UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO

FACULTAD DE QUMICA

BIOQUMICA EXPERIMENTAL

GRUPO: 6

ACTIVIDAD ENZIMTICA CURVAS TEMPORALES DE ACTIVIDAD ENZIMTICA DE LA LDH DE MSCULO ESQUELETICO DE POLLO

LPEZ PREZ ADRIANA ABIGAIL TIBURCIO DOMNGUEZ IVETTE CARRILLO MENDOZA IVONNE

Objetivos Conocer las caractersticas generales de las enzimas como catalizadores biolgicos. Adquirir la habilidad para medir la actividad de una enzima utilizando un mtodo espectrofotomtrico. Relacionar los distintos parmetros asociados a la medicin de la actividad enzimtica que permiten seguir y evaluar la purificacin de una enzima Hiptesis Si la reaccin catalizada por la enzima LDH en el sentido piruvato a lactato oxida al NADH a NAD+, entonces la absorbancia ir disminuyendo conforme pase el tiempo ya que el NADH absorbe a 340 nm pero no su forma oxidada. Resultados Ocupamos las fracciones F1, F2, F3 de la parte 1 extraccin y precipitacin por salado de la prctica Purificacin de la enzima LDH de msculo esqueltico de pollo. Hicimos varias diluciones a cada fraccin para poder seguir la reaccin catalizada por la LDH, de manera que no fuera ni muy rpida ni muy lenta y pudiramos obtener as una buena tendencia al graficar Absorbancia vs tiempo. Iniciamos con la F3 de la cual tomamos 2 L y 995 L de H20 lo que nos da un factor de dilucin de: FD= 1000 L /2 L = 500 Para la F1 y F2 se tomaron 5 L y 495 L de H2O obteniendo un FD= 500 L /5 L = 100 Preparamos celdas con 600 L de 100mM amortiguador de fosfatos, 36 L de 10 mM piruvato y 291 L agua. Adicionamos a una de ellas 63 de 4 mM NADH, tapamos con parafilm y agitamos, lemos la absorbancia a 340 nm; inmediatamente aadimos 10 L de la F3 tapamos con parafilm, agitamos y lemos la absorbancia. Para el clculo de la actividad enzimtica en cada una de las fracciones realizamos una curva temporal de la actividad enzimtica de la LDH para cada fraccin (figuras 1, 2 y 3).
1 0.9 0.8 0.7 0.6 Abs 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 1.00 2.00 3.00 Tiempo (min)

y = -0.1339x + 0.8536 R = 0.9947

4.00

5.00

Figura 1. Curva temporal de la LDH extrada en la fraccin 1. Actividad total de la LDH en la fraccin 1: ( ( ) ) ( ( ) ) ( )

1 0.9 0.8 0.7 0.6 Abs 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 Tiempo (min) y = -0.1412x + 0.8707 R = 0.9975

Figura 2. Curva temporal de la LDH extrada en la fraccin 2. Actividad total de la LDH en la fraccin 2: ( (
0.9 0.8 0.7 0.6 Abs 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 Tiempo (min) y = -0.1286x + 0.7592 R = 0.9961

) ) (

( )

) ( )

Figura 3. Curva temporal de la LDH extrada en la fraccin 3. Actividad total de la LDH en la fraccin 3: ( ( ) ) ( ( ) ) ( )

Tabla 1. Tabla de purificacin de la LDH de musculo esqueltico de pollo.

Procedimiento Homogeneizado F1 Sobrenadante de la precipitacin con sulfato de amonio 45% F2 Botn obtenido de la precipitacin con sulfato de amonio 70% F3

Proteina total en la fraccin (mg) 11237

Actividad total (mmol/ min) 0.2368

Actividad enzimatica especifica (mmol -1 -1 min mg ) 2.107 x 10

-5

Grado de pureza o veces de purificacin 1

Rendimiento

100

6328.298

0.2497

3.945 x 10

-5

1.872

105.44

2114.043

1.1371

53.788 x 10

-5

25.528

480.194

Discusin Para evaluar de manera cuantitativa el xito de una purificacin de protenas se evalu el rendimiento, que corresponde al porcentaje de actividad biolgica en cada paso de la purificacin, y el grado de pureza a lo largo del proceso. La purificacin debera proporcionarnos una muestra proteica que contuviera solo un tipo de molcula, sin embargo en nuestro ensayo solo pudimos medir la actividad enzimtica de las fracciones extradas por salado con sulfato de amonio, ya que no obtuvimos protena en las fracciones obtenidas por cromatografa de afinidad. Observamos que la absorbancia va disminuyendo conforme avanza el tiempo esto debido a que el NADH es convertido a su forma oxidada NAD+ molcula que no absorbe a 340nm, los valores de actividad van incrementando conforme a las fracciones obtenidas, en F2 es mayor que F1 ya que esta se obtuvo despus de la precipitacin con (NH4)2SO4, y en la F3 se obtuvo una valor mucho ms grande de actividad dado que esta fraccin la obtuvimos del botn que contena mayor concentracin de protena. Un alto grado de purificacin y un bajo rendimiento proporcionan poca protena con la que experimentar, mientras que un alto rendimiento con una baja purificacin deja muchos contaminantes (protenas diferentes de la de inters) en la fraccin y complica la interpretacin de los experimentos, experimentalmente observamos que la fraccin F3 tiene un mayor grado de pureza y mayor rendimiento que en las otras fracciones, sin embargo se esperaba que tuviera un menor rendimiento ya que en estos procesos se tiende a la perdida de protena, este resultado se podra atribuir a que la actividad total de la protena no era nicamente de LDH pura en la fraccin 3.

Conclusin A travs de hacer uso de los criterios principales de la actividad enzimtica y mediante el seguimiento de la concentracin de NADH durante un intervalo de tiempo se logr determinar la actividad de la LDH en las fracciones obtenidas durante el proceso de purificacin. Determinar la actividad de una enzima como es la LDH puede tener relevancia si se tiene una mezcla de isoenzimas y se requiere slo de una de ellas podra saberse que isoenzima se encuentra en una muestra determinada ya que aunque todas tienen actividad de LDH, tienen diferentes afinidades por el lactato y el piruvato. Bibliografa

1. Teijn R. J. 2001. Bioqumica estructural. Ed. Tbar. 1ra edicin. Espaa. 2. Berg, J. M. et al. 2008 Bioqumica. Editorial Revert S. A. 1ra edicin Espaa. 3. Voet. 2006. Bioqumica. Ed. Mdica Panamericana. 3ra edicin. Argentina.