PCR (Polymerase Chain Reaction / Reaccin en Cadena de Polimerasa)

I. Reacciones Bsica Para catalizar la amplificacin, una enzima DNA polimerasa sensible al calor es utilizada y esta enzima necesita ser suministrada con un buffer apropiado, un cofactor o cofactores inico metlicos y desoxiribunicleotidos, dNTPs (Tabla 1). Otros componentes adicionales pueden ser agregados por aplicaciones especficas (es decir, para estabilizar la enzima, manipular la temperatura de desnaturalizacin, etc.). En una reaccin de PCR tpica, los siguientes componentes son mezclados en un tubo de PCR de 0,2 o 0,5 mL y compuestos por 25 100 uL con agua doble destilada. La mezcla de la reaccin se superpone con 3 gotas de aceite mineral (es decir cubrir completamente la superficie de la mezcla con la capa de aceite de 2mm). En el caso de las maquinas de PCR con tapas de calefaccin, el aceite mineral no es necesario.

Cuadro 1. Elementos bsicos de la mezcla de la reaccin para PCR Plantilla de ADN 105 106 molculas de blanco Primer 0.1 M Buffer 10x Se suministra con la enzima MgCl2 1.5mM (si no est incluido en el buffer) dNTPs 100 M para cada molcula de dATP, dCTP, dGTP y dTTP DNA polimerasa estable al 1 2 unidades calor 1.1. Perfil de temperatura para los ciclos de PCR Cualquier PCR esencial envuelve un nmero de ciclos de diferentes temperaturas. Una cuando el molde es desnaturalizado (+94 C); otro cuando los primers son recocidos (hibridizados) por el molde (una gama amplia de posibles temperaturas superiores a los 72 C) y un tercer ciclo trmico donde los primers son extendidos (72 C). Dicho perfil de temperatura es mostrado en la Figura 1.

En los primeros das de la PCR, los tubos son desplazados en tres diferentes baos de agua o bloques de calefaccin que se mantuvieron a diferentes temperaturas. Sin embargo, la automatizacin es rpidamente seguida y la amplificacin ahora convenientemente puede llevar a cabo un ADN por ciclo trmico. Hoy en da, una larga variedad de dichos ciclos estn disponibles (ver Apndice A). Algunos de estos ofrecen la deteccin en tiempo real de la reaccin de amplificacin y ser discutido en su momento. Un tpico perfil de temperatura depende de una variedad de factores como objetivos y, longitudes y composicin de primers y otras variables que se trataran en otras secciones.

Cuadro 2. Ciclo tpico para PCR Dichos ciclos son usualmente repetidos de 25 a 20 veces Desnaturalizacin 94 C, 20s (la desnaturalizacin inicial requiere usualmente ms tiempo(30s) cuando trabajamos con material cromosmico o complejo genmico) Recocin del primer 55 C, 20 30s Extensin del 72 C, extensin por 1 minuto por amplicn de 1000pb primer Extensin final 72 C por 5 minutos (especialmente cuando se amplifica productos largos o cuando el clonamiento del amplicn es considerado)

1.2.

ADN molde Para las muchas diferentes aplicaciones del PCR, existen muchos mtodos diferentes de aislamiento y preparado del ADN molde, sobre todo dependiendo de la fuente del ADN. Esto es importante para notar que el resultado del PCR depende de la calidad e integridad del molde de ADN. Este es recomendable para purificar el molde de ADN usando productos o mtodos que son especialmente asignados para purificar el ADN para usar en PCR (con ms detalle en las Secciones de Protocolo de los Captulos 7 y 8). La cantidad de ADN molde inicial es de crucial importancia en PCR y un error comn es el de aadir demasiado ADN molde para la reaccin de PCR. Generalmente, la cantidad de ADN por reaccin debe ser 104 105 molculas de blanco/molde. Los directorios siguientes (Tablas 3; 4 y 5) pueden servir como una regla general para los diferentes tipos de muestras para cada ADN que es cmodamente amplificado.

Cuadro 3. Directrices para la adhesin de la plantilla de ADN ADN humano 0.5 g 1 x 105 blancos Sangre (humana) 1 L 7.5 x 104 blancos (40ng) Filtro de sangre 2.5mm 105 blancos Guthrie Semen 30 L 3 x 105 blancos (5ug) Levadura 10 ng 3 x 105 blancos ADN de E. coli 1 ng 1.5 x 105 blancos Bacterifago 1 placa 106 blancos

Cuadro 4. Una directriz til para escoger el nmero de copias por molde Nmero de copias ADN de 1Kb ADN de E. coli ADN del genoma iniciales del molde humano 10 0.01 fg 0.05 pg 36 pg 100 0.11 fg 0.56 pg 360 pg 1000 1.10 fg 5.60 pg 3.6 ng 10000 11.0 fg 56.0 pg 36 ng

Cuadro 5. Conversiones molar para los moldes de cidos nucleicos Acido nucleico Talla Pmol/L Moleculas/g ADN de 1 Kb 1000 pb 1.52 9 x 1011 ARNm promedio 1930 b 1.67 1 x 1012 E. coli 5 x 106* 3 x 10-4* 2 x 108# Humano 3 x 109 5 x 10-7 3 x 105# *Pares de bases en genomas haploides #Para genes con copia simple 1.3. Primers Los primers para PCR son cadenas especficas cortas de ADN de cadena simple (ADNss), conocidos como oligodesoxiribonucleotidos u oligmeros. Estos primers estn en el flanco opuesto de la cadena al final del ADN de objetivo. El diseo de estos cebadores es muy importante y es la composicin, secuencia con el molde y la concentracin de los primers lo que juega un papel importante en los resultados de un anlisis de PCR. 1.3.1. Concentracin del primer La concentracin del primer suele ser 0.1 0.5 M en reacciones optimas de tipo estndar. Las concentraciones elevadas del primer (> 0.5 M) pueden causar la acumulacin de productos inespecficos mediante el cebado y sitios inespecficos en el molde (mal cebado). No obstante, los primers suelen estar en exceso con el fin de evitar su agotamiento antes de la finalizacin de la reaccin que pondra en peligro el rendimiento de la amplificacin deseada. Como regla general, 5 pmol de cada primer por cada 25 L de reaccin de PCR, 10 pmol por cada 50 L de reaccin de PCR y 20 pmol por cada 100 L de reaccin de PCR. - Clculos

Con el fin de obtener una molaridad de 0.1 0.5 M, la cantidad molar correspondiente de primer necesitada en una reaccin de 100 L, es 10 50 pmol. Esto es til para disolver la cantidad de oligonucletidos de primer a una concentracin de 10 pmol/L (10 M), permitiendo la adicin del volumen adecuado para la cantidad de primer para la reaccin de PCR (1 - 5 L/ 100 L de reaccin PCR). Despus de la sntesis, la concentracin del oligonucletido del primer puede ser expresada en unidades distintas, segn el fabricante (a menudo en unidades de densidad ptica (OD), y/o in g). Los siguientes valores aproximados son tiles en el clculo de nuestra dilucin requerida de la solucin de primer concentrado.
-

Frmula 1 pmol de 30 mer oligo 1 g de 30 mer oligo 1 OD260 (ADNss)

= = =

10.26 ng 0.0975 nmol 33 g/mL

Ejemplo 1 G (+) es un primer de PCR 23 mer La densidad ptica es medida como 77 OD260 Necesitas usar 10 pmol/100L de reaccin PCR (dilucin adecuada del primer es 10 pmol/L) Usando los valores aproximados, el clculo podra ser:

Frmula: 1 pmol de 30 mer oligo = 10.26 ng Por lo tanto: 1 pmol de 23 mer = 7.87 ng (es decir, menos peso!) Dilucin requerida: 10 pmol/L = 78.7 ng/L = 78.7 g/mL Es decir 77 OD x [OD260 para ADNss] = 77 x 33 g/mL x 1000L. Z = 30.9 L

(M1V1) = (M2V2); 2541 g/mL x Z L = 78.7 g/L x 1000 L. Z = 30.9 L Por lo tanto: 30.9 L de primer concentrado est compuesto por 1 mL rendir una concentracin de 78.7 g/mL = 10 pmol/ L Frmula corta: a/30 x 10.26/33 x 10000/b = L cantidad de la concentracin del primer que podra estar compuesta en 1

mL para rendir 10 pmol/L (donde a es la longitud del primer y b es la concentracin del primer en OD/mL). Ejemplo 2 L (-) es un primer de PCR 24 mer Concentracin es 3.39 g/L Necesitas usar 10 pmol/100L de reaccin PCR Dilucin adecuada del primer es 10 pmol/L Usando los valores aproximados, el clculo podra ser: Frmula: 1 g de 30 mer = 0.0975 Mol Por lo tanto: 1 g de 24 mer = 0.122 Mol (es decir, menos molculas!) Por lo tanto: 3.39 g/L da 0.122 x 3.39 = 0.41 Mol/L =410 nMol/L y 1L dara 410 nMol de primer Una dilucin 41x rendir 10 pMol/L: Por ejemplo: 20 L del primer concentrado est compuesto por 820 L del volumen total Frmula corta: 30/a x 0.0975 x b x 100 = dilucin necesitada para el rendimiento de 10 pMol/L (donde a es la longitud del primer y b es la concentracin del primer en g/L) Ejemplo 3 Cuando pides primers de una compaa, ellos le preguntaran la siguiente informacin: Secuencia (5 - 3) del primer, nmero de nucletidos El tamao de la uita (ejemplo 100nol) Depuracin estndar (ejemplo desalacin estndar o gel purificado) El primer a continuacin se sintetiza y enva a ti de manera liofilizada (frio seco), junto con la siguiente informacin: Peso molecular Contenido de GC

Tm (50mM NaCl) Cantidad de oligo (liofilizado). Este puede ser expresado en OD260, nM y g Solucin madre Tomar como ejemplo la informacin del primer con la siguiente informacin OD260 = 11.7 Molaridad = 51.88 nM Peso = 390 g Si usted hace este primer superior a 1 mL, necesita tener 51.88 nmol/mL o 51.88 Mol/L Solucin de trabajo: Si usted a continuacin diluye la solucin madre 1:5, usted tendra 10 pMol/L

1.3.2. Diseo de los primers El diseo de los primers, ms que cualquier otra cosa, determinar el xito del anlisis de PCR especfica. Los dos primers no estn relacionados entre s, ya que fortalecer a las distintas cadenas y en los extremos opuestos del amplicn de destino. Sin embargo, la atencin especial debe ser tomada para asegurarse que no hay complementariedad significativa en o entre primers y esta pareja de primers son balanceados con respecto a la temperatura de fusin (Tm) Cuando 2 molculas de ADN de simple cadena hibridan, tales como en la recocin del primer de PCR del molde, la estabilidad del dplex depende de la secuencia y nmero de pares de bases asociadas, la concentracin de las especies de ADN, y la concentracin de sales de la solucin. Las cadenas del dplex pueden ser separadas por el calor y la temperatura en los cuales la mitad de las molculas son de cadena simple y la mitad son de cadena doble, es llamada el Tm. Por lo tanto, el Tm determinara la temperatura de recoccin (Ta) en el perfil del ciclo de temperatura y debe adaptarse a ambos primers. Un nmero de otros punteros son tambin de importancia en el diseo de los primers que funcionaran ptimamente, y sern

discutidos brevemente. Todos los criterios pueden ser encontrados en ms casos mediante el anlisis cuidadoso y reflexionado, pero por conveniencia, el diseo de varios software estn disponibles con ms paquetes para el anlisis general de secuencias de ADN.
-

Informacin adicional Los primers pueden contener extensiones 5 o desajustes con el fin de mecanizar dominios especficos dentro del amplicn de PCR. Esto puede ser requerido por una larga variedad de aplicaciones y puede incluir: Restriccin de los sitios enzimticos -3CCATGG+4 (secuencia Kozak para aumentar la traslacin) Secuencias promotoras, potenciadores y otras secuencias reguladoras Desajustes internos por mutagnesis

Cuadro 6. Caractersticas de los primers a) Los primers tpicos para PCR tienen entre 18 28 nucletidos de longitud b) c) d) e) f) g) h) i) j) La composicin G + C debera ser similar a la del amplicn deseado y debera ser en general entre 50 60% La Tm calculada para una pareja de primers debera ser balanceada Regla del pulgar: Tm = 2 (A+T) + 4(G+C) y -1.5C para cada desajuste Una Tm de 55 C 72C es deseada (62 65 C es mejor) Verificar la complementariedad en el extremo 3 del primer par esta inicia al primer artefactos dmeros Evitar una estructura secundaria significativa con primers, es decir secuencias palindrmicas internas Se ejecuta de 3 o ms Cs y Gs en el extremo 3 promoviendo el mal cebado en regiones ricas en G/C Secuencias palindrmicas dentro de los primers deben ser evitadas Evitar una A y especialmente una T en el extremo 3 del primer (esto permite la respiracin en la hibridacin del primer por el molde) Evitar cualquier desajuste potencial en el extremo 3 del los primers

k)

1.3.3. Recocido de primers Las temperaturas de recocido aplicadas (Ta) son usualmente 5 C por debajo del verdadero Tm, pero la temperatura de recocido ptima esta usualmente mayor (5 10 C) que la Tm de los primers. Esta temperatura de recocido ptima es tambin externamente dependiente de la concentracin de sales as como la concentracin de Mg2+ en la reaccin y tiene que ser determinada empricamente. La mayor temperatura de recocido posible permitida por un primer especifico en conjunto podra ser seleccionada dado el aumento de la mejora de la temperatura y reduce la mala extensin. Por lo tanto un rigor alto en la temperatura de recocido asegurara una buena calidad de producto y este debera estar en el rango de 55 72 C. El recocido requerir solo unos pocos segundos en las correctas concentraciones del primer. 1.3.4. Extensin del primer El tiempo requerido para la extensin del primer y la sntesis de toda la longitud del amplicn utilizado, depende de la longitud y la concentracin de la secuencia usada y de la temperatura y de las propiedades de la enzima especfica utilizada. La velocidad del ciclo y las propiedades de los tubos tambin se utiliza como influyente, como ms tarde se discutir. Extensin de la temperatura 72C est cerca de la temperatura ptima de trabajo de la mayora de polimerasas estables al calor Las tasas de incorporacin varan entre 35 a 100 nucletidos por segundo y por lo tanto, como un indicador general, 1 min a 72 C es suficiente para productos de 2kb Ciclos ms largos pueden ser tiles, sobre todo desde el principio si la concentracin de sustrato es muy baja y ms tarde cuando la concentracin de producto excede la concentracin de enzima. Un ciclo largo anterior (por ejemplo, 10 min a 72 C) es til para garantizar que todas las copias amplificadas son de larga duracin

1.3.5. Degeneracin del primer En ocasiones, la secuencia de nucletidos exacta del ADN objetivo de la plantilla no se sabr y la secuencia tiene que ser deducida de la secuencia de aminocidos. Para habilitar dichas plantillas de ser amplificado por PCR, primers degenerados se pueden utilizar. Estas son en realidad mezclas de varios primers cuyas secuencias difieren en las

posiciones que corresponden a las incertidumbres en la secuencia de la plantilla. 1.3.6. Diseo y pautas de uso Evite degeneraciones en los ltimos tres nucletidos en el extremo 3 'del primer Si es posible, utilice Met o tripletes Trp para la codificacin en el extremo 3 ' Para aumentar la eficiencia de la unin en la plantilla del primer, reducir la degeneracin permitiendo los desajustes entre el primer y la plantilla, especialmente hacia el extremo 5 '(por lo tanto permiten primer recocido a una menor Tm ptima). Una vez ms, evitar el desajuste en el extremo 3 ' Diseo de cebadores con menos de la degeneracin de 4 veces en cualquier posicin dada Aumentar la concentracin de los cebadores de 1 / M 1.3.7. Almacenamiento de los primers Los oligonucletidos son qumicamente estables. Izquierda seca, que debe ser bueno por muchos aos. Una vez hidratados, son susceptibles a la degradacin por nucleasas. Si se maneja correctamente, debe ser estable durante aos. Cualquier oligonucletido de ADN pueden ser degradados por nucleasas microbianas o de punta de los dedos. Los primers deben almacenarse en agua desionizada o soluciones buffer que contengan EDTA y mantenerse congelados cuando no se usan. Prepare una solucin de caldo concentrado en agua o TE (10 mM Tris pH 8,0; 1mM EDTA). Una accin conveniente puede ser de 100 mM, almacenado a 20 C Aconsejamos que las soluciones madre se distribuyan en varios tubos para el almacenamiento a largo plazo por lo que la contaminacin accidental de un tubo no dar lugar a la prdida de la sntesis de todo. 1.3.8. Ejemplo de formulacin del primer Haga liofilizado de primer hasta un volumen conveniente para contener 50 nmol de primer (vase la Seccin 2.3.1.5, ejemplo 3)

Disolver 50 nmol de primer en 500 L TE para hacer una solucin 100 mM de valores Diluir 1:10 de esta poblacin en agua estril para preparar una solucin de trabajo en 10 M para su uso en las reacciones de PCR Aadir 1 L del primer 10 M a 20 L de reaccin de PCR resultara una concentracin final de primer de 0,5 M, o 10 pmol de primer en 20 L de volumen.

1.4.

Buffer y componentes Un buffer que proporciona la fuerza inica y la capacidad de amortiguacin durante la reaccin es necesaria y estos aspectos del ambiente inico en la PCR son crticos El buffer estndar es generalmente 10 a 50 mM Tris-HCl (pH 8.3 a 8,8), y hasta un 50 mM de KCl se pueden incluir para facilitar el recocido del primer Otros buffers utilizados en aplicaciones especficas pueden incluir NaCl (permite una mejor desnaturalizacin de moldes ricos en GC) o sulfato de amonio (puede limitar artefactos debido a la amplicones incompletos) La adicin de DMSO puede ser til cuando amplificas varias secuencias en la misma reaccin (reducir la estructura secundaria del ADN objetivo), pero generalmente no se recomienda debido al efecto inhibitorio sobre la enzima La gelatina, albmina de suero bovino (BSA), formamida o Triton X 100 puede ser incluido en el buffer de almacenamiento de la enzima por algunos fabricantes para estabilizar la enzima Concentracin de Magnesio La concentracin de los co-factores esenciales, MgCl2, puede tener un efecto particularmente profundo en la especificidad y el rendimiento de la PCR. La concentracin de Mg2+ afecta a la reaccin distinta en concentraciones bajas o altas y es influyente en trminos de especificidad y el rendimiento de la reaccin de amplificacin. Mg2+ forma complejos solubles con los bloques de construccin dNTP para que estn disponibles y reconocibles como sustrato para la enzima La concentracin de Mg2+ libre se determina por la presencia y concentracin de agentes quelantes como el EDTA, pirofosfatos libres, y los dNTP

1.5.

Los siguientes factores generales se deben tener en cuenta: Lo mejor es determinar la ptima concentracin de Mg2+ empricamente para cada ensayo de PCR Los PCR deben contener 0,5-2,5 mM de Mg2+ y el ms utilizado Mg2+ (concentracin es de 1,5 mM, cuando los cuatro dNTP estn presentes en 200 mM cada uno) de ADN, dNTPs y las protenas se une a Mg2+ El total de [Mg2+] = (obligado + libres) [Mg2+] Libres [Mg2+] deben ser igual al [dNTP] La presencia de EDTA, la hemoglobina, la heparina y otros quelantes en la mezcla de reaccin de PCR pueden influir en la aparente [Mg2+] Es preferible que las muestras de sangre se recogieron en presencia de citrato. La segunda mejor es la sangre con tubos de EDTA, tubos de heparina, pero nunca debe ser utilizado. El auto ajuste de buffers de magnesio que se ajustan automticamente a la concentracin de Mg2+ a travs de la reaccin de PCR tambin se puede utilizar. El llamado "reformulada" Mg2+ concentracin es de 2,0 mm Mg2+ puede ser utilizado en caso necesario La concentracin de Magnesio puede influenciar Primer recocido Temperaturas de disociacin de las hebras Especificidad de los productos Formacin de los artefactos dmero del primer Actividad y fidelidad enzimtica dNTPs Una accin de trabajo con 10 mM de cada dNTP (pH 7,0) se recomienda y una concentracin final de reaccin entre 20 y 200 M cada uno (sobre todo dependiendo del tamao del amplicn, [Mg2+]), dan como resultado un equilibrio ptimo en el rendimiento, la especificidad y la precisin. Esta molaridad representan un exceso suficiente para permitir la concentracin de dNTPs mantendr prcticamente constante durante toda la reaccin. Concentraciones ms altas de dNTP conducen a una disminucin en la especificidad y fidelidad de la PCR. Es importante que los dNTP se deban utilizar en concentraciones equivalentes (es decir, debe ser equilibrado) con el fin de minimizar los errores misincorporation. En general: 200M de cada dNTP por cada amplicn de 2kbp / 2 a 30 ciclos de amplificacin.

1.6.

1.7.

Enzimas y concentraciones enzimticas La concentracin de la polimerasa recomendada generalmente es de 1 a 2,5 unidades por cada 100 L de volumen de reaccin (ms a menudo se suministra como 5U/L). Esto representara el equivalente molar comparativamente bajo de 1 a 2,5 nM, en relacin con todos los componentes de la reaccin de otros. Esta concentracin lmite asegura la fidelidad ya la enzima da mayor resultado en concentraciones en los productos de fondo no especfico. Al utilizar otros aditivos en las reacciones, sus efectos sobre la enzima deben tenerse en cuenta. Por ejemplo el glicerol aumenta la estabilidad trmica de la enzima, pero reduce la Tm. DMSO tambin reduce Tm pero reduce la estabilidad trmica de la enzima (reducido Tm permite bajar la temperatura y por lo tanto menos dao del ADN). La polimerasa es una molcula compleja con tres actividades: una actividad polimerasa 3'-5, una actividad exonucleasa 5'-3 (actividad de revisin) y una actividad exonucleasa 5'-3'. Estas actividades de la enzima polimerasa se muestran en las Figuras 2 (a - c) 1.7.1. Fidelidad de la polimerasa La fidelidad de la polimerasa se ve influenciada por mltiples factores, incluyendo: La tendencia de una polimerasa para insertar el nucletido incorrecto La presencia de una correccin de la actividad exonucleasa 5' - 3'que puede eliminar los desajustes La facilidad con que los desajustes se pueden extender ADN polimerasas clsicas como T4, T7 y polimerasas Klenow tienen actividad de correccin de pruebas 3'-5', pero la ADN polimerasa original Taq no tiene esa capacidad (vase el cuadro 7 para una comparacin de la fidelidad de la polimerasa). Sin embargo, varios tipos de enzimas termoestables, entre ellos algunos con capacidades de correccin de pruebas 3 - 5' ya estn disponibles. Algunos ejemplos de enzimas diferentes comercializado por Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, se muestran en las Tablas 7, 8 y 9

Figura 2a) ADN polimerasa con actividad polimerasa 5 3 Manera de polimerizacin en direccin de 5 a 3 (es decir, leyendo la cadena complementaria en direccin 3 a 5 del sitio de cebado

Figura 2b) ADN polimerasa con actividad exonucleasa 3 5

Figura 2c) ADN polimerasa con actividad exonucleasa 5 3

Cuadro 7. Comparacin de los errores de polimerizacin por polimerasas clsicas y ADN polimerasas termoestables Taq Tipo de ADN polimerasa Tasa de error (errores/nucletidos) T4 1/80000 T7 1/60000 Klenow 1/160000 Taq 1/9000 (es decir 1 error cada 400 nt despus de 30 ciclos Cuadro 8. Procedencia de las polimerasas 1) ADN polimerasa Taq es originalmente aislada de la bacteria termoflica Thermus aquaticus BM y es ahora principalmente suministrada como una protena recombinante, producida en E. coli 2) La ADN polimerasa Pwo es tambin suministrada como protena recombinante en E. coli y fue clonada de la bacteria hipertermoflica Pyrococcus woesi (Una arqueobacteria) 3) La ADN polimerasa Tth es aislada y purificada de la bacteria termoflica Thermus thermophilus spec.

Muchas otras enzimas termoestables se descubren regularmente. Las enzimas termoestables, aunque tolerante a altas temperaturas, tienen un nmero limitado de medio activo de la vida dictadas por el tiempo que estuvieron expuestos a altas temperaturas Cuadro 9. Comparacin de las enzimas de PCR ADN 5-3 3-5 Procesividad Longitud polimerasa exonucleasa exonucleasa (pb) del (i) amplicn (kb) (ii)

Tasa Rendimiento a lo de largo del molde error de PCR (106) (iii) Para 2 - 3 - 10 2 5 15 30 26 3.2 30 ++ ++ ++ (+) (+) (+) -

Taq Pwo Tth

+ +

+ -

50 20 30 50

3 3 3

i. Procesividad: nmero de pb que pueden ser aadidas a una copia por una molcula de polimerasa antes que esta caiga en el molde ii. Longitud del amplicn: Longitud del fragmento de PCR que puede ser amplificado por un molde de ADN del genoma humano con buenos resultados iii. Tasa de error por pb calculada por el anlisis Lacz. (Ver referencia 1 para detalles) 1.8. Tiempo de desnaturalizacin y temperatura Las hebras de ADN de la plantilla amplicn se suelen disociar totalmente el plazo de 20-30 minutos a 94-95 C, donde esta desnaturalizacin es proporcional a la temperatura. Es posible que en determinadas condiciones (por ejemplo, el molde muy rico en G-C) es apropiado utilizar altas temperaturas de desnaturalizacin a fin de garantizar la desnaturalizacin completa y evitar la renaturalizacin del ADN rpida o "snap-back". Una consideracin importante al seleccionar el tiempo de desnaturalizacin y la temperatura es, sin embargo, la vida media limitada de la Taq

polimerasa a estas temperaturas elevadas. Por lo general la vida media de este tipo de enzimas es aproximadamente el siguiente: 72h (92.5 C) 40min (95 C) 5min (97.5 C)

1.9.

Ciclos Cita: "Si tiene que pasar ms de 40 ciclos para amplificar un gen de copia nica, hay algo seriamente mal con su polimerizacin en cadena" - Kary Mullis. De hecho, los demasiados ciclos aumentan la cantidad y complejidad de los productos de fondo no especficos. Normalmente, el nmero ptimo de ciclos que garantice una buena PCR es entre 25 y 30. En determinados casos excepcionales (por ejemplo, un nmero muy pequeo de las molculas de DNA de la blanco), el nmero de ciclos a menudo es mayor a 35 o superior. Un resumen de la salida de amplificacin en un nmero diferente de ciclos se da en la tabla 10.

Cuadro 10. Terica salida de amplicones despus de diferentes nmeros de ciclos de PCR Nmero de ciclos Copias puestas Salida de amplicones 1 1 2 10 1 103 20 1 1 x 106 30 1 1 x 109 Despus de 30 ciclos tericamente esperara 1x109 copias, pero en realidad slo 1x106 copias se generan porque el proceso no es 100% efectivo (ver seccin 11). En cuanto a nmero de entrada de copia, a continuacin se ofrece una gua general para el nmero de ciclos necesarios para una reaccin de PCR en particular. < 100 copias puestas 50@ 1000 copias puestas 40@ >1000 copias puestas 25 30@ 1.10. El efecto meseta Con el fin de obtener el mejor rendimiento de la PCR en un sistema dado

Las concentraciones de componentes de reaccin debe ser optimizado Los tiempos de ciclo se debe optimizar La temperatura debe ser optimizada

Sin embargo, aun cuando la reaccin es ajustada, la acumulacin logartmica de amplicones es posible solamente para un nmero limitado de ciclos. La disminucin de esta tasa exponencial de la acumulacin de producto que se conoce como el efecto meseta (Figura 3). La aplicacin de la PCR est en la fase logartmica, donde el aumento constante (2, 4, 8, 16, 32) del nmero amplicn es evidente (es decir, el poder de la PCR). Cuando el aumento del nmero de copias amplicn no est ms en la fase logartmica (debido a la inhibicin o limitaciones reactivo), la acumulacin de amplicones entrar en la fase estacionaria o de meseta. Los siguientes factores pueden influir en la meseta Utilizacin y agotamiento de los sustratos (dNTP, cebadores, plantilla) Reduccin del rendimiento desnaturalizacin La ineficiencia del recocido del primer Estabilidad de los reactivos (dNTP, enzima), la inactivacin trmica y la limitacin de la concentracin de enzima. Fin de la inhibicin del producto (pirofosfato, dplex de ADN) Nuevo producto de asociacin La competencia por los reactivos de los productos no especficos, los productos no especficos puede seguir para amplificar preferentemente

La meseta es inherente a la PCR y no puede ser evitado. El exceso de sustrato, una de las principales razones para el inicio de la fase lineal/estacionaria es, afortunadamente, tambin es un indicador del xito de la PCR. Reacciones mltiples se pueden configurar en los casos donde se requiere una gran cantidad de amplicones de PCR.

Figura 3) El efecto meseta en PCR A pesar de las diferentes cantidades puestas del molde de ADN, las muestras A y B producir casi la misma cantidad de producto despus de 30 ciclos de PCR. II. Optimizacin de una aplicacin de PCR Algunas empresas comerciales tambin ofrecen un kit de optimizacin de PCR que se puede utilizar para simplificar el procedimiento de optimizacin de PCR. Adems, los enfoques tales como la PCR touchdown tambin ofrece optimizacin OneStep simple de las reacciones de PCR que se espera ser la ptima con respecto al texto bsico / homologa plantilla. Como regla general, sin embargo, ninguna de PCR que se convertir en un ensayo establecido en el laboratorio debe estar debidamente optimizada por un mtodo de titulacin. Nos gusta recomendar un protocolo ms til simplificado para la optimizacin de PCR, basada en un conjunto de mtodos que se aplican ampliamente los ensayos de desarrollo para el diseo de procesos industriales, son llamados los mtodos de Taguchi. 2.1. Mtodo Taguchi para la optimizacin de PCR

Con el uso de los mtodos de Taguchi, el rango de condiciones ptimas para cualquier ensayo de PCR dado se puede obtener en una fraccin del nmero de reacciones necesarias para optimizar las diferentes variables en un bloque de titulacin clsica. Si, por ejemplo cuatro variables diferentes (dNTP, Mg2+, primer, enzima) se prueban en tres concentraciones diferentes cada uno, la titulacin tendra 81 reacciones. Sin embargo, utilizando los mtodos Taguchi, slo 9 reacciones son necesarias. En este mtodo, el nmero de reacciones (E) se calcula a partir de E = 2k + 1, con k es el nmero de variables a analizar. Con un creciente nmero de variables a analizar, la reduccin en el nmero de reacciones que se realizan cada vez ms drsticas. Para 8 variables, 6561 reacciones tienen que ser probados en la titulacin de bloque, pero slo 17 reacciones son necesarias con el uso del mtodo de Taguchi. En el mtodo de Taguchi, las variables a analizar estn dispuestas en una matriz ortogonal (Cuadro 11). En esta matriz, cada columna representara una de las variables y cada fila representa una reaccin especfica (tubo de PCR). Cuadro 11. Anlisis Taguchi para PCR Reaccin Variable 1 Variable 2 Variable 3 Variable 4 (tubo) 1 A A A A 2 A B B B 3 A C C C 4 B A B C 5 B B C A 6 B C A B 7 C A C B 8 C B A C 9 C C B A Cada uno de los elementos mviles ahora se aadir a la reaccin a una de las tres diferentes concentraciones seleccionadas. Los tres valores de concentracin deben ser seleccionados con el fin de estar dentro del intervalo de concentraciones que pueden ser ms influyentes en la reaccin, y debe ser lo suficientemente separados para permitir la determinacin de sus efectos en la reaccin. El siguiente es un ejemplo de las concentraciones de seleccionados para un ensayo de PCR dado.

Cuadro 12. Ejemplo de variables y concentraciones para ser probados A B C Primer: (pM) 7.5 15 30 MgCl2: (mM) 0.5 1.5 3 dNTPs: (M) 50 100 200 Enzima: (U) 0.5 2 5 Usando este mtodo, el nmero apropiado de las reacciones pueden ser montados de acuerdo a la matriz de Taguchi (por ejemplo en el cuadro 11) y el uso de las variables pre-seleccion y concentraciones (para el ensayo de PCR especfica. Las variables ms comunes que por lo general se debe optimizar primero son: Temperatura de recocido Concentracin de Mg2+ Concentracin del primer Concentracin del molde

Este mtodo para la optimizacin inicial de las reacciones de PCR ofrece flexibilidad en la optimizacin de la interaccin entre los componentes clave de la reaccin y puede ser modificado y ajustado para adaptarse a cualquier aplicacin de la PCR especfica.