DVELOPPEMENT

DES LYMPHOCYTES

Introduction
On s'intresse aux phnomnes de gnration des LB dans les OLI, et plus prcisment l'limination des LB auto-ractif, la slection positif et l'limination des LT auto-ractifs. Dans le moelle osseuse, prcurseur hmatopotique commun dont une partie va dans le thymus (LT) et une autre volue et va directement dans les OLII (LB). Pro-B rarrangement DJ puis pr-B rarrangement V avec DJ puis LB immature VJ et VDJ productif qui donne des Ig membranaires et enfin LB mature nafs qui co-expriment IgM et IgD la membrane. Tout cela lieu dans les OLI ensuite les LB mature nafs colonisent les OLII. Deux grands mcanismes sont . cf diapo

Questions
L'auto-immunit est un vnement rare malgr le potentiel gntique de chaque individu crer un rpertoire ractif vis vis des Ag autologue. Le SI apprend d'une certaines faon reconnatre les Ag du SOI et les tolrer. Comment ? Le comportement du SI est le mme vis vis des Ag membranaires et solubles ?

limination Des LB Auto Ractifs Dans La Moelle Osseuse

On a cre des souris transgniques cf madoc. Pour vrifier que le gne est prsent on fait PCR ou Southern Blot. Si on veut que la souris produise une Ig on doit injecter 2 transgnes un pour la chane lourde et une pour la chane lgre. D10 prsentation CMH de la souris ( les noms ). Souris trs utilis donc important savoir. D11 haut polymorphisme donc on met en place nomenclature spciale. Si on met exposant sur H2 sa veut dire que toutes les sous classe de CMH sont du mme allle. D12 pas savoir juste exemple d'allle D13 D14 ralisation d'une souris transgnique en introduisant les transgnes codant pour les chanes lourdes et lgres d'un Ac anti-H2KK. Kohler et Milstein ( mise en place des hybridome ) on cre une souris qui ne possdait pas H 2K et par hybridome B parmi production Ac anti H2KK. Cet hybridome possdent des modifications dans son ADN qui permettent production Ac, ils ont isols cette zone d'ADN ( VDJ ). Ces transgnes ont t mis chez des souris H 2d, cette souris a t crois avec une souris d'haplotype H2k on obtient une souris H2d/k. Toutes les cellules ( sauf les hmaties ) de l'organisme expriment le CMHI. D15 Analyse par ELISA et FACS. Chez l'animal H2d (Tg Ac anti H2k ), si on veut qu'il en produise que les Ac transgniques on invalide les gnes Rag, donc il y aura expression d'IgM anti H2k et d'IgM recombin ( population polyclonale ). Pour doser la prsence d'Ac anti H2k ils ont utilis des Ac anti dterminants idiotypique. D16 D17 Dans les trois cas prsence d'IgM dan sle srum des concentration trs diffrente. Chez les non transgniques et les Tg H2d/k on ne dtecte pas d'IgM anti H2k. L'autre souris correspond 50% de ces IgM. D18 Ensuite FACS pour tudi expression la membrane des cellules de la rate. Anti B220 marque les LB et le Thy1 marque les LT. On observe un pic chez les Tg H2d a s'explique car pas besoin de recombinaison somatique donc avantag par rapport ceux qui ne sont pas fonctionnels forte expression. Cette forte reprsentation permet de voir si il y a des modifications, disparition . D19 Dans cette situation, dans la moelle osseuse, quand on a un LB qui reconnat un Ag du SOI ils sont limins. Mise en vidence de la dltion clonale dans les OLI.

Editing De La Rponse B
Est ce que c'est la seule solution, qu'un LB auto-ractif soit limin ? Ce n'est pas la seule solution l'aute passe par le rcepteur editing. D21 L'Ac reconnat Kk fortement mais aussi avec une affinit moindre Kb. Ils ont donc regard le comportement au niveau de la moelle osseuse. Cet Ac anti Kk est constitu d'un HC mu et d'une LC kappa. Ils ont constat de faon gnrale que chez les souris non Tg possdent une LC kappa, chez notre Tg aussi. Chez les Tg des LC lambda apparaisse donc soit recombinaison somatique ont lieu soit changement de chane lgre donc change l'affinit pour Kk qui n'est plus reconnu mais reconnaissance Kb. D22 Pour vrifier cette hypothse tude des enzymes impliqu dans la recombinaison ( Rag et TdT ), par RT-PCR. Chez les Tg on observe un r-expression de Rag et TdT. D23 Quelle sont les cellules qui vont r-induire l'expression de Rag. On isole la population qui possde le BCR Tg des autres et on observe laquelle r-exprime Rag. On remarque que la population qui exprime de BCR Tg r-exprime Rag alors que l'autre non. Donc LB qui reconnaisse Ag du SOI sont r-orient pour changer leur spcificit. D25 Rarrangement de la LC possible si reconnat rien il devient mature sinon quand plus de rarrangement possible mort = editing receptor. D26 Dcalage dans numrotation des diapos ( -1 )

Anergie Clonale Dans Les Cellules B Matures

29/01/2013 D26 D27 Tg qui code pour LC et HC d'une Ig reconnaissant le lysozyme de poulet ( HEL, Hen Egg Lysozyme ). Promoteur methallotionine permet de rguler expression de cette protine si on met pas de mtaux dans la boisson de l'animal pas de d'expression de la protine. D28 On cherche a voir si il y a production d'Ac anti HEL chez les souris Tg et non Tg. Chez les non Tg on est capable de mettre en vidence une grande quantit d'Ac anti HEL ( entre 10^3 et 10^4 ). Chez les Tg la quantit d'Ac anti HEL est trs faible voir nulle. Si il y a pas production d'Ac slection ngative ? Autre mcanisme ? D29 Pour le savoir on a croiser souris non Tg et Tg. On est pas dans un cas Rag -/- donc forte expression de l'Ig Tg mais aussi les autres, population polyclonale d'Ac chez cet animal. D30 Le Tg code pour une Ig d'allotype a ( VDJ-C dj associe sur le Tg ) or celle de la souris sont de type b ( recombinaison somatique avec les C mu de la souris ) donc permet de les reconnatre. D31 Les non Tg sont toutes d'allotype b donc IgM et IgD que de type b. Chez les souris Tg il y a quasiment pas d'allotype b alors que la majorit sont d'allotype a. Sur la dernire ligne on voit que tout ces Ig d'allotype a reconnaisse HEL. Chez double Tg Expression la membrane que d'IgD pas d'IgM, cette population reconnat aussi HEL. Situation diffrente de celle vu avant, modifications d'expression des Ig de surface ( dans la phase de maturation dans la MO ). D32 D33 Vrification que malgr l'expression que d'IgD la membrane il y a RI chez le double Tg pas de RI ( tolrance, pas dltion clonale ), chez le Tg crois RI. D34 D35 Rsume les diffrents cas qu'on peut rencotrer dan sle MO 4 rencontre aucun Ag dan sla MO donc exprim et passe dans les OLII 1 LB exprime IgM qui sera ractive vis a vis d'un Ag du soi mort ou editing de son rcepteur ( surtout sur VJ ).

2 LB exprime IgM qui reconnat Ag du soi soluble diminution de l'expression de ces IgM de surface et ne conserve que ces IgD cellules dit anergique ne rponde pas cet Ag ( pas de scrtion d' AC ). 3 LB exprime BCR qui reconnat Ag mais cet Ag ne peut pas faire interagir 2 BCR entre eux pas de transduction du signal donc poursuit son chemin mais devient clone ignorant.

Transduction Du Signal
D36 STM des Ig membranaire trop courte pour induire une rponse donc besoin de molcule pour permettre transduction du signal = Ig alpha et beta. Quand interaction avec Ag recrutement de ces molcules pour induire la rponse. Sur ces molcules il y a des squences ITAM ( Immuno Tyrosine Activated Motif ) dans la partie cytoplasmique. Ce sont ces domaines qui sont P. Le complexe BCR Ig alpha Ig beta se forme dans le RE si Ig alpha et beta ne sont pas associ le BCR ne sera pas exprim la membrane. Quand ITAM va tre P cela va crer un domaine SH2 donc crer site pour la PLC gamma voie des MAP kinase, PKC. D37 Plus il y a de regroupement de BCR par les AG plus la cascade de signalisation est importante. Cas 1 ignorance, interaction trop faible Cas 2 Fab'2 permet regrouper 2 BCR donc petite induction Cas 3 Fab'2 et anti Fab'2 permet formation de groupe importante de BCR donc forte rponse cellulaire D38 Des le stade pr B les Ig alpha et beta sont exprim. Si on fait des souris KO pour Ig alpah et beta les phnomne de recombinaison somatique s'arrte au stade pr B a montre l'importance de ces molcules. Au stade prB expression a la mbn de HC, LC substitutive et Ig alpha/beta. La LC substitutive permet reconnaissance d'Ag qui induisent signalisation intracellulaire joue sur l'expression des gne Rag 1 et 2 qui sont plus exprims + P de Rag 2 donc directement dgrad ( plus de recombinaison somatique, explique exclusion alllique ) + le locus de la HC ne sera plus rendu accessible Rag 1. Si on fait une souris KO pour lambda 5 on trouver LB qui auront deux rarrangements fonctionnels au niveau des Ig. Si LB immature interagi avec Ag membranaire alors signalisation qui vont soit amener limination de ces LB autoractif soit permettre r-expression de Rag pour faire l'editing du rcepteur. Chez les LB qui sont en anergie clonale on a dtecter dfaut de signalisation niveau de P trs trs bas et phosphatase trs fortement exprim bloque passage de l'tat actif inactif.

Questions pos l'examen :

1) Dcrivez l'exprience prsente en cours dmontrant la dltion clonale des LB dans un modle Tg. 2) La dltion clonale est elle la seule issue pour ces LB ? Justifiez.