witega). Piroxicam (Sigma). cido niflmico (Sigma). Flurbiprofen (Sigma). Suxibuzona (Sigma). Indometacina (Sigma). cido flufenmico (Sigma). cido meclofenmico (Sigma). Naproxeno-D3 (Witega). Gas nitrgeno "U" (99.99%). Equipo:

Equipo de cromatografa lquida rpida de alta eficacia con detector de espectrometra de masas de triple cuadrupolo y sistema informtico de tratamiento de datos cromatogrficos y espectrales (Waters).

2.3. Preparacin de los patrones, la muestra y el cromatgrafo.

2.3.1. Preparacin de patrones.
a) Solucin madre de PBZ, 1000 g/ml: pesar 50 mg de PBZ, disolver con metanol y llevar a 50 ml con metanol en matraz aforado. Conservacin en congelacin a temperatura inferior a -10 C. b) Soluciones madre de OPBZ, NPX, MEF, PIR, NFL, FBP, SBZ, IND, FFA y MCF de 1000 g/ml: pesar 25 mg de cada una de las sustancias, disolver y llevar a 25 ml cada una con metanol en matraz aforado. Conservacin en congelacin a temperatura inferior a -10C. c) Solucin madre de CXIBF, 500 g/ml: pesar 12.5 mg de CXIBF, disolver con metanol y llevar a 25 ml con metanol en matraz aforado. Conservacin en congelacin a temperatura inferior a -10C. d) Solucin mezcla intermedia, 10 g/ml: pipetear el volumen necesario (con una pipeta automtica 100-1000 l, resolucin 1 l) de la solucin madre de PBZ, OPBZ, NPX, MEF, PIR, NFL, FBP, SBZ, IND, FFA, MCF y CXIBF, y llevar a un matraz aforado de 50 ml enrasado con metanol, para obtener una solucin de concentracin de 5.0 g/ml para PBZ, PIR y NFL, de 10.0 g/ml para OPBZ, 50

MEF, SBZ, IND, FFA, MCF y CXIBF, de 20.0 g/ml para NPX y de 40 g/ml para FBP. Conservacin en refrigeracin a temperatura inferior a 8C. e) Solucin mezcla de trabajo 0,50 g/ml: pipetear 0.5 ml de la solucin mezcla intermedia en un matraz aforado de 10 ml clase A y enrasar con metanol. Preparacin diaria. f) Solucin madre de PBZ-D10, 500 g/ml: pesar 12.5 mg de PBZ-D10, disolver con metanol y llevar a 25 ml con metanol en matraz aforado. Conservacin en congelacin a temperatura inferior a -10C. g) Solucin madre de NPX-D3, 500 g/ml: pesar entre 12.5 mg de NPX-D3, disolver con metanol y llevar a 25 ml con metanol en matraz aforado. Conservacin en congelacin a temperatura inferior a -10C. h) Solucin de patrn interno (PBZ-D10 y NPX-D3) de trabajo de 1 y 2 g/ml: pipetear el volumen necesario de la solucin madre de PBZ-D10 y de NPX-D3, y llevar a un matraz aforado de 50 ml enrasado con metanol, para obtener una solucin de concentracin de 1.0 g/ml de PBZ-D10 y 2.0 g/ml de NPX-D3. Conservacin en refrigeracin a temperatura inferior a 8C. i) Solucin mezcla de todos los AINES para el control del factor respuesta: pipetear 100 l. de la solucin mezcla de trabajo de 0.50 g/ml y 250 l de la solucin de patrn interno (PBZ-D10 y NPX-D3) de trabajo y llevar a un matraz aforado de 1 ml con solucin de resuspensin del extracto final.

2.3.2. Preparacin de la muestra.

- En muestras de msculo: Se homogeniza perfectamente la muestra despus de haber eliminado la parte visible de grasa, mediante el corte en pequeas porciones con tijeras de diseccin. Posteriormente se tomar la porcin para el anlisis. - En muestras de leche: Se homogeniza perfectamente la muestra agitando el envase, posteriormente se tomar la alicuota para el anlisis.

2.3.3. Preparacin del cromatgrafo.

-

Se deja estabilizar el cromatgrafo durante al menos 10 minutos antes de la primera inyeccin. Se estabiliza en las condiciones indicadas en el punto 2.4.4 (Deteccin).

51

2.4. Realizacin del mtodo.

La determinacin de AINEs de este mtodo es cualitativa en todas las secuencias de rutina.

2.4.1. Paralelamente a la muestra se realizan un blanco de reactivos, un blanco de muestra y una muestra enriquecida, se les aade a todos ellos 100 l de la solucin de patrones internos (PBZ-D10 y NPX-D3) de trabajo y se preparan de la siguiente forma: a) Blanco de reactivos: sustituir los 2.5 g de muestra por 2 ml de agua. b) Blanco de muestra: pesar aproximadamente 2.5 g de una muestra en la que previamente no se han detectado los analitos de inters. c) Muestras enriquecidas en el CC: a cada alicuota de 2.5 g de muestra en la que previamente no se han detectado los analitos de inters, se aaden 25 l de la solucin mezcla de trabajo de 0.5 g/ml. d) Muestras: pesar aproximadamente 2.5 g de msculo en tubos de centrifuga de polisulfona de 50 ml y los 2.5 g de leche en tubos falcon de polipropileno 50 ml.

2.4.2. En muestras de msculo se realiza una hidrlisis qumica que consiste en los siguientes pasos: 1) Aadir 10 mL de cido clorhdrico 0.24 M y cido ascrbico 0.02 M a la muestra. 2) Agitar durante 1 minuto con el vortex. 3) Centrifugar a aproximadamente 11.000 rpm durante 10 min. En muestras de leche se realiza una extraccin orgnica con metanol, siguiendo los pasos indicados a continuacin: 1) Aadir 6 ml de metanol a la muestra. 2) Agitar en los agitadores basculantes durante 10 minutos. 3) Centrifugar a 11.000 rpm durante 5 minutos. 4) Llevar a evaporar el sobrenadante metanlico hasta 1 o 2 ml a aproximadamente 50 C en corriente de nitrgeno en el Turbo Vap. 5) Aadir 4 ml de la solucin de cido clorhdrico 0.24 M y cido ascrbico 0.02 M al extracto.

52

2.4.3. Fase de extraccin y purificacin de los analitos: 1) Preparar la columna de extraccin en fase solida C8 500 mg/6cc de Applied separations, pasando sucesivamente 4 ml de metanol y 4 ml de cido clorhdrico 0,24 M y cido ascrbico 0.02 M. 2) Pasar por la columna, el sobrenadante obtenido despus de centrifugar el msculo, o bien en el caso de las muestras de leche pasar el extracto evaporado y reconstituido. 3) Lavar la columna con 4 ml de una solucin metanol:agua (30:70). 4) Secar la columna durante 15 minutos con nitrgeno. 5) Eluir los AINEs de la columna con 4 ml de acetato de etilo. 6) Los extractos se evaporan a sequedad a aproximadamente 50 C en corriente de nitrgeno en el Turbo Vap. 7) Disolver el extracto con 250 l de una mezcla de cido frmico 0.1 % y acetonitrilo 50:50 (solucin de resuspensin), agitar en el vortex, y finalmente transferir a un tubo eppendorf con filtro. 8) Centrifugar durante 10 min a 8C a 13.000 rpm en la ultracentrifuga. 9) Transferir el sobrenadante a un vial de 250 l de polipropileno con un tapn con pre-apertura.

2.4.4. Deteccin: El cromatgrafo se estabiliza y se prepara para su funcionamiento con las siguientes condiciones: 1) Inyeccin de la muestra: se inyectan en el sistema cromatogrfico 10 l de los extractos purificados. 2) Condiciones cromatogrficas: a) Flujo: 0.600 ml/min. b) Columna Cromatogrfica Acquity UPLC HSS T3 1.8 m (50 x 2.1 mm d.i.) c) Gradiente cromatogrfico: segn se indica en la Tabla 3.1.

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Tabla 3.1. Gradiente cromatogrfico para el anlisis de AINEs. Tiempo (minutos) 0.00 0.50 4.50 5.50 6.00 7.00 7.10 8.50 cido frmico 0,1 (%) Acetonitrilo con 0.1% de cido frmico (%) 0 0 50 60 95 95 0 0

100 100 50 40 5 5 100 100

3) Condiciones del espectrmetro de masas: Parmetros de la pgina tune: a) Capillary (Kv): 4.0 b) Extractor (V): 5. c) RF Lens (V): 0.5. d) Source temperature: 150 C. e) Desolvation temperature: 460 C. f) Cone gas flow (L/Hr): 50. g) Desolvation gas flow (L/Hr): 1100. h) Collision gas flow (mL/Min): 0.35. 4) Mtodo MS: segn se muestra en la Tabla 3.2. 5) La secuencia de trabajo en el cromatgrafo constar de: Determinacin cualitativa: inyeccin de solucin de resuspensin, blanco de reactivos, blanco de muestra, muestra adicionada en el CC, inyeccin de solucin de resuspensin y el resto de muestras que podrn ser desde una hasta aproximadamente treinta, intercalando una inyeccin de solucin de resuspensin cada 6 muestras que garantice la inexistencia de efecto memoria del sistema.

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Tabla 3.2. Condiciones espectromtricas para el anlisis de AINEs. Analito / ESI1 CXIBP (-) OPBZ (+) NPX (+) PIR (+) PBZ (-) MEF (+) FBP (+) FFA (+) NFL (+) MCF (+) SBZ (+) IND (-) PBZ-D10 (ISTD) (-) NPX-D3 (ISTD) (+)
1 2

Cone voltaje (V) 15 30 20 20 30 20 70 20 30 20 20 20 30 20

Ion precursor 235.4 325.2 231.2 332.2 307.0 242.2 245.7 282.5 283.0 296.1 439.6 356.1 317.3 234.2

C.E.2 (eV) 10 15 20 20 20 30 20 20 20 20 10 30 30 30 20 30 20 40 30 35 20 20 10 20 40 10

Iones producto 3 191.2 73.0 204.2 120.0 185.2 170.0 95.3 121.2 279.3 131.0 224.2 209.4 197.2 217.5 264.3 244.5 264.3 145.1 243.4 180.1 309.4 160.1 312.0 297.1 289.1 188.2

Modo ionizacin electrospray (negativo o positivo). Energa de colisin. 3 Los iones productos colocados en la primera fila de cada AINE son los mayoritarios.

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2.5. Tratamiento y expresin de los resultados.

2.5.1. Tratamiento de los resultados por determinacin cualitativa. El resultado cualitativo se obtiene del valor del ratio de rea del AINE/rea del patrn interno (ISTD) obtenido en la muestra adicionada en el CC. A este valor se le restar el CV (%) obtenido en la validacin para este ratio. El resultado de las muestras analizadas cuyo ratio de rea de cualquier AINE/rea de ISTD sea mayor o igual al ratio rea del AINE/rea ISTD menos el CV (%) ser mayor o igual al CC de ese AINE. El resultado de las muestras cuyo ratio de rea de AINE/rea de ISTD sea menor al ratio rea AINE/rea ISTD menos el CV (%) ser menor al CC de ese AINE. En la Tabla 3.3 se muestran los 2 patrones internos (ISTD) que se utilizan en el mtodo, la fenilbutazona-d10 (PBZ-D10) y el naproxeno-d3 (NPX-D3). Tabla 3.3. Patrones internos (ISTD) para cada uno de los AINEs investigados. Patrn interno (ISTD) PBZ-D10 NPX-D3 Analitos

CXIBP, FBZ, IND. OPBZ, NPX, MEF, PIR, NFL, FBP, SBZ, FFA y MCF.

2.5.2. Confirmacin de los antiinflamatorios no esteroideos.. La confirmacin se basa en una comparacin del tiempo de retencin de cada uno de los AINEs en las muestras enriquecidas en el nivel del CC, con el tiempo de retencin del pico de inters de la muestra problema y sus respectivos espectros de masas. Una muestra se considerar no conforme cuando aparezca un pico en el cromatograma del ion producto de algn AINE, cuyo tiempo de retencin relativo no difiera ms del 2.5 % respecto al tiempo de retencin relativo de la seal obtenida para dicho ion en la muestra enriquecida. Adems, el ratio rea AINE/rea ISTD de la muestra deber cumplir lo descrito en el apartado 2.5.1, y la intensidad relativa obtenida entre los iones producto (rea ion producto 1 mayoritario/rea ion producto 2) debe ser similar a aquella obtenida para la muestra adicionada, teniendo en cuenta las tolerancias recogidas en la Decisin 657/2002/CE que se muestran en la Tabla 3.4.

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Tabla 3.4. Tolerancias permitidas por la Decisin 657/2002/CEE para las intensidades relativas de los iones producto. Intensidad relativa (% del ion ms abundante) > 50 % > 20-50 % > 10-20 % 10 % Tolerancia permitida 20 % 25 % 30 % 50 %

En el caso de obtener una muestra no conforme, se repetir de nuevo el anlisis por duplicado. La interpretacin del resultado se realizar en base a que, de los tres resultados obtenidos, para considerar la muestra como no conforme al menos dos deben dar un resultado superior o igual al lmite de decisin (CC), confirmndose la identidad de los analitos,. En el caso de que las dos muestras repetidas por duplicado fueran conformes, la muestra se informar como conforme o menor del CC.

2.5.3. Expresin de los resultados para la determinacin cualitativa: Se informar como < CC (muestra conforme) o CC (muestra no conforme). Indicando el valor del CC de cada AINE de la matriz y especie analizadas.

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2.6. Control de calidad.

2.6.1. Control interno del laboratorio: Como anteriormente se ha citado, la determinacin de los analitos en este mtodo es cualitativa, por lo tanto se deben controlar los siguientes criterios en cada secuencia de muestras analizadas: 1) Control previo al inicio del trabajo mediante una solucin para el control del factor respuesta. Se controlar el factor respuesta de la PBZ, dividiendo el rea obtenida por la concentracin del patrn. Criterio de aceptacin: se aceptarn valores comprendidos en el intervalo obtenido en la validacin. 2) Control del blanco de reactivos y del blanco de muestra: en primer lugar se verificar que el rea del ISTD est por encima del valor mnimo obtenido en la validacin para este rea, y posteriormente, que no hay ningn pico interferente (seal inferior al 30% del rea del analito en el CC) en el tiempo de retencin de cada AINE. 3) Control en las muestras adicionadas en el CC: primero se verificar que el rea del ISTD est por encima del valor mnimo obtenido en la validacin para esta rea. Posteriormente, se verificar que el ratio rea AINE/rea ISTD esta comprendido en el intervalo de la validacin. Finalmente se verificar que las intensidades relativas de los iones producto estn comprendidas en el intervalo obtenido en la validacin. 4) Criterio de aceptacin para las muestras: se aceptar como correcta una muestra, cuando el valor de rea del ISTD obtenido en ella sea mayor al rea del ISTD en la muestra adicionada al CC al que se le habr restado el % correspondiente al C.V obtenido en la validacin para tener en cuenta la variabilidad de esta rea. Acciones correctoras: ante el incumplimiento de alguno de los criterios de aceptacin de los controles de calidad, se realizar un estudio de las causas y se repetirn los anlisis anotndolo en el formato adecuado para que quede registrado.

2.6.2 Control externo: Participacin en ejercicios interlaboratorio cuando existan.

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RESULTADOS Y DISCUSIN

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1. Desarrollo de un mtodo analtico para la determinacin de antiinflamatorios no esteroideos (AINEs) no autorizados en sanidad animal en leche.
Con el objetivo de desarrollar un nuevo mtodo multi-residuos para la determinacin de antiinflamatorios no esteroideos (AINEs) en leche, se probaron diferentes procedimientos para la preparacin de las muestras. Las diferencias en la preparacin de las muestras de cada mtodo propuesto (A, B, C, B1, C1, B2, D, F y H) se basan principalmente en la forma de extraer los analitos de la matriz. A continuacin, se detallan los procedimientos de extraccin de los diferentes mtodos: - Mtodo A: Se extraen los AINEs con metanol, ya que son solubles en este solvente. Posteriormente se centrifuga, y se evapora el sobrenadante a 50 C en corriente de Nitrgeno (hasta obtener 1 - 2 ml). - Mtodos B y C: Se adicionan 5 ml de una solucin Tampn de Acetato Sdico 2 M a pH 4.8 y 10 ml de acetonitrilo, la solucin tampn a pH 4.8 hace que los analitos se extraigan con la fase orgnica (el acetonitrilo). Se aade un paquete de sales de extraccin EN 15662 (4 g MgSO4; 1 g NaCitrato; 0.5 g citrato disodio 6-H2O), estas sales ayudan a separar, de la matriz, las impurezas de los analitos, y estos pasan a la fase orgnica (el acetonitrilo). Posteriormente, se centrifuga y se recoge todo el sobrenadante. Tras observar las nfimas recuperaciones de las muestras analizadas con estos dos mtodos, se decidi pipetear solamente 5 ml del sobrenadante obtenido tras centrifugar, dando lugar a unos mejores resultados debido a la disminucin de las sustancias (sales) que supriman la ionizacin de los analitos en el equipo UPLC-MS/MS. Con esta modificacin, estos mtodos son el B1 y el C1. - Mtodo B2: Es igual que el mtodo B1 pero se aaden 100 l de una solucin antioxidante (cido ascrbico y EDTA). Esta solucin antioxidante, se aade con la finalidad de prevenir o disminuir la oxidacin de tres AINEs, la fenilbutazona, la oxifenilbutazona y la suxibuzona (precursora de la fenilbutazona). Si se observa la Grfica 4.1 (en el final de este apartado), con el mtodo B1 hay bajas recuperaciones de estos tres analitos, mientras que en el mtodo B2 (con solucin antioxidante) la recuperacin de estos tres analitos mejora. - Mtodo D: Se extrae con metanol y se centrifuga, igual que en el mtodo A. - Mtodo F y H: Se adicionan 5 ml de un tampn de HCl 0.24 M y cido ascrbico 0.02 M para producir la hidrlisis qumica de la muestra y, posteriormente, se centrifuga. 61

Las fases de purificacin difieren segn el modo de extraer los analitos:

-

Mtodo A: Tras la evaporacin en el Turbo Vap hasta 1-2 ml, se aaden 4 ml de HCl 0.24 M y cido ascrbico 0.02 M y se contina con la fase de purificacin mediante la Extraccin en Fase Slida con los cartuchos C8 500 mg/6cc de Applied. Estos cartuchos contienen un gel de slice al que, tras su activacin con metanol, y con el tampn de HCl y cido ascrbico, se adhieren los analitos y posteriormente se eluyen con acetato de etilo. Mtodo B, B1 y B2: Los paquetes aadidos de sales de extraccin EN 15662 (4 g MgSO4; 1 g NaCitrato; 0.5 g citrato disodio 6-H2O) tienen tambin cierto efecto purificante. Tras la centrifugacin, el sobrenadante se evapora y finalmente se redisuelven los extractos. Mtodo C y C1: Se traspasa el sobrenadante a un tubo de centrifugar 15 ml, que contiene diversas sales (150 mg PSA, 150 mg C18 y 900 mg de sulfato de Magnesio) que tienen la funcin de purificar las muestras (separando las impurezas de los analitos que se quieren extraer). Posteriormente, se vuelve a centrifugar, se recoge el sobrenadante, y se contina con la evaporacin a 50 C con corriente de Nitrgeno en el Turbo Vap. Tras la evaporacin, se redisuelven los extractos para su inyeccin en el equipo UPLC-MS/MS. Mtodo D: Tras centrifugar, se evaporan las muestras a 50 C en corriente de Nitrgeno en el Turbo Vap y se redisuelve, pero el extracto final en este caso se redisuelve en 2.5 ml de la solucin de resuspensin (en todos los dems mtodos se redisuelve en 250 l) y se utilizan viales mini-uniprep con filtros de 0.2 nm. Mtodo F: Tras centrifugar, se utiliza el sobrenadante para realizar la Extraccin en Fase Slida.Posteriormente, se evaporan las muestras y se redisuelven (este es el mismo mtodo que se aplica para la preparacin de las muestras de tejido muscular en este estudio). Mtodo H: Se adicionan las sales de extraccin EN 15662 (4 g MgSO4; 1 g NaCitrato; 0.5 g citrato disodio 6-H2O), tambin utilizadas en el mtodo B. Se vuelve a centrifugar y se contina con la evaporacin en el Turbo Vap. Finalmente, se redisuelven los extractos.

En cuanto a la deteccin de los analitos en el equipo UPLC-MS/MS, se realiz de la misma manera para todos los mtodos (apartado 2.4.4 de materiales y mtodos).

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En la Gr rfica 4.1, se s observan los porcentajes de rec cuperacin d de los 12 AINEs A deter rminados co on cada uno o de los mto odos probad dos. Con en el e mtodo A se obtuvi ieron recup peraciones cercanas c al 100 % de 11 de los 12 analitos determinado d os. La nica a excepcin n se observa a en el pirox xicam (PIR) ), que se re ecupera en torno al 80 %, % observn ndose una mejor m recup peracin con n otro mtodo, el B1, e en el que se s recupera el 100 % de este ana alito, sin em mbargo con n este mto odo la recup peracin de e los dems analitos es s menor. Po or lo tanto, seleccionam s mos el mto odo A como o el ms ade ecuado para a determinar ar AINEs en n muestras de d leche. Grfi fica 4.1. Porcentajes P de recupe eracin de los 12 an nalitos (car rboxiibupro ofeno, pirox xicam, napr roxeno, ox xifenilbutazo ona, cido niflmico, , flurbiprof fen, suxibu uzona, indom metacina, fenilbutazona, cid do mefen mico, c cido flufe enmico, cido mecl lofenmico) ) determina ados median nte UPLC-M MS/MS, segn los dif ferentes m todos proba ados de extr raccin y pu urificacin, , en muestra as de leche.

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2. Determinacin de carboxiibuprofeno, piroxicam, naproxeno, oxifenilbutazona, cido niflmico, flurbiprofen, suxibuzona, indometacina, fenilbutazona, cido mefenmico, cido flufenmico y cido meclofenmico, en leche y tejido muscular por UPLC-MS/MS.
En la determinacin de antiinflamatorios no esteroideos se debe tener en cuenta que estos frmacos se eliminan del organismo en forma libre o unidos al cido glucurnico formando glucuroconjugados, y tienen una gran capacidad de unin a las protenas [26]. La unin de los AINEs a las protenas y la presencia de grasa en algunas matrices biologicas son dos inconvenientes para la extraccin de estos frmacos y sus metabolitos durante el desarrollo del mtodo. El tratamiento qumico para provocar la hidrlisis de la muestra de tejido muscular, en este estudio, mejora la extraccin de este grupo de medicamentos. Por otra parte, para eliminar la grasa de las matrices biolgicas se utiliza n-hexano Otra condicin importante para el desarrollo de cualquier mtodo analtico, es el tiempo que se tarda en extraer y purificar las muestras. En el caso del mtodo utilizado en tejido muscular, se tarda aproximadamente una hora en analizar entre 1 a 12 muestras, mientras que con el mtodo desarrollado para leche se tarda ms tiempo debido a la lenta evaporacin del metanol bajo corriente de Nitrgeno en el Turbo Vap, por lo que se puede tardar entre 3 a 4 horas en analizar de 1 a 12 muestras aproximadamente. Tambin hay que destacar la rapidez del equipo para analizar una muestra, ya que con este mtodo se tardan entre 6 y 7 minutos aproximadamente en obtener los resultados de la presencia o no de los analitos en una muestra. Como fase mvil o solucin de resuspensin se utiliza cido frmico 10 mM (solucin A) y acetonitrilo (solucin B), ya que era la fase mvil que se utilizaba en el mtodo acreditado de rutina anteriormente en tejido muscular. Con esta fase mvil se consegua una buena separacin cromatogrfica y una ptima ionizacin, por lo que se sigue utilizando en el nuevo mtodo propuesto. En la Figura 4.1, se observa un cromatograma de un blanco de muestra de tejido muscular. Se puede observar, en todos los cromatogramas de los dos iones producto de cada analito, la ausencia de seal o pico interferente en la matriz durante los tiempos de retencin correspondientes de cada analito, demostrndose la selectividad/especificidad del mtodo. En cada cromatograma se observa que el patrn interno correspondiente al analito determinado se extrae correctamente. Se han sealado los tiempos de retencin aproximados donde apareceran los picos de los iones producto de cada analito en caso de una muestra enriquecida o no conforme.

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Figur ra 4.1. Crom matogramas de un bla anco de tejido muscula ar con los p patrones int ternos adici ionados, fen nilbutazona-D10 (FBZ-D10) y nap proxeno-D3 (NPX-D3) ).

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En las Figuras F 4.2 y 4.3 se ob bservan los s cromatrog gramas de d dos muestra as, de leche e y tejido muscular m res spectivamen nte, enriquecidas con lo os 12 AINE Es en el nivel del CC. Se observa a una buena a separacin n cromatogr rfica y una a buena resp puesta del eq quipo frent te a las mol lculas. En cada crom matograma se s observan n los dos io ones produc cto de cada analito (fra agmentados a partir de su ion precursor) y el in i del patro on interno.

enriquecida Figur ra 4.2. Cro omatogramas de una muestra de d leche de d bovino e a con carbo oxiibuprofe eno (CXIBP P), piroxica am (PIR), naproxeno n (NPX), o oxifenilbuta azona (OPB BZ), cido niflmico (NFL), ( flurb biprofen (F FBP), suxibu uzona (SBZ Z), indomet tacina (IND D), fenilbuta azona (PBZ Z), cido m mefenmico o (MEF), cido flufen nmico (FF FA) y cido o meclofen mico (MCF F) a las con ncentraciones del CC y con los p patrones int ternos (NPX X-D3 y PBZ Z-D10).

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Figur ra 4.3. Cro omatogram mas de una muestra de d msculo o de ave e enriquecida a con carbo oxiibuprofe eno (CXIBP P), piroxica am (PIR), naproxeno n (NPX), o oxifenilbuta azona (OPB BZ), cido niflmico (NFL), ( flurb biprofen (F FBP), suxibu uzona (SBZ Z), indomet tacina (IND D), fenilbuta azona (PBZ Z), cido m mefenmico o (MEF), cido flufen nmico (FF FA) y cido o meclofen mico (MCF F) a las con ncentraciones del CC y con los p patrones int ternos (NPX X-D3 y PBZ Z-D10).

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La Deci isin 657/2002/CEE [ 10] estable ece que par ra sustancia as del grup po B, como o los AINE Es, los mt todos anal ticos deben n aportar como c mnim mo 3 punto os de ident tificacin (I IPs), que en n el caso d de la espect trometra de e masas de e baja resolucin (com mo el triple e cuadrupol lo utilizado o en este estudio) e cor rresponden a un punt to de ident tificacin para cada io on precursor r y 1,5 pun ntos de iden ntificacin p para cada io on de trans sicin o hijo. En el ca aso de los A AINEs dete erminados en este m todo, ya qu ue no tiene en LMR y que q estn prohibidos p p por la UE, sera necesa ario tener a al menos 4 IPs a pesar r de pertene ecer al grupo B. Con el l equipo UP PLC-MS/MS S utilizado e en este proy yecto, se ha an obtenido 2 iones pro oducto de ca ada analito (Tabla 3.2 del d apartado o 2 de mate eriales y m todos) que junto j con el ion precur rsor suman 4 IPs. Los patr rones intern nos utilizad dos son la a fenilbutaz zona-D10 ( (PBZ-D10) y el napro oxeno-D3 (NPX-D3), ( en la Figur ra 4.4 se muestran m sus s estructura as qumicas s. Los patro ones interno os se aaden n en todas l las muestras s, incluyend do los blanc cos de mues stra, a partir r de una so olucin que contiene un na concentr racin de 1, ,0 g/ml de e PBZ-D10 y 2,0 g/m ml de NPX-D3 (como se indica e en el aparta ado 2 de materiales m y mtodos), y se utiliz zan para ob bservar la correccin de la recu uperacin de d cada ana alito en todo el proce eso de extra accin al rel lativizar su seal con la a del analito o a identific car. En todos s los croma atogramas d de este apa artado se pu uede observ o que var un pico corre esponde a los l iones producto de PBZ-D10 (289.1) o NPX-D3 ( 188.2), seg gn el anali ito determin nado, estos s dos iones s se corresp ponden con n el ion m mayoritario de la fragm mentacin del d ion padr re 317.3 y 2 34.2, respec ctivamente (como se in ndica en la Tabla T 3.2 d del apartado o 2 de mate eriales y m todos). La fenilbutazo ona-d10 es e el patrn in nterno de l los iones determina ados por ESI (-) (carboxiibup ( profeno, in ndometacin na, y fenilb butazona), mientras que q el nap proxeno-d3 es el pat trn intern no de los iones deter rminados por ESI (+) (piroxicam m, naproxen no, oxifenil lbutazona, cido niflm mico, flurb biprofen, suxibuzona a, cido mefenmic co, cido flufenam mico y cido mecl lofenamico) ).

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Figura 4.4. Estructura qumica de los patrones internos utilizados en el mtodo.

Fenilbutazona-D10

Naproxeno- D3

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2.1. Validacin del mtodo.

La validacin se ha realizado atendiendo a las recomendaciones de la Decisin 657/2002 de la Comisin Europea por la que se aplica la Directiva 96/23/CE del Consejo en cuanto al funcionamiento de los mtodos analticos y la interpretacin de los resultados, tal y como se describe en el apartado 1 de materiales y mtodos, donde se explica el procedimiento para la validacin de mtodos analticos cualitativos. El mtodo desarrollado es cualitativo, ya que determina sustancias no autorizadas que no tienen LMR. Las matrices utilizadas durante el desarrollo del mtodo y la validacin han sido leche y tejido muscular de diferentes especies. Se han analizado 22 muestras de tejido muscular de bovino, porcino, ave y ovino, y 37 muestras de leche de bovino, ovino y caprino. Las muestras de msculo procedan de diversos mataderos de la Comunidad Valenciana, y las de leche de la Universidad Politcnica de Valencia (muestras de caprino) y de diferentes lecheras de la Comunidad Valenciana. La identificacin de las muestras de leche y tejido muscular, con su especie correspondiente, se muestran en las Tablas 4.1 y 4.2, respectivamente. Los parmetros que se han estudiado y establecido para la validacin del mtodo son los siguientes: 1. Selectividad /Especificidad. 2. Limite de Decisin (CC). 3. Capacidad de Deteccin (CC).

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Tabla 4.1. Muestras de leche de bovino, ovino y caprino analizadas con el mtodo desarrollado. Identificacin muestra 08-10-05969 08-10-05849 08-10-06154 08-10-05847 08-10-05853 08-10-05901 08-10-05848 08-10-05850 08-10-05886 08-10-05970 08-10-05851 08-10-05852 08-10-05971 08-11-04760 08-11-07707 08-11-07708 08-11-07882 08-11-07879 08-11-07883 08-11-07880 08-11-07734 08-11-07881 20/01/2011 24/01/2011 27/01/2011 31/01/2011 03/02/2011 08-12-03582 08-12-03439 08-12-03570 4769 5605 5574 08-07-07800 08-08-12172 08-10-05985 08-08-13810 Especie Bovino Bovino Caprino Bovino Bovino Caprino Bovino Bovino Caprino Ovino Bovino Bovino Bovino Caprino Caprino Caprino Caprino Caprino Bovino Caprino Bovino Caprino Bovino Bovino Bovino Bovino Bovino Ovino Caprino Bovino Caprino Ovino Caprino Bovino Bovino Bovino Bovino

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Tabla 4.2. Muestras de tejido muscular de diferentes especies analizadas con el mtodo desarrollado. Identificacin muestra 08-12-05360 08-12-04063 08-12-04288 08-12-05253 08-12-04802 08-12-04054 08-12-04423 08-12-04287 08-12-03648 08-12-04106 08-12-05251 08-12-05346 08-12-05354 08-12-05258 08-12-04062 08-12-06497 08-12-07556 08-12-07649 08-12-07650 08-12-04170 08-12-04885 08-12-07576 Especie Porcino Ave Porcino Porcino Porcino Ave Porcino Porcino Bovino Ovino Ovino Ovino Ovino Ave Ave Bovino Bovino Bovino Bovino Ovino Porcino Ave

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1. Selectividad /Especificidad Con este parmetro se demuestra que el procedimiento esta libre de interferencias para el rango de concentraciones y las matrices a las que se aplica. Para poder validar un mtodo, al menos se deben analizar 20 muestras en blanco y verificar que no existen interferencias en el tiempo de retencin del cromatograma en el que cabe esperar la elucin del analito. Se considera que la muestra esta libre de interferencias cuando la seal obtenida, si existe, es al 30% de la seal obtenida del analito en la muestra adicionada en el lmite de decisin (CC). Si la seal observada es > al 30% de la que se obtiene en el nivel del CC del analito correspondiente, se debe evaluar si dicha presencia puede conducir a una falsa identificacin o la identificacin del analito se ve dificultada por la presencia de la interferencia. En caso de observar alguna interferencia que pueda afectar a la identificacin del analito, se debera de aumentar el nivel del CC hasta que la seal fuera al 30% de la seal en el lmite de decisin. Durante la validacin de este mtodo, no se observ ninguna seal interferente, en el tiempo de retencin de ninguno de los analitos, que superase el 30% del rea del lmite de decisin (CC) y/o pudiese afectar en la identificacin del analito. Con ello se demuestra la especificidad del mtodo desarrollado, tanto para ambas matrices como para las especies analizadas. Tabla 4.3. Tiempo de retencin esperado para la elucin de cada AINE y los patrones internos en los cromatogramas. Analito
Carboxiibuprofeno Piroxicam Naproxeno-D3 Naproxeno Oxifenilbutazona Fenilbutazona-D10 cido niflmico Flurbiprofen Suxibuzona Indometacina Fenilbutazona cido mefenmico cido flufenmico cido meclofenmico

Tiempo de retencin (minutos)

3.28 3.69 4.21 4.22 4.29 5.29 4.84 4.84 4.93 5.03 5.32 5.47 5.47 5.54

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En las fi iguras que se s muestran n a continua acin, se ob bserva un c cromatogram ma de una m muestra sin adicionar con c una se al cercana al a tiempo de e retencin del ion producto mayo oritario del naproxeno (pico seal lado en rojo o del cromat tograma de la Figura 4.5), 4 y otro cromatogra ama de la misma muest tra adicionada en el niv vel del CC (Figura 4.6 6). En el cromatogram c ma de la figura 4.6, el naproxeno se p puede ident tificar corre ectamente en e el nivel del CC a adicionado. . Adems, la seal id dentificada en el blanc co de la Fig gura 4.5 es < al 30% d del rea del analito en la muestra adicionada en el CC de la secue encia, ya qu ue: re ea en el CC = 2724.57 7 30 % de 2724.5 57 817.37 7 re ea seal (pic co rojo de la l Figura 4.5 5) = 752.03 Para con nsiderarse un na interfere encia el pico o que aparec ce en el tiem mpo de retencin del n naproxeno (NPX) ( de la a Figura 4.5 5, se tendra que obser rvar un rea a > de 817. .37, y en este caso se e observa un u rea de e 752.03 (< ( de 817.3 37). Por lo o tanto, la seal obser rvada no perjudica la identificaci in del ana alito en la muestra m adi icionada y no se consi idera una in nterferencia. Figur ra 4.5. Cromatogram C ma de una a muestra de d leche de d caprino con seal para napro oxeno (NPX X).

ra 4.6. Cro omatograma a de la m misma mues stra del bla anco de la a figura an nterior Figur adici ionado al ni ivel del CC.

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2. Limite de Decisin (CC) La determinacin del CC de cada analito en ambas matrices se ha realizado de forma experimental. Se inyectaron soluciones patrn de cada analito en concentraciones decrecientes en el equipo UPLC-MS/MS para as tener una idea aproximada de su valor atendiendo a la respuesta obtenida. Posteriormente, se realizaron adiciones sobre diferentes muestras blanco a diferentes niveles de concentracin (2.5, 5 y 10 g/kg o ppb) durante varias secuencias a partir de la solucin mezcla intermedia de AINEs preparada. Se comprob la seal de los distintos analitos en las diferentes concentraciones, matrices y especies, y se determin, de este modo, la concentracin ms baja que permita identificar a cada uno de los analitos. Finalmente, se seleccionaron los niveles de concentracin ms bajos en los que cada analito se confirmaba en el 100% de los casos. Para aceptar esos valores como lmites de decisin (CC) de cada analito por lo menos se debe repetir el anlisis 10 veces, confirmndolo en 10 muestras diferentes. Durante la validacin del mtodo desarrollado, se repiti ms veces la adicin sobre otros blancos de matriz a ese nivel de concentracin, hasta analizar un nmero de 57 muestras de msculo (en 8 secuencias procesadas) y 45 muestras de leche (en 7 secuencias procesadas), con la finalidad de demostrar que esos niveles son el lmite de decisin o CC. Tras el anlisis de las muestras se identific en el 100% la presencia de los 12 analitos, por lo tanto, esos valores de concentracin (Tabla 4.4) correspondieron al CC establecido para cada analito en msculo y leche.

3. Capacidad de Deteccin (CC) Se establece segn requisitos de identificacin. Su valor se considera en el caso de mtodos cualitativos igual al CC (Tabla 4.4) ya que se exige que sea una concentracin tal que permita identificar el analito en el 100 % de las repeticiones (0% de falsos conformes).

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Tabla 4.4. Niveles seleccionados y, posteriormente, confirmados para cada analito como lmites de decisin (CC) y capacidad de deteccin (CC). AINE CC y CC (g/Kg) para leche y msculo 5 5 5 2.5 5 2.5 20 5 10 5 2.5 5

cido flufenmico cido meclofenmico cido mefenmico cido niflmico Carboxiibuprofeno Fenilbutazona Flurbiprofen Indometacina Naproxeno Oxifenilbutazona Piroxicam Suxibuzona

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2.2. Comparacin de los lmites establecidos con los de otras metodologas analticas.
A continuacin, se realiza una comparacin de los lmites de decisin (CC) establecidos para el mtodo propuesto con los CC establecidos en la metodologa analtica para el anlisis de leche, tejido muscular y otras matrices (plasma sanguneo, rin y orina). En la Tabla 4.5, se observa que con los lmites establecidos en el presente estudio se detectan unas concentraciones un poco ms elevadas que en los mtodos consultados. Esto se debe a que al mtodo propuesto es cualitativo y, por lo tanto, se han establecido unos lmites en los que se detecte el analito en el 100 % de los casos (ya que el lmite de decisin es igual que la capacidad de deteccin). Sin embargo, en el caso de mtodos cuantitativos (mayora de los mtodos consultados) se establecen los lmites de decisin con una probabilidad de error de un 5 % (como se propone en la legislacin), detectando de este modo el 95 % de los casos no conformes. Por otra parte, se piensa que cuando se establecen niveles tan bajos de algunos analitos, como por ejemplo el nivel de 0.40 g/Kg para naproxeno [17] y de 0.25 a 2 g/ Kg para flurbiprofen [13], puede ser debido a que realmente no se ha comprobado de forma exprerimental la deteccin de esas concentraciones en matrices. Tabla 4.5. Limites de decisin (CC) establecidos en el mtodo desarrollado (ltima columna, sealada en negrita), comparados con los rangos de lmites de decisin (CC) recopilados a partir de la metodologa analtica empleada para la determinacin de antiinflamatorios no esteroideos (apartado 3.3 de la introduccin de este trabajo). AINE CC en leche (g/Kg)
1.46 - 10 0.92 - 10 1.26 - 20 0.55 - 6 0.25 - 2 0.50 - 5.9 2.12 - 6 2.86

CC en msculo (g/ Kg)

1.92 7.4 0.92 - 3.86 2.0 0.4 - 6.36 3.13 0.4 -

CC en plasma sanguneo (g/ Kg)

1.27 0.36 - 0.70 0.23 1.19 - 25 4.06 - 26 1.74 0.18 1.24 0.20

CC en rin (g/ Kg)

1.2 0.58 2 -

CC en CC en orina leche y msculo (g/ Kg) (g/Kg)

0.25 0.5 0.5 2.5 5 15 1.5 1 -

cido flufenmico cido meclofenmico cido mefenmico cido niflmico Carboxiibuprofeno Fenilbutazona Flurbiprofen Indometacina Naproxeno Oxifenilbutazona Piroxicam Suxibuzona

5 5 5 2.5 5 2.5 20 5 10 5 2.5 5

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2.3. Control del factor respuesta.

Durante los anlisis realizados para la validacin del mtodo se han tomado tambin los datos de la respuesta para la fenilbutazona (PBZ), obtenida de la solucin para el control del factor respuesta de las distintas secuencias de la validacin. La concentracin de este AINE en el factor respuesta es de 25 ng/ml. Con los datos del rea de la PBZ en el factor respuesta,. se ha calculado el factor respuesta de este AINE en cada una de las secuencias procesadas para la validacin, dividiendo el rea obtenida de este analito por la concentracin terica del analito en el extracto, rea PBZ en factor repuesta/25 ng/ml. En la tabla 4.6, se muestran los valores obtenidos de media de los factores respuesta para PBZ de los controles que se han realizado durante la validacin, la desviacin estndar de todos los valores registrados y el valor mnimo de aceptacin del factor respuesta, calculado como la media menos 2 veces la desviacin estndar. Para verificar el correcto funcionamiento del equipo, se controlar el factor respuesta de la PBZ antes de todas las secuencias de rutina que se procesen, dividiendo el rea obtenida de este AINE por la concentracin del patrn (25 ng/ml). Como criterio de aceptacin, se aceptarn valores mayores al mnimo de aceptacin (Tabla 4.6). Tabla 4.6. Media, desviacin estndar y valor mnimo de aceptacin obtenidos a partir de la frmula rea de la fenilbutazona (PBZ)/25 ng/ml, dato calculado en todas las secuencias de la validacin. Media Factor respuesta PBZ 643 Desviacin estndar 125 Valor mnimo de aceptacin 393

2.4. Control de los patrones internos de las muestras.

Para la validacin del mtodo, se han tomado los datos de las reas de ISTD (PBZ-D10 y NPX-D3) de las muestras adicionadas en el nivel del CC de todas las secuencias procesadas, de esos valores se ha calculado la media, la desviacin estndar y el coeficiente de variacin para msculo y para leche (Tabla 4.7). Para evaluar y controlar la respuesta (ratio rea analito/rea ISTD), se han calculado los valores mnimos de aceptacin de este dato a partir del coeficiente de variacin (C.V.) obtenido en la validacin (Tabla 4.8). Por ltimo, tambin se han obtenido datos de las intensidades relativas de los iones producto de cada AINE en el nivel de adicin del lmite de decisin (CC), este dato se denomina ion ratio, y se ha calculado un criterio de aceptacin que es igual al valor medio de ion ratio 3 desviacin estndar (Tabla 4.9). Estos intervalos servirn para aceptar como correcta la confirmacin de la muestra enriquecida en el CC en cada secuencia de trabajo, y hacer trazables las intensidades 85

relativas de los iones producto del analito a las obtenidas en la validacin. El valor de intensidad relativa se obtiene a travs del rea del ion producto cualificador relativa al rea del ion producto mayoritario. En todas las secuencias procesadas se debe realizar el control de la extraccin de los patrones internos tanto en el blanco de reactivos, el blanco de muestra, en las muestras adicionadas en el nivel del CC y en las muestras reales.
-

En primer lugar, se verificar que en la muestra adicionada al nivel del CC, el valor de rea del ISTD obtenido sea mayor al rea media del ISTD de las muestra adicionada al CC en la validacin al que se le habr restado el % correspondiente al C.V obtenido en la validacin (Criterio de acptacin de la Tabla 4.7). Adems, por otra parte, hay que verificar que ni en el blanco de reactivos ni en el de muestra se observe ningn pico interferente en el tiempo de retencin de cada AINE (seal al 30 % del rea del analito en la muestra adicionada en el CC de la secuencia procesada). En cada secuencia procesada, se debe verificar que en la muestra adicionada al nivel del CC el ratio rea AINE/rea ISTD est por encima del valor mnimo de aceptacin obtenido en la validacin (Tabla 4.8). Por otra parte, hay que observar que las intensidades relativas de los iones producto, de la muestra adicionada en el nivel del CC, se encuentran comprendidas en el intervalo obtenido en la validacin (Tabla 4.9).

Tabla 4.7. Valores de los patrones internos obtenidos de las muestras de msculo y leche analizadas durante la validacin. Patrn interno Media rea 12599 20855 31327 36024 Desviacin estndar 6207 8179 8488 10423 C.V. (%) 49 39 Muestras de leche Naproxeno-D3 Fenilbutazona-D10 27 29 22869 25867 Criterio de aceptacin (Media rea - C.V) 6425 12721

Muestras de msculo Naproxeno-D3 Fenilbutazona-D10

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Tabla 4.8. Valores calculados a partir de los datos de la respuesta (ratio rea AINE/rea ISTD) de las muestras de msculo y leche adicionadas en el CC durante la validacin. Analito (AINE) Media Response Desviacin estndar Valor mnimo de aceptacin C.V. (%)

Muestras de msculo adicionadas al CC Carboxiibuprofeno Piroxicam Naproxeno Oxifenilbutazona cido niflmico Flurbiprofen Suxibuzona Indometacina Fenilbutazona cido mefenmico cido flufenmico cido meclofenmico 0,0162 0,4803 0,1066 0,0829 1,0583 0,0323 0,0628 0,0361 0,1757 0,6143 0,1164 0,0711 0,0066 0,1973 0,0288 0,0313 0,3749 0,0101 0,0201 0,0133 0,0572 0,2296 0,0408 0,0231 0,0030 0,0858 0,0490 0,0202 0,3085 0,0121 0,0226 0,0095 0,0613 0,1552 0,0349 0,0249 41 41 27 38 35 31 32 37 33 37 35 32

Muestras de leche adicionadas al CC Carboxiibuprofeno Piroxicam Naproxeno Oxifenilbutazona cido niflmico Flurbiprofen Suxibuzona Indometacina Fenilbutazona cido mefenmico cido flufenmico cido meclofenmico 0,0126 0,1611 0,0989 0,0462 0,5332 0,0115 0,0571 0,0437 0,1658 0,5795 0,1181 0,0627 0,0047 0,0479 0,0126 0,0148 0,0749 0,0048 0,0190 0,0122 0,0368 0,1293 0,0217 0,0149 0,0031 0,0652 0,0737 0,0166 0,3835 0,0019 0,0192 0,0194 0,0921 0,3209 0,0747 0,0328 38 30 13 32 14 42 33 28 22 22 18 24

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Tabla 4.9. Intervalos de Ion Ratio de las muestras de leche adicionadas en el CC durante la validacin. Analito (AINE) Intervalos del Ion Ratio Muestras de msculo adicionadas al CC Carboxiibuprofeno Piroxicam Naproxeno Oxifenilbutazona cido niflmico Flurbiprofen Suxibuzona Indometacina Fenilbutazona cido mefenmico cido flufenmico cido meclofenmico 0.76 - 2.15 1.99 - 2.65 0.21 - 4.73 0.60 - 2.95 0.95 - 1.32 0.15 - 3.17 0.88 - 2.92 0.19 - 5.85 0.54 - 2.05 0.95 - 2.57 2.27 - 9.64 0.36 - 4.62 Muestras de leche adicionadas al CC 0.85 - 1.94 1.78 - 2.73 1.06 - 4.56 0.34 - 2.81 0.93 - 1.39 0.05 - 3.07 1.11 - 2.72 1.52 - 4.86 0.79 - 1.90 0.92 - 2.55 3.19 - 10.53 1.19 - 3.43

Finalmente, como criterio de aceptacin para las muestras reales, el blanco de reactivos y el blanco de muestra, se aceptar como correcta una muestra, cuando el valor de rea del ISTD obtenido en ella sea mayor al rea del ISTD en la muestra adicionada al CC de esa secuencia, al que se le habr restado el % correspondiente al C.V obtenido en la validacin para tener en cuenta la variabilidad de esta rea (este valor, por lo tanto, se debe calcular en los controles de cada secuencia rutinaria).

Tras observar que todos los criterios para el control de la correcta extraccin del patrn interno se cumplen, se contina con la comprobacin de otros parmetros antes de concluir el anlisis de las muestras.

88

2.5. Confirmacin.
Para los mtodos cualitativos, durante la validacin, se estudia la confirmacin de los analitos a nivel del CC y por encima de l. La confirmacin de las muestras se ha realizado aplicando los criterios de identificacin de la Decisin 657/2002/CE a los controles de calidad, teniendo en cuenta los cuatro puntos que se explican a continuacin: Como se ha indicado anteriormente, con este mtodo se obtienen 4 puntos de identificacin (IPs) en el cromatograma de cada analito (1 IP del ion precursor y 1.5 IPs por cada ion producto). Para que una muestra se pueda considerar no conforme se deberan observar los 4 puntos de identificacin correspondientes a los iones del analito a confirmar. Una muestra se considerar que podra ser no conforme cuando aparezca un pico en el cromatograma del ion producto de algn AINE, cuyo tiempo de retencin relativo no difiera ms del 2.5 % respecto al tiempo de retencin relativo de la seal obtenida para dicho ion en la muestra enriquecida en el CC. El resultado cualitativo (de identificacin) se calcula a partir del valor del ratio de rea del AINE/rea del patrn interno (ISTD), denominado respuesta. Al valor obtenido en la muestra adicionada en el CC de la secuencia procesada junto con las muestras a analizar, se le restar el correspondiente C.V. (%), del analito correspondiente, obtenido en la validacin (Tabla 4.8). El resultado de las muestras cuyo ratio de rea del AINE/rea de ISTD sea mayor o igual al ratio rea del AINE/rea ISTD de la muestra adicionada en el CC, menos el CV (%), ser mayor o igual al CC de ese AINE (no conforme). El resultado de las muestras cuyo ratio de rea de AINE/rea de ISTD sea menor al ratio rea AINE/rea ISTD de la muestra adicionada en el CC, menos el CV (%), ser menor al CC de ese AINE (conforme). Por ltimo, para que la muestra sea considerada no conforme, la intensidad relativa obtenida entre los iones producto (ion ratio) debe ser semejante a aquella obtenida para la muestra adicionada en el CC, teniendo en cuenta las tolerancias recogidas en la Decisin 657/2002/CE que se muestran en la tabla 3.4 del apartado materiales y mtodos.

Tras observar todos estos criterios en los 12 cromatogramas correspondientes a los 12 analitos a determinar en la muestra procesada, se indicar si sta es < CC (conforme) para todos los analitos o CC (no conforme) para alguno de los analitos determinados. Como ejemplo, en la Figura 4.7, se muestra un cromatograma de leche sin adicionar. Se pueden observar dos picos que se podran corresponder con los dos iones hijo del cido flufenmico, ya que se encuentran en el tiempo de retencin propio de los iones producto de este analito y la seal es > del 30 % de la seal obtenida de la muestra enriquecida al nivel del CC en esa secuencia.

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Teniendo o en cuenta los siguien ntes datos: Respuesta a en el CC (secuencia) ) = 0.15 Ion ratio mu uestra en el CC (secue encia) = 4 CV (% %) de la resp puesta para a FFA (valid dacin) = 18 8% A contin nuacin, se muestran m lo os clculos realizados: r 1 18% de 0.15 5 = 0.027 0 0.15 0.027 7 = 0.123 Respues sta (Figura a 4.7) = ratio o rea AINE E/ISTD = 11280.70 / 3 2318.14 = 0.349 0 0.349 > Respuesta R d del CC de la secuenci ia - % C.V.. (0.123) Por lo ta anto, podra ser sospech hosa para la a presencia de d cido flu ufenmico (FFA A), pero: Ion Ratio R (Figur ra 4.7) = 11 1280.70 / 97 7.73 = 115.4 43 Intensid dad relativa en el CC (secuencia) ( 100/4= 25% as tolerancia as Decisin 657/2002/C CE (tabla 3.4 de materi iales y mto odos): Segn la Para 25% % de intens sidad relativ va (> 20-50 %) se perm mite una tole erancia de 25% de la intensidad r relativa 25% 2 de 25 = 6.25 25% % 6.25 para que la muestra fue ese no conf forme deber ra tener una a ntensidad re lativa de 18 8.75 a 31.25 5% in Intensidad d relativa m muestra Figu ura 4.7 10 00/115.43 = 0.86% Como se e puede obs servar tras r realizar los clculos, el ion ratio d de la muest tra no es sim milar al ion n ratio obten nido en la m muestra adicionada en el e CC para a FFA y, por r ello, tamp poco entra en e las tolera ancias de in ntensidad re elativa de lo os iones pro oducto reco ogidas en la a Decisin 657/2002/C 6 CE. Por lo ta anto, esta muestra m es conforme c pa ara FFA pe ero no podr a utilizarse como bl lanco para la detecci n de este e AINE, ya a que los picos detec ctados tiene en un rea > al 30% del rea en el CC y podran s ser debidos s a la prese encia de una a sustancia que descon nocemos. Figur ra 4.7. Cro omatograma a del cido o flufenmic co (FFA) de d una mue estra de lech he de capri ino sospech hosa para est te analito.

90

CONCLUSIONES

91

A partir de los resultados obtenidos se pueden extraer las siguientes conclusiones: 1. Con la finalidad de determinar antiinflamatorios no esteroideos, en leche y tejido muscular, no autorizados en sanidad animal, se ha puesto a punto un mtodo sensible y sencillo para la realizacin de los programas de control oficial de residuos de medicamentos veterinarios en el Laboratorio de Salud Pblica de Valencia. 2. El mtodo desarrollado es cualitativo (identificacin), y se ha validado segn las recomendaciones de la Decisin 657/2002/CEE, requirindose para ello un equipo UPLC con espectrometra de masas. 3. Como resultado de la validacin se han obtenido los parmetros selectividad/especificidad, limite de decisin y capacidad de deteccin que demuestran que el mtodo cumple los requisitos tcnicos establecidos en la legislacin mediante la Decisin 657/2002/CEE. 4. Estos parmetros han servido para establecer unos criterios de aceptacin para los controles de calidad internos. Estos controles son requisito de los ensayos qumicos que se incluyen en el sistema de calidad establecido en el LSPV, acorde a la Norma UNE EN-ISO/IEC 17025. 5. El uso de un equipo UPLC-MS/MS ha permitido alcanzar una buena sensibilidad para todos los analitos, facilitando su identificacin y aportando 4 puntos de identificacin (IPs).

93

94

BIBLIOGRAFA

95

[1] [2] [3]

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97

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99

100

ANEXO

101

Tabla 1. Mtodos analticos para la determinacin de antiinflamatorios no esteroideos (AINEs) en diferentes matrices. AINEs Matriz Tcnica analtica Condiciones de separacin Procedimiento de extraccin Patrones internos (ISTD) Rendimiento del mtodo (%Rec1)
82 - 108

Autores, ao [Referencia]

cido mefenmico cido niflmico Carprofeno Diclofenaco Fenilbutazona Naproxeno Oxifenilbutazona Suxibuzona

Leche de bovino

RRLC-ESI (-)MS/MS Modo MRM, con 2 transiciones de cada analito.

Columna Agilent Eclipse Plus C18 (2.1 x 50 mm, 1.8 m de tamao de partcula). Fase mvil: -Solucin A: Agua y acetonitrilo (90:10) y cido actico 0.001 M. -Solucin B: Acetonitrilo.

Extraer los analitos con acetonitrilo (ACN), adicionndolo dos veces. Aadir cido ascrbico 10 mM y cido clorhdrico 1 M, y comprobar el pH 3. Purificar las muestras con cartuchos de Extraccin en Fase Solida (SEP) EvoluteTM ABM. Activar los cartuchos con metanol y cido ascrbico, pasar las muestras, lavar con metanol:agua, secar a vaco y eluir con n-hexano:ter dietlico (50:50). Evaporar con N2 y redisolver.

Fenilbutazona-D10 Carprofeno-D3 Diclofenaco-D4 cido tolfenmico-D3

Dowlin G et al, 2009 [12]

Firocoxib

Leche bovino

RRLC2-ESI3 (+)-MS/MS Modo MRM4, 2 transiciones de cada analito.

Columna Agilent Eclipse Plus C18 (2.1 x 50 mm, 1.8 m de tamao de partcula). Fase mvil:

Realizar dos extracciones con acetonitrilo (ACN). Aadir al sobrenadante cido ascrbico 10 mM y cido clorhdrico 1 M, y comprobar que el pH se encuentre en 3. Purificacin con cartuchos SEP Evolute ABMTM. Activar los cartuchos con metanol y cido

No indicado.

96.3 - 105.2

Dowling G et al, 2009 [14]

-Solucin A: Agua y acetonitrilo (90:10). -Solucin B: Acetonitrilo. cido meclofenmico cido mefenmico cido niflmico cido tolfenmico Carprofeno 5-Hidroxiflunixin Flurbiprofen Naproxeno Vedaprofeno Leche bovino HPLC con deteccin por fluorescencia Columna 80 A Max-RP Synergi sta inless steel (250 x 4.6 mm, 4 m). Fase mvil: -Solucin A: -cido fosfrico 0.010 mol/L a pH 2.1 -Solucin B: Acetonitrilo.

ascrbico, pasar las muestras, lavar con metanol:agua (10:90). Secar a vaco y eluir con nhexano:ter dietlico (50:50). Evaporar los extractos bajo N2 y redisolver. Adicionar acetonitrilo y metanol (90:10) a 5 g de leche, agitar y centrifugar. Aadir al sobrenadante un tampn de cido ascrbico 0.010 mol/l a pH 3.0 y cido clorhdrico 1.0 mol/L. Pasar por cartuchos de SPE C18 1g previamente activados con hexano:ter dietilico (1:1), metanol y el tampn utilizado anteriormente, de cido ascbico y HCL. Lavar los cartuchos con el mismo tampn, y con agua miliQ:metanol (90:10), secarlos al vaco durante 30 minutos, y eluir con n-hexano:ter dietlico (1:1). Finalmente, las muestras se evaporan a sequedad bajo Nitrgeno y se redisuelven. Centrifugar 5 mL de la muestra, hidrolizar adicionando HCl 1 M. Adicionar un tampn de cido ascrbico 10 mM a pH 3.0, pasar por cartuchos C18 1g. Lavar los cartuchos con 3 mL del tampn de cido ascrrbico y con 3 mL de agua MiliQ. Secar a vaco durante No indicado. 64 - 116.6 Gallo P et al, 2010 [16]

cido meclofenmico cido mefenmico cido niflmico cido saliclico cido tolfenmico Carprofeno Diclofenaco Fenilbutazona

Plasma

Cualitativo: IT LC5-ESI (+)-MS/MS y IT LC-ESI (-)MS/MS

Columna Synergi MAX RP (250 x 3,0 mm). Fase mvil: -Solucin A: 0.1 % cido actico en agua.

No indicado.

72 - 95.19

Fabbrocino S et al, 2010 [17]

Flunixin 5-Hidroxiflunixin Flurbiprofen Ibuprofeno Ketoprofeno Naproxeno Oxifenilbutazona Suxibutazona

-Solucin B: 0.1 % cido actico en ACN. Cuantitativo: HPLC-DAD6 Columna Synergi MAX RP (250 x 4.6 mm). Fase mvil: -Solucin A: -cido fosfrico 0.010 M a pH 2.8. -Solucin B: Acetonitrilo.

10 minutos y eluir con n-hexano:dietileno (1:1). Evaporar y redisover con 0.5 mL de metanol.

Firocoxib Piroxicam Propifenazona Ramifenazona

Plasma de bovino

LC-MS/MS (QqQ)

Columna CL Zorbax Eclipse Plus C18 (3 x 50 mm, 1.8 m de tamao de partcula). Columna Waters C8 (150 mm x 3.9 mm, 5 m). Fase mvil: -Solucin A: Tampn de acetato de amonio 1.5 mM con cido actico (pH 4.75).

Extraccin con cido clorhdrico 1M y acetonitrilo (con cloruro de sodio). Purificar las muestras con 5 ml de hexano. Centrifugar y evaporar el sobrenadante con nitrgeno a 60 C. Redisolver con fase mvil. Tras enriquecer las muestras con las soluciones correspondientes, se dejan 10 minutos en oscuridad. Se extrae con 10 ml de acetonitrilo y 2 gr de cloruro sdico. Mezclar y centrifugar. Recoger el sobrenadante y aadir 4 ml de nhexano para purificar. Centrifugar y evaporar a sequedad en Nitrgeno a 55 C. Redisolver las muestras en acetonitrilo:agua

No indicado.

91 - 104

Dowling G et al, 2010 [18]

cido tolfenmico 5-Hidroxiflunixin Meloxicam 4-Metil aminoantipirina

Leche de bovino.

LC-MS/MS ESI (+) y (-) Modo MRM, con 2 transiciones por analito.

cido tolfenmico-D3 Aminoantipirina-D3 Meloxicam-D3 Dexametasona-D4

99.4 - 102.1

Malone E M et al, 2009 [19]

-Solucin B: Acetonitrilo. Acemetacina Acetaminofeno Acetofenetidina cido saliclico Aminoantipirina Benzidamina Etodolac Etoricoxib Fencufen Firocoxib Flunixin Formilaminoantipirina Indometacina Indoprofen Ketorolac Ketoprofeno Loxoprofeno Meloxicam Mepirizole Nabumetone Naproxeno Nimesulide Oxaprozin Piroxicam Rofecoxib Sasapirina Sulindac Tenoxicam Tolmetin Zomepirac Msculo de cerdo UPLC-MS/MS QqQ ESI (+) y () Modo MRM, con 2 transiciones por analito. Columna AcquityTM UPLC BEH C18 (50 mm x 2.1 mm, 1.7 m de tamao de partcula). Fase mvil: -Solucin A: Acetonitrilo. -Solucin B: 0.1 % cido frmico con 0.5 mmol/L de acetato de amonio.

(28:72) y transferir a un vial. Pesar 5 g de muestra. Extraer con acetonitrilo y cido fosfrico. Aadir sulfato de sodio anhdrido, agitar, dejar en ultrasonidos y centrifugar. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo y repetir el procedimiento anterior. Mezclar los sobrenadantes obtenidos y aadir n-hexano con acetonitrilo. Agitar y centrifugar. Descartar el sobrenadante y pasar la capa inferior obtenida por cartuchos HLB previamente activados. Enjuagar con agua los cartuchos y eluir con una mezcla de hidrxido de amonio:acetonitrilo:tert- metyl:eter butyl. Evaporar a sequedad bajo Nitrgeno a 40 C y redisolver con fase mvil. Mezclar en vortex, filtrar y transferir al un vial. No lo indica. 61.7 - 125.7 Hu T et al, 2012 [20]

cido tolfenmico cido meclofenmico Carprofeno Celecoxib Diclofenaco Fenilbutazona Firocoxib Flunixin 5-Hidroxiflunixin Ibuprofeno Ketoprofen Meloxicam Naproxeno Oxifenilbutazona Rofecoxib AINEs con pH bsico: 4-Acetilaminofenazona 4-Aminofenazona 4Formilaminofenazona 4-Metilaminofenazona

Leche

LC-MS/MS QTrap 5500 ESI (-) para AINES cidos. ESI (+) para AINEs con pH bsico. Modo MRM, con 2 transiciones por analito.

Precolumna Phenomenex Luna C8 (2.0 x 4 mm). Columna Phenomenex Luna C8 (2.1 x 150 mm, 3 m de tamao de partcula). Fase mvil: -Solucin A: Metanol:acetonitr ilo (8:2) -Solucin B: Formato amonio 0.01 mol/l a pH 5.

Tras adicionar las concetraciones adecuadas de los patrones internos y las correspondientes concentraciones de AINEs, mezclar y esperar 10 minutos. Extraer con acetonitrilo y acetato amonio, agitar y centrifugar. El sobrenadante se separa en dos porciones para analizar por una parte los AINEs cidos y por otra los bsicos. AINEs con pH cido: Purificacin de5 ml del sobrenadante en cartuchos SepPak NH2 (con una capa adicional de sulfato de sodio), activar los cartuchos, pasar las muestras y eluir con cido fmico al 5% en acetonitrilo. Aadir DMSO (dimetilsulfxido) a la elucin y evaporar bajo Nitrgeno a 40 C (hasta aproximadamente 0.25 ml). Finalmente, transferir al vial. AINEs con pH bsico (metabolitos de metanizole): Evaporar 2.5 ml del sobrenadante a sequedad bajo corriente de Nitrgeno, redisolver en fase mvil y transferir al vial.

cido Tolfenamico-D4 Carprofeno-D3 Diclofenaco-D4 Fenilbutazona-D10 Firocoxib-D6 Flunixin-D3 Meloxicam-D3 4-MetilaminofenazonaD4

71 - 116

Jedziniak P et al, 2012 [21]

cido mefenmico cido tolfenmico Carprofeno Diclofenaco Fenilbutazona Flunixin 5-Hidroxiflunixin Ketoprofeno Meloxicam Naproxeno Oxifenilbutazona Vedaprofeno cido mefenmico cido tolfenmico Carprofeno Diclofenaco Fenilbutazona Flunixin Ketoprofeno Meloxicam Naproxeno Oxifenilbutazona

Leche bovino

LC-ESI (-)MS/MS Quantum Ultra tandem quatrupolo. 2 transiciones MRM de cada analito. *ESI (+) para confirmar ketoprofeno.

Columna C18 Uptisphere Strategy (150 x 2 mm, 5 m). Fase mvil: -Solucin A: cido actico 1 mM:acetonitrilo (90:10). -Solucin B: Acetonitrilo. Precolumna Luna C18 (2.0 x 4mm). Columna Inertsil ODS-3 (2.1 x 150 mm, 3 m de tamao de partcula). Fase mvil: -Solucin A: Acetonitrilo. -Solucin B: cido frmico al 0.1%.

Extraccin con metanol. Dejar en un agitador rotatorio a 100 rpm durante 10 min y centrifugar. Transferir 5 ml del sobrenadante a un nuevo tubo y evaporar a sequedad bajo Nitrgeno. Redisolver y filtrar el extracto con jeringa.

Flunixin-D3 Fenilbutazona-D10 Meloxicam-D3 Diclofenaco-D4 Carprofeno-D3

94.7 - 110

DubreilChneau E et al, 2011 [22]

Msculo de cerdo, caballo y pollo

LC-ESI (-)MS/MS QqQ Modo MRM, con 2 transiciones por analito.

A 2 g. de muestra aadir 4 ml de un tampn de acetato de sodio con cido ascrbico (ajustado a pH 4.5 con cido actico) y 50 l de glucuronidasa dando lugar a una hidrlisis enzimtica de la muestra. Mezclar e incubar. Enfriar la muestra, extraer con acetonitrilo, agitar y centrifugar. Recoger el sobrenadante, repetir la extraccin con acetonitrilo y centrifugar. Pasar el sobrenadante a travs de cartuchos Sep Pak Alumina N activados, y evaporar la elucin en el evaporador rotatorio a 50 C. Posteriormente, el extracto se pasa por cartuchos C18 previamente activados, se lavan con cido ascrbico y agua, y se secan al vaco. Los analitos se eluyen con n-hexano:acetato de

Flunixin-D3 Meloxicam-D3 Diclofenaco-D4 Carprofeno-D3 Fenilbutazona-D10 cido tolfenamico-D4

80 - 131

Jedziniak P et al, 2010 [23]

etilo (1:1) y se evaporan a sequedad con N2. El residuo se redisuelve con acetonitrilo:cido frmico 0.1% (30:70), se filtra con jeringas y se transfiere a los viales. cido tolfenmico Carprofeno Diclofenaco Fenilbutazona Flunixin 5-Hidroxiflunixin Ketoprofeno Meloxicam Oxifenilbutazona Plasma sanguneo LC-ESI (+)MS/MS Modo MRM, 2 transiciones de cada analito. Leche Columna Gemini C18 (150 x 2 mm, 3 m de tamao de partcula). Fase mvil: -Solucin A: cido frmico. 0.05% en ACN -Solucin B: cido frmico 0.05% en agua. Hidrlisis con cido clorhdrico (HCl) 1 M diluido con cido ascrbico 0.01 M. Purificacin con cartuchos Strata XTM, y elucin con MeOH (metanol) y acetonitrilo (ACN). Hidrlisis con la encima -glucuronidasa, precipitacin de las protenas tras aadir acetonitrilo diluido con cido clorhdrico (HCl) 0.01 M. Extraccin y purificacin con cartuchos Strata XTM, y elucin con MeOH y ACN. Tras enriquecer las muestras correspondientes y aadir los patrones internos, esperar 15 minutos. Extraer con cido hidroclorhdrico y acetonitrilo, mezclar en vortex y centrifugar. Aadir al sobrenadante cido ascrbico 10 mM, homogeneizar y comprobar el pH 3. Purificacin con los cartuchos de SPE Evolute ABMTM. Pasar las muestras por los cartuchos previamente activados, Meloxicam-D3 Diclofenaco-D4 Ibuprofeno-D3 Flunixin-D3 Tolfenamico-D4 Fenilbutazona-D10 99 - 109 Dowling G et al, 2012 [25] No indicado. 99.9 Antonic J et al, 2010 [24]

80.3

cido Mefenmico cido Tolfenmico Carprofeno Diclofenaco Fenilbutazona Flunixin Hidro-flunixin Ibuprofeno Ketoprofeno Meloxicam

Plasma

LC-MS/MS

Columna Agilent Eclipse Plus C18 (3.0 x 50 mm) Fase mvil: -Solucin A: cido actico 0.001 M, acetonitrilo (90:10) -Solucin B:

Acetonitrilo

lavar con metanol:agua (10:90), secar en vaco y eluir con nhexano:ter dietlico:acetonitrilo:metanol. Homogeneizar y transferir a los viales. Tras enriquecer las muestras correspondientes y aadir los patrones internos, esperar 15 minutos. Aadir acetonitrilo, agitar y centrifugar. Guardar el sobrenadante y volver a extraer con acetonitrilo. Mezclar los dos sobrenadantes y aadir cido ascrbico y cido clorhdrico. Comprobar el pH 3. Purificar con los cartuchos de SPE Evolute ABMTM. Pasar las muestras por los cartuchos previamente activados, lavar con metanol:agua (10:90), secar bajo vaco y eluir con nhexano:terdietlico:acetonitrilo: metanol. Homogeneizar y transferir a los viales. 74 - 109

Leche

Acetaminofn cido meclofenmico cido saliclico cido tolfenmico Carprofeno Diclofenaco Etodolac Fenilbutazona Flunixin

Leche bovino

HPLC-MS/MS QqQ ESI (-) 2 reacciones de monitorizacin selecionadas por analito.

Precolumna Waters (20 x 3.9 mm I.D., 5 m de tamao de partcula). Columna XTerra-MS C18 (150 x 4.6 mm

A 5 ml de leche adicionar acetonitrilo, mezclar en el vortex y dejar en un bao de ultrasonidos. Centrifugar. Dejar el sobrenadante bajo Nitrgeno a 30 C para eliminar el disolvente orgnico, hasta obtener un volumen de 5 ml. Centrifugar los extractos. Pasar por cartuchos OASIS HLB

Acetaminofn-D3 cido meclofenmicoD4 cido tolfenmico-D4 cido saliclico-D6 Carprofeno-D3 Diclofenaco-C6 Etodolac-D3 Fenilbutazona-C12

97 - 101

Gentili A et al, 2012 [26]

5-Hidroxi-Flunixin Ibuprofeno Ketoprofeno Naproxeno Nimesulide Meloxicam

I.D., 5 m de tamao de partcula). Fase mvil: -Solucin A: Acetonitrilo:meta nol (50:50) con DBA 0.2 mmol/L. -Solucin B: Agua con DBA 0.2 mmol/L.

previamente activados, secarlos al vaco y lavarlos con hexano. Eluir con metanol y acetonitrilo. La elucin obtenida se concentra en 500 l bajo Nitrgeno a 30 C y se ajusta el volumen final a 1 ml con metanol. Los extractos se fitran y se inyectan 20 l en el equipo HPLC-MS/MS. A 5 g. de muestra aadir metanol y homogeneizar. Aadir acetonitrilo, agitar en vortex, dejar en ultrasonidos y centrifugar. Repetir el proceso de extraccin con acetonitrilo. Mezclar los dos extractos obtenidos, concentrarlos en un bao de agua a 30 C hasta 5 ml y centrifugar. Pasar por cartuchos OASIS HLB previamente activados, secarlos al vaco y lavarlos con hexano. Eluir con metanol y acetonitrilo. La elucin obtenida se concentra en 500 l bajo Nitrgeno a 30 C y se ajusta el volumen final a 1 ml con metanol. Los extractos obtenidos se filtran y se inyectan 20 l en el equipo HPLC-MS/MS. A 2g de muestra aadir 4 ml de agua Elga, 0.5 ml de hidrxido de potasio 10 M., y homogeneizar. Aadir un tampn de hidrxido de potasio 10 mM, y agitar. Hidrlisis

Flunixin-D3 Ibuprofeno-D3 Ketoprofeno-D3 Meloxicam-D3 Naproxeno-D3 Nimesulide-D5

Tejido muscular

cido niflmico cido tolfenmico Carprofeno Diclofenaco Fenilbutazona

Rin de caballo, bovino y cerdo

HPLC-ESI (-)MS/MS Quatro Platinum detector.

Columna Waters XBridge Phenyl (100 x 2.1 mm, 3.5 m de tamao de

No lo indica

No lo indica

Points J et al. 2010, [27]

Flunixin Ibuprofeno Meloxicam Naproxeno Vedaprofeno

partcula). Modo MRM, con 3 transiciones por analito. Fase mvil: -Solucin A: 90 % cido actico 0.001 M, formato amonio 50 mM (99.8:0.2), y 10% acetonitrilo. -Solucin B: Acetonitrilo.

de la muestra en un bao de agua a 60 C 15 min. Agitar y enfriar. Ajustar el pH a 2.0 con cido fosfrico. Aadir 4 ml de agua, agitar y centrifugar. Purificar con cartuchos de SPE activados con TBME ( tert butyl metyl ether), MeOH y H2O. Pasar por los cartuchos las muestras y lavarlos con un tampn de acetato de sodio 50 mM a pH 7.0 y MeOH:H2O (60:40), secar a vaco y eluir con cido frmico:TBME:MeOH (5:75:20).Aadir formiat amnico 50 mM con H2O:TBME:MeOH (5:20:75) y 500 l de fase mvil. Secar bajo N2, ajustar el volumen a 1 ml y filtrar a un vial. Diluir con un tampn de fosfato potsico (ph 6.0, 0.1 M) y ajustar el pH a 6.0 usando hidroxido de potasio (KOH) 0.1M y cido clorhdrico (HCl) 0.1M. Aadir una solucin de proteasa y b-glucuronidasa. Incubar a 65 C durante 3.5 horas. Diluir con un tampn de fosfato potsico y purificar con cartuchos Bond Elut Cristify. Activar los cartuchos con metanol, agua desionizada y el tampn de fosfato potsico, pasar las muestras, lavar los cartuchos con un tampn de fosfato potsico y con cido actico, y eluir con Hidroxicortisona-D4 cido meclofenmico FBP7: 80 FFA7: 51 MCF7: 55 NPX7: 97 NFL7: 54 PBZ7: 12 Ho E N M et al, 2006 [29]

cido flufenmico cido mefenmico cido niflmico cido tolfenmico Alclofenaco Celecoxib Deracoxib Diclofenaco Eltenac Etodolac Fenilbutazona Fenoprofen Flunixin Flurbiprofen Indoprofen Isoxicam

Orina de caballo

LC-ESI (-)MS/MS QqQ Modo MRM, con una transicin por analito.

Columna fase inversa LC-8-DB (3.3 cm L x 2.1 mm I.D., 3 m de tamao de partcula). Fase mvil: -Solucin A: cido actico 5mM. -Solucin B: Acetato de amonio 10 mM. -Solucin C: Metanol.

Lornoxicam Meloxicam Naproxeno Nimesulide Oxaprozin Piroxicam Sulindac Tenoxicam Valdecoxib Vedaprofeno Zomepirac

diclorometanol:acetato de etilo (4:1). Aadir hidroxido de sodio y cloruro de sodio a la elucin. Filtrar el extracto y evaporar a sequedad bajo Nitrgeno a 60 C. Redisolver y transfierir a un vial cnico.

Recuperacin de los analitos (%). Cromatografa lquida de rpida resolucin (RRLC). Modo ionizacin electrospray (negativo o positivo). Mltiple reaccin de monitorizacin. Trampa inica (IT) asociada a cromatografa lquida (LC). Cromatografa lquida de alta eficacia (HPLC) con detector Diodo Array (DAD). Flurbiprofen (FBP), cido flufenmico (FFA), cido meclofenmico (MCF), naproxeno (NPX), cido niflmico (NFL), fenilbutazona (PBZ).