Bioeletricidade Este captulo introduz os conceitos bsicos utilizados na tomada de medidas eltricas das clulas e na descrio de instrumentos utilizados

em fazer essas medies. Potenciais eltricos Uma clula deriva suas propriedades eltricas principalmente a partir das propriedades eltricas de sua membrana. Uma membrana, por sua vez, adquire suas propriedades de seus lipdios e protenas, tais como canais inicos e transportadores. Uma diferena de potencial existente entre o interior e o exterior das clulas. Um objeto carregado (ion) ganha ou perde energia que se move entre os locais de potencial eltrico diferente, apenas como um objeto com massa se move "para cima" ou "para baixo" entre pontos de potencial gravitacional diferente. Diferenas de potencial eltrico so geralmente denotada como V ou DV e medido em volts; tenso, portanto, o potencial tambm denominado. A diferena de potencial atravs de uma clula se relaciona o potencial do interior da clula para que da soluo externa, o que, de acordo com a conveno comumente aceita, zero. Diferenas de potencial entre dois pontos que so separados por um isolante so maiores do que as diferenas entre esses pontos separados por um condutor. Assim, a membrana lipdica, que um bom isolante, tem uma diferena de potencial eltrico atravs dele. Esta diferena de potencial ("Potencial transmembrana") equivale a menos de 0,1 V, tipicamente mV 30-90 na maioria das clulas animais, mas pode ser tanto quanto 150-200 mV em clulas vegetais. Por outro lado, as solues de sal rico do citoplasma e sangue so condutores razoavelmente boa, e geralmente h diferenas muito pequenas no estado estacionrio (raramente mais de alguns milivolts) entre quaisquer dois pontos dentro do citoplasma de uma clula ou dentro do extracelular soluo. Equipamentos eletrofisiolgico permite aos pesquisadores para medir potencial (voltagem) diferenas nos sistemas biolgicos. Equipamentos correntes eltricas eletrofisiolgico tambm pode medir a corrente, que o fluxo de carga eltrica que passa um ponto por unidade de tempo. Corrente (I) medida em amperes (A). Normalmente, as correntes medidos por faixa de equipamentos eletrofisiolgicas de picoamperes para microamperes. Para exemplo, normalmente, 104 ons Na + atravessar a membrana a cada milsimo de segundo que um nico canal de Na + aberto. Esta corrente igual a 1,6 pA (1,6 x 10-19 coul / ion x 104 ons / ms x 103 ms / s). Duas regras prticas sobre correntes, muitas vezes ajudam a entender fenmenos eletrofisiolgicos: (1) atual conservada em um ponto de ramificao (Figura 1-1) e (2) de corrente sempre flui em um circuito completo (Figura 1-2). Nas medies eletrofisiolgicas, correntes podem fluir atravs de capacitores, resistores, canais inicos, amplificadores, eletrodos e outras entidades, mas sempre de fluxo em circuitos completos.

Figura 1-1. Conservao da atual Atual conservada em um ponto de ramificao.

Figura 1-2. Um circuito tpico Eltrica Exemplo de um circuito eltrico com vrias partes. Corrente sempre fluide forma completa circuito. Resistores e condutores Correntes fluem atravs resistores ou condutores. Os dois termos, na verdade se complementam o primeiro enfatiza as barreiras ao fluxo da corrente, enquanto o segundo enfatiza os caminhos para o fluxo. Em termos quantitativos, a resistncia R (unidades: ohms (W)) o inverso da condutncia G (unidades: siemens (S)), portanto, a resistncia infinita condutncia zero. Em eletrofisiologia, conveniente para discutir correntes em termos de condutncia porque side-by-side ("paralelo") condutncias simplesmente somam (Figura 1-3). A aplicao mais importante do paralelo condutncias envolve canais inicos. Quando vrios canais de ons em uma membrana so abertas simultaneamente, a condutncia total simplesmente a soma das condutncias dos canais individuais aberto.

Figura 1-3. Somatrio de Condutncia Condutncias em paralelo somam juntos, se eles so resistores oucanais. A representao mais precisa de um canal inico um condutor em srie com dois elementos do circuito adicional (Figura 1-4): (1) um interruptor que representa o porto do canal, que seria na sua posio conduzir quando o porto est aberto e (2) uma bateria que representa o potencial de reverso da corrente inica para esse canal. O potencial de reverso definido operacionalmente como a tenso em que as mudanas atuais sua direo. Para um canal perfeitamente seletivo (isto , um canal atravs do qual apenas um nico tipo de on pode passar), o potencial de reverso igual ao potencial de Nernst para o on permeante. O potencial de Nernst para o on A, Ea, pode ser calculada pela equao de Nernst: onde R a constante dos gases (8,314 VC K-1 mol-1), T a temperatura absoluta (T = 273 + C ), zA a carga do on A, F a constante de Faraday (9.648x104 C mol-1), e [a] e o [A] i so os concentraes de ons Um fora da clula e dentro da clula, respectivamente. A 20 C ("temperatura ambiente"), 2,303 (RT / ZAF) = mV 58 para um on univalente.

Figura 1-4. Circuito equivalente para um nico canal de membranaUm circuito mais realista equivalente para um nico canal de membrana. Por exemplo, temperatura ambiente, um canal de Na + Na + intracelular enfrentando concentrao que dez vezes menor do que a concentrao extracelular desse on seria representado por uma bateria de 58 mV. Um canal de K +, para a qual o gradiente de concentrao geralmente revertida, seria representado por uma bateria de -58

mV.Potencial de reverso no so facilmente previsveis para os canais que so permeveis a mais de um ction ion. Nonspecific canais, tais como receptores nicotnicos de acetilcolina, geralmente tm potenciais de reverso perto milivolts zero. Alm disso, muitos canais abertos tm uma relao no linear entre tenso e corrente. Conseqentemente, representando canais como resistores apenas uma aproximao.Investigaes biofsicas considervel tem sido dedicada compreenso das relaes corrente-tenso de canais de ons e como eles so afetados pelas propriedades e concentraes de ons permeante. O potencial transmembrana definido como o potencial no lado interno da membrana em relao ao potencial no lado exterior da membrana. O potencial de repouso da membrana (ERP) descreve uma condio de estado estacionrio, sem fluxo lquido de corrente eltrica atravs da membrana. O potencial de repouso da membrana determinado pelas concentraes intracelulares e extracelulares de ons para o qual a membrana permevel e sobre a sua permeabilidade. Se uma condutncia inica dominante, o potencial de repouso prximo ao potencial de Nernst para aquele on.Desde uma membrana celular tpica em repouso tem uma permeabilidade muito maior ao potssio (PK) do que ao clcio, sdio ou cloreto (PNA, CaP e PCL, respectivamente), o potencial de repouso da membrana muito prximo ao EK, o potencial de reverso do potssio. Lei de Ohm Para eletrofisiologia, talvez a mais importante lei da eletricidade a lei de Ohm. A diferena de potencial entre dois pontos ligados por um caminho atual com uma condutncia G e uma corrente I (Figura 1-5) :

Figura 1-5. Lei de Ohm. Este conceito aplica-se a qualquer medida eletrofisiolgicos, como ilustrado pelos dois exemplos seguintes: (1) Em um experimento de gravao extracelular: a corrente I que flui entre partes de uma clula atravs da resistncia externa R produz uma diferena de potencial DV, que geralmente menos de 1 mV (Figura 1-6). Como o impulso se propaga, eu alteraes e, portanto, mudanas DV tambm.

Figura 1-6. IR Drop

Na gravao extracelular, eu corrente que flui entre os pontos de uma clula medido como a diferena de potencial ("drop IR") atravs da resistncia R do fluido entre os dois eletrodos. (2) Em um experimento de tenso grampo: quando os canais N, cada uma condutncia g, esto abertas, a condutncia total Ng. A eletroqumica fora motriz DV (potencial de membrana menos potencial reverso) produz uma NgDV atual. Como canais de abrir e fechar, N mudanas e tambm a tenso-clamp atual I. Assim, a corrente de voltagem clamp simplesmente proporcional ao nmero de canais abertos em um dado momento. Cada canal pode ser considerado como ag incremento de condutncia. O divisor de tenso Figura 1-7 descreve um circuito simples chamado um divisor de tenso em que dois resistores so conectados em srie:

Figura 1-7. Um divisor de tenso A diferena total potencial fornecido pela bateria E; uma parte desta tenso aparece em cada resistor. Quando dois resistores so ligados em srie, a mesma corrente passa atravs de cada um deles. Portanto, o circuito descrito por

where E is the value of the battery, which equals the total potential difference across both resistors. As a result, the potential difference is divided in proportion to the two resistance values. Perfeita e Real Instrumentos eltricos Medies eletrofisiolgicas devem satisfazer dois requisitos: (1) Eles devem medir com preciso o parmetro de interesse, e (2) que deve produzir no perturbao do parmetro. O primeiro requisito pode ser discutida em termos de um divisor de tenso. O segundo ponto ser discutido aps abordar eletrodos. A melhor maneira de medir uma diferena de potencial a utilizao de um voltmetro com resistncia infinita. Para ilustrar este ponto, considere o arranjo da Figura 1-8 (A), que pode ser reduzida para o circuito equivalente da Figura 1-8 (B).

Figura 1-8. Voltmetro representante com resistncia infinita Instrumentos utilizados para medir os potenciais devem ter uma alta resistncia de entrada Rin. Antes de fazer a medio, a clula tem um potencial de repouso de ERP, que deve ser medido com um eletrodo intracelular de Re resistncia. Para entender o efeito do circuito de medio do parmetro medido, vamos fingir que o nosso instrumento um voltmetro "perfeito" (ie, com uma resistncia infinita) em paralelo com uma resistncia finita Rin, que representa a resistncia de um voltmetro real ou o circuito de medio. A combinao Re Rin e forma um divisor de tenso, de modo que apenas uma frao do Erp aparece na entrada do voltmetro "perfeito"; essa frao igual ErpRin / (Rin + Re). O Rin maior, o V mais perto Erp. Claramente o problema fica mais grave como o eletrodo aumenta Re resistncia, mas a melhor soluo fazer com que Rin to grande quanto possvel. Por outro lado, a melhor maneira de medir a corrente abrir o caminho e inserir um ampermetro. Se o ampermetro tem resistncia zero, ele no vai perturbar o circuito, pois no h IR drop-atravs dela. ons em solues e Eletrodos Lei de Ohm a relao linear entre a diferena de potencial e fluxo de corrente aplica-se a solues aquosas inicas, como citoplasma, sangue e gua do mar. Complicaes so introduzidos por dois fatores: (1) A corrente transportado por pelo menos dois tipos de ons (um nion e um ction) e muitas vezes por muitos mais. Para cada on, o fluxo de corrente na soluo em massa proporcional diferena de potencial. Para uma primeira aproximao, a condutncia de toda a soluo simplesmente a soma das condutncias contribuio de cada espcie inica. Quando a corrente flui atravs de canais inicos, realizado seletivamente por apenas um subconjunto dos ons na soluo. (2) No eletrodos, a corrente deve ser transformada suavemente de um fluxo de eltrons no fio de cobre para um fluxo de ons em soluo. Muitas fontes de erros (artefatos) so possveis. Vrios tipos de eletrodos so usados em medies eletrofisiolgicas, o mais comum um cloreto de prata / prata (Ag / AgCl) interface, que um fio de prata revestido com prata cloreto (Figura 1-9). Se os eltrons fluem do fio de cobre atravs do fio de prata para o eletrodo de AgCl pellet, que converter o AgCl a tomos Ag e os ons Cl-se hidratado e entrar na soluo. Se os eltrons fluem no sentido inverso, os tomos de Ag em fio de prata que revestido com AgCl desistir de seus eltrons (um eltron por tomo) e se combinam com Clions que esto na soluo para fazer AgCl insolvel. Este , portanto, um eletrodo reversvel, ou seja, a corrente pode fluir nos dois sentidos. H vrios pontos para se lembrar sobre Ag / AgCl eletrodos: (1) O eletrodo Ag / AgCl executa bem apenas em solues contendo ons de cloreto; (2) Porque corrente

deve fluir em um circuito completo, dois eletrodos so necessrios. Se os dois eletrodos cara diferente Cl-concentrao (por exemplo, 3 M KCl dentro de uma micropipeta * e 120 mM NaCl em uma soluo de banho em torno da clula), haver uma diferena no potencial de meia clula (a diferena de potencial entre as soluo eo eletrodo) para os dois eletrodos, resultando em uma diferena grande potencial constante nos dois fios ligados aos eletrodos. Essa diferena constante potencial, denominado potencial de juno lquida, pode ser subtrado eletronicamente e coloca alguns problemas, desde que o eletrodo usado dentro de seus limites reversveis; (3) Se o AgCl esgotado pelo fluxo de corrente, prata nua poderia entrar em contato com a soluo. Vazamento de ons de prata do fio pode envenenar muitas protenas. Alm disso, os potenciais de meia clula-se agora dominado por imprevisvel, mal reversvel reaes de superfcie devido a outros ons na soluo de impurezas e de rastreamento na prata, fazendo com que a polarizao do eletrodo. No entanto, utilizado adequadamente, Ag / AgCl eletrodos possuem as vantagens de polarizao pouco e potencial de juno previsvel.

Figura 1-9. O eletrodo de cloreto de prata / prata. O eletrodo de cloreto de prata / prata reversvel, mas esgotveis. Outro tipo de eletrodo, feito de platina (Pt) (Figura 1-10), irreversvel, mas no esgotveis. Na sua superfcie, Pt catalisa a eletrlise da gua. O H2 gasoso ou O2 produzido, dependendo da direo do fluxo de corrente, deixa a superfcie do eletrodo. Se ambos os eletrodos so eletrodos de Pt, os ons hidroxila e prtons so produzidos em igual nmero, no entanto, mudanas de pH local pode ainda ocorrer.

Figura 1-10. O elctrodo de platina Um eletrodo de platina irreversvel, mas inesgotvel.

Capacitores e seus campos eltricos O campo eltrico uma propriedade de cada ponto no espao e definido como proporcional fora experimentada por uma carga colocada nesse ponto. Quanto maior a diferena de potencial entre dois pontos fixos no espao, o maior campo em cada ponto entre eles. Formalmente, a eltrica campo um vetor definido como o negativo da derivada espacial do potencial. O conceito de campo eltrico importante para compreender a funo da membrana. Membranas biolgicas so tipicamente menos de 10 nm de espessura. Conseqentemente, uma transmembrana potencial de repouso de cerca de 100 mV produz um campo muito considervel eltrica na membrana de cerca de 105 V / cm. Este prximo do valor em que a maioria isoladores quebrar irreversivelmente porque seus tomos ficam ionizados. Claro, equipamentos eletrofisiolgicas tpicas no se pode medir estes campos diretamente. No entanto, mudanas nesses campos so presumivelmente sentida pelos domnios gating de canais de ons sensveis voltagem, que determinam a abertura e fechamento de canais, e assim a campos eltricos esto na base da excitabilidade eltrica das membranas. Outra conseqncia da magreza da membrana que faz um capacitor excelente. Capacitncia (C; medido em farads, F) a capacidade de armazenar carga Q, quando ocorre uma tenso DV entre as duas "pontas", de modo que

O smbolo formal para um capacitor de duas linhas paralelas (Figura 1-2). Este smbolo surgiu porque os capacitores mais eficazes so paralelas a realizao de placas de grande rea separados por uma fina camada de isolante (Figura 1-11) uma excelente aproximao da bicamada lipdica. A capacitncia C proporcional rea e inversamente proporcional distncia que separa as duas folhas de conduo.

Figura 1-11. capacidade Uma carga Q armazenada em um capacitor de C valor mantido em umpotencial DV. Quando vrios capacitores so conectados em paralelo, isto eletronicamente equivalente a um nico grande capacitor, ou seja, a capacitncia total a soma de seus valores de capacitncia individual (Figura 1-12). Assim, a capacitncia da membrana aumenta com o tamanho da clula. Capacitncia da membrana normalmente expressa em valor por unidade de rea, quase todas as membranas bicamada lipdica de clulas tm uma capacidade de 1 F/cm2 (0,01 pF/m2).

Figura 1-12. Capacitores em paralelo adicionar seus valores Correntes por capacitores Equao 4 mostra que a carga armazenada em um capacitor apenas quando h uma mudana na tenso sobre o capacitor. Portanto, a corrente que flui atravs da capacitncia C proporcional variao de tenso com o tempo:

At agora, temos estado a discutir circuitos cujas propriedades no mudam com o tempo. Enquanto a tenso atravs de uma membrana permanece constante, pode-se ignorar o efeito da capacitncia de membrana sobre as correntes que fluem atravs da membrana atravs de canais inicos. Enquanto o variaes de tenso, no so transitrios correntes capacitivas, alm de as correntes de estado estacionrio atravs de canais condutores. Estas correntes capacitivas constituem uma das duas maiores influncias sobre as propriedades de tempo ependent eltrica das clulas (o outro a cintica de propagao do canal). Axon Instruments em amplificadores de tenso ou de patch-clamp, vrios controles so dedicados a lidar com essas correntes capacitivas. Portanto, vale a pena obter algum "sentir" intuitivo para seu comportamento. A carga armazenada na capacitncia de membrana acompanha o potencial de repouso, e qualquer mudana na tenso atravs da membrana acompanhada por uma mudana neste carga armazenada. De fato, se uma corrente aplicada membrana, ou por canais em outras partes da clula ou pela corrente do eletrodo, este satisfaz a exigncia atual primeiro para carregar a capacitncia de membrana e, em seguida ela muda a tenso de membrana. Formalmente, isto pode ser demonstrado atravs da representao da membrana como um resistor de valor R em paralelo com a capacitncia C (Figura 1-13):

Figura 1-13. Comportamento da membrana Comparada com uma corrente eltrica A membrana se comporta como uma capacitncia eletricamente em paralelo com uma resistncia. Agora, se aplicarmos um pulso de corrente para o circuito, os encargos atual primeiro a capacitncia, ento muda a tenso (Figura 1-14).

Figura 1-14. Resposta RC Circuito Paralelo Resposta de um circuito paralelo RC a um degrau de corrente. A tenso V (t) se aproxima estado estacionrio ao longo de um curso de tempo exponencial: O valor Vinf steady-state (tambm chamado de tempo infinito ou valor de equilbrio) no depende a capacitncia, simplesmente determinada pela corrente I ea resistncia R membrana: Esta apenas a lei de Ohm, claro, mas quando a capacitncia de membrana est no circuito, a tenso no for alcanado logo. Em vez disso, abordada com o tempo t constante, dada por Assim, o tempo de carregamento aumenta constante quando quer capacitncia da membrana ou a resistncia aumenta. Conseqentemente, grandes clulas, tais como ocitos Xenopus que so frequentemente utilizados para a expresso dos genes que codificam protenas de canais inicos e clulas com membrana extensa invigorations, como o T-sistema no msculo esqueltico, tem uma longa fase de carregamento. Pina de corrente e tenso Grampo Em um experimento de fixao de corrente, aplica-se um conhecido constante ou varivel no tempo atual e mede a variao no potencial de membrana causadas pela corrente aplicada. Este tipo de experimento imita a corrente produzida por uma entrada sinptica. Em um experimento braadeira de tenso controla a tenso de membrana e mede a corrente transmembrana necessrio para manter a tenso. Apesar do facto de grampo de tenso no imitar um processo encontrados na natureza, existem trs razes para fazer tal experincia: (1) Fixao da tenso elimina a corrente capacitiva, exceto por um breve tempo na sequncia de um passo para uma nova tenso (Figura 1-15). A brevidade da corrente capacitiva depende de muitos fatores que so discutidas nos captulos seguintes, (2) Exceto para o breve tempo de carregamento, as correntes que o fluxo proporcional apenas condutncia da membrana, ou seja, o nmero de canais abertos, (3 ) Se gating do canal determinada pela voltagem transmembrana sozinho (e insensvel a outros parmetros, como a atual ea histria da tenso), braadeira de tenso oferece controle sobre a varivel-chave que determina a abertura e fechamento de canais inicos.

Figura 1-15. Experimento Voltage-Clamp tpico Uma experincia de tenso clamp-on do circuito da Figura 1-13. O patch clamp uma braadeira de tenso especial que permite resolver correntes que fluem atravs de canais de ies simples. Ela tambm simplificou a medio de correntes que fluem atravs da membrana wholecell, particularmente em pequenas clulas que no podem ser facilmente penetrado com eletrodos. As caractersticas de um patch clamp so ditadas por dois fatos: (1) As correntes medidas so muito pequenas, na ordem de picoamperes em canal nico de gravao e, geralmente, at nano amperes vrias de clula inteira de gravao. Devido s correntes de pequeno porte, particularmente em um nico canal de gravao, as polarizaes eletrodo e nolinearidades so desprezveis eo eletrodo Ag / AgCl pode gravar tenso com preciso, mesmo durante a passagem da corrente. (2) O ampermetro eletrnico deve ser cuidadosamente concebido para evitar a adio de rudo sensvel para as correntes que medidas. Microeletrodos vidro e Selos apertado Sucesso medies eletrofisiolgicas dependem de duas tecnologias: o projeto de instrumentao eletrnica e as propriedades e fabricao de micropipetas de vidro. Pipetas de vidro so usados tanto para gravao intracelular e para a gravao patch; recentemente pipetas de quartzo foram usados para o rudo ultra-baixo de gravao de canal nico (para uma discusso detalhada de culos eletrodo ver Captulo 4). Gravao de patches bem-sucedido requer uma boa vedao entre a pipeta ea membrana. Embora ainda no existe uma descrio satisfatria molecular deste selo, podemos descrever suas caractersticas eltricas. Exigncia (3) acima (em Perfeito e Real Instruments Eltrica) afirma que a qualidade da a medida depende minimizando perturbao das clulas. Para o caso de gravao de tenso, este ponto pode ser apresentado com o circuito divisor de tenso (Figura 1-16).

Figura 1-16. Medio do eletrodo intracelular Este eletrodo intracelular medir o potencial de repouso de uma clula cuja membrana contm apenas os canais abertos + K. Como o selo resistncia Rs aumenta, a medio do se aproxima do valor de EK.

Para o caso de gravao de patch, correntes atravs do selo no distorcem a tenso medida ou atual, mas tambm aumentam o rudo atual. Rudo atual pode ser analisado tanto em termos do rudo Johnson de um condutor, que o rudo trmico que aumenta com a condutncia (ver Captulo 7 e Captulo 12), ou em termos de estatstica simples. Este ltimo o seguinte: Se uma corrente de ons N / ms passa por um canal aberto, ento a corrente vai variar de um milissegundos para o seguinte com um desvio padro de ON. Estas flutuaes produzir rudo na traos de canal nico gravado. Se uma corrente adicional est fluindo em paralelo atravs do selo (Figura 1-17), que provoca um aumento no desvio-padro. Por exemplo, se a corrente atravs do selo dez vezes maior do que atravs do canal, ento as flutuaes estatsticas no fluxo da corrente produzida pelo selo so O10 (316%) maiores do que seria para um selo de "perfeito".

Figura 1-17. Selos bons e maus Em uma gravao de patch, correntes atravs do selo tambm fluir atravs do circuito de medio, aumentando o rudo na corrente medida.