INSTITUTO TECNOLGICO DE TUXTLA

GUTIRREZ
DVSN DE ESTUDOS DE POSGRADO E
NVESTGACN
MAESTRA EN CENCAS EN NGENERA BOQUMCA
BORRADOR DE TESS
Evaluacin in vitro del potencial probitico de
bacterias cido lcticas aisladas de una
bebida fermentada autctona de Chiapas
PRESENTA:
JORGE LUS GONZLEZ ESCOBAR
TUXTLA GUTIRREZ CHIAPAS A 11 DE FEBRERO DEL 2013
ndice
Captulo !"#$ina
I% A&t'act.i
II% A$'adeci(iento.....,,,,,,,..ii
III% "u&licacione...iii
I)% ndice..i*
)% Lita de Ta&la..*
)I% Lita de +i$u'a...*i
)II% Lita de a&'e*iacione....*ii
,% Int'oducci-n.....1
.% Antecedente.5
2.1 Probiticos
2.1.1 Efectos de los probiticos en la salud
2.1.2 Fuentes de aislamiento e identificacin
2.1.2.1 Taberna fuente potencial de cepas probiticas
2.2 Bacterias cido lcticas (BAL)
2.2.1 Metabolismos de azcares
2.2.2 Produccin de exopolisacridos
2.2.3 Actividad proteoltica
2.2.4 Produccin de sustancias inhibitorias
2.3 Criterios de seleccin de los probiticos
2.3.1 Supervivencia bajo condiciones gastrointestinales
2.3.2 Reduccin del colesterol mediante la desconjugacin de las
....sales biliares
2.3.3 Actividad antimicrobiana
2.3.4 Propiedades de adherencia y estimulacin inmunolgica
2.3.5 Habilidad para fermentar diferentes carbohidratos
/% O&0eti*o
3.1 Objetivo general
3.2 Objetivos especficos
1% 2ate'iale 3 (4todo
4.1 Microorganismos
4.2 Seleccin de los microorganismos
4.2.1 Evaluacin de las caractersticas de crecimiento
4.2.2 Determinacin de la supervivencia de las BAL bajo condiciones
gastrointestinales simuladas
4.3 Pruebas in vitro de la caracterizacin metablica de las BAL
4.3.1 Desconjugacin del taurocolato de sodio
4.3.2 Produccin de cido lctico y cido actico
4.3.3 Actividad antimicrobiana contra patgenos
4.3.3.1 Evaluacin de crecimiento de los patgenos
4.3.3.2 Preparacin de los sobrenadantes
4.3.3.2 Evaluacin de actividad antimicrobiana en placa
4.3.3.3 Evaluacin de actividad antimicrobiana en caldo
4.3.4 Cuantificacin de exopolisacridos
4.3.5 Capacidad para fermentar diferentes carbohidratos
4.4 Anlisis Estadsticos

5% Reultado
5.1 Evaluacin del crecimiento de las bacterias cido lcticas
5.2 Supervivencia de las bacterias cido lcticas en condiciones
.gastrointestinales simuladas
5.3 Capacidad de desconjugacin de sales biliares
5.4 Produccin de cido lctico y cido actico
5.5 Actividad antimicrobiana contra patgenos
5.6 Produccin de exopolisacridos
5.7 Capacidad para fermentar diferentes carbohidratos
5.8 Anlisis Clster
6% Concluione
7% 8utu'a lnea de in*eti$aci-n
9% Re+e'encia
Ap4ndice
II Antecedente
.%, "'o&i-tico
Los probiticos se definen como "microorganismos vivos que, cuando se
administran en cantidades adecuadas, confieren un beneficio a la salud del
husped" (FAO/OMS, 2002). A travs de los aos, muchas especies de
microorganismos han sido utilizadas y no solo consisten en bacterias cido
lcticas (Lactobacilos, Estreptococos, Enterococos, Lactococos, Bifidobacterias),
sino tambin se han incluido los Bacillus y algunos hongos, tales como
Saccharomyces y Aspergillus.
Algunas especies de Lactobacillus y Bifidobacterium ya han sido
establecidas en el mercado como cepas probiticas, se incluyen L. acidophilus, L.
delbrueckii subsp. bulgaricus, L. casei, L. fermentum, L. plantarum, L. reuteri, B.
infantis, B. breve, B. animalis, B. adolescentis y B. longum. Estas bacterias son
sometidas a un proceso de seleccin, evaluando su capacidad de resistir las
condiciones gastrointestinales y adherencia a la mucosa de las clulas epiteliales
intestinales (Jacobsen et al., 1999). Dentro del proceso de seleccin tambin se
evala la existencia de actividades funcionales que permiten a las cepas modular
funciones fisiolgicas en el husped y ejercer efectos saludables.
El mercado de los probiticos en el mundo se encuentra en expansin y
presenta una de las mayores tasas de crecimiento dentro del mercado global de
los alimentos funcionales (Saxelin, 2008). El nmero de nuevos productos con
probiticos aumenta cada ao y el principal sector asociado al uso de probiticos
sigue siendo el de los productos lcteos. Sin embargo, los progresos de la
microbiologa y la tecnologa de alimentos, y en particular los procesos de
microencapsulacin estn permitiendo la incorporacin de estos microorganismos
a productos tan variados como jugos, helados, cereales, mayonesas, chocolates y
galletas.
.
.%,%, E+ecto de lo p'o&i-tico en la alud
Varias especies de Lactobacillus han sido cientficamente establecidas y/o
clnicamente probadas en cuanto a sus efectos a la salud, tales como la reduccin
y la prevencin de la diarrea, la mejora del equilibrio microbiano intestinal debido a
la actividad antimicrobiana, la prevencin de alergias a los alimentos y el aumento
del potencial inmune (McFarland, 2000; Andersson et al, 2001). Algunos estudios
han demostrado que ciertas cepas de Lactobacillus poseen actividad antioxidante
(Kaizu et al, 1993; Kullisaar et al, 2002). La cual les permite disminuir el riesgo de
acumulacin de especies reactivas del oxgeno en el husped, y que
posteriormente podran ser utilizadas en suplementos alimenticios para reducir el
estrs oxidativo. En un estudio realizado por Kullisaar et al., (2002), demostraron
que la cepa Lactobacillus fermentum ME-3 (DSM 14241) tiene un alta actividad
antimicrobiana y antioxidante. Por su parte Anderson y Gilliland (1999), reportaron
que el consumo de leche fermentada con Lactobacillus gener una reduccin del
colesterol en los seres humanos.
Algunos probiticos como L. acidophilus y L. casei producen lactasa en el
intestino delgado, enzima que hidroliza la lactosa a glucosa y galactosa,
permitiendo la fcil absorcin por la mucosa intestinal y revertiendo la
sintomatologa tpica de la mala absorcin de azcares. As mismo, L. acidophilus
ha sido reportado que es capaz de aumentar la inmunidad del husped, mediante
la estimulacin de la produccin de anticuerpos en el intestino (Ajmal et al., 2009).
En el caso de la gastritis crnica provocada por la actividad de Helicobacter pylori,
se ha demostrado que L. salivarius tiene un efecto inhibidor sobre la proliferacin
de este patgeno debido a la alta produccin de cido lctico. En otra
investigacin con L. acidophilus result que este microorganismos es capaz de
reducir los sitios de unin de H. pylori en la pared celular del intestino infectado
(Ajmal et al., 2009).
En cuanto a las Bifidobacterias, estn relacionadas a la sntesis de las
vitaminas, la inhibicin de bacterias productoras de gases y la estimulacin del
sistema inmune (Mitsuoka, 1992). Tambin han sido asociadas con el tratamiento
de la diarrea viral (incluyendo la diarrea por rotavirus), la prevencin de la diarrea
de los viajeros, la modulacin de la flora intestinal (Marteau et al.,1990), la
modulacin de la respuesta inmune (Link-Amster et al., 1994), la mejora de
estreimiento y el alivio de los sntomas de la dermatitis atpica en los nios.
Estudios experimentales en ratones alimentados con Bifidobacterias han
demostrado tambin un menor nmero de tumores inducidos qumicamente en el
intestino grueso (Koo y Rao, 1991).
.%,%. 8uente de aila(iento e identi+icaci-n
Los probiticos generalmente se han aislados de la flora normal de los
humanos (boca, tracto intestinal y aparato reproductor femenino) y de muchos
animales. (Marathe et al., 2009). Sin embargo, la importancia que han adquirido
los probiticos en los ltimos aos ha incrementado su demanda, por esa razn se
ha optado por la bsqueda de nuevas fuentes alternas para su obtencin, as
como el inters de usar BAL aisladas de productos fermentados naturalmente
(Nawaz et al., 2011).
Alvarado et al., (2006) trabajando con el pulque, tepache y una solucin
madre del vinagre, aislaron bacterias del gnero Lactobacillus y Lactococcus, e
identificaron que estos microorganismos tenan actividad antimicrobiana contra E.
coli, Staphy. aureus y L. monocitogenes. Soda et al, (2003) realizaron estudios
con la leche cruda y fermentada, el queso, la nata y la mantequilla, de donde
aislaron bacterias del gnero Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococus y
Enterococcus. A estas bacterias se le identificaron caractersticas con potenciales
probiticos debido a su alta produccin de cido lctico, produccin de
exopolisacridos, actividad proteoltica y actividad antimicrobiana. As mismo, en
estudios que se realizaron a los granos hmedos del destilado de trigo en Suecia,
se identificaron Lactobacillus con atributos probiticos debido a sus caractersticas
fisiolgicas como la supervivencia a pH de 2.5 en jugos gstricos sintticos y en
presencia de sales biliares, capacidad de crecer a temperaturas de 54C,
capacidad de adherencia a la mucosa y la utilizacin de una variedad de
carbohidratos para su crecimiento (Pedersen et al., 2004). En bebidas
fermentadas tradicionales de Nigeria como el Nono (yogurt con harina e hierbas),
la Fura (bebida lctea con bolas de harinas y especias) y el Ogi (bebida alcohlica
fermentada de sorgo, mijo y maz), se identificaron bacterias del gnero de
Lactobacillus y Leuconostoc, la caracterstica principal de estos microorganismos
fue la produccin de EPS (Bukola et al., 2008).
Los estudios anteriores demuestran que los productos fermentados
naturalmente son una excelente fuente para aislar cepas con potenciales
probiticos, por esa razn se especula que las BAL encontradas en la taberna y
reportada por Alcntara et al. (2010), podran tener caractersticas probiticas.
.%,%.%, Ta&e'na: +uente potencial de cepa p'o&i-tica
La taberna es una bebida alcohlica tradicional del sureste de Mxico
obtenida a partir de la palma de coyol (Acrocomia aculeate) (Alcntara et al.,
2010). Esta bebida se produce por la fermentacin de la savia del tallo de la palma
adulta previamente derribada, al cual se le hace un canal en el pice del tallo,
donde acumula un lquido que al fermentarse produce un vino de consistencia
espesa y blanca. Este proceso se realiza durante cinco das a la intemperie, entre
los meses de Febrero y Marzo en condiciones no controladas (Balick, 1990;
Rodrguez et al., 2011).
Al consumo de la taberna se le han atribuido algunas propiedades
medicinales, entre las cuales destacan su capacidad desinflamante, cicatrizante
de ulceras estomacales, laxante, e incluso es recomendada como parte del
tratamiento de vesculas y prstata (Rodrguez, 2011). As mismo, se le suman
efectos de debilitamiento de las piernas, al grado de quien ingiere la bebida no
puede sostenerse en pie aun cuando se sienta sobrio, esta es una caracterstica
muy peculiar de esta bebida alcohlica.
De la taberna se han aislado microorganismos que participan durante la
fermentacin, evidenciandose la presencia de bacterias cido lcticas (Alcntara
et al., 2010). Estos microorganismos podran ser los responsables de algunos
atributos de la taberna, tales como el aroma, el sabor, la consistencia, la acidez y
el pH caracterstico, sin olvidar las propiedades medicinales que la caracterizan.
Muchas de las bacterias cido lcticas (BAL) estn reportadas como probiticos
(Zourari et al., 1991; Broadbent et al., 2003; Parada et al., 2007; Badel et al.,
2011). Sin embargo es importante mencionar que cada cepa es especfica, es
decir, que una cepa determinada ejerce alguna propiedad o atributo especifico.
Por lo tanto, antes de usarlas se requiere una evaluacin cuidadosa de la
funcionalidad de cada una de las nuevas especies o cepas de BAL.
.%. ;acte'ia #cido l#ctica <;AL=
El trmino BAL se aplica a diversos microorganismos cuya caracterstica
comn es la capacidad de producir cido lctico como producto final de la
fermentacin de los carbohidratos. (Parada et al., 2007). Sin embargo, estas
bacterias tienen otras caractersticas en comn como la actividad proteoltica, la
produccin de exopolisacridos y la produccin de sustancias inhibitorias. Las BAL
juegan un rol importante en la salud y bienestar humano y animal. Representan a
los microorganismos ms ampliamente utilizados como cultivos iniciadores en la
industria y cultivos probiticos en la produccin de varios productos alimentarios
como queso, yogurt, carnes fermentadas, pescados y vegetales, as como
inoculantes para ensilados
Estas bacterias requieren de medios nutricionalmente complejos para su
crecimiento, con aminocidos, pptidos, derivados de cidos nucleicos, vitaminas,
sales, cidos grasos y carbohidratos fermentables. El medio de cultivo ms
empleado para su crecimiento es el medio De Man, Rogosa y Sharpe (MRS),
donde despus de 24 h de incubacin a 37C forman colonias pequeas y lisas de
1 a 2.2 mm de dimetro, de color blanco y convexa. Este medio facilita el
crecimiento de las BAL, incluso de las especies ms exigentes, como
Lactobacillus brevis y Lactobacillus fermenti (Zahoor et al., 2003; Marathe et al.,
2009).
Son microorganismos Gram positivos y catalasa negativa. Tiene forma de
cocos o bacilos con un tamao de 0.5-1.2 x 1.0-10.0 m y frecuente forman
cadenas cortas. Son aerobios facultativos o microaerofilicos, y generalmente son
bacterias inmviles. No son esporulados y son sacarolticos obligados. Crecen de
2-53 C, aunque su temperatura ptima vara entre 28-44 C. Son acidricos, por
lo que crecen ptimamente a pHs entre 4.2-6.4 y toleran un rango de 4 a 6.5 %
de NaCl (Messens et al., 2002; Estela et al., 2007).
Las BAL pertenecen al phylum Firmicutes clasificado en cuatro familias y
siete gneros i) familia Lactobacillaceae (gnero Lactobacillus y Pediococcus), ii)
familia Leuconostocaceae (gnero enococcus y Leuconostoc), iii) familia
Enterococcaceae (gnero Enterococcus) y iv) familia Streptococcaceae (gnero
Lactococcus y Strepiltococcus) (Zhang et al., 2011). El gnero de Lactobacillus y
Bifidobacterium son los ms importantes y frecuentemente se usan como cultivos
probiticos.
.
.%.%, 2eta&oli(o de a>?ca'e
Los azcares son la principal fuente de carbono y energa de las bacterias
cido lcticas, sin embargo desde la perspectiva tecnolgica de los probiticos, es
importante que estas bacterias sean capaces de crecer en leche o metabolizar la
lactosa. Ya que la leche sirve como el sistema ideal para el suministro de
bacterias probiticas en el tracto gastrointestinal humano debido a la provisin de
un entorno favorable que promueve el crecimiento y la mejora viabilidad de estos
microorganismos (Lourens-Hattingh y Viljoen, 2001). En la mayora de las
especies de Lactococcus y algunos Lactobacillus, la lactosa es fosforilada durante
su paso a travs de la membrana por medio del sistema enzimtico
PEP/fosfotransferasa. Posteriormente la lactosa-6-P es hidrolizada por la accin
de la fosfo-galactosidasa a glucosa, que sigue la va Embden-Meyerhof-Parnas
(EMP), y la galactosa-6-P se metaboliza por la va de la tagatosa. En el gnero de
Leuconostoc y en la mayora de las especies de Lactobacillus, el transporte de la
lactosa se realiza mediante una permeasa especfica utilizando una fuerza protn-
motriz, donde se intercambia lactosa por galactosa y luego es hidrolizada por la -
galactosidasa. La glucosa, fructosa y manitol se transportan a travs de la
membrana por medio del mismo sistema enzimtico PEP/fosfotrasperasa (Zourari
et al., 1991).
Los miembros de las BAL usualmente estn divididos en dos distintos
grupos basados en su metabolismo de carbohidratos: los homofermentativos y los
heterofermentativos.

El grupo homofermentativo consiste en Lactococcus, Streptococcus,
Enterococcus, Pediococcus y algunos Lactobacillus que metabolizan los azcares
por la va EMP para producir cido lctico como producto principal de la
fermentacin. Tericamente se producen 2 moles de cido lctico a partir de 1 mol
de glucosa, generando un rendimiento neto de 2 moles de ATP. Sin embargo, es
muy difcil lograr el 100% de conversin, por lo que algunos autores consideran
que las bacterias homofermentativas son aquellas que producen ms de 85% de
cido lctico (Vodnar et al., 2010). La produccin de este cido como nico
producto metablico tiene lugar solamente en condiciones de exceso de fuente de
carbono. Bajo ciertas condiciones limitantes o cuando el azcar es la galactosa, la
fermentacin es heterolctica o mixta disminuyendo la produccin del cido lctico
y producindose un aumento en los niveles de cido frmico, cido actico y
etanol. La ausencia de la fosfocetolasa en las BAL homofermentativas les
incapacita fermentar pentosas.
El grupo heterofermentativo consiste en Leuconostoc y algunas especies de
Lactobacillus que fermentan los azcares por la ruta de la fosfocetolasa (pentosas)
y producen solo el 50% de cido lctico. La fermentacin de 1 mol de glucosa
produce 1 mol de cido lctico, 1 mol de CO2 y 1 mol de cido actico o etanol
(Vodnar et al., 2010). El crecimiento de las bacterias con este tipo de metabolismo
se ve favorecido en condiciones aerobias, ya que la regeneracin de NAD+ es
consumido en la oxidacin de la glucosa y se utiliza el oxgeno como aceptor de
electrones, lo que permite desviar el acetil-CoA hacia la sntesis del cido actico
y generar una molcula extra de ATP.
.%.%. "'oducci-n de e@opoliac#'ido <E"S=
Algunas bacterias cido lcticas tienen la capacidad de sintetizar
polisacridos extracelulares (EPS). Los cuales son polmeros de cadena larga y
elevado peso molecular que se disuelven o dispersan en agua y que contribuyen a
mejorar la textura y viscosidad de productos fermentados. Adems del inters por
las propiedades reolgicas de los EPS, estos polmeros han sido objeto de
numerosos estudios que han puesto de manifiesto algunos beneficios para la
salud, tales como la estimulacin del sistema inmune, actividad antitumoral,
reduccin del colesterol y actividad antilcera. Debido a que los EPS conceden a
los probiticos propiedades de adherencia, proteccin contra compuestos
antimicrobianos o txicos y permiten la supervivencia a condiciones extremas
(Badel et al., 2011).
La cantidad de EPS depende de la fuente de carbono, nitrgeno y
condiciones fisicoqumicas en el crecimiento como la temperatura, pH, oxigeno,
etc. La sacarosa al parecer es la mejor fuente de carbono para varios
Lactobacillus. Se distinguen dos tipos de EPS de acuerdo a su localizacin; los
polisacridos capsulares (CPS) y los polisacridos extracelulares (EPS). Los CPS
se localizan en la superficie celular formando una capa adherente, a menudo
unida de forma covalente, su presencia se manifiesta por la formacin de colonias
de aspecto mucoso o "slime. Los EPS estn unidos a la clula mediante una
unin no covalente muy dbil o inexistente. As mismo debido a la composicin de
los EPS pueden dividirse en dos clases: Los homopolisacridos y los
heteropolisacridos. (Broadbent et al., 2003; Badel et al., 2011).
Los homopolisacridos (HoPSs): Son polmeros compuestos por
repeticiones de unidades de glucosa (glucanos) o fructosa (fructanos). Se
sintetizan extracelularmente por la accin de glucansacarasas que utilizan
sacarosa como donador de fructosa o glucosa. Estos enzimas utilizan la energa
del enlace de la sacarosa para catalizar la transferencia del monosacrido a la
cadena del EPS (Broadbent et al., 2003; van Hijum et al., 2006; Badel et al., 2011).
Los heteropolisacridos (HePSs): Son polmeros constituidos por diferentes
monosacridos, siendo glucosa, galactosa y rhamnosa los ms comunes. Se
sintetizan intracelularmente a partir de precursores azcar-nucletido y
posteriormente son excretados al exterior celular mediante un transportador
lipdico isoprenoide-fosfato (undecaprenil fosfato UDP) como se observa en la
figura 2.1. Entonces, los EPS pueden unirse covalentemente a la superficie de la
clula para formar una cpsula, o ser liberados en el medio como limo.
(Broadbent, et al., 2003; van Hijum et al., 2006; Badel et al., 2011).
8i$u'a .%,. Rutas metablicas de fermentacin de azcares y sntesis de EPSs en BAL. Los
nmeros indican los enzimas implicados : 1, fosfo--galactosidasa; 2, -galactosidasa; 3,
glucoquinasa; 4, fosfoglucomutasa; 5, UDP-glucosa pirofosforilasa; 6, UDP-galactosa-4-epimerase;
7, dTDP-glucosa pirofosforilasa; 8, deshidratasa; 9, epimerasa reductasa; 10, fosfoglucosa
isomerasa; 11, 6-fosfofructoquinasa; 12, fructosa-1,6-difosfatasa; 13, fructosa-1,6-difosfato
aldolasa; 14, galactosa 6-fosfato isomerasa; 15, tagatosa 6-fosfato quinasa; 16, tagatosa-1,6-
difosfato aldolasa; 17, 1-fosfofructoquinasa; 18, manitol 1-fosfato-5-deshidrogenasa (Snchez,
2005).
.%.%/ Acti*idad p'oteoltica
Las BAL tienen limitada la capacidad de sintetizar aminocidos usando
fuentes de nitrgeno inorgnico, por lo tanto estas dependen de los aminocidos
presentes en el medio de crecimiento como fuentes de nitrgeno. La conversin
de pptidos a aminocidos libres y subsecuentemente la utilizacin de estos, es
una actividad metablica importante para estas bacterias, debido a que esta define
su velocidad de crecimiento. El crecimiento en medios qumicamente definidos en
general es lento y est claro que las BAL se han adaptado a ambientes ricos en
nutrientes mediante el desarrollo de un sistema para explotar eficientemente las
fuentes de nitrgeno presentes. Uno de los sistemas ms ampliamente estudiados
es la actividad del sistema proteoltico en la leche, debido a la importancia
tecnolgica de la fermentacin mediante el crecimiento rpido de los
microorganismos en este medio (Salminen y Wright, 1998; Christensen et al.,
1999).
El sistema proteoltico de las bacterias cido lcticas est conformado por
una proteinasa extracelular, transportadores especficos en la membrana
(dipptidos, tripptidos y oligopptidos) y peptidasas intracelulares. La protenasa
extracelular sirve para romper los complejos protenicos a pptidos, los cuales son
llevados al interior de la clula mediante los transportadores especficos y
finalmente los pptidos son degradados por la peptidasas, liberando aminocidos
como se observa en la Figura 2.2 (Sadat-Mekmenea et al., 2011).
Lactobacillus helveticus ha sido reportada como la bacteria con mayor
actividad de la protenasa extracelular (Yamamoto, Akino y Takano, 1994). Sin
embargo tambin hay bacterias que carecen de este sistema proteoltico, por lo
tanto es necesario suministrar los aminocidos en el medio de cultivo para lograr
el crecimiento de los microorganismos. Tal es el caso de Bifidobacterium, la cual
crece lentamente en leche debido a que carecen de actividad proteoltica eficiente
y para la elaboracin de alimentos probiticos se adicionan aminocidos para
mejorar su crecimiento (Dave y Shah, 1998). Autores como Picot y Lacroix (2004),
reportan que durante la encapsulacin de Bifidobacterium breve y Bifidobacterium
lomgun utilizarn el caldo MRS adicionado con cistena para lograr altas tasas de
crecimiento para someter a las bacterias al proceso de encapsulacin.
8i$u'a .%. Rep'eentaci-n eAue(#tica del ite(a p'oteoltico de L.
helveticus <SadatB2eC(enea et al%: .D,,=%
.%/ C'ite'io de elecci-n
Para poder ser considerados como probiticos, los microorganismos deben
cumplir con ciertas condiciones complementarias en los aspectos de seguridad y
los aspectos tecnolgicos, adems de presentar una propiedad benfica
demostrada. Entre las condiciones requeridas se pueden mencionar que los
probiticos deben ser inocuos para la salud del consumidor, ser genticamente
estables, no presentar resistencia a antibiticos, mantenerse viables en el
producto del cual formen parte, factibles de ser reproducidos a gran escala y
preferentemente fago-resistentes. Adems, cuando forman parte de un producto
alimenticio, ste debe ser sensorialmente aceptable y debe conservar las
propiedades probiticas estables durante su vida til (FAO/OMS, 2002; Vrese y
Schrezenmeier, 2008).
Entre los criterios funcionales se pueden destacar que resistan las
condiciones a travs del tracto gastrointestinal, es decir que sean resistentes a los
jugos gstricos, a la bilis y a las enzimas, para que logren llegar al intestino un
nmero mnimo de 10
6
clulas viables/mL. Concentracin a la cual los probiticos
pueden poblar el intestino y ejercer efectos significativos a la salud. Adems,
deben otorgar algn beneficio al husped, como favorecer la absorcin de
nutrientes, regularizar la flora intestinal, combatir microorganismos patgenos
oportunistas y/o activar las defensas del organismo, entre otras (FAO/OMS, 2002;
Saxelin et al., 2005).
En el contexto de los probiticos, la nueva normativa sobre alimentos
funcionales destaca la necesidad de evaluar las relaciones dosis-efecto y definir
de forma especfica las propiedades beneficiosas, el consumo diario de cada
probiticos y los aspectos relativos a su seguridad, hasta ahora slo regulados en
probiticos para la alimentacin animal. La estandarizacin de los criterios de
evaluacin de la funcionalidad y la seguridad de los probiticos, as como el
establecimiento de correlaciones entre los ensayos de evaluacin in vivo e in vitro,
siguen constituyendo un gran reto para la comunidad cientfica, los productores y
los organismos reguladores (FAO/OMS, 2002; Hickey, 2005).
.%/%, Supe'*i*encia &a0o condicione $at'ointetinale
Las bacterias probiticas generalmente son adicionadas en alimentos y
estas comienzan su viaje hacia el tracto intestinal inferior a travs de la boca. Los
principales vehculos para los probiticos son los yogures y las leches
fermentadas, las cuales proporcionan un pH relativamente bajo en su ambiente y
con el cual deben sobrevivir. Adems, estas bacterias deben ser resistentes a la
acidez gstrica, la toxicidad de las sales biliares y las condiciones de estrs en el
colon (Gibson et al., 2000). El tiempo de promedio de residencia de los alimentos
en el estmago es aproximadamente 90 min (Berada et al., 1991). Es estmago
es el lugar donde inicia el estrs celular, debido a que tiene un pH tan bajo como
1.5 (Lankaputhra y Shah, 1995) y despus pasan al tracto intestinal superior
donde se segrega bilis. La concentracin de bilis en el sistema gastrointestinal
humano es variable y difcil de predecir en cualquier momento dado (Lankaputhra
y Shah, 1995). Por lo tanto, las cepas seleccionadas para uso como bacterias
probiticas deben ser capaces de tolerar el cido durante al menos 60 min (tiempo
minino de la residencia de los alimentos en el estmago), tolerar las sales biliares,
adherirse al epitelio y crecer en el tracto intestinal inferior, antes de que empiecen
a dar algn beneficio a la salud.
La tolerancia a pHs cidos y la bilis, son una de las primeras propiedades en la
evaluacin cuando se realiza la seleccin de cepas probiticas. Pruebas simples
in vitro se han aplicado a las bacterias cido lcticas antes de ser utilizadas en la
industria lechera como probiticos. Los resultados de estas pruebas muy a
menudo predicen la capacidad de las cepas para sobrevivir en los ambientes
cidos y con bilis. Estas pruebas in vitro para la seleccin de cepas tolerantes a
los pHs cidos y a las sales biliares, fcilmente puede aplicarse para asegurar la
calidad de los cultivos probiticos durante la fabricacin, el almacenamiento y vida
de anaquel del producto (Tuomola et al., 2001).
Sin embargo, la extrapolacin cuantitativa de rendimiento probitico in vivo
ha sido difcil, debido a la variacin intraespecfica entre cepas potencialmente
probiticas. Adems, los experimentos in vivo tambin implican factores
ambientales que afectan a la fase de cultivo de crecimiento e inducen estrs
causando cambios en el rendimiento del cultivo (Lee y Salminen, 1995). As, los
experimentos in vitro que se han utilizado a menudo y se han hecho esfuerzos
para imitar las condiciones in vivo. El jugo gstrico humano se utiliz en estudios
in vitro para evaluar mejor la capacidad de supervivencia de las cepas a travs del
estmago (Dunne et al., 2001). Para minimizar variaciones, Drasar et al. (1969)
ajust el jugo gstrico humano de sujetos sanos antes utilizarlo, como el pH del
estmago es conocido a fluctuar, se utiliz un pH tan bajo de 1.5, como el de
individuos en ayuno. Ellos informaron que la mayora de las cepas de
Lactobacillus mostraron tolerancia a las condiciones del estmago humano y
llegaron eficazmente al intestino. Sin embargo, Bifidobacterium demostr ser ms
sensible a las condiciones cidas y al jugo gstrico humano que las cepas de
Lactobacillus.
Los cidos biliares se sintetizan en el hgado a partir del colesterol y se
secretan de la vescula biliar al duodeno en la forma conjugada (Hoffman et al.,
1983). Estos cidos se someten a muchas modificaciones qumicas en el colon
como resultado de la actividad microbiana (Hylemon y Glass, 1983). Se ha
encontrado que las bacterias Gram positivas son ms sensibles a estos cidos
que las bacterias Gram negativas (Floch et al., 1972). Adems, la sensibilidad a la
bilis depende de los orgenes de las sales biliares; se ha encontrado que la bilis
porcina tiene ms efectos de inhibicin sobre cepas de Lactobacillus y
Bifidobacterium que la bilis bovina. Dunne et al. (2001) encontraron que la mayora
de los gneros Lactobacillus y Bifidobacterium, aislados en humanos tena la
capacidad de tolerar las concentraciones fisiolgicas de bilis humana.

.%/%. Reducci-n del colete'ol (ediante la decon0u$aci-n de la ale
&ilia'e
La bilis est compuesta principalmente de sales biliares. Las sales biliares
no conjugadas son glicina y taurina, las cuales actan como detergentes inicos
naturales. En el intestino, las sales biliares desempean un papel importante en la
emulsin de lpidos, que permiten la liplisis y la absorcin de productos lipolticos
por los enterocitos. El cido clico, uno de los cidos biliares libres ms comunes
en el intestino, es producido principalmente por la desconjugacin de sales biliares
(Kurdi et al., 2003).
La principal va de excrecin de colesterol de los humanos y otros
mamferos es a travs de las heces. El colesterol es el precursor de las sales
biliares primarias, que se forman en el hgado y se almacena en forma de sales
biliares conjugadas en la vescula biliar para la secrecin en el tracto
gastrointestinal (Corzo y Gilliland, 1999). Donde despus de realizar sus funciones
las sales biliares conjugadas son absorbidas a travs del epitelio y transportadas
en la corriente de la sangre. Sin embargo, las sales biliares desconjugadas son
ms hidrofbicas que las sales biliares conjugadas, lo que resulta una menor
absorcin en el lumen intestinal y por lo tanto son eliminados a travs de las
heces. Por esa razn en una situacin de estado estacionario, la desconjugacin
de las sales biliares pueden reducir los niveles de colesterol en el suero mediante
el aumento de la formacin de sales biliares nuevas que se necesitan para
reemplazar las que han sido eliminadas (Reynier et al., 1981).
Algunos probiticos, tales como Lactobacillus acidophilus son capaces de
excretar la hidrolasa sal biliar (BSH) (EC 3.5.1.24), enzima que cataliza la hidrlisis
de la glicina y/o taurina en sales biliares conjugadas, liberando residuos de
aminocidos y sales biliares (no conjugadas) (Corzo y Gilliland, 1999). Las
hidrolasas de sales biliares son activas en sales biliares conjugados con glicina y
taurina. Sin embargo, en experimentos con condiciones parecida al intestino
humano (pH 6.5 y con una proporcin de 2:3 de sales de glicocolato y
taurocolato), se report que la sal biliar de glicina conjugada era ms eficiente la
desconjugacin por cepas de L. acidophilus de origen tanto humano y porcino que
la sal biliar de taurina conjugada (Corzo y Gilliland, 1999). Con estos resultados se
postul que la solubilidad de las sales biliares conjugadas en condiciones cidas
era la causa. Debido a que con el pH normal de la parte superior del tracto
intestinal (5.5-6.5), se encontr que aproximadamente el 50% de sales biliares
libres y una pequea cantidad de sales biliares conjugadas de glicina estaban
protonadas (no ionizada), mientras que en la sal biliar conjugada con taurina no
ocurri una protonacin (Carey y Cahalane, 1988). La razn de este
comportamiento fueron los valores de pKa de las sales biliares conjugadas de
taurina y glicina, y de las sales biliares desconjugadas. Por lo tanto, a un pH cido,
las sales biliares desconjugadas se protonan y precipitan, mientras que las sales
biliares conjugadas con taurina permanecen ionizados en solucin, y el caso para
las sales biliares conjugadas de glicina se precipitan parcialmente sin hidrlisis
(Dashkevics y Feighner, 1989). La regulacin de la actividad de la HBS por el pH
todava no est clara, aunque algunas actividades de BSH, muestran ser mayor en
los valores de pH ms bajos.
Tomando en cuenta que el glicolato de sodio predomina en el intestino humano,
se pensara que las cepas prefieren desconjugar el glicocolato de sodio y as
tener mejor potencial de reducir las concentraciones de colesterol en suero
(Brashears et al., 1998). Para ello se propuso que la especificidad hacia el sustrato
se obtendra con los conjugados de glicina que con los conjugados de taurina. Sin
embargo, en una cintica tipo Michaelis-Menten con la HSB, se encontr una
inhibicin competitiva con el glicolato y el taurocolato, por lo que se especula que
ambas sales biliares conjugadas se hidrolizaron en un solo sitio. Los productos de
la hidrlisis, la taurina y cido clico, se encontraron que son los factores que
inhiben la hidrlisis del glicolato (Dean et al., 2002). Por el contrario De Smet et al.,
(1995), reportaron que utilizando la bilis bovina cruda se demostr de que la
enzima hidroliza completamente todas las sales biliares conjugadas sin
interferencia de otros componentes de la bilis (Colesterol y fosfolpidos) o
productos de reaccin (taurina, glicina, cido clico). En un estudio utilizando la
HBS aislada y purificada a partir de B. longum SBT 2928 se encontr que HBS era
una enzima intracelular y la hidrlisis de las sales biliares hace que el nitrgeno de
los aminocidos liberados queden disponibles para las clulas (Tanaka et al.,
2000).
Algunos estudios han sugerido que la distribucin de la actividad en HBS en
Bifidobacterium y Lactobacillus se correlacionan con el hbitat de un gnero,
especie o incluso cepas. La mayora de los organismos probiticos que se han
aislado del intestino de mamferos y de las heces mostraron actividad HBS. Sin
embargo, tambin debe tenerse en cuenta que no todas las cepas aisladas de
esos sitios tienen actividad de la BSH, lo que sugiere que las bacterias sin esta
enzima pueden sobrevivir bajo las condiciones del intestino con bilis utilizando
otros mecanismos (Tanaka et al., 1999).
.%/%/ Acti*idad anti(ic'o&iana
Hasta el momento, se ha reportado que las actividades antimicrobianas de
los probiticos comprometen tanto a la clula y los metabolitos producidos por ella.
Un mecanismo fisiolgico que considera a toda la clula bacteriana es competir
por sitios de unin disponibles y por nutrientes contra los patgenos. Comnmente
estas bacterias expresan hidrofobicidad y protenas en la superficie celular para
facilitar la coagregacin con clulas de la misma cepa o de especies relacionadas
y con los epitelios del husped (Wadstrom et al, 1987; Strus et al, 2001). Estas
caractersticas adhesivas proporcionan un impedimento estrico contra otros
microorganismos y ayudan a competir por los nutrientes disponibles (Ouwehand y
Salminen, 1998; Tannock, 1999). Por lo tanto, la superficie epitelial de acogimiento
est protegida gracias a un escudo asociado a las mucosas de una variedad de
invasiones nocivas (bacteria patgenas, sustancias toxicas, agentes oxidantes).
Adems, algunos estudios tambin reportan que algunas especies de
Lactobacillus ejercen actividad antimicrobiana in vitro por la coagregacin con
patgenos, y la creacin de un rea de contacto mayor entre las membranas
bacterianas, por lo tanto, el resultado mejor el debido al contacto de los
metabolitos antimicrobianos hacia los patgenos (Reid et al., 1988 ; Drago et al,
1997).
Los metabolitos producidos por los probiticos han demostrado tener un
amplio espectro de inhibicin contra bacterias tanto Gram positivas y Gram
negativas. Tomando en cuenta que existe una diversidad de compuestos
qumicos, lo ms probable es que su actividad antimicrobiana no es atribuible a un
mecanismo especfico, es decir podra haber efectos sinrgicos de distintos
componentes de la clula. Algunos metabolitos como el lactato y el acetato,
disminuye el pH. Sin embargo, el efecto general de los probiticos es debido a la
produccin de cido, que reduce el pH en el intestino, y a su vez limita el
crecimiento de patgenos. Esto se debe a la constante de disociacin (pK) de 3.86
para el cido lctico y 4.75 para el cido actico, estas sustancias estn
parcialmente en su forma no disociada a valores de pH ms bajos. Por lo tanto,
estos cidos orgnicos no disociados son lipoflicos y son capaces de penetrar la
membrana de la clula bacteriana, y a mayores valores de pH intracelulares se
disocian para producir iones de hidrgeno que interfieren con las funciones
esenciales bacterianas (Booth, 1985; Bian, 2008). As mismo, se ha reportado que
los cidos orgnicos pueden funcionar en combinacin para lograr una actividad
inhibidora fuerte contra muchos patgenos transmitidos por alimentos, tales como
Salmonella !yphimurium, E. coli, Bacillus cereus, "lostridium botulinum,
"lostridium perfringens, Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus (Wong y
Chen, 1988; Kao y Frazier, 1996; Alakomi et al, 2000; De Keersmaecker et al,
2006).
Otro factor importante que contribuye a la eficacia global de la inhibicin de
los patgenos son las bacteriocinas, las cuales son molculas catinicas de bajo
peso molecular, que son liberadas extracelularmente (Riley y Wertz, 2002;
Ouwehand y Vesterlund, 2004). Una hiptesis ampliamente aceptada para la
actividad de las bacteriocinas es que en primer lugar se adsorben a receptores
especficos o no especficos sobre la superficie de la clula, y entonces altera la
permeabilidad de la membrana (Jung, 1991; Nissen-Meyer et al., 1992). Las
bacteriocinas son diferentes de los antibiticos debido a que son pptidos
ribosomalmente sintetizados, su modo de accin son principalmente en la
membrana y tienen un espectro estrecho para matar slo especies estrechamente
relacionadas (Abee et al, 1995; Vuyst et al., 2006). Hoy en da, muchas
bacteriocinas se han descubierto y varan en espectro de inhibicin, modo de
accin, peso molecular, el origen gentico y propiedades bioqumicas. La nisina es
la bacteriocina ms conocida producida por Lactobacillus lactis, y se ha aprobado
para su uso en diversas industrias por todo el mundo (Hurst, 1981). Otras
bacteriocinas producidas por las BAL incluyen lactacin de L. acidophilus, pediocina
de Pediococcus acidilactici y enterocina de Enterococcus faecium. A pesar de que
las bacteriocinas han sido ampliamente utilizados en la conservacin de alimentos
y aplicaciones mdicas, todava estn limitados por su estrecho espectro de
inhibicin, y los parmetros extrnsecos tales como tolerancia al pH y la
termoestabilidad.
Otro grupo de molculas ms pequeas se han reportado que se asocian
tambin con la actividad antimicrobiana de los probiticos. Estas son sustancias
que comparten las caractersticas comunes de tolerancia a pH bajo,
termoestabilidad y actividad antimicrobiana, que ejercen a travs de un amplio
espectro. Estos incluyen, agentes oxidantes fuertes como el perxido de
hidrgeno generado a travs de la NADH oxidasa y la superxido dismutasa
(Batdorj et al, 2007.); el dixido de carbono de la heterofermentatin para fortificar
el ambiente anaerbico, y el diacetilo (Ouwehand y Vesterlund, 2004; Audisio et
al., 2011). Por lo tanto, la actividad antimicrobiana de los probiticos depende de
mltiples factores, los cuales pueden trabajar de forma sinrgica para contribuir a
la eficacia general. Sin embargo, se prefiere que los factores antimicrobianos de
los probiticos ejerzan actividad solamente contra bacterias patgenas, sin
ocasionar algn otro efecto adverso.
.%/%1 "'opiedade de adEe'encia 3 eti(ulaci-n del ite(a in(unol-$ico
El rol fisiolgico que los exopolisacridos juegan en los probiticos se
relaciona con la adaptacin y reconocimiento de factores ambientales. Estos
constituyen una barrera hidroflica que puede proteger a la bacteria y estar
implicada en la adhesin a superficies (Ruas et al., 2008). Dada la estructura
qumica y el tipo de uniones que presentan estos EPS, no pueden ser hidrolizados
por las enzimas presentes en el tracto gastrointestinal, por lo tanto pueden llegar
al intestino delgado donde podran ejercer un efecto biolgico a travs de diversos
mecanismos (Ruas, Hugenholtz y Zoon, 2002). A pesar de los bajos niveles de
produccin comparados con otros microorganismos, las BAL representan una
fuente de EPS natural que se puede utilizar en diversos procesos de fermentacin
o ser utilizados como aditivos alimentarios (agentes espesantes, emulsificantes y
estabilizantes) (Jolly et al., 2002; Ruas-Madiedo et al., 2006).
Algunos EPS producidos por BAL son capaces de contrarrestar el efecto de
ciertos enteropatgenos, ya sea por su capacidad de interactuar con las clulas
del epitelio intestinal o por secuestro de toxinas u otros metabolitos nocivos. Los
EPS producido por L. rhamnosus ATCC9595 demostr capacidad de secuestrar
toxina colrica (Kim et al., 2006). As mismo, en los ltimos aos muchos estudios
han demostrado que algunos EPS producidos por BAL son capaces de actuar
como inmunomoduladores (Madiedo et al., 2002). Diferentes estudios in vitro
demostraron que varios fosfopolisacridos presentan actividad mitognica sobre
linfocitos B (Takeda et al., 1997; Kitazawa et al., 1998). En estudios in vivo en
modelos murinos demostraron que la administracin oral del EPS producido por L.
kefiranofaciens es capaz de inducir una respuesta a nivel de la mucosa intestinal,
incrementando la produccin de gA y modificando los patrones de citoquinas
sricas (Vinderola, et al., 2006). Las propiedades inmunomoduladoras que poseen
algunos exopolisacridos se han vinculado con la actividad antitumoral, como en
los estudios realizados con la administracin intraperitoneal de cultivos de Lact.
lactis subsp. cremoris KVS20 productores de EPS, estos fueron capaces de inhibir
in vivo el crecimiento de tumores inducidos en ratones (Kitazawa et al., 1991).
En conclusin los exopolisacridos juegan un rol relevante en la actividad
probitica de los microorganismos, por lo tanto cuando se realiza una seleccin de
bacterias con propiedades probiticas es necesario evidenciar la presencia de
estas estructuras debido a que proveen propiedades tan importantes y esenciales,
como la adhesin a la mucosa y la proteccin contra los factores ambientales,
caractersticas funcionales que deben estar implcitas en los probiticos.
III% O;FETI)O
/%, O&0eti*o $ene'al
Evaluar las caractersticas cinticas y metablicas de las BAL aisladas de la
taberna para determinar su potencial probitico.
/%. O&0eti*o epec+ico
Seleccionar las BAL por su capacidad de crecimiento y supervivencia en
condiciones gastrointestinales simuladas.
Evaluar la capacidad de disociacin del taurocolato de sodio, produccin de
cido lctico, produccin de exopolisacridos, fermentacin de azcares y la
actividad antimicrobiana de las BAL seleccionadas.
)% 2ATERIALES G 2TODOS
1%, 2ic'oo'$ani(o
Un total de 32 cepas de bacterias cido lcticas catalasa (-) y Gram (+),
fueron obtenidas de la coleccin de cultivos del Laboratorio de nvestigacin del
nstituto Tecnolgico de Tuxtla Gutirrez. Las cepas fueron aisladas de la taberna
colectada en la Colonia Benito Jurez municipio de Villaflores (Chiapas, Mxico).
Los cultivos Stock fueron conservados en 40 % (v/v) de glicerol a -18C. Todas las
cepas se trabajaron en condiciones microaerofilicas y los cultivos frescos se
obtuvieron despus de la activacin por dos sucesivas transferencias en caldo
MRS (DBCO) (De Man, Rogosa y Sharpe), usando un inoculo del 10% (v/v),
incubados a 35C durante 20 h y con una agitacin de 80 rpm (Thermo scientific,
SHKA 200) (Desai, 2008).
1%. Selecci-n de lo (ic'oo'$ani(o
1%.%, E*aluaci-n de la ca'acte'tica de c'eci(iento
Se realizaron cinticas de crecimiento de cada una de las BAL, para ello se
emplearon matraces Erlenmeyer con 25 mL de caldo MRS (DBCO) con una
agitacin de 80 rpm (Thermo scientific, SHKA 200) a 35C y con un inoculo del
10% (v/v) de cultivo fresco. El crecimiento fue monitoreado durante 33 h en
intervalos de 1 h, midiendo la absorbancia a 620 nm (DO620) con un
espectrofotmetro (Beckman coulter, DU 73) y realizando simultneamente la
siembra sobre la superficie del agar MRS (DBCO) utilizando perlas de ebullicin,
cada caja fue sembrada con 0.1 mL del cultivo proveniente de las diluciones
seriadas. Las placas se incubaron a 35C por 48 h. La cuantificacin del
crecimiento celular se llev a cabo mediante las unidades formadoras de colonias
por mililitros (UFC/mL) y se expres en Log UFC/mL, tomando en cuenta las
placas que contenan entre 30 y 300 colonias. Para la estimacin rpida de la
concentracin celular se realiz una correlacin entre UFC/mL y la densidad ptica
(Lin et al., 2007; Wu et al., 2009; Desai et al., 2003).
La biomasa mxima (Xmax) se obtuvo a partir de la curva de crecimiento. La
velocidad especifica de crecimiento () se determin utilizando el coeficiente
angular de la correlacin de la fase exponencial de crecimiento de la biomasa (X),
donde se graficaron los logaritmos neperianos de la biomasa (ln X) contra el
tiempo (h) de la fermentacin, mientras que el tiempo de duplicacin (Td) fue
calculado como Td=ln2/, y expresado en horas (Shin et al., 2000; Pancheniak et
al., 2012). Todas las pruebas se realizaron por duplicados y se sembraron por
duplicados.
1%.%. Dete'(inaci-n de la upe'*i*encia de la ;AL &a0o condicione
$at'ointetinale i(ulada
Las BAL capaces de crecer a concentraciones de 10
9
UFC/mL y con
tiempos de duplicaciones cortos (1.2-1.8 h) en caldo MRS, fueron sometidas a la
simulacin gastrointestinal de acuerdo al protocolo general descrito por Picot y
Lacroix, (2004). La tolerancia de las BAL a las condiciones cidas del estmago se
determin mediante la exposicin sucesiva de cada uno de los microorganismos
con jugos gstricos a un pH de 1.9 durante una hora y la simulacin en el intestino
delgado se realiz con jugos intestinales a un pH de 7.5 durante seis horas.
Los jugos gstricos se prepararon disolviendo 0.26 g/L de pepsina (Matheson
Coleman y Bell Manufacturing Chemists, USA) en agua destilada estril ajustando
el pH a 1.9 con una solucin de HCl (0.1 N). Los jugos intestinales consistieron en
una solucin de pancreatina y una solucin de sales biliares. La solucin de
pancreatina se prepar disolviendo pancreatina 4X (Pncreas porcina, P-1500,
SGMA-ALDRCH) en buffer de fosfato de sodio estril (0.02 M, pH 7.5) para lograr
una concentracin final de 1.95 g/L. La solucin de sales biliares (3 g/L) fue
preparada disolviendo polvo de extracto de sales biliares (Bilis bovina, B3883,
SGMA-ALDRCH) en agua destilada. La suspensin resultante se esteriliz por
filtracin a travs de una membrana (0.45 m, Millipore). Todas las soluciones
fueron preparadas al momento de realizar la simulacin.
Para la simulacin se emple aproximadamente 1 g de clulas de cada una de las
BAL obtenidas a partir de 150 mL de cultivo fresco en caldo MRS (DBCO). Los
cultivos fueron centrifugados en tubos falcn a 3510 rpm por 15 min a 4C, las
clulas se lavaron dos veces con 2 mL de solucin salina al 0.9% (p/v) utilizando
las mismas condiciones de centrifugacin y se suspendieron en una probeta con 9
mL de jugos gstricos que contena una solucin de pepsina (0.318 g/L, pH 1.9),
se retir una muestra de 1 mL para determinar el nmero de clulas viables al
inicio de la prueba. La suspensin de clulas se mantuvo a 37C en bao mara y
en agitacin. Despus de un periodo de incubacin de 1 h, el pH se increment a
7.5 con una solucin de NaOH (1 N) y se retir una muestra de 1 mL para
determinar el nmero de clulas viables. Posteriormente se adicionaron 1.2 mL de
solucin de buffer de fosfato de sodio concentrado (0.25 M, pH 7.5) y 2 mL de
solucin de sales biliares. Se ajust el pH a 7.5 y el volumen a 14 mL con agua
destilada estril. Finalmente se adicion 1 mL de solucin de pancreatina,
obteniendo un volumen final de 15 mL. Despus de un periodo de incubacin de 6
h, se retir una muestra de 1 mL para determinar el nmero de clulas viables. La
viabilidad de las clulas se llev a cabo mediante la siembra en superficie de agar
MRS. Todas las pruebas se realizaron por triplicado y se sembraron por
duplicados.
1%/ "'ue&a in vitro de la ca'acte'i>aci-n (eta&-lica de p'o&i-tico
De la etapa de seleccin de los microorganismos, se eligieron 11 BAL
capaces de crecer a concentraciones de 10
9
UFC/mL en tiempos de duplicaciones
cortos (1.2-1.8 h) en caldo MRS y con una supervivencia por arriba del 60% (10
6
UFC/mL) despus de las condiciones gastrointestinales simuladas. Por lo tanto en
esta seccin se evaluaron 11 BAL.
1%/%, Capacidad de la diociaci-n del tau'ocolato de odio
Se utilizaron 10 mL de caldo MRS suplementado con 6 mM de taurocolato
de sodio. La concentracin de sal biliar utilizada se asemeja a las concentraciones
existentes en el intestino delgado humano (Brashears et al., 1998). El mtodo es
una adaptacin del descrito por Liong y Shah, (2005). Se basa en medir la
cantidad de cido clico liberado por cada BAL a partir de la desconjugacin del
taurocolato de sodio.
Las BAL estresadas en la simulacin gastrointestinal descrita en la seccin 4.2.2,
se recuperaron mediante la centrifugacin de 10 mL de la suspensin celular en
tubos falcn a 3950 rpm por 15 min a 4C. Las clulas se lavaron dos veces con 2
mL de solucin salina al 0.9% (p/v) y se inocularon en 10 mL de caldo MRS
suplementado con 6 mM de taurocolato de sodio, se incubaron a 35C por 20 h.
Despus del perodo de incubacin el cultivo se ajust a pH 7.0 con NaOH (1 N).
Las clulas se centrifugaron a 10000 rpm (Centrifuga eppendorf, 5810 R) a 4 C
durante 10 min. El sobrenadante obtenido se ajust a pH 1.0 con HCl (10 N). Un
mililitro del sobrenadante se adicion con 2 mL de acetato de etilo en un tubo
limpio y se mezclaron en un vortex durante 1 min. Los 2 mL de la capa de acetato
de etilo se transfirieron a un tubo de vidrio y se evapor a temperatura ambiente.
El residuo se disolvi en 1 mL de NaOH (0.01 N) con la ayuda de un vortex
durante 1 min. Despus se adiciono 1 mL de furfuraldehdo (1%) y 1 mL de H2SO4
(16 N), la mezcla se agit en un vrtex durante 1 min antes de calentar a 65 C en
un bao de agua durante 10 min. Despus de enfriar en un bao de hielo durante
1 min, se adicionaron 2 ml de cido actico glacial y la mezcla se agito en un
vrtex durante 1 min. Finalmente se ley la absorbancia a 660 nm (DO660)
(Beckman coulter, DU 73). La cantidad de cido clico liberado se determin
usando una curva estndar de cido clico. Todos los experimentos se realizaron
por triplicado.
1%/%. Cuanti+icaci-n de #cido l#ctico: #cido ac4tico 3 $lucoa
Los productos de la fermentacin (cido lctico y cido actico) y la glucosa
residual se determinaron usando un equipo de cromatografa liquida de alta de
precisin (HPLC, PerkinElmer, series 200) conectado a un detector de R
(PerkinElmer, series 200a). Se utilizaron los caldos obtenidos al final del periodo
de incubacin como se describe en la seccin 4.2.1. La muestras se centrifugaron
(Centrifuga eppendorf, 5810 R) a 10000 rpm por 10 minutos a 4 C, el
sobrenadante se diluy cinco veces y se filtr a travs de una membrana (0.22
m, Millipore). Para la cuantificacin se utiliz una columna Hi-Plex Ca (300 x 7.7
mm) (Agilent Technologies, Alemania) mantenida a 85C. Se trabaj en
condiciones isocrticas a un flujo de 0.3 mL/min, utilizando como fase mvil agua
tridestilada y con un volumen de inyeccin de 10 L. Las soluciones estndar de
los productos de fermentacin fueron preparados en agua tridestilada para
conocer los tiempos de elusin y las curvas de calibracin. Todas las
determinaciones se realizaron por triplicado.
1%/%/ Acti*idad anti(ic'o&iana
1%/%/%, 2ic'oo'$ani(o
Las cepas patgenas de E. coli ATCC 11775 serotipo 01:K1:H7 y
Staphylococcus aureus ATCC 25923 y Salmonella typhimurium ATCC 14028
fueron proporcionadas por el cepario de la Universidad Autnoma de San Luis
Potos. Los cultivos frescos se obtuvieron despus de la activacin por dos
sucesivas transferencias en caldo BH (DBCO) (Brain Heart nfusion), usando un
inculo del 1% (v/v), incubados a 35C durante 18 h y con una agitacin del 250
rpm (Thermo scientific, SHKA 200) (Bian, 2008).
1%/%/%. E*aluaci-n de c'eci(iento de lo pat-$eno
Se evalu el crecimiento de cada uno los patgenos empleando matraces
Erlenmeyer con 25 mL de caldo BH (DBCO) con una agitacin de 250 rpm
(Thermo scientific, SHKA 200) a 35 C y con un inculo del 10% (v/v) de cultivo
fresco. El crecimiento fue monitoreado durante 15 h en intervalos de 1.5 h,
midiendo la densidad ptica a 600 nm (DO600) con un espectrofotmetro (Beckman
coulter, DU 73) y realizando simultneamente la siembra sobre la superficie del
agar BH utilizando perlas de ebullicin, cada caja fue sembrada con 0.1 mL de
cultivo proveniente de diluciones seriadas con agua estril. La cuantificacin del
crecimiento celular se llev a cabo mediante las unidades formadoras de colonias
por mililitros (UFC/mL) y se expres en Log UFC/mL, tomando en cuenta. Las
placas se incubaron a 35C por 48 h. Para la estimacin rpida de la
concentracin celular se realiz una correlacin entre UFC/mL y la densidad
ptica.
1%/%/%. "'epa'aci-n de lo o&'enadante de li&'e de c4lula
Se utilizaron 100 mL de cultivo de un periodo de incubacin de 24 h como
se describe en la seccin 4.2.1. Los cultivos de cada BAL se centrifugaron a 4000
rpm por 15 min a 4C. La mitad del sobrenadante obtenido se ajust a un pH de
6.8 con NaOH (2 N) para excluir los efectos de los cidos orgnicos, este
sobrenadante se le design MRSN y el sobrenadante cido restante sin ajustar el
pH se le design MRSA. Los sobrenadantes se esterilizaron por filtracin a travs
de una membrana (0.45 m, Millipore) y se liofilizaron (Liofilizadora Labconco,
FreeZone Plus 2.5) a una temperatura de -40C y a una presin de vaco de 0.1
mBar durante 48 h. Los liofilizados se disolvieron con 5 mL de agua destilada
estril y se conservaron a 4 C hasta su uso (almacenamiento mximo de un mes)
(Audisio et al., 2009;).
1%/%/%. E*aluaci-n de acti*idad anti(ic'o&iana en placa
Los cultivos de los patgenos en placa se realizaron con 20 mL de agar BH
(DBCO) con un inculo de 0.1 mL del cultivo bacteriano obtenido como se
describe en la seccin 4.3.3.1. Una vez solidificado el medio, se realizaron pozos
de 5 mm de dimetro y se llenaron con 100 L de sobrenadante MRSN y MRSA.
Las placas se incubaron durante 3 h a 4C para difundir el sobrenadante en el
agar y se adiciono nuevamente 100 L de sobrenadante MRSN y MRSA,
posteriormente se incubarn a 35C por 48 h. Despus del periodo de incubacin,
se midieron las zonas de inhibicin alrededor de los pozos. Cada ensayo se
realiz cuatro veces de manera independiente ( Audisio et al., 2011; Bian et al.,
2011).
1%/%1 "'oducci-n de e@opoliac#'ido
Se emplearon 10 mL de cultivo de un periodo de incubacin de 24 h como
se describe en la seccin 4.2.1. Los cultivos se centrifugaron a 12 000 rpm por 10
min a 10C, se lavaron dos veces son solucin de PBS y el pellet se disolvi en 5
mL de NaCl (1M). Para liberar los EPS unido a la pared celular, la solucin se
snico a 78 W durante 3 min a 10C y se centrifug a 5945 rpm por 30 min. Los
EPS del sobrenadante se precipitaron mediante la adicin de 2 volmenes de
etanol seguida por una incubacin a 4C durante una noche. Despus del periodo
de incubacin, se centrifug a 6000 rpm durante 30 min a 4 C, el pellet obtenido
se disolvi en 2 mL agua destilada y se dializ a travs de una membrana de
dilisis (tamao de poro: 6-8 KDa, Sigma) con 5 L de agua destilada a 4C durante
2 das con tres cambios de agua por da. Las solucin de los EPS purificados se
congelaron a 18C hasta su posterior anlisis (Tallon et al., 2003; Mendoza,
Pea y Garca, 2009).
Para la cuantificacin de EPS se emple el mtodo colorimtrico fenol-sulfrico
reportado por Dubois et al., (1956). Se emplearn 300 L de solucin de EPS, 21
L de fenol (10% v/v) y 750 L de cido sulfrico. La mezcla se agit en un vrtex
por 5 s y se incub durante 15 min a 100C. Finalmente se ley la absorbancia a
490 nm (DO490) (Espectrofotmetro Beckman coulter, DU 73). Para determinar la
concentracin de EPS se realiz una curva de calibracin con glucosa. Cada
experimento se realiz por triplicado.
1%/%5 Capacidad pa'a +e'(enta' di+e'ente ca'&oEid'ato
Para conocer la habilidad de las BAL para fermentar diferentes
carbohidratos se utiliz un sistema AP 50 (bioMrieux) que contiene 49
carbohidratos diferentes, la prueba se realiz de acuerdo al protocolo descrito por
Nigatu (2000). Se emplearon 10 mL de cultivo de un periodo de incubacin de 20
h como se describe en la seccin 4.2.1. Los cultivos se centrifugaron a 12000 rpm
durante 10 minutos, se lavaron dos veces con una solucin de NaCl al 0.9% (p/v)
y las clulas obtenidas se suspendieron en el medio AP CHL (bioMrieux), el cual
se deposit en los microtubos de AP 50 CH (bioMrieux). La superficie de los
microtubos se cubri con aceite de parafina estril (Merck) para crear las
condiciones de anaerobiosis. El AP 50 CH se mantuvo dentro de una cmara
humedad y se incub a 30 C como lo recomienda el fabricante. Se realizaron dos
lecturas de los cambios de color de violeta a amarillo a las 24 y 48 h,
respectivamente. . Los resultados se interpretarn usando con una base de datos
AP/D32 mediante el programa apiweb
TM
.
1%1 An#lii etadtico
Se realiz un anlisis de varianza (ANOVA) para estudiar la diferencia
significativa entre las medias con un nivel de significancia a d = 0,05 para cada
prueba. As mismo, se realiz un anlisis clster para la evaluacin de las cepas
potencialmente probiticas, con el cual se pretendi establecer una estrategia
alternativa para la obtencin de grupos con similares caractersticas basado en el
mtodo de Ward. Agrupando las cepas mediante un alto grado de homogeneidad
interna (dentro del conglomerado) y un alto grado de heterogeneidad externa
(entre conglomerados), representados en un dendodrana. Los parmetros
utilizados fueron: supervivencia a las condiciones gastrointestinales simuladas
(%), capacidad de desconjugacin del taurocolato de sodio (mM), produccin de
exopolisacridos (mg/L), produccin de cido lctico (g/L), produccin de cido
actico (g/L), actividad antimicrobiana contra patgenos (E. coli, Salmonella
typhimurium y Staphylococcus aureus) reportada en zonas de inhibicin del
crecimiento (mm). Todos los anlisis de datos se realizarn empleando el software
estadstico Statgraphics Centurin.
)% RESULTADOS G DISCUSIONES
5%, E*aluaci-n del c'eci(iento de la &acte'ia #cido l#ctica
En la evaluacin del crecimiento celular de las BAL despus de las 33 h de
incubacin en caldo MRS se observaron tres patrones de crecimientos, las BAL
rpidas, moderadas y lentas. Las curvas de crecimiento de las BAL rpidas y
moderadas se observan en la Figura 5.1. Ambos patrones de crecimiento
alcanzaron la fase exponencial despus de las 4 h y la fase estacionario despus
de las 10h. Las BAL de crecimiento rpido alcanzaron una densidad poblacional
mxima de 9.73 0.01 log UFC/mL (5.38 x 10
9
UFC/mL) con una velocidad
especfica de crecimiento de 0.59 0.01 h
-1
, y un tiempo de duplicacin de 1.16
0.01 h. Las BAL de crecimiento moderado alcanzaron una densidad poblacional
mxima de 9.67 0.03 log UFC/mL (4.69 x 10
9
UFC/mL) con una velocidad
especfica de crecimiento de 0.46 0.01 h
-1
y un tiempo de duplicacin de 1.49
0.10 h. El tercer grupo constituido por las BAL de crecimiento lento alcanzaron una
densidad poblacional mxima de 5.12 0.02 log UFC/mL (1.3 x 10
5
UFC/mL) con
una velocidad especfica de crecimiento de 0.09 0.01 h
-1
y un tiempo de
duplicacin de 8.25 1.53 h (ver Tabla 5.1).

8i$u'a 5%,% Curvas de crecimiento en medio MRS donde se muestra la absorbancia a
620nm y la correlacin con las (A) Curva de crecimiento rpido (B) Curva de crecimiento
moderado.
Ta&la 5%, Parmetros cinticos de las BAL en caldo MRS
Los resultados se expresan como medias, es el error estndar de las medias; cada punto de datos es el
promedio de dos mediciones repetidas de dos rplicas de manera independiente, n = 2. (a-n) Las medias en
la misma columna seguidas por diferentes letras minsculas son significativamente diferentes (P <0,05).
Las patrones de crecimiento rpido y moderado en caldo MRS son
consistentes con lo reportado por Stacy et al., (1998), con una Xmax de 8.21 log
UFC/mL y un Td de 0.94 h. En investigaciones realizadas por Ahn et al., (2002),
estudiando el efecto de la temperatura sobre el crecimiento de Lactobacillus
acidophillus reportaron Td que van de 1.7 a 0.5 h a en un rango de temperatura de
32 a 40 C. En relacin a estos resultados, se demuestra que la temperatura (35
C) utilizada en esta investigacin no es un factor que no influya en el crecimiento
de las BAL, tal como se observa en los patrones de crecimiento lento. Por otra
parte #onkor et al (2007), reportaron que los patrones de actividad proteoltica
tuvieron un efecto directo sobre el crecimiento de las BAL.
Las bacterias cido lcticas nutricionalmente son muy exigentes, requieren
de pptidos o aminocidos especficos o pptidos en el medio de cultivo para su
crecimiento. En el caso particular de L. acidophilus tiene una capacidad limitada
para sintetizar aminocidos, solo puede sintetizar tres aminocidos (cistena,
serina y aspartato). Por lo tanto, el requerimiento de aminocidos debe
satisfacerse mediante la absorcin de aminocidos y oligopptidos (Azcarate-Peril
et a., 2005). Autores como Juillard et al., (1995) reportan que las BAL en medios
deficientes de aminocidos y pptidos libres, dependen de un sistema proteoltico
que permite la degradacin de las protenas para obtener estos factores de
crecimiento. El caldo MRS utilizado en esta investigacin tiene como fuentes de
aminocidos la peptona, el extracto de carne, y el extracto de levadura, es decir
los aminocidos estn en forma de pptidos y protenas, por lo consiguiente las
BAL necesitan romper los enlaces peptdicos mediante un sistema proteoltico que
les permita liberar a los aminocidos requeridos para lograr altas concentraciones
celulares. De esta manera la actividad proteoltica responde al efecto significativo
sobre el crecimiento bacteriano en el caldo MRS, debido a que los Td van desde
1.16 h hasta 8.25 h. Esta dependencia proteoltica podra explica el crecimiento
lento de las BAL-01A, BAL-01-B, BAL-02, BAL-04, BAL-13B y BAL-23. Tal como lo
reportaron Dave y Shah (1998), para las Bifidobacterium que carecen de
actividad proteoltica eficiente por su lento crecimiento en leche. As mismo
Christensen y Steele (2003), demostraron que la prdida de aminopeptidasas
especficas (PEPC, PepN, y PepX) dan lugar a un deterioro significativo de la tasa
de crecimiento de las bacterias. De ah que las BAL con crecimiento lento podran
requerir factores adicionales en el medio de cultivo para lograr altas
concentraciones celulares, tal como en el caso de Bifidobacterium que en muchas
investigaciones han reportado el necesario suministro de cistena en los medios de
cultivos (Picot y Lacroix et al., 2004).. De la misma manera Donkor et al., (2007)
sugirieron factores de crecimiento para L. delbrueckii ssp. bulgaricus por su baja
actividad de peptidasas y su lento crecimiento.
Debido a que la actividad proteoltica es una caracterstica importante de las
bacterias cido lcticas, se utiliza como requisito para la produccin de los
alimentos probiticos, ya que generalmente estos microorganismos se integran a
productos lcteos que contienen casenas, la cual sirve como fuente de
aminocidos para el crecimiento de los probiticos. Adems, esta caracterstica
permite mayor supervivencia en el intestino delgado, debido a que la mayor parte
de los aminocidos existentes en los alimentos se absorben en la parte superior
del intestino.
Por lo tanto, es posible considerar que las BAL de crecimiento rpido (BAL-
05, BAL-07, BAL-13A, BAL-14, BAL-17, BAL-18, BAL-20, BAL-21, BAL-26, BAL-
27A y BAL-28) y las de crecimiento moderado (BAL-03, BAL-09, BAL-10, BAL-
12B, BAL-22 y BAL-25) son microorganismo con actividad proteoltica
aparentemente eficiente, lo que les permite alcanzar poblaciones celulares
mayores a 9 Log UFC/mL en Td cortos (1.16-1.49 h).
Por ltimo, a lo largo del crecimiento bacteriano se observ en todos los
cultivos tuvieron una disminucin de pH desde un valor inicial de 6.5 hasta un
rango de 4.33 a 3.77 aproximadamente, teniendo lugar esta acidificacin durante
la fase de crecimiento exponencial y mantenindose constante este valor durante
la fase estacionaria. Es posible que este decremento de pH se deba a la
produccin de cidos orgnicos como lo han reportado muchos autores (Audisio
et al., 2010; Bian et al 2011).
5%. Supe'*i*encia de la &acte'ia #cido l#ctica a la condicione
$at'ointetinale i(ulada
La capacidad de las bacterias para sobrevivir y crecer en un nicho
determinado depende de las condiciones biolgicas y fsico-qumicas del
ecosistema en particular. En este sentido, la capacidad de resistencia a un pH
bajo, al jugo intestinal y a las sales biliares es de gran importancia en la
supervivencia y crecimiento de las bacterias en el tracto gastrointestinal. Por este
motivo, estas caractersticas se consideran un requisito esencial para seleccionar
cepas probiticas. Por lo tanto se realiz la simulacin gastrointestinal in vitro,
simulando condiciones del tracto gastrointestinal con objeto de evaluar la
capacidad de supervivencia de las 17 cepas de BAL con Xmax mayor a 9 Log
UFC/mL y Td cortos de 1.16-1.49 h. Para lograr una concentracin inicial
uniforme en todos los cultivos se emplearon las curvas de correlacin de la DO(620)
vs UFC/mL generada de la etapa anterior (ver Figura 5.1).
El efecto de la viabilidad de las bacterias cido lcticas durante la
simulacin gastrointestinal se muestra en la Tabla 5.2. El mayor efecto se observa
en las condiciones cidas simuladas al estmago, donde hay un decremento
significativo sobre la viabilidad de las BAL a diferencia del efecto bajo las
condiciones del intestino. La BAL-22 fue la cepa ms tolerante a las condiciones
gastrointestinales con una reduccin de 1.05 ciclo Log. Por otra parte las BAL-03,
BAL-07, BAL-09, BAL-10, BAL-12B, BAL-21, BAL-25, BAL-26, BAL-27 y BAL-28
tambin fueron cepas tolerantes, pero con una reduccin de 1.52 a 3.95 ciclos
Log. Todas estas cepas tuvieron una supervivencia por arriba del 60 %,
asegurando as una concentracin mayor de 10
6
UFC/mL al final de la simulacin
gastrointestinal. Mientras que las BAL-05, BAL-13A BAL-14, BAL-17, BAL-18,
BAL-20 y BAL-29 fueron las cepas ms sensibles, lo que demuestra que las
condiciones gastrointestinales simuladas son perjudiciales para la supervivencia
de estas cepas, provocando una supervivencia por debajo del 60% con una
concentracin menor de 10
6
UFC/mL al final de la simulacin gastrointestinal.
Ta&la 5%.% Sobrevivencia de las BAL en condiciones gastrointestinales
simuladas
Bacterias
BAL-03 10.26 0.08
ab
8.46 0.13
de
8.37 0.02
c
81.59
BAL-05 10.21 0.04
ab
0.00 0.00
n
0.00 0.00
k
0.00
BAL-07 10.22 0.04
ab
7.47 0.03
g
6.54 0.04
g
64.00
BAL-09 10.30 0.11
ab
6.95 0.06
i
7.04 0.12
e
68.36
BAL-10 10.22 0.06
ab
7.71 0.04
f
6.48 0.04
g
63.45
BAL-12B 10.30 0.12
ab
8.52 0.03
d
6.78 0.04
f
65.81
BAL-13A 10.29 0.11
ab
0.00 0.00
n
0.00 0.00
k
0.00
BAL-14 10.35 0.13
ab
6.71 0.04
j
6.09 0.04
h
58.83
BAL-17 10.22 0.04
ab
5.77 0.13
l
5.24 0.19
i
51.28
BAL-18 10.27 0.07
ab
5.32 0.17
m
4.89 0.28
j
47.59
BAL-20 10.31 0.10
ab
6.10 0.09
k
6.12 0.08
h
59.36
BAL-21 10.37 0.14
a
6.76 0.10
j
6.42 0.03
g
61.94
BAL-22 10.20 0.08
b
10.15 0.05
a
9.15 0.08
a
89.71
BAL-25 10.31 0.10
ab
9.59 0.03
b
8.78 0.02
b
85.16
BAL-26 10.33 0.22
ab
8.38 0.03
e
7.01 0.10
e
67.91
BAL-27A 10.34 0.12
ab
9.37 0.15
c
8.82 0.01
b
85.26
BAL-28 10.28 0.04
ab
7.28 0.05
h
7.35 0.01
d
71.51
BAL-29 10.21 0.02
ab
6.74 0.06
j
5.99 0.02
h
58.64
Cuenta viable de clulas (log UFC/mL)
% de
Supervi-
vencia
0 h 1 h 6 h
Control pH 1.9 Sales biliares
Los resultados se expresan como medias, es el error estndar de las medias; cada punto de datos es el
promedio de dos mediciones repetidas de tres rplicas de manera independiente, n = 3. (a-n) Las medias en
la misma columna seguidas por diferentes letras minsculas son significativamente diferentes (P <0,05).
Esta evaluacin es muy importante debido a que las BAL para realizar la funcin
como un microorganismo probitico primero tienen que tolerar el paso a travs del
tracto gastrointestinal asegurando una concentracin minina de 10
6
UFC/mL para
colonizar el intestino y posteriormente ejercer un efecto clnico significativo en la
salud del husped. Sin embargo, estas bacterias bajo las condiciones del
estmago con pHs extremadamente cidos que van de 1.5 a 3.0 y bajo las
condiciones del tracto gastrointestinal superior con sales biliares, disminuyen su
viabilidad (Lankaputhra y Shah, 1995; Corzo y Gilliland, 1999). Los protones
provenientes de HCl penetran la membrana de la clula provocando daos al ADN
y las protenas. Por su parte la bilis solubiliza los lpidos de las membranas, afecta
la formacin del ARN, el plegamiento de protenas y expone a la clula al estrs
oxidativo (Mills et al., 2011).
Nuestros resultados evidencian la presencia de cepas tolerantes a las condiciones
gastrointestinales simuladas, tales como la BAL-03, BAL-07, BAL-09, BAL-10,
BAL-12B, BAL-21, BAL-22, BAL-25, BAL-26, BAL-27 y BAL-28, las cuales tuvieron
una supervivencia por arriba del 60% en condiciones estrictas a pH de 1.9 y una
concentracin de sales biliares de 3 g/L. Por lo tanto estas BAL poseen
caractersticas de resistencia gastrointestinal que les permitira llegar viables hasta
el intestino delgado.
En investigaciones de Picot y Lacroix (2004), reportaron que
Bifidobacterium breve R070 decreci 5 ciclos log y Bifidobacterium longum R023
decreci 7 ciclos log, obteniendo una concentracin menor a 10
4
UFC/mL al final
de la simulacin gastrointestinal. Consecuentemente a estos resultados los
autores proponen encapsular a los probiticos para lograr una mayor
supervivencia. En el caso de las BAL evaluadas en este trabajo se identificaron 11
cepas que no requieren un tratamiento adicional que les permita soportar las
condiciones gastrointestinales. Por otro lado Lin et al., (2003), utilizando cepas
probiticas de Lactobacillus acidophillus provenientes de cinco diferentes
productos comerciales de Taiwan, reportaron una reduccin de 0.2 a 2.78 ciclos
log despus de una simulacin gastrointestinal. En relacin a nuestra
investigacin podemos deducir que la BAL-03, BAL-22, BAL-25, BAL-27 y BAL-28
poseen caractersticas probiticas de tolerancia a las condiciones
gastrointestinales semejantes a las cepas comerciales, reportando reducciones de
1.88, 1.05, 1.59, 1.52 y 2.93 ciclos log respectivamente. Es probable que estas
BAL tengan mecanismos de defensa que se expresan cuando estn sometidas a
condiciones de estrs; tal como lo reportado con Lactobacillus casei que cambia la
composicin de los cidos grasos de su membrana en repuesta a un medio cido
decreciendo la permeabilidad de los protones (Quivey et al., 2000). De la misma
manera Lactobacillus reuteri codifica el gen lr1797 que expresa la
fosfatidilglicerofosfatasa, enzima clave en la sntesis de fosfatidilglicerol y
cardiolipina que son los componentes de la membrana celular que permiten la
adaptacin a los medios cidos. En la cepa de L. reuteri CLR 1089 creciendo en
un medio con sales biliares, el gen lr1797 induce cambios en la fraccin de
glucolipidos, fosfolpidos y en la composicin de cidos grasos (Dowhan, 1997;
Wall et al., 2007).
En otras investigaciones realizadas con Lactobacillus reuteri ATCC 55730
determinaron que esta bacteria expresa el gen ClpL, el cual codifica una ATPasa
con actividad chaperona que contribuye a la supervivencia de estos
microorganismos en el tracto gastrointestinal. As mismo, se han reportado que las
chaperonas DnaK, GroEL, Groes, DnaJ y GrpE tambin contribuyen a la
supervivencia de las bacterias bajo diferentes condiciones de estrs (Wall et al.,
2007). En cuanto al sistema ATPasa F0F1 se ha reportado que es un mecanismo
que utilizan los probioticos para expulsar el exceso de protones del citoplasma.
De igual forma algunos componentes de la ruta de arginina deiminasa tales como
la arginina deiminasa (lr1517), arginina represor (lr1518), acetil ornitina deacetilasa
(lr1731) y ornitina carbamoiltransferasa (lr1020), se ha evidenciado que participan
en la tolerancia de los pHs cidos debido a que esta ruta produce amonio, la cual
contribuye a la alcalinizacin del medio ambiente (Van de Guchte et al., 2003;
Rollan et al., 2003). Por otro lado Liong y Shah (2005), reportaron la presencia de
la hidrolasa sal biliar en Lactobacillus acidophillus y Lactobacillus casei.
Mecanismos que utilizan algunas bacterias para hidrolizar las sales biliares
conjugadas y evitar daos a su membrana.
5%/ Capacidad de decon0u$aci-n de ale &ilia'e
La desconjugacin de las sales biliares por las bacterias cido lcticas se
muestra en la Tabla 5.3. En los resultados preliminares de esta investigacin, se
determin que las BAL estresadas despus de la simulacin gastrointestinal
presentaron mayor actividad de desconjugacin del taurocolato de sodio que las
BAL obtenidas a partir de un cultivo stock (datos no mostrados). Es probable que
el sucesivo contacto de las BAL con sales biliares durante la simulacin
gastrointestinal estimulara la produccin de la hidrolasa sal biliar (HSB), enzima
involucrada en la desconjugacin de las sales biliares (Corzo y Guilligant, 1999;
Liong y Shah, 2004). Autores como Bron et al., (2011), reportaron que utilizando
clones basados en micro arreglos de ADN para comparar las respuestas
transcripcionales de los cultivos de L. plantarum WCFS1 que se desarrollaron en
agar MRS conteniendo 0.1% de bilis porcina y los que se desarrollaron en
ausencia de bilis; Estos experimentos revelaron que la enzima bsh 1 (lp_3536) fue
inducida 6 veces ms en las clulas cultivadas en presencia de bilis. Por lo tanto,
esta investigacin apoya la especulacin de que la HSB puede ser inducida bajo
las condiciones de estrs gastrointestinal. Adems, da un aporte cientfico ms
real de la actividad de desconjugacin que tienen estos microorganismos al ser
sometidos a esta prueba. Muchos autores han reportado la actividad de
desconjugacin a partir de cultivos stock, sin considerar que las bacterias al ser
sometidas a condiciones de estrs durante el paso a travs del tracto
gastrointestinal reducen su nmero de clulas viables y estimulan la actividad de
desconjugacin de sales biliares (Lion y Shah, 2005).
Ta&la 5%/ Desconjugacin del Taurocolato de sodio por las BAL
BAL-03 1.35 0.43
bc
BAL-07 0.53 0.23
f
BAL-09 0.91 0.16
def
BAL-10 0.92 0.16
def
BAL-12B 1.01 0.17
cde
BAL-21 0.69 0.34
ef
BAL-22 1.44 0.16
ab
BAL-25 1.22 0.24
bcd
BAL-26 1.04 0.15
cde
BAL-27A 1.39 0.23
bc
BAL-28 1.79 0.13
a
Bacterias
cido clico liberado
(mM)
Los resultados se expresan como medias, es el error estndar de las medias de tres rplicas de manera
independiente, n = 3. Las medias seguidas por diferentes letras minsculas son significativamente diferentes
(P <0,05).
En esta investigacin reportamos que todas las cepas evaluadas fueron
capaces de desconjugar el taurocolato de sodio en diferentes niveles. En general,
la BAL-28 demostr la mejor actividad de desconjugacin con un 1.79 mM.
Mientras que la BAL-21 fue la cepa de menor actividad con 0.69 mM. Liong y Shah
(2005), reportaron valores de desconjugacin de 1.20 a 3.48 mM para varias
cepas de Lactobacillus acidophillus de origen humano. Haciendo una comparacin
con nuestros resultados, observamos que las cepas evaluadas en esta
investigacin presentaron menor actividad de desconjugacin. Es posible que las
divergencias entre los resultados se deban al origen de las cepas; ya que los
autores como Morse y Savage (2001), reportaron que Bifidobacteroum breve,
Lactobacillus fermentum, Lactobacillus rhamnosus y Lactobacillus curvatus
provenientes de fuentes naturales no presentan actividad de la HSB. Lo anterior
sugiere que las cepas provenientes de origen humano estn adaptadas a las
condiciones del intestino, lo que les permite presentar mayor actividad de
desconjugacin a diferencia de las BAL provenientes de la taberna.
Por otra parte, no se observ una correlacin entre la concentracin celular
inicial que se someti a la prueba y la actividad de desconjugacin de la respectiva
BAL (ver Tabla 5.2 y Tabla 5.3). Tal y como se presenta en la BAL-28, la cual
demostr mayor actividad de desconjugacin (1.79mM) e inici con una
concentracin celular de 7.35 log de UFC/mL. Por otro lado, la BAL-22 demostr
menor actividad de desconjugacin (1.44 mM) e inici la prueba con mayor
concentracin clular (9.15 log de UFC/mL). Por lo tanto la desconjugacin es una
actividad independiente de la concentracin celular y es una caracterstica propia
de cada BAL.
En general, todas las BAL de la taberna presentaron actividad de
desconjugacin de las sales biliares, lo que sugiere que estas cepas son capaces
de reducir el colesterol de la sangre utilizando este mecanismo. La reduccin del
colesterol en sangre se debe a que las sales biliares no conjugadas son menos
solubles que las sales biliares conjugadas, lo que resulta una menor adsorcin en
las clulas epiteliales del intestino y consecuentemente una eliminacin por las
heces fecales. Por lo tanto, se incrementa la formacin de nuevas sales biliares
nuevas a partir de molculas de colesterol dispones para reemplazar aquellas que
fueron eliminadas de la circulacin entero heptica, ya que le colesterol es el
precursor primario de las sales biliares (Reynier et al., 1981).
5%1% "'oducci-n de #cido l#ctico 3 #cido ac4tico
La produccin de cidos orgnicos generados por las BAL en caldo MRS se
muestra en la Tabla 5.4; en ella se observa que la mayor concentracin de cido
lctico (22.95 g/L) fue producido por la BAL-21, mientras que la menor produccin
(19.01 g/L) lo presento la BAL-22.
Ta&la 5%1% Produccin de los cidos orgnicos por las BAL
BAL-03 21.96 1.38
ab
94.00 96.32 Homofermentativo 1.72 0.70
bc
7.81
BAL-07 21.92 0.57
ab
92.22 97.66 Homofermentativo 1.55 0.50
bc
6.93
BAL-09 21.25 1.12
bc
89.79 96.76 Homofermentativo 1.79 0.28
bc
8.16
BAL-10 21.26 0.48
bc
94.34 92.95 Homofermentativo 2.00 0.11
c
8.73
BAL-12B 21.30 1.58
ab
89.65 97.14 Homofermentativo 1.69 0.94
bc
7.72
BAL-21 22.95 1.60
a
95.38 99.48 Homofermentativo 1.17 0.94
abc
5.07
BAL-22 19.01 0.68
d
86.50 89.25 Homofermentativo 1.44 1.13
bc
6.76
BAL-25 22.70 0.32
ab
95.80 97.99 Homofermentativo 0.19 0.03
a
0.83
BAL-26 22.07 0.46
ab
96.20 94.97 Homofermentativo 1.60 0.50
bc
6.90
BAL-27A 19.63 0.85
cd
93.39 86.55 Homofermentativo 0.97 0.30
abc
4.30
BAL-28 21.85 0.51
ab
96.79 93.53 Homofermentativo 0.63 0.20
ab
2.70
% Yp/s (g
A/g s)
Bacterias cido lctico
(g/L)
% Conv de
Glucosa
% Yp/s (g
L/g s)
Tipo de
metabolismo
cido
actico (g/L)
Los resultados se expresan como medias, es el error estndar de las medias de tres rplicas de manera
independiente, n = 3. Las medias seguidas por diferentes letras minsculas son significativamente diferentes
(P <0,05).
En general la produccin de cido actico fue mucho menor que la
produccin del cido lctico, alcanzndose valores de 0.19 a 1.17 g/L de cido
actico. En la industria de los alimentos es deseable las BAL produzcan cido
lctico en elevedas concentraciones, ya que es uno de los ingredientes ms
verstiles aplicados en la alimentacin y en la preservacin de productos (Vickroy,
1985). En contraste con el cido actico, que en cantidades moderadas puede
afectar las propiedades organolpticas de los alimentos (Chandan y O'Rell, 2006).
Por otro lado, la habilidad de las bacterias para convertir un determinado sustrato
juega un papel vital en la tecnologa de la fermentacin (Krishna, 2005). Knig y
Frhlichet (2009), reportaron que las bacterias homofermentativas son capaces de
convertir la glucosa a cido lctico con una eficiencia por arriba del 85%. Adems,
estas bacterias son las ms utilizadas en la fermentaciones ya que producen
mayores cantidades de cido lctico como producto principal de la fermentacin,
produciendo 2 moles de cido lctico a partir de 1 mol de glucosa por la va EMP.
Los resultados demuestran que las BAL de la taberna son homofermentativas, ya
que presentaron porcentajes de conversin por arriba del 86%. En cuanto a los
rendimientos de la produccin de cido lctico con respecto al consumo de
glucosa, las BAL presentaron valores de 86% a 99 %. Lo cual indica que la mayor
parte de la glucosa se est convirtiendo en cido lctico. Por lo tanto la enzima
con mayor actividad es la aldolasa, la cual cataboliza a la glucosa a travs de la
va EMP, y la enzima con menor actividad es la fosofocelotasa, la cual cataliza la
produccin del cido actico en bajas concentraciones por la ruta de las pentosas
fosfato.
No obstante, alcanzar una conversin del 100% es muy difcil, ya que las
bacterias utilizan el sustrato para diferentes fines, tales como el crecimiento
celular, la reproduccin y la produccin de diferentes metabolitos (Buchta et al.,
1983). En sus investigaciones de Kim et al. (2003), reportaron rendimientos del
91% de cido lctico a 42 C con un pH inicial de 6.0 empleando Lactobacillus
delbrueckii. En nuestros resultados se observaron rendimientos por arriba del
99%, por lo que es posible considerar que hay otros sustratos que participan en el
suministro de esqueletos carbonados. Tal como citrato, que es un componente del
caldo MRS posible de ser metabolizado por algunas bacterias cido lcticas
(Sanchez, 2005).
5%5 Acti*idad anti(ic'o&iana
La actividad antimicrobiana de las BAL se estudi contra 3 bacterias patgenas
intestinales comunes, mediante la produccin de metabolitos en el caldo MRS
despus de 24 h de incubacin utilizando los sobrenadantes de los caldos cidos
(MRSA) y los caldos neutralizados (MRSN) libres de clulas. El efecto de la
actividad antimicrobiana se report por la medicin de las zonas de inhibicin del
crecimiento de los patgenos sobre la superficie del agar. De acuerdo a los
resultados obtenidos se encontr que todos los MRSN no tuvieron un efecto
inhibitorio contra el crecimiento de los patgenos, mientras que los MRSA
presentaron efectos inhibitorios contra los tres patgenos de prueba (Tabla 5.5).
Ta&la 5%5 Actividad antimicrobiana de sobrenadantes cidos de las BAL
estudiados con bacterias potencialmente patgenas en humanos.
BAL-03 7.75 0.96
ef,A
7.25 0.50
f,A
6.75 0.50
e,A
BAL-07 8.50 0.58
de,A
7.25 0.50
f,B
6.75 0.50
e,B
BAL-09 12.50 0.58
c,A
11.00 0.82
d,B
8.75 0.50
d,C
BAL-10 14.75 0.96
b,A
14.00 0.82
b,A
12.25 0.50
b,B
BAL-12B 9.25 0.50
d,A
8.50 0.58
e,A
6.25 0.50
e,B
BAL-21 9.50 0.58
d,A
8.25 0.96
e,A
6.75 0.96
e,B
BAL-22 8.50 0.58
de,A
7.25 0.50
f,A
6.25 0.50
e,B
BAL-25 14.25 0.50
b,A
13.25 0.50
b,B
12.25 0.50
b,C
BAL-26 16.75 0.96
a,A
15.25 0.50
a,B
14.00 0.82
a,B
BAL-27A 12.75 0.82
c,A
12.25 0.96
c,A
10.50 0.58
c,B
BAL-28 7.25 0.96
f,A
7.25 0.50
f,A
6.25 0.58
e,A
cepas
Staph. aureus
$A!"" %&'%()
S. typhimurium
(ATCC 14028)
E. coli
(ATCC 11775)
Zonas de nhibicion del crecimiento (mm)
Los resultados se expresan como medias, es el error estndar de las medias de cuatro rplicas de manera
independiente, n = 4. Las medias seguidas por diferentes letras minsculas en la misma columna son
significativamente diferentes (P <0,05). Las medias seguidas por las diferentes letras maysculas en la fila
son significativamente diferentes (P <0,05).
Todas los MRSA de las BAL tuvieron un efecto inhibitorio con las tres cepas
estudiadas. No obstante la BAL-09, BAL-10, BAL-25, BAL-26 y BAl-27A fueron
aquellas que presentaron mayor actividad inhibitoria significativa (P<0.05) sobre
todas las cepas patgenas. Los bacterias Gram negativas (S. thyphimurium y E
.coli) fueron ms sensibles que la bacteria Gram positiva (S. aureus). Sin
embargo, el efecto inhibitorio de MRSA contra el crecimiento con E. coli tuvo un
efecto significativo (P<0.05) con respecto a las dems bacterias.
Con esta prueba se pretendi conocer los metabolitos responsables de la
actividad antimicrobiana, ya que al neutralizar los MRSN se elimin la actividad de
los cidos orgnicos producidos por las BAL y se busc la interaccin de otros
metabolitos como las bacteriocinas. Sin embargo Belgacem et al., (2012)
reportaron que la mayora de los compuestos inhibitorios son inestables por
encima de pH neutro, ya que de acuerdo a sus investigaciones determinaron que
a un pH de 5 las bacteriocinas producidas por Pediococcus pentosaceus MMZ26,
Enterococcus faecium MMZ17 y Lactococcus lactis MMZ25 tiene mayor actividad
contra L. monocitogenes. Ellos atribuyeron a este comportamiento de las
bacteriocinas por su alto contenido de glicina, a la formacin a nivel molecular de
las estructuras globulares y a las fuertes interacciones hidrofbicas en las
molculas que se ven a afectadas por el cambio del pH. Por lo que esta prueba no
permite descartar complemente la produccin de bacteriocinas por estas cepas.
Por el contrario, en los MRSA los principales responsables de la actividad
antimicrobiana son los cidos orgnicos (cido lctico y el cido actico, cido
frmico y cido succnico) producidos por las bacterias cido lcticas y que en
muchas investigaciones han reportado ser los responsables de la actividad
antimicrobiana contra varios patgenos (Jin et al., 1996; Lehto y Salminen, 1997;
De Keersmacker et al., 2006; Hutt et al., 2006; Millette et al., 2007). El efecto de
los cidos ha sido intensamente estudiado y el mecanismo de accin se ha
asociado con la disociacin de estas molculas. En el caso del lactato la constante
de disociacin (pK) es de 3.86 y para el acetato es de 4.75, por lo que estas
sustancias estn parcialmente en su forma no disociada a valores de pH ms
bajos. Por lo tanto, estos cidos orgnicos no disociados son lipoflicos y son
capaces de penetrar la membrana de la clula bacteriana, y a mayores valores de
pH intracelulares se disocian para producir iones de hidrgeno generando un
gradiente de protones dentro de la clula que interfieren con las funciones
esenciales bacterianas (Booth, 1985; Bian, 2008). De igual manera, se ha
reportado que los cidos orgnicos pueden funcionar en combinacin con otros
para lograr una actividad inhibidora fuerte contra muchos patgenos transmitidos
por alimentos (Wong y Chen, 1988; Kao y Frazier, 1996; Alakomi et al, 2000).
Adems, todos los patgenos estudiados en estos experimentos son
microorganismos neutrfilos, por lo que son muy sensibles a los cambios de pH.
En investigaciones realizadas por Cordoba et al., (2003), reportaron que a
concentraciones de 17 y 25 g/L de cido lctico y a concentraciones de 1 y 3 g/L
cido actico producidas por cepas de Lactobacillus plantarum presentaron
efectos inhibitorios contra E.coli, Staphy. aureus y Salmonella thiphyrium. Por su
parte Audisio et al., (2011), evidenciaron que los sobrenadantes de cepas de
Lactobacillus *onhsonni presentaban efectos inhibitorios con E.coli, Staphy. aureus
y Listeria monocitogenes. Las cepas producan una concentracin de 24.5 g/L de
cido lctico. Por lo tanto, los resultados encontrados con MRSN pueden asociarse
con las altas concentraciones de cido lctico producidas por las BAL de la
taberna, por lo que este mecanismo permite a las BAL tener una actividad
antimicrobiana contra bacterias patgenas.
5%6 "'oducci-n de e@opoliac#'ido
La produccin de EPS por las bacterias cido lcticas se muestra en la
Tabla 5.5. La mayor produccin de EPS la presento la BAL-10 con 233.99 21.85
mg/L y la menor produccin lo presento la BAL-25 con 23.42 8.65 mg/L. As
mismo, las BAL-03, BAL-09, BAL-12B, BAL-21, BAL-26, BAL-27A y BAL-28
presentaron una produccin moderada de EPS en comparacin con la BAL-07 y la
BAL-22.
Ta&la 5%5 Produccin de exopolisacridos por las BAL
BAL-03 135.30 32.49
c
BAL-07 35.00 10.72
e
BAL-09 119.43 72.31
cd
BAL-10 233.99 21.85
a
BAL-12B 119.26 57.94
cd
BAL-21 215.43 22.90
ab
BAL-22 69.21 12.48
de
BAL-25 23.42 8.65
e
BAL-26 148.37 7.16
c
BAL-27A 163.18 51.62
bc
BAL-28 118.75 12.98
cd
;acte'ia E"S
(a@
<($HL=
Los resultados se expresan como medias, es el error estndar de las medias de tres rplicas de manera
independiente, n = 3. Las medias seguidas por diferentes letras minsculas son significativamente diferentes
(P <0,05).
Stacy y Robert (1998), reportaron que el extracto de carne, el extracto de
levadura y la peptona contenidas en el caldo MRS, interfieren en un 94% en la
cuantificacin de los EPS. Sin embargo, ellos no consideraron que las bacteria
cido lcticas pueden romper las macromolculas protenicas de esos
componentes mediante un sistema proteoltico. Por otra parte las investigaciones
realizadas Younis et al., (2010), demostraron que el extracto de carne y extracto
de levadura influyen drsticamente en el crecimiento de BAL. Por lo que es obvio
que esos constituyentes no permanecen constantes durante el crecimiento de las
BAL, si no que forman parte del suministro de fuente de carbono y energa. Lo que
permite tener altas tasas de crecimiento (<9 log UFC/mL) y una produccin de
diferentes metabolitos. As mismo, hay que tomar en cuenta que las protenas que
no se consumieron durante la fermentacin tienden precipitar por el descenso de
pH. Aunado a esto, se realiz tratamiento de centrifugacin (12,000 x g) a las
muestras para eliminar las protenas restantes o las partculas insolubles que
pudieran interferir en la cuantificacin de EPS. Por lo tanto, consideramos que los
resultados obtenidos pertenecen a estructuras de polisacrido de < 8000 Da
producidas por las BAL.
Por otro parte, varias investigaciones han demostrado que los EPS estn
implicados en la resistencia a diferentes condiciones de estrs. Strack et al.,
(2010), reportaron que la presencia de EPS en Lactobacillus paracasei NFBC 338
mejor la tolerancia al calor y a las condiciones cidas. En contraste con los EPS
de las BAL no influyeron en la supervivencia a las condiciones gastrointestinales
simuladas. Tal como se observa en la BAL-22 que tiene una supervivencia de
89.71% y presento una baja produccin de EPS (69.21mg/L). Por lo tanto, no hay
patrones de correlacin entre la cantidad de EPS y la tolerancia a las condiciones
gastrointestinales Sin embargo en las investigaciones Rustrin (2012), reporto
una supervivencia de las BAL en los procesos de secado de 86.30% y una
supervivencia de 64.94% despus de 4 meses de almacenamiento. Esto indica
que las BAL son resistentes a los procesos de secado y que los EPS podran estar
implicados en la supervivencia de procesos tecnolgicos.
Finalmente en las investigaciones realizadas por Tallon et al., (2003),
reportaron que Lactobacillus plantarum EP56 produce 140.2 mg/L de EPS. Con
estos resultados evidenciamos que las BAL de la taberna son buenas productoras
5%7 Capacidad pa'a +e'(enta' di+e'ente ca'&oEid'ato
El sistema AP 50 CH utilizado en esta investigacin permiti conocer los
patrones de fermentacin de los microorganismos (Tabla 5.7). Las BAL capaces
de utilizar un carbohidrato como nica fuente de carbono se determin mediante
la produccin de cidos, el cual provoco el descenso del pH por debajo de 5.2,
donde el indicador de bromocresol purpura cambio su coloracin a amarillo. Con
respecto a la caracterizacin fenotpica, ninguna de las BAL fermento glicerol,
eritritol, D-arabinosa, L-xilosa, D-adonitol, 3-metil D-xilsido, L-sorbosa, L-
ramnosa, dulcitol, inositol, inulina, almidn, glcogeno, xilitol, D-lixosa, D-tagalosa,
D-fucosa, L-fucosa, D-arabitol, L-arabitol, 2-cetogluconato y 5-cetogluconato. Sin
embargo, todas las cepas fermentaron D-ribosa, D-galactosa, D-glucosa,
melibiosa, trealosa y D-rafinosa. Los diferentes patrones fenotpicos obtenidos
demuestran la diversidad de cepas BAL autctonas que participan durante la
fermentacin de la taberna. Lo que indica que la fermentacin de carbohidratos
existentes en la sabia de la palma de coyol no solo depende de una especie si no
de varias. Aunque el sistema AP 50 CH haya identificado a la mayora de las
especies como Lactobacillus plantarum +, estas cepas tienen diferentes patrones
de fermentacin (Tabla 5.7).
Realizando una comparacin con las investigaciones realizadas por
Arboleya et al (2011), trabajando con cepas de Bifidobacterium aisladas de leche
materna encontraron cepas que fermentaban solamente 9 carbohidratos (D-
fructosa, D-manosa, D-manitol, D-sorbitol, Salicin, D-melezitosa, Glucgeno,
Gentiobiosa y D-turanosa). Sin embargo en las investigaciones de Chambel et al
(2006), trabajando con bacterias cido lcticas aisladas de higo maduro
encontraron cepas que fermentaban 18 carbohidratos (L-arabinose, Celobiosa,
Esculina, Galactosa, Gentiobiosa, Gluconato, Lactosa, Manitol, Maltosa, D-
Manosa, Melibiosa, Rafinosa, Ribosa, Almidn, Sucrosa, Trealosa, D-Turanosa y
D-Xylose), de los cuales 17 carbohidratos las BAL de la taberna tambin
fermentan a acepcin del almidn. Estos resultados demuestran que el origen de
las cepas esta relaciona con la capacidad de fermentacin, ya que es posible que
los factores ambientales promuevan el desarrollo de mecanismos para sobrevivir.
Ta&la 5%7. Fermentacin de diferentes carbohidratos por las BAL
`03 `09 10 12B 21 22 25 26 27A 28
L-Arabinosa + + + + + - + + + +
Ribosa + + + + + + + + + +
D-xilosa - - - - - - - - - +
Galactosa + + + - + + + + + +
Glucosa + + + + + + + + + +
Fructosa + + + - + + + + + +
Manosa + + + - - + + + + +
Manitol + + + - - - + + + +
Sorbitol + + + - - - + + + +
a-metil D-
manosido
- + + - - + + + + +
a-metil D-
glcosido
- - - - - + - - - +
N-acetil-
glucosamina
+ + + - - + + + + +
Amigdalina + + + - - + + + + +
Arbutina - + + - - - + + + +
Esculina + + + + + - + + + +
Salicina + + + - - + + + + +
Celobiosa + + + + - + + + + +
Maltosa + + + + - + + + + +
Lactosa + + + + - + + + + +
Melibiosa + + + + + + + + + +
Sacarosa + + + + - + + + + +
Trealosa + + + + + + + + + +
Meliciosa + + + + - + + + + +
Rafinosa + + + + + + + + + +
Gentibiosa + + + + - + + + + +
D-turano + + + - + + + + + +
Gluconato - + - - - - + + + -
Cepas BAL
Carbohidrato
Los resultados visuales se expresan como: (+) microorganismos capaces de fermentar el carbohidrato con un
vire amarillo < 60% y () microorganismos incapaces de fermentar el carbohidrato con un vire > 40% o nulo.
Los resultados presentados se obtuvieron de un experimento manera independiente por cada
microorganismos, n = 1.
Ta&la 5%7. dentificacin de las BAL por el software bioMrieux
Cepas
BAL-03 99.1 (Lactobacillus plantarum +)
BAL-09 ''.' (Lactobacillus plantarum +)
BAL-10 ''.+ (Lactobacillus plantarum +)
BAL-12B ''.' (Lactobacillus fermentum %)
BAL-21 &(.& (Lactobacillus fermentum +)
BAL-22 ''.' (Lactobacillus plantarum +)
BAL-25 ''.' (Lactobacillus plantarum +)
BAL-26 ''., (Lactobacillus plantarum +)
BAL-27A ''.' (Lactobacillus plantarum +)
BAL-28 &'.+ (Lactobacillus plantarum ')
% de Probabilidad de dentificacin
(especies)
Los resultados presentados se obtuvieron de un experimento manera independiente por cada
microorganismos, n = 1.
La fermentacin de azucares de las bacterias cido lcticas es una
caracterstica muy importante que depende de la maquinaria enzimtica y de los
sistemas transportadores de carbohidratos en las membranas. Las cepas capaces
de fermentar muchos carbohidratos tienen ms posibilidades de sobrevivir debido
a la mayor disponibilidad de nutrientes en sus respectivos ambientes (Francl et al,
2010). Las enzimas sacarolticas participan en el metabolismo de los
monosacridos, disacridos, y polisacridos para suministrar sustratos a la
gluclisis. En investigaciones realizadas por Barrangou et al (2006), utilizando una
cepa de Lactobacillus acidophillus determinaron las enzimas que participan en el
metabolismo de algunos carbohidratos, en el caso de la fructosa se utiliza el
transportador PTS (FruA), la fosfofructoquinasa (FruK) y el regulador de
transcripcin (FruR). Para la sacarosa se utiliza el transportador PTS (ScrA), la
sucrosa-6-fosfato (ScrB) y el regulador de transcripcin (Scrc). Los FOS utilizan el
transportador ABC (MsmEFGK), la -fructosidasa (BfrA) y la sucrosa-1-fosfato
(GtfA). Para la rafinosa se utiliza el transportador ABC (MsmEFGK2), la
galactosidasa (MelA) y la sucrosa fosforilasa (GtfA2). Para la lactosa y galactosa
se utiliza la permeasa de la familia de translocadores (GTP), la -galactosidasa
(LacS), la galactocinasa (GalK), la galactosa-1-fosfatouridil transferasa, la
galactosa epimerasa (GalM) y la UDP-glucosa epimerasa (GalE). En particular, el
potencial sacaroltico de L. acidophilus refleja su capacidad para fermentar
eficientemente los carbohidratos disponibles en el intestino y otros medios, debido
a que esta cepa codifica numerosos genes potencialmente implicados en la
absorcin y metabolismo de una variedad de carbohidratos. Por lo consiguiente
aquellas bacterias equipadas con diversas enzimas son ms atractivas para ser
usadas.
En la actualidad constantemente se estn desarrollando productos
probiticos utilizando bases diferentes a la leche, tales como los nctares, los
dulces, las galletas, etc. De la misma manera se estn desarrollando productos
que contienen prebiticos, que son carbohidratos complejos que atraviesan el
tracto gastrointestinal sin ser degradados por las enzimas digestivas y que en el
colon son utilizados como sustratos por los microorganismos probiticos para la
producir metabolitos que contribuyen a la mejora de la salud del hospedero
(Simmering y Blaut, 2001). Por lo tanto, en la industria de los alimentos se
requieren bacterias con caractersticas especficas para diferentes procesos
tecnolgicos. En la produccin de vinos y nctares se utilizan bacterias cido
lcticas capaces de fermentar fructosa y sacarosa tales como la BAL-03, BAL-09,
BAL10, BAL-22, BAL-25, BAL-26, BAL-27A y BAL-28. Por otro lado, para la
mayora de las bacterias probiticas es un requisito indispensable que fermenten
lactosa como fuente de carbono para producir clulas a gran escala o para
mantener su viabilidad en los productos lcteos. Por lo que la BAL-03, BAL-09,
BAL10, BAL-12B, BAL-22, BAL-25, BAL-26, BAL-27A y BAL-28 seran las
adecuadas para producir alimentos probiticos en base de leche, ya que son
capaces de fermentar lactosa. En el caso de la BAL-03, BAL-09, BAL10, BAL-12B,
BAL-22, BAL-25, BAL-26, BAL-27A y BAL-28 fueron capaces de fermentar la
rafinosa y la celobiosa, por lo que podran ser utilizadas en los alimentos
simbiticos utilizando estos prebiticos. Con todo lo anterior, las BAL de la taberna
poseen una maquinaria enzimtica compleja que les permite fermentar diferentes
carbohidratos lo que les proporciona un potencial biotecnolgico.
5%9% An#lii Cute'
Los resultados obtenidos del anlisis clster utilizando el mtodo de Ward
se observan en la Figura. El dendograma obtenido relaciona las caractersticas
probiticas de las cepas mediante distancias conectadas en una escala de
heterogeneidad donde las BAL que muestran mayor similitud son las conectadas
por distancias ms pequeas.
8i$u'a 5%9. Anlisis de clster representado con el dendograma de agrupando cepas BAL
con caractersticas similares(n=11), utilizando el mtodo de Ward.
El anlisis clster revelo a una distancia de 45 hay tres grandes
agrupamientos, donde la principal caracterstica del grupo (a) es la alta resistencia
a las condiciones gastrointestinales, en comparacin con el grupo (b) y (c). El
grupo (a) incluye la BAL-03, BAL-28, BAL-22, BAL-27A y BAL-25. En este grupo
se comparten caractersticas como alto porcentaje de supervivencia a las
condiciones gastrointestinales y una excelente desconjugacin de sales biliares.
Por lo que estas cepas podran ser usadas en la reduccin del colesterol y
recuperacin de la flora intestinal, ya que debido a sus caractersticas podran ser
muy tiles en el rea clnica. Sin embargo dentro de este grupo podemos
encontrar subgrupos muy similares como la BAL-03 y BAL-28 que comparten
caractersticas muy particulares como la supervivencia a las condiciones
gastrointestinales, desconjugacin de sales biliares, la produccin de cido lctico
y la produccin de exopolisacridos. De la misma manera hay subgrupos que se
separan del grupo por difieren de algunas caractersticas, tal es el caso de la BAL-
25 que produce muy poca cantidad de exopolisacridos pero tiene una alta
actividad antimicrobiana contra patgenos. El grupo (b) incluye la BAL-07, BAL-
09, BAL-12B y BAL-21. Todas estas cepas comparten caractersticas propias
como la alta produccin de exopolisacridos y la excelente produccin de cido
lctico y cido actico. Por lo que estas cepas podran ser usadas en los procesos
tecnolgicos donde se requiere el uso de altas temperaturas, reduccin de
actividad de agua y largos periodos de vida de anaquel, ya que muchas
investigaciones han correlacionado la resistencia de cepas bacterianas a varios
procesos debido a la alta produccin de exopolisacridos. As mismo, estas cepas
podran participar en la elaboracin de varios alimentos que requiera la produccin
de cido lctico. El subgrupo formado por la BAL-09 y BAL-12B son las cepas muy
similares, ya que comparten caractersticas como la produccin de
exopolisacridos, la produccin de cido lctico y la moderada actividad
antimicrobiana contra las cepas patgenas. El grupo (c) incluye la BAL-10 y la
BAL-26, estas cepas comparten caractersticas como la alta produccin de
exopolisacridos, la alta produccin de cido lctico y cido actico. Sin embargo
la principal caracterstica es la excelente actividad inhibitoria contra E.coli, Staphy.
aureus y Salmonella thiphyriu. Por lo que estas cepas podran dirigirse para fines
clnicos en el tratamiento de enfermedades gastrointestinales provocadas por
microorganismos patgenos.
Finalmente el anlisis clster permiti agrupar las cepas de acuerdo sus
caractersticas probiticas con el objeto de conocer sus interrelaciones y as poder
dirigirlas a investigaciones ms especficas.

)I% CONCLUSIONES
De las 24 BAL aisladas de la taberna y caracterizadas en esta
investigacin, 18 cepas fueron capaces de crecer a concentraciones de orden de
10
9
UFC/mL con tiempos de duplicacin cortos (1.16-1.49 h).
Once de las 18 BAL mencionadas anteriormente son capaces de tolerar el
estrs de las condiciones gastrointestinales simuladas alcanzando una
supervivencia por arriba del 60%, por lo que estas BAL fueron seleccionadas para
realizar la caracterizacin metablica.
Todas las cepas seleccionadas mostraron capacidad para desconjugar las
sales biliares. No obstante, la BAL-03, BAL-28, BAL-22, BAL-27A y BAL-25 fueron
las que presentaron mayor actividad.
Se determin que las BAL de la taberna son homofermentativas, por lo que
producen altas cantidades de cido lctico y bajas cantidades de cido actico,
caracterstica que las hace viables para ser usadas en alimentos.
As mismo, se comprobado que las once BAL seleccionadas tienen
actividad antimicrobiana contra E. coli, Salmonella thipymurium y staphylococcus
aureus debida a la alta produccin de cido lctico. Sin embargo, la BAL-10, BAL-
25 y BAL-26 son las que presentan mayor actividad. Adems se determin que la
prueba realizada en esta investigacin para determinar bacteriocinas no es
adecuada.
En el estudio de la produccin de exopolisacridos revel que la BAL-10,
BAL-21 y BAL-27A son las cepas mejores productoras. Sin embargo se determin
que la tcnica no era reproducible con un margen del 10% en la desviacin
estndar debido a que la tcnica es muy sensible.
El anlisis clster permite el agrupamiento de cepas con caractersticas
similares, pero no revela aquellas cepas con mejores atributos probiticos. Sin
embargo es una herramienta til que permite dirigir las cepas futuras
investigaciones especficas.
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