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UNIVERSIDAD AUTNOMA DE BAJA CALIFORNIA FACULTAD DE INGENIERA, ARQUITECTURA Y DISEO

Microbiologa Dra. Ma. Victoria Orozco Borbn

Exposicin 4 Microscopio Confocal


Alberto Abaroa Villanueva Omar Morales Rodrguez Jhordan Ojeda Gonzales Bioingeniera 631
2013/10/04

2 Microscopio Confocal INTRODUCCIN Historia La microscopa lser confocal es una nueva tcnica de observacin microscpica que est logrando excelentes resultados en diversas ramas de la ciencia (medicina, biologa, microbiologa, geologa, etc.) Su xito se debe a las indudables ventajas que ofrece frente a la microscopa ptica tradicional (imgenes de mayor nitidez y contraste, mayor resolucin vertical y horizontal, etc.) y, sobre todo, a la posibilidad de obtener "secciones pticas" de la muestra, lo que permite su estudio tridimensional. Aunque el principio de la microscopa confocal fue patentado hace varios aos (Marvin Minski, 1957), su gran aceptacin y espectacular desarrollo no ha tenido lugar hasta hace unos pocos aos con el desarrollo del lser y de los ordenadores personales. Principio Bsico El principio de la microscopa confocal se basa en eliminar la luz reflejada o fluorescente procedente de los planos fuera de foco. Para ello se ilumina una pequea zona de la muestra y se toma el haz luminoso que proviene del plano focal, eliminndose los haces procedentes de los planos inferiores y superiores.

FUNCIONAMIENTO Componentes Fuente luminosa. Luz amplificada por emisin estimulada de radiacin, Lser (Light amplification by stimulated emission of radiation). Normalmente un microscopio confocal viene con varios lser que tienen una o varias lneas de emisin: Argon (458, 476, 488, 496 y 514nm), Helio-Nen (543nm), Helio-Nen (633nm), Diodo azul (405 nm), etc. A mayor intensidad del lser tendremos mayor emisin de fluorescencia, pero tambin se nos producir un mayor photobleaching (disminucin de la fluorescencia con el tiempo). Espejo dicroico. Refleja totalmente la luz que incide con un ngulo de cerca de 45. Es la propiedad de presentar de manera alternativa dos coloraciones segn la direccin de los rayos de luz incidentes. Ranura detectora Pinhole. Esta ranura slo permite el paso de la luz reflejada por el plano focal.

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3 Microscopio Confocal Lente objetivo. Permite enfocar el rayo de luz reflejado por el espejo dicroico hacia el plano focal de la muestra. Detector. Recibe el haz de luz y genera una imagen. Ajusta la amplificacin de la seal elctrica generada a partir de los fotones emitidos por la muestra. Si la intensidad de luz emitida por la muestra es dbil deberemos de aumentar la ganancia para poder obtener la imagen. Un aumento excesivo de la ganancia se traduce en una prdida de calidad de la imagen debido al ruido electrnico que se genera.

PREPARACIN DE LA MUESTRA La preparacin de las muestras vara segn los procedimientos y las estructuras que se deseen visualizar. Sin embargo, la preparacin de las muestras es igual a la utilizada para microscopa de fluorescencia convencional y/o citometra de flujo, en cuanto a los mtodos de fijacin y la tincin o marcaje. Es importante tener en cuenta algunos aspectos.

Fijacin Cuando es necesaria se deben respetar los lugares de reconocimiento del anticuerpo y minimizar la presencia de artefactos. En general no son adecuados los fijadores como el glutaraldehdo, porque exageran la autofluorescencia de la muestra, y son adecuados el paraformaldehdo (4% en solucin salina isotnica) y metanol o acetona fros (-20C).

Secciones Histolgicas El grosor depende de la distancia de trabajo propia de cada objetivo, de la penetrabilidad del anticuerpo o de los fluorocromos empleados en la tincin y de las propiedades de transparencia de los tejidos que conforman la muestra.

Atenuacin de la fluorescencia Se debe limitar el tiempo de observacin, puesto que los radicales libres que se producen durante el tiempo de excitacin de los fluorocromos daan las clulas y los tejidos no fijados.

Conservacin de las muestras Deben ser protegidas de la luz, analizadas rpidamente y almacenadas en fro.
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4 Microscopio Confocal VENTAJAS Mayor resolucin: Para un objetivo de inmersin en aceite con una apertura numrica de 1.4 y una longitud de onda de 442 nm es posible alcanzar resoluciones de 0.14 m en horizontal y 0.23 m en vertical (Wilson, 1990). Mayor contraste: Debido a que se elimina la luz procedente de las zonas Microscopa lser confocal fuera de foco. Posibilidad de realizar secciones pticas: Variando el plano de enfoque el sistema es capaz de tomar imgenes a diferente profundidad. Lo que permite obtener informacin tridimensional de la muestra. Anlisis de imgenes: Al obtenerse la imagen de modo electrnico es posible digitalizarla y aplicar sobre ella toda una serie de tcnicas de anlisis de imgenes como: realce de imgenes, para mejorar su calidad, combinacin de imgenes para comparar cambios en el tiempo, medida de intensidades, medidas morfomtricas, etc. Reconstruccin 3D: A partir de las secciones pticas es posible aplicar tcnicas de reconstruccin 3D que nos permitan visualizar las estructuras. Imgenes multidimensionales: El microscopio confocal nos permite estudiar imgenes en 2 y 3 dimensiones a lo largo del tiempo. Es posible programar el equipo para obtener imgenes durante un periodo de tiempo determinado. Imgenes Lambda: Si el equipo cuenta con un detector espectral podremos tomar imgenes a diferentes longitudes de onda (lambda scan) y a partir de ellas deducir el espectro de emisin de un fluorocromo determinado.

El sistema de barrido punto a punto (scan) utilizado en los microscopios confocales de tipo CLSM (Confocal Laser Scanning Microscopy) comporta una serie de ventajas adicionales como son: Posibilidad de obtener imgenes perpendiculares al plano XY tomando la misma lnea a diferentes profundidades. Fijar el lser sobre un punto o una pequea zona de la muestra y tomar imgenes a diferentes tiempos para observar los efectos del lser sobre esa zona. Aumentar la resolucin mediante zoom del rea a barrer tomando mayor nmero de puntos en reas ms pequeas.

La velocidad de formacin de la imagen depende tambin del nmero de puntos que tomemos por imagen, as es mayor en imgenes de 512 x 512 pxeles que en imgenes de 1024 x 1024 pxeles.

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5 Microscopio Confocal UTILIDADES Este tipo de tcnica sirve para estudiar la estructura de materiales biolgicos, siendo muy til en investigacin biomdica. Permite monitorizar los movimientos de las molculas dentro de las clulas. Por ejemplo el movimiento del Calcio. Permite adems localizar anticuerpos para estudios de inmunocitoqumica con mayor resolucin que la microscopa convencional, realizar hibridacin histoqumica in situ de alta resolucin con procedimientos no isotpicos para localizar la posicin de las secuencias de los cidos nucleicos en las clulas. Una de las grandes cualidades es que permite la visualizacin en tres dimensiones incluyendo el interior y permite registrar procesos de secrecin en clulas vivas con marcadores como el FM1-43. Con el uso de software y posterior al procesamiento de la imagen permite realizar colecciones de secuencias seriadas, reconstrucciones en 3D, medidas de colocalizacin de marcadores, imgenes laterales del objeto, superposicin de imgenes obtenidas por diferentes tcnicas.

PROCESO DE IMGENES Y MICROSCOPA CONFOCAL El hecho de que la mayora de los microscopios lser confocal utilicen un sistema informtico para digitalizar las imgenes facilita la aplicacin de tcnicas de proceso y anlisis de imgenes. La visualizacin de muestras con fluorescencia dbil puede ser mejorada mediante la acumulacin de un determinado nmero de imgenes. Un fondo con ruido debido a una alta amplificacin de la seal puede ser corregido mediante promedio de varias imgenes. Otras tcnicas, como realce de contornos, filtros, etc., pueden ser aplicadas a las imgenes de microscopa confocal para realzarlas. En estudios de cintica celular los cambios experimentados en un determinado componente (Ca++, por ejemplo) pueden visualizarse mediante sustraccin de imgenes tomadas a diferentes tiempos. Tcnicas de anlisis de imgenes como clasificacin, operaciones morfolgicas y cuantificacin de componentes, pueden ser utilizadas para la realizacin de mediciones morfomtricas y den sito mtricas de determinados parmetros presentes en la imagen; por ejemplo, contenido en DNA de ncleos teidos con un determinado fluorocromo.

APLICACIONES DE LA MICROSCOPA CONFOCAL La microscopa confocal es muy til para el estudio de muchos problemas en biologa, permitiendo un nuevo conocimiento de la estructura celular y sus procesos. Entre otras aplicaciones la microscopa confocal se utiliza en: estudios de estructura celular y cito esqueleto, medida de actividad intracelular (pH e iones), produccin de reconstrucciones tridimensionales, etc.

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6 Microscopio Confocal Para trabajar con microscopa de fluorescencia, ya sea convencional o confocal, se ha de tener en cuenta que la longitud de onda de la fuente de iluminacin (el lser en el caso del confocal) se corresponda con la longitud de onda de excitacin del fluorocromo utilizado. La eficiencia es mxima cuando la longitud de onda del lser coincide con el pico del espectro de excitacin del fluorocromo. Por lo tanto antes de decidirnos a utilizar un fluorocromo determinado debemos de estar seguros de que alguna de las lneas de lser de nuestro microscopio confocal coincide con su espectro de excitacin. La intensidad de la seal fluorescente ser mayor cuanto ms prxima est la lnea del lser al pico de excitacin del fluorocromo. Las principales aplicaciones de la microscopa confocal son entre otras: A. Anlisis de colocalizacin. Mediante microscopa Confocal son posibles estudios de coexpresin de protenas u otro tipo de molculas en una misma clula /preparacin. Usando un mximo de 4 marcajes/canales simultneos: Rojo Verde Infrarrojo Dapi (azul)

La colocalizacin permite determinar si una molcula de inters se expresa simultneamente en una misma regin de nuestra preparacin y se pone de manifiesto mediante la visin de la mezcla de colores de los diferentes fluorocromos/marcadores (canales -dapi, 2-verde y 3-rojo) en un mismo canal (canal 4-mezcla). a. Imgenes teidas con un marcador fluorescente (single labeling). Imgenes de una muestra con auto fluorescencia o que estn teidas con un nico marcador fluorescente, visualizadas con microscopa confocal presentan una considerable mejora en relacin a la misma imagen visualizada con microscopa de fluorescencia convencional. Esta mejora es ms evidente cuanto mayor es el espesor de la muestra a estudiar. En muestras con espesores inferiores a 10 micras apenas hay diferencia entre una imagen de fluorescencia y una imagen confocal, mientras que en una muestra de ms de 20 micras la calidad de la imagen confocal es muy superior a la de la imagen de Microscopio de Fluorescencia. b. Imgenes teidas con varios marcadores fluorescentes (multiple labeling).

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7 Microscopio Confocal Mltiples estructuras de una clula o tejido pueden ser observadas simultneamente tiendo la muestra con dos o ms marcadores fluorescentes, donde cada fluorocromo marca una determinada estructura o sirve como indicador de determinados procesos celulares. El microscopio confocal suele venir equipado con uno o varios lseres que emiten en diferentes longitudes de onda pudiendo utilizarse varias de ellas como fuente de iluminacin de la muestra. Si tenemos una muestra con dos o tres marcadores fluorescentes podremos recoger simultneamente su seal en diferentes fotomultiplicadores.

B. Inmunofluorescencias y deteccin de sondas. Mediante ensayos multicolor basados en el uso de fluorocromos/marcadores especficos para hasta 4 marcajes simultneos (ej: fluorocromos Rojo,Verde,Infrarrojo, Dapi ) y aplicables a numerosos estudios( apoptosis y proliferacin celular, localizaciones celulares y subcelulares, estudios de difusin ,expresin de protenas, etc). El uso de marcadores especficos permite poner de manifiesto molculas especficas en nuestra preparacin basada en la interaccin Ag-Ac y la emisin de fluorescencia.

C. Series Z (Reconstrucciones 3-D). Mediante Microscopa Confocal es posible la recogida de una secuencia de cortes pticos como un lote de imgenes y su posterior procesamiento digital lo que presenta la ventaja de que este bloque de datos de varias dimensiones permite generar una imagen bidimensional calculada (proyeccin) o una representacin reducida en 3 dimensiones de la muestra con el software apropiado. Las Series Z realizan una serie de capturas en los diferentes planos de la muestra que posteriormente pueden ser integrados para obtener una reconstruccin 3D de la muestra. El nmero de cortes y calidad de la reconstruccin 3D depende del grosor de la muestra por lo que no es adecuada para muestras/clulas con bajo volumen. a. Realizacin de secciones transversales (x-z). Con el microscopio ptico siempre observamos la muestra en el plano X-Y. Una caracterstica interesante del microscopio confocal es la posibilidad de realizar secciones transversales de la muestra que nos permiten observar como es su estructura interna sin necesidad de realizar complejas preparaciones.

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8 Microscopio Confocal Para realizar secciones transversales de calidad necesitamos contar con una platina motorizada de alta precisin que nos permita realizar desplazamientos verticales en intervalos muy pequeos, del orden de 0,2 micras. Fijando el haz de barrido del lser en el punto en el que queremos realizar la seccin y desplazando la muestra verticalmente iremos obteniendo un corte transversal de esa zona. b. Informacin tridimensional de la muestra. Como se ha mencionado anteriormente una de las mayores ventajas de la microscopa confocal es la posibilidad de estudiar tridimensionalmente la muestra a partir de secciones pticas de la misma. Para ello se fija la posicin de barrido del microscopio en un extremo de la estructura a medir y se van tomando imgenes, correspondientes a diferentes secciones de la misma, hasta llegar al otro extremo. c. Reconstruccin tridimensional. La imagen estereoscpica suministra informacin tridimensional de la muestra desde un punto de vista esttico y en una determinada direccin. Un mtodo mejor para analizar y estudiar las complejas relaciones espaciales es la realizacin de reconstrucciones tridimensionales donde el volumen de datos puede ser visualizado desde varios ngulos.

D. Estudios de actividad intracelular (ph e iones). El desarrollo, durante los ltimos 10 aos, de indicadores fluorescentes que responden selectivamente a iones biolgicos ha permitido a los investigadores medir el flujo de estos iones en clulas vivas. Indicadores fluorescentes han sido descritos para la mayora de los ms importantes iones biolgicos, aunque los usados ms ampliamente son los indicadores de PH y calcio intracelular. La mayor resolucin y contraste de la microscopa confocal permite obtener imgenes de actividad inica o PH mucho ms claras que las que se observan con microscopa de fluorescencia, adems la posibilidad de programar el barrido del lser permite tomar imgenes del mismo plano focal a distintos tiempos, pudiendo estudiarse la propagacin de un determinado Ion (por ejemplo la expansin de la ola de calcio despus de aplicar un estmulo sobre la clula).

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9 Microscopio Confocal E. Time Series (Series Temporales). La Microscopa Confocal permite la captura de imgenes de la preparacin a intervalos definidos (ms,seg,min) y el posterior procesado de las imgenes para la obtencin de una pelcula que permita observar la evolucin de la muestra en el intervalo de tiempo definido.

F. Determinacin de espectros de fluorescencia (lambda scan). Si el sistema cuenta con un detector espectral es posible utilizarlo para obtener el espectro real de emisin del fluorocromo con que hemos marcado nuestra muestra. Aunque existen mltiples tablas de los espectros de emisin de los fluorocromos, hay ligeras variaciones entre el espectro terico y el real debidas principalmente a variaciones en el PH al preparar la muestra o a variaciones de temperatura.

G. FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching). El mtodo de Recuperacin de Fluorescencia Tras Fotoquemado es una tcnica para la observacin del movimiento intracelular mediante quemado de la fluorescencia de una zona o molcula de inters. Una rea especfica de la muestra se quema mediante la accin del laser confocal, la prdida y recuperacin de fluorescencia es utilizada entonces para determinar cmo se recupera esta fluorescencia que se relaciona con la difusin y/o desplazamiento de la molcula fotoquemada.

H. FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). La tcnica FRET (Transferencia de Energa por Resonancia Fluorescente) es una tcnica usada para la visualizacin y deteccin de molculas biolgicas (protenas, lpidos o cidos nucleicos) El FRET es una tcnica importante para investigar una gran variedad de fenmenos biolgicos que implican la proximidad entre dos molculas y que permite caracterizar con enorme precisin la distancia entre 2 molculas. El mecanismo se basa en la presencia de 2 molculas fluorescentes: un donante y un aceptor. La molcula donante puede ser excitada a una longitud de onda especifica y a su vez, provocar la excitacin de la molcula aceptora que a su vez emitir en una fluorescencia detectable.

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