TUGAS TERSTRUKTUR BIOTEKNOLOGI PERTANIAN

Oleh: Resti Nafisah Putri Holaw Hening Pratiwi Erlyn Polantina Eka Sulistia Rini Nur Setiana Istiqomah A1L111011 A1L111012 A1L111014 A1L111028 A1L111029

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN FAKULTAS PERTANIAN PURWOKERTO 2013

I. PENDAHULUAN

Tanaman papaya (Carica papaya L.) merupakan salah satu tanaman buah tropis yang popular di masyarakat. Pepaya adalah produk hortikultura yang penting karena memiliki nilai ekonomi yang tinggi. Buah papaya dapat disebut buah rakkyat, karena digemari oleh semua lapisan masyarakat Indonesia. Rasanya yang manis, kaya vitamin A dan C, dan mudah diperoleh dengan harga yang terjangkau, serta tersedia sepanjang musim. Produksi papaya di Indonesia cenderung meningkat dari tahun ke tahun hingga mencapai 643.451 ton pada tahun 2006 (Deptan, 2009), laju peningkatan sekitar 14% dari produksi tahun sebelumnya yang hanya mencapai 548.651 ton. Meskipun terjadi peningkatan produksi, saait ini masih banyak kendala yang dihadapi dalam budidaya tanaman papaya. Salah satu kendala tersebut adala papaya yang terserang PRSV. Pepaya ringspot virus (PRSV) adalah patogen virus tanaman yang termasuk dalam genus Potyvirus dan keluarga Potyviridae . Virus ini adalah non-menyelimuti, flexous partikel berbentuk batang dengan ukuran 760-800 nm panjang dan 12 nm. Hal ini ditularkan antara tanaman melalui kegiatan mekanis seperti pemangkasan dan ditularkan oleh ektor yaitu kutu

spesies seperti Myzus persicae. Tidak ada transmisi pada benih yang telah terdeteksi. Ada dua jenis utama dari virus ini yang dibedakan karena genetik dan sekarang dianggap spesies virus yang sama. Jenis virus ini namanya adalah isolat

P Type (PRSV-P). Jenis ini menginfeksi pepaya dan beberapa anggota keluarga melon ( Cucurbitaceae ). Jenis lain, Type W isolat (PRSV-W), tidak menginfeksi pepaya. Isolat PRSV-W melakukan menginfeksi tanaman cucurbits seperti semangka, mentimun, dan labu dan awalnya dikenal sebagai virus mosaik Semangka. Gejala khas dari penyakit yang terserang virus ini adalah Pepaya

menguning, daun distorsi, dan mosaik yang parah. Bintik-bintik berminyak seperti direndam air dan goresan muncul pada batang dan tangkai. Buah akan menunjukkan benjolan dan klasik "ringspot". Dengan mengisolasi parah PRSV juga telah terbukti menyebabkan nekrosis jaringan. Virus ini memproduksi dua jenis badan inklusi terlihat di bawah mikroskop cahaya dengan pewarnaan yang tepat dari strip epidemal. Satu inklusi adalah dimasukkannya khas cylidrical (CI) yang dianggap diagnostik untuk kelompok potyvirus, dan yang lainnya disebut inklusi amorf (AI). Kehadiran keduanya inklusi dapat diagnostik untuk virus ini. Dalam labu, semangka dan lainnya cucurbits, PRSV-W menyebabkan bintik-bintik dan distorsi daun dan buah. PRSV-W dianggap salah satu faktor pembatas dalam pertumbuhan cucurbits di Florida. Kendala lainnya adalah produktivitas yang masih relatif rendah, bentuk atau ukuran buah yang kurang sesuai harapan, masih relatif rendah, bentuk atau ukuran buah yang kurang sesuai harapan, masih belum banyak varietas berumur genjah dengan perawakan pendek, rasa kurang manis, serta belum banyak varietas yang

mempunyai kemampuan beradaptasi terhadap cekaman lingkungan terutama kekeringan dan kegenangan. Salah satu cara menyelesaikan masalah tersebut adalah dengan kegiatan pemuliaan tanaman papaya untuk mendapatkan varietas unggul baru yang mempunyai sifat-sifat yang diinginkan. Tujuan umum pemuliaan tanaman papaya adalah mendapat varietas yang lebih baik dari varietas yang sudah ada. Karakteristik tanaman papaya yang diinginkan berdasarkan idiotype adalah tanaman yang kuat, perawakan pendek dan cepat berbuah, pohon hermaprodit, tidak terbentuknya benang sarikarpeloid (tidak sempurna) atau steril, resisten terhadap serangan hama dan penyakit serta produktivitasnya tinggi. Karakteristik buah yang disukai adalah rasa manis, beraroma lembut, kulit buah halus, daging buah tebal berwarna merah, rongga buah bulat dan shelf-life-nya lama. Mengingat populasi tanaman papaya mempunyai dua tipe penyerbukan yaitu tipe penyerbukan silang dan penyerbukan sendiri, maka strategi pemuliaan tanaman papaya diarhkan membentuk varietas menyerbuk bebas atau menyerbuk terbuka dan varietas hibrida.

II. ISI

A. Asal Donor DNA

Penelitian untuk mengembangkan GE pepaya dengan resistensi terhadap PRS dimulai pada tahun 1985 . Konsep resistensi patogen yang diturunkan atau resistensi parasit yang diturunkan adalah konsep yang digunakan dalam penelitian ini . Konsep ini pada dasarnya menyatakan bahwa tanaman yang mengandung gen ( s ) atau urutan patogen dilindungi terhadap efek merugikan dari patogen yang sama atau terkait erat . Untuk pepaya , pendekatan kami adalah untuk mengembangkan transgenik pepaya dengan protein mantel ( CP ) gen PRSV yang akan melindungi tanaman transgenik terhadap kerusakan yang disebabkan oleh PRSV . Secara singkat , penelitian untuk mendapatkan transgenik pepaya yang terlibat mengisolasi dan sekuensing gen CP dari PRSV dari Hawaii , mengubah embriogenik kalus nontransgenic Sunset pepaya , pepaya komersial di Hawaii. B. Tempat Perbanyakan Asal Tanaman

Resistensi terhadap PRSV ada di Vasconcellea spesies , yang terkait dengan Carica papaya . Namun , persilangan antara Carica papaya dan spesies Vasconcellea tidak subur . Upaya untuk mentransfer gen resistensi diduga ( s ) dengan menyeberangi dari Carica papaya dan spesies Vasconcellea diikuti oleh penyelamatan embrio dan kembali selanjutnya persimpangan dengan Carica papaya telah dicoba , tapi sejauh ini belum dikembangkan untuk tahap budidaya komersial . Upaya untuk memasukkan toleransi terhadap PRS di Carica papaya

telah sedikit lebih berhasil . Beberapa baris PRS toleran telah dikomersialisasikan di Filipina dan dijual secara komersial di Taiwan , dan garis toleran telah dirilis di Florida dan Thailand; garis-garis ini berkembang hanya gejala ringan ketika terinfeksi . PRSV masih bisa tersebar di seluruh kebun garis toleran , karena mereka tidak tahan terhadap virus . Ketika garis-garis toleran yang terinfeksi PRSV , mereka masih mampu menghasilkan tanaman yang baik . Namun, kualitas buah ini toleran terinfeksi umumnya menyebabkan mereka tidak banyak ditanam . Perakitan tanaman dikembangkan cukup luas di Taiwan tetapi belum begitu baik, kemudia dikembangkan lagi di Hawai hingga berhasil> sehingga tanaman ini diperbanyak. C. Metode Memasukan Tanaman

Perakitan pepaya transgenik tahan Papaya ringspot virus (PRSV) dengan mentransfer gen CP dari strain kuat lokal Hawai (PRSV YK) dengan A.tumifaciens. Cara ini dikenal pula sebagai transformasi DNA. Gen dari organisme lain disisipkan ke dalam DNA tanaman untuk tujuan tertentu. Strategi pemuliaan ini banyak mendapat penentangan dari kelompok-kelompok

lingkungan karena kultivar yang dihasilkan dianggap membahayakan lingkungan jika dibudidayakan. Transformasi tanaman yang dimediasi dengan Agrobacterium tumefaciens merupakan metode transformasi tanaman yang paling umum digunakan. A. tumefaciens secara alami menginfeksi tumbuhan dikotil dan menyebabkan tumor yang disebut crown gall Bakteri ini merupakan bakteri gram negatif yang

menyebabkan crown gall dengan mentransfer bagian DNA-nya (dikenal sebagai T-DNA) dari Tumour inducing plasmid (Ti plasmid) ke dalam inti sel dan berintegrasi dengan genom sehingga menyebabkan penyakit crown gall.T-DNA mengandung 2 tipe gen, gen onkogenik yang menyandikan enzim termasuk sintesis auksin dan sitokinin dan membentuk formasi tumor, serta gen yang menyandikan sintesis opin, hasil dari kondensasi asam amino dan gula. Opin dihasilkan dan diekskresikan sel crown gall dan digunakan oleh A. tumefaciens sebagai sumber karbon dan nitrogen. Sementara gen untuk reaksi katabolisme opin, gen yang membantu transfer T-DNA dari bakteri ke sel tanaman, dan gen tansfer konjugatif plasmid, terdapat diluar T-DNA. A. tumefaciens terlebih dahulu melakukan pelekatan pada permukaan sel tanaman dengan membentuk mikrofibril sehingga menyebabkan terjadinya luka pada tanaman yang akan mengeluarkan senyawa fenolik yaitu asetosiringone sebagai respon sinyal. Sinyal tersebut mengaktifkan virA yang merupakan protein kinase untuk mengaktifkan virG dan memfosforilasinya menjadi virG-P. Dengan aktifnya virG-P ini akan mengaktifkan gen-gen vir lainnya untuk mulai bersifat virulen dan melakukan transfer VirD untuk memotong situs spesifik pada Ti plasmid, pada sisi kiri dan kanannya sehingga melepaskan T-DNA yang akan ditransfer dari bakteri ke sel tanaman . T-DNA utas tunggal akan diikat oleh protein VirE yang merupakan single strand binding protein sehingga terlindung dari degradasi. Bersamaan dengan itu, protein virB membentuk saluran transmembran ysng menghubungkan sel A. tumefaciens dan sel tanaman sehingga T-DNA dapat masuk ke sel tanaman. Gen pada T-DNA, yang meliputi gen auksin,

sitokinin dan opin, ikut terekspresi sehingga memacu pertumbuhan sel tanaman menjadi banyak (tumor) Dengan adanya teknologi transformasi yang dimediasi A. tumefaciens ini berperan dalam menghasilkan tanaman transgenik, seperti tanaman tembakau yang tahan terhadap antibiotik tertentu. Resistensi terhadap antibiotik ini didapatkan dari bakteri yang turut menyisip pada T-DNA A. tumefaciens.

Berikut ini adalah skema cara kerja transfer gen melalui A. tumifaciens:

D. Seleks dan Uji Sebelum Tanaman Dilepas

Upaya untuk mengembangkan transgenik pepaya untuk mengendalikan PRSV dimulai tak lama setelah berita tersebar bahwa tembakau transgenik mengekspresikan gen protein mantel virus mosaik tembakau tahan atau menunjukkan keterlambatan dalam gejala berikut inokulasi dengan virus mosaik tembakau .Pada 1986, kloning gen protein mantel PRSV dilakukan. Pada tahun 1988 dimulai transformasi budaya embriogenik pepaya menggunakan pendekatan

Biolistic. Kultivar yang digunakan adalah ' Sunrise ' , ' Sunset ' , dan ' Kapoho '. Namun demikian , menggunakan pendekatan Biolistic untuk mengubah budaya pepaya embriogenik , diperoleh 17 galur tanaman yang berubah. Kemudian segera dilakukan penelitian untuk menguji resistensi dari galur pada tahap R0 dengan menyebarkan setiap baris dan inokulasi klon dengan PRSV HA , strain parah dari Hawaii. Tahun 1991 teridentifikasi satu galur (galur ditunjuk 55-1) yang resisten terhadap PRSV HA diinokulasi rumah kaca. Galur tahan adalah merah - fleshed ' Sunset ' , yang jauh kurang diinginkan daripada kuning - fleshed ' Kapoho ' . Yakin bahwa telah teridentifikasi galur resisten dari pepaya transgenik, maka segera dilakukan uji coba lapangan . Tujuan dari uji coba lapangan awal adalah untuk mengamati perlawanan dalam kondisi lapangan dan untuk menentukan apakah galur resisten tunggal memiliki sifat hortikultura diinginkan. Uji coba lapangan dimulai pada April 1992 di Waimanalo Field Station dari University of Hawaii di pulau Oahu . Hasil dari uji lapangan menunjukkan bahwa semua tanaman nontransgenik terinfeksi sedangkan garis 55-1 tanaman yang resisten . Dalam Puna , upaya besar untuk mengandung PRSV pun dimulai, tetapi virus terus menyebar , meskipun agak lambat pada awalnya . Keuntungan utama dari uji coba lapangan di 1992 Waimanalo adalah bahwa mengembangkan kultivar yang mungkin berguna bagi petani di Puna .Dua kultivar transgenik baru yang dikembangkan - ' SunUp ' dan ' Rainbow ' . ' SunUp ' adalah transgenik Sunset merah berdaging yang homozigot untuk gen protein mantel . 'Rainbow' adalah F1 hibrida kuning - fleshed

dikembangkan dengan menyilangkan ' SunUp ' dan nontransgenic kuning fleshed ' Kapoho '. Seperti disebutkan di atas , ' Kapoho ' adalah berbagai hampir eksklusif tumbuh di Puna. Pada bulan Oktober tahun 1995, uji coba lapangan penting dari ' Rainbow ' pepaya (bersama dengan jumlah yang lebih kecil dari ' SunUp ' ) dimulai di Puna untuk menentukan ketahanan kultivar tekanan virus parah dan untuk memperoleh data hortikultura pada kultivar di Puna , yang meiliki iklim berbeda dari Waimanalo . Hasil menunjukkan bahwa transgenik ' SunUp ' dan ' Rainbow ' yang resisten dan bahwa kultivar ini adalah kualitas komersial . Bahkan , data menunjukkan bahwa ' Rainbow ' menghasilkan sekitar 125.000 pon buah berharga per hektar per tahun , sedangkan nontransgenic 'Sunrise ' (semua yang menjadi terinfeksi oleh PRSV ) menghasilkan 5.000 buah per hektar per tahun. Para petani pepaya di Puna sangat terkesan dengan ' Rainbow ' karena itu kuning berdaging , menghasilkan buah matang beberapa bulan lebih awal dari ' Kapoho ' , dan memberi hasil yang jauh lebih baik daripada ' Kapoho ' . Petani di hawai kemudian cepat menanam benih pepaya transgenik , yang hampir semua ' Rainbow ' karena petani di Puna menyukai jenis kultivar ini . Pemanenan 'Rainbow' dimulai pada tahun 1999 dan penerimaan petani , packer , dan konsumen yang luas . Industri pepaya telah terhindar dari bencana PRSV . Sejak tahun 1992 , ketika virus itu ditemukan di Puna , jumlah emisi tahunan dari pepaya segar dijual dari Puna telah pergi dari 53 juta pound pada tahun 1992 menjadi 26.000.000 pada tahun 1998 . Pada tahun 2001 , produksi pepaya Puna rebound menjadi 46 juta pon pepaya segar pasar . Dampak lain yang penting telah

pengurangan dramatis PRSV inokulum di Puna , karena bidang yang terinfeksi telah digantikan oleh resisten transgenik pepaya , dan karena banyak bidang yang terinfeksi ditinggalkan sudah dihancurkan . Kondisi ini , bersama dengan isolasi bijaksana dan rouging tanaman terinfeksi , telah memungkinkan petani untuk terus memproduksi nontransgenic pepaya , terutama untuk memasok pasar Jepang , yang belum memungkinkan impor transgenik pepaya . Pada bulan Januari 2003 , Kanada mengizinkan impor transgenik pepaya . Namun manfaat lain adalah bahwa pepaya areal telah berkembang di Oahu karena penggunaan PRSV - tahan transgenik ' Rainbow ' ( atau hibrida baru yang telah diturunkan dari ' Rainbow ' ) .

III. PENUTUP

Tanaman transgenic papaya tahan PRSV adalah salah satu upaya menciptakan tanaman yang tahan terhadap PRSV yang pertama kali di temukan di Puna Hawaii yang menyebabkan kehilangan cukup banyak hasil produksi. Salah satu varietas papaya yang tahan PRSV adalah papaya rainbow. Pepaya rainbow merupakan hasil persilangan dari varietas sunup dan kapoho. Varietas sunup merupakan papaya transgenic yang sudah disisipi galur 55-1 yang merupakan galur resisten PRSV. Galur resisten ini pertama kali ditemukan pada varietas sunset merah. Selanjutnya gen galur resiten ini dimasukkan melalui

Agrobacterium tumifaciens yang menginfeksi papaya varietas sunup. Uji lapangan dilakukan sekalligus untuk seleksi tanaman dan terlihat bahwa papaya yang mengandung galur 55-1 lebih tahan terhadap PRSV. Oleh karena itu papaya varietas rainbow banyak ditanam petani di Hawaii dan sekarang sudah diekpor hingga Kanada.

DAFTAR PUSTAKA

Cai, W.Q., Gonsalves, C., Tennant, P., Fermin, G., Souza, M., Sarindu, N., Jan F.J., Zhu H.Y., & Gonsalves, D. (1999). A protocol for efficient transformation and regeneration of Carica papaya L. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant, 35(1), 61-69. Ferreira, S.A., Pitz, K.Y., Manshardt, R., Zee, F., Fitch, M M.., & Gonsalves, D. (2002). Virus coat protein transgenic papaya provides practical control of papaya ringspot virus in Hawaii. Plant Disease, 86(2), 101-105. Fitch, M.M., Manshardt, R.M., Gonsalves, D., Slightom, J.L., & Sanford, J.C. (1990). Stable transformation of papaya via microprojectile bombardment. Plant Cell Reports, 9(4),189-194. Fitch, M.M., Manshardt, R.M., Gonsalves, D., Slightom, J.L., & Sanford, J.C. (1992). Virus resistant papaya derived from tissues bombarded with the coat protein gene of papaya ringspot virus. Bio/Technology, 10, 1466-1472. Gonsalves, D. (1998). Control of papaya ringspot virus in papaya: A case study. Annual Review of Phytopathology, 36, 415-437. Gonsalves, D., & Ishii, M. (1980). Purification and serology of papaya ringspot virus. Phytopathology, 70, 1028-1032. Lius, S., Manshardt, R.M., Fitch, M.M., Slightom, J.L., Sanford, J.C., & Gonsalves, D. (1997). Pathogen-derived resistance provides papaya with effective protection against papaya ringspot virus. Molecular Breeding, 3, 161-168. Manshardt, R.M. (1998). 'UH Rainbow' papaya. Germplasm, G-1. Honolulu, HI: University of Hawaii College of Tropical Agriculture and Human Resources. Tennant, P.F., Gonsalves, C., Ling, K.S., Fitch, M.M., Manshardt, R., Slightom, L.J, & Gonsalves, D. (1994). Differential protection against papaya ringspot virus isolates in coat protein gene transgenic papaya and classically crossprotected papaya. Phytopathology, 84(11), 1359-1366. Tennant, P.F., Ahmad, M.H., & Gonsalves, D. (2002). Transformation of Carica papaya L. with virus coat protein genes for studies on resistance to papaya ringspot virus from Jamaica. Tropical Agriculture (Trinidad), 79(2), 105-113.

Tennant, P., Fermin, G., Fitch, M.M., Manshardt, R.M., Slightom, J.L., & Gonsalves, D. (2001). Papaya ringspot virus resistance of transgenic Rainbow and SunUp is affected by gene dosage, plant development, and coat protein homology. European Journal of Plant Pathology, 107(6), 645-653. Yeh, S.D., & Gonsalves, D. (1984). Evaluation of induced mutants of papaya ringspot virus for control by cross protection. Phytopathology, 74(9), 10861091.