Rezende Rlo

UNIVERSIDADE DE SO PAULO
FACULDADE DE CINCIAS FARMACUTICAS

Programa de Ps-Graduao em Frmaco e Medicamentos
rea de Produo e Controle Farmacuticos

Separao dos enantimeros do cetoprofeno e do
fenoprofeno por CLAE em fase estacionria quiral

Ricardo Leite de Oliveira Rezende

Dissertao para obteno do grau de
MESTRE

Orientadora:
Profa. Tit. Dra. Maria Ins Rocha
Miritello Santoro

So Paulo
2008

RICARDO LEITE DE OLIVEIRA REZENDE

Separao dos enantimeros do cetoprofeno e do fenoprofeno
por CLAE em fase estacionria quiral

Dissertao apresentada Faculdade de
Cincias Farmacuticas da Universidade
de So Paulo para a obteno do ttulo de
Mestre em Frmaco e Medicamentos

rea de Concentrao: Produo e
Controle Farmacuticos
Orientadora: Profa. Tit. Dra. Maria Ins
Rocha Miritello Santoro

So Paulo
2008

Ricardo Leite de Oliveira Rezende

Separao dos Enantimeros do Cetoprofeno e do Fenoprofeno por CLAE em Fase
Estacionria Quiral

Dissertao apresentada Faculdade de
Cincias Farmacuticas da Universidade
de So Paulo para a obteno do ttulo de
Mestre em Frmaco e Medicamentos

rea de Concentrao: Produo e
Controle Farmacuticos

Aprovado em: ____/____/______.

Banca Examinadora

________________________________________
Profa. Tit. Dra. Maria Ins Rocha Miritello Santoro
Faculdade de Cincias Farmacuticas da USP
Orientadora/Presidente

________________________________________
Prof. Dr. J ivaldo do Rosrio Matos
Faculdade de Cincias Farmacuticas da USP
1 Examinador

________________________________________
Profa. Dra. Nadia Maria Volpato
Faculdade de Farmcia da UFRGS
2 Examinador

AGRADECIMENTOS

minha amiga Vanessa Alves Pinheiro, por ter aberto as portas da
Universidade de So Paulo para mim.
Ao meu amigo Maurcio Rocha de Magalhes Sampaio, que com interesses
comuns aos meus, facilitou a minha vinda para esta cidade e a minha permanncia
aqui.
Profa. Dra. Maria Ins Rocha Miritello Santoro, por ter me concedido a
oportunidade de realizar um antigo sonho.
Ao Prof. Dr. Anil Kumar Singh, pela ajuda oferecida no incio deste trabalho.
minha amiga Renata Soares, companheira de mestrado, pela amizade
sincera, confiana e incentivo.
Ao meu colega de ps-graduao Gabriel Lima Barros de Arajo, por fornecer
as amostras de fenoprofeno clcico diidratado (frmaco e medicamento) e por sua
valorosa amizade.
Ao tcnico de laboratrio Renato Vieira do Nascimento J unior, do Instituto de
Qumica da Universidade de So Paulo, pela ajuda com as determinaes do teor
de gua, pelo mtodo de Karl Fischer.
doutoranda Ktia Cirlene Alves Botelho e ao tcnico de laboratrio Charles
Lima Brito, pela ajuda na obteno dos espectros de infravermelho.
doutoranda Simone Schramm Andrade, por me ajudar em diversas
ocasies, sempre com extrema boa vontade.
Ao Prof. Dr. J ivaldo do Rosrio Matos e sua esposa, Profa. Dra. Lucildes
Pita Mercuri, um agradecimento especial, pelo exemplo inspirador, incentivo,

suporte, amizade e por toda ajuda oferecida em diversos momentos, deste e de
outros trabalhos.
minha me, Maria Emlia Leite, por seu amor incondicional e por me ofertar
sempre o amparo emocional e as palavras de encorajamento de que preciso.
Simplesmente, tudo o que sou, ou o que fao, devo a ela.
minha noiva Ana Ferreira Ribeiro, a quem amo tanto, por ter sido desde o
incio a minha maior incentivadora, mas tambm por todo seu amor, carinho e
compreenso.

RESUMO

Durante muito tempo, os frmacos quirais de origem sinttica foram
comercializados predominantemente como racematos. Atualmente, sabe-se que os
enantimeros de um frmaco quiral podem apresentar propriedades
farmacocinticas, farmacodinmicas e toxicolgicas bastante distintas. Assim sendo,
tcnicas analticas enantiosseletivas so fundamentais para a pesquisa e para o
controle da qualidade desses frmacos.
O cetoprofeno e o fenoprofeno so dois frmacos quirais, pertencentes
classe dos agentes antiinflamatrios no-esterides derivados do cido propinico.
Seus enantimeros apresentam significativas diferenas farmacodinmicas. Por
essa razo, pretendeu-se desenvolver, no presente trabalho, mtodos de separao
enantiomrica para ambos os frmacos. Para tanto, utilizou-se a tcnica de
cromatografia a lquido de alta eficincia em fase estacionria quiral (coluna Whelk-
O 1), nos modos normal e reverso. Abordagens uni- e multivariadas foram utilizadas
para desenvolver e otimizar os mtodos de separao.
Pde-se observar que a enantiosseletividade exibida pela coluna Whelk-O 1
em fase normal superior quela exibida em fase reversa. Empregando a CLAE em
fase normal, foi possvel desenvolver mtodos de separao apropriados para os
enantimeros de ambos os frmacos. Em fase reversa, no entanto, apenas os
enantimeros do fenoprofeno puderam ser separados satisfatoriamente.

SUMMARY

For a long time, the synthetic chiral drugs were marketed mainly as
racemates. Currently, it is known that enantiomers of chiral drugs may exhibit quite
different pharmacokinetic, pharmacodynamic and toxicological properties. Therefore,
enantioselective analytical techniques are critical to the research and quality control
of these drugs.
Ketoprofen and fenoprofen are two chiral drugs, belonging to the class of
propionic acid-derived nonsteroidal anti-inflammatory agents. Their enantiomers
show significant pharmacodynamic differences. For that reason, we aimed to
develop, in this work, separation methods for the enantiomers of both drugs. In order
to do so, it was used the high-performance liquid chromatography technique and the
Whelk-O 1 column as the chiral stationary phase, under normal- and reversed-phase
modes. Uni- and multivariate approaches were used to develop and optimize the
separation methods.
It was noted that the enantioselectivity exhibited by the Whelk-O 1 column
under normal-phase mode is higher than that exhibited under reversed-phase mode.
Under normal-phase mode, it was possible to achieve an appropriate separation for
the enantiomers of both drugs. Under reversed-phase mode, however, only the
enantiomers of fenoprofen could be successfully separated.

SUMRIO

1 Introduo ........................................................................................................ 15

2 Reviso da literatura ....................................................................................... 19

2.1 Estereoqumica: a qumica em trs dimenses ........................................... 19
2.1.1 Histrico ................................................................................................ 19
2.1.2 Terminologia bsica da estereoqumica ................................................ 22
2.1.2.1 Outros termos comumente empregados em estereoqumica .......... 27
2.1.3 Nomenclatura dos enantimeros ........................................................... 29

2.2 A importncia biolgica e farmacutica da quiralidade ............................... 33
2.2.1 Quiralidade e farmacodinmica ............................................................. 35
2.2.2 Quiralidade e farmacocintica ............................................................... 39
2.2.3 Quiralidade e estudos de bioequivalncia ............................................. 42
2.2.4 Quiralidade e farmacotcnica ................................................................ 50
2.2.5 A quiralidade no desenvolvimento de novos frmacos ......................... 52

2.3 Cetoprofeno e fenoprofeno: agentes antiinflamatrios no-esterides ....... 62
2.3.1 Caracterizao fsico-qumica dos frmacos ......................................... 69
2.3.1.1 Cetoprofeno ..................................................................................... 69
2.3.1.2 Fenoprofeno clcico diidratado ....................................................... 70

2.4 Tcnicas de separao enantiomrica ........................................................ 72
2.4.1 Tcnicas analticas de separao enantiomrica .................................. 77
2.4.1.1 Tcnicas de eletromigrao em capilares ....................................... 77
2.4.1.2 Tcnicas cromatogrficas ................................................................ 83
2.4.1.2.1 Cromatografia em camada delgada .......................................... 83
2.4.1.2.2 Cromatografia a gs .................................................................. 86
2.4.1.2.3 Cromatografia a fluido supercrtico ............................................ 86
2.4.1.2.4 Cromatografia a lquido de alta eficincia .................................. 88

2.5 Mtodos de separao enantiomrica por CLAE ........................................ 89
2.5.1 Mtodo indireto ...................................................................................... 89
2.5.2 Mtodo direto ........................................................................................ 93

2.6 Princpios do reconhecimento quiral ........................................................... 94

2.7 Fases estacionrias quirais ......................................................................... 95
2.7.1 Fases estacionrias quirais do tipo doador-aceptor .............................. 96
2.7.1.1 A coluna Whelk-O 1 ......................................................................... 98
2.7.2 Fases estacionrias quirais derivadas de polissacardeos .................... 100
2.7.3 Fases estacionrias quirais derivadas de ciclodextrinas ....................... 102
2.7.4 Fases estacionrias quirais derivadas de teres de coroa .................... 104
2.7.5 Fases estacionrias quirais do tipo troca de ligantes ............................ 105
2.7.6 Fases estacionrias quirais derivadas de protenas .............................. 106
2.7.7 Fases estacionrias quirais derivadas de antibiticos glicopeptdicos .. 108
2.7.8 Outras fases estacionrias quirais ........................................................ 109

2.8 Outras tcnicas analticas importantes ....................................................... 110

2.9 Reviso dos mtodos para separao e determinao quantitativa dos
enantimeros do cetoprofeno e do fenoprofeno por CLAE ......................... 115

3 Objetivos .......................................................................................................... 135

4 Justificativas ................................................................................................... 137

5 Materiais e mtodos ....................................................................................... 139

5.1 Materiais ..................................................................................................... 139
5.1.1 Reagentes e solventes .......................................................................... 139
5.1.2 Substncia qumica de referncia ......................................................... 140
5.1.3 Amostras dos frmacos e medicamentos ............................................. 140
5.1.3.1 Frmacos ........................................................................................ 140
5.1.3.2 Medicamentos ................................................................................. 141
5.1.4 Equipamentos ....................................................................................... 142
5.1.5 Consumveis e outros materiais ............................................................ 143

5.2 Mtodos ...................................................................................................... 144
5.2.1 Qualificao dos frmacos: ensaios de identificao ............................ 144
5.2.1.1 Espectroscopia de absoro no infravermelho ............................... 144
5.2.1.2 Espectrofotometria de absoro no ultravioleta .............................. 145
5.2.1.3 Determinao da faixa de fuso ...................................................... 146
5.2.1.4 Ensaio para identificao de clcio ................................................. 146
5.2.1.5 Determinao do teor de gua pelo mtodo de Karl Fischer .......... 147
5.2.1.6 Determinao do teor de gua por termogravimetria ...................... 148
5.2.2 Desenvolvimento do mtodo de separao para os enantimeros do
fenoprofeno por CLAE em fase reversa ................................................ 148
5.2.2.1 Preparao da amostra ................................................................... 148
5.2.2.2 Preparao das fases mveis ......................................................... 149
5.2.2.3 Condies comuns a todos os ensaios ........................................... 150
5.2.2.4 Ensaios preliminares ....................................................................... 150
5.2.2.5 Planejamento fatorial fracionrio ..................................................... 151
5.2.2.6 Planejamento composto central ...................................................... 155
5.2.2.7 Determinao das condies timas para a separao .................. 159
5.2.2.8 Avaliao dos cromatogramas ........................................................ 161
fenoprofeno por CLAE em fase normal ................................................. 163
5.2.3.4 Investigao da seletividade de diferentes modificadores orgnicos 165
5.2.3.5 Otimizao da vazo da fase mvel ............................................... 168
5.2.3.6 Otimizao da temperatura da coluna ............................................ 169
5.2.3.7 Otimizao da quantidade de cido actico empregada na fase
mvel .............................................................................................. 170

cetoprofeno por CLAE em fase reversa ................................................ 171
5.2.4.4 Desenvolvimento do mtodo ........................................................... 173
cetoprofeno por CLAE em fase normal ................................................. 174
5.2.5.4 Ensaios preliminares ....................................................................... 176
5.2.5.5 Planejamento de mistura ................................................................. 177
5.2.5.6 Determinao das condies timas para a separao .................. 180
5.2.5.8 Determinao da ordem de eluio dos enantimeros ................... 182
5.2.6 Aplicao dos mtodos selecionados s amostras de medicamentos .. 183

6 Resultados ....................................................................................................... 185

6.1 Qualificao dos frmacos: ensaios de identificao .................................. 185
6.1.1 Espectroscopia de absoro no infravermelho ...................................... 185
6.1.2 Espectrofotometria de absoro no ultravioleta .................................... 188
6.1.3 Determinao da faixa de fuso ............................................................ 190
6.1.4 Ensaio para identificao de clcio ....................................................... 190
6.1.5 Determinao do teor de gua pelo mtodo de Karl Fischer ................ 192
6.1.6 Determinao do teor de gua por termogravimetria ............................ 193

6.2 Desenvolvimento do mtodo de separao para os enantimeros do
fenoprofeno por CLAE em fase reversa ...................................................... 194
6.2.1 Ensaios preliminares ............................................................................. 194
6.2.2 Planejamento fatorial fracionrio ........................................................... 196
6.2.2.1 Avaliao dos cromatogramas obtidos ............................................ 196
6.2.2.2 Clculo e avaliao dos efeitos ....................................................... 200
6.2.3 Planejamento composto central ............................................................ 208
6.2.3.1 Avaliao dos cromatogramas obtidos ............................................ 208
6.2.3.2 Construo dos modelos matemticos ............................................ 214
6.2.3.3 Avaliao do grau de ajuste dos modelos ....................................... 215
6.2.3.4 Obteno das superfcies de resposta ............................................ 222
6.2.4 Determinao das condies timas para a separao ........................ 225

fenoprofeno por CLAE em fase normal ....................................................... 226
6.3.1 Investigao da seletividade de diferentes modificadores orgnicos .... 226
6.3.2 Otimizao da vazo da fase mvel ...................................................... 230
6.3.3 Otimizao da temperatura da coluna ................................................... 233
6.3.4 Otimizao da quantidade de cido actico empregada na fase mvel 236

cetoprofeno por CLAE em fase reversa ...................................................... 241
6.4.1 Avaliao dos cromatogramas obtidos ................................................. 241

cetoprofeno por CLAE em fase normal ....................................................... 245
6.5.1 Ensaios preliminares ............................................................................. 245
6.5.2 Planejamento de mistura ...................................................................... 247
6.5.2.1 Avaliao dos cromatogramas obtidos ........................................... 247
6.5.2.2 Construo dos modelos matemticos ........................................... 251
6.5.2.3 Avaliao do grau de ajuste dos modelos ....................................... 254
6.5.4 Determinao da ordem de eluio dos enantimeros ......................... 263

6.6 Aplicao dos mtodos selecionados s amostras de medicamentos......... 263

7 Discusso ........................................................................................................ 265

7.1 Qualificao dos frmacos: ensaios de identificao .................................. 265

fenoprofeno por CLAE em fase reversa ...................................................... 268

fenoprofeno por CLAE em fase normal ....................................................... 279

cetoprofeno por CLAE em fase reversa ...................................................... 284

cetoprofeno por CLAE em fase normal ....................................................... 286

7.6 Aplicao dos mtodos selecionados s amostras de medicamentos......... 290

8 Concluses ...................................................................................................... 293

9 Referncias bibliogrficas ............................................................................. 295

15

1. INTRODUO

Durante muito tempo, os frmacos quirais de origem sinttica foram
comercializados predominantemente como racematos. No entanto, graas aos
avanos proporcionados pelas novas tecnologias que se tornaram disponveis a
partir da dcada de 80, permitindo a obteno de enantimeros puros em grandes
quantidades, o interesse e a preocupao com a estereoqumica da ao
farmacolgica tm crescido. Hoje, pode-se dizer que a estereoqumica
reconhecida como uma dimenso essencial da farmacologia. Mais ainda, acredita-se
que a assimetria (ou quiralidade) molecular tenha sido um fenmeno essencial para
o surgimento dos primeiros organismos vivos, e que certamente o para a
manuteno da vida como a conhecemos.
A assimetria molecular permite a ocorrncia de um tipo singular de
isomerismo, o enantiomerismo. Os enantimeros possuem propriedades fsicas
idnticas e apresentam o mesmo comportamento qumico quando em ambientes
aquirais. No entanto, o corpo humano essencialmente quiral, possibilitando, assim,
que enantimeros de um frmaco apresentem propriedades farmacocinticas,
farmacodinmicas e toxicolgicas bastante distintas.
Por essa razo, algumas das principais agncias reguladoras dos mercados
de medicamentos passaram a adotar exigncias especficas para o registro de
novos frmacos quirais e medicamentos que os contenham. Tais exigncias tm por
objetivo obrigar as indstrias a fornecer evidncias cientficas que justifiquem suas
escolhas pela comercializao de um dado racemato, ao invs da comercializao
de um de seus enantimeros em particular. Essa nova postura das agncias
reguladoras conduziu a um declnio dramtico no lanamento de novos racematos,
Introduo

16

alm de estimular a comercializao da forma enantiopura apropriada de antigos
frmacos racmicos.
Atualmente, o nmero de frmacos quirais ultrapassa o nmero de frmacos
aquirais comercializados. Observa-se tambm que os frmacos enantiopuros so
responsveis por uma parcela cada vez maior da fatia do mercado que cabe aos
frmacos quirais. Entretanto, esse crescimento s se tornou possvel devido ao
maior domnio adquirido sobre as snteses assimtricas e, sobretudo, aos enormes
avanos nas tcnicas de separao enantiomrica em escala produtiva.
Paralelamente, as tcnicas analticas capazes de separar e quantificar os
enantimeros tambm se desenvolveram, como uma resposta s exigncias
impostas pela pesquisa, desenvolvimento e comercializao de frmacos
enantiopuros. Dentro desse contexto, tais tcnicas so fundamentais na produo e
no controle da qualidade desses frmacos, onde so aplicadas para garantir a
identidade e a pureza de produtos de partida, intermedirios de sntese e produtos
finais, bem como para assegurar a estabilidade dos prprios frmacos e de seus
medicamentos. Ao mesmo tempo, as tcnicas analticas capazes de separar e
quantificar enantimeros se revelam imprescindveis na pesquisa clnica e pr-clnica
de frmacos quirais, assim como em determinados estudos de bioequivalncia.
Dentre as tcnicas analticas de separao enantiomrica, a cromatografia a
lquido de alta eficincia (CLAE) com o emprego de fase estacionria quiral (FEQ)
merece especial destaque. A CLAE uma tcnica amplamente difundida e que
possui boa aceitao, sendo capaz de oferecer os nveis de exatido e preciso
necessrios s anlises para determinao da pureza enantiomrica de frmacos.
Alm disso, a grande disponibilidade atual de colunas quirais permite encontrar o
Introduo

17

Introduo
seletor quiral adequado para a separao de praticamente qualquer frmaco,
embora essa no seja, necessariamente, uma tarefa fcil.
O cetoprofeno e o fenoprofeno so dois frmacos quirais, pertencentes
classe dos agentes antiinflamatrios no-esterides derivados do cido propinico.
Esses derivados so denominados conjuntamente de profenos. Como os outros
frmacos dessa classe, eles exercem aes antipirtica, analgsica e
antiinflamatria, sendo muito prescritos na prtica mdica. Seus enantimeros
apresentam significativas diferenas farmacodinmicas, as quais conduziram ao
interesse na avaliao do valor teraputico individual dos mesmos. Por essa razo,
alguns dos profenos se encontram disponveis como enantimeros puros, como o
caso do (S)-(+)-cetoprofeno. E a julgar pela tendncia de comercializao de
frmacos na forma enantiomericamente pura, espera-se que o mesmo ocorra com
outros profenos atualmente comercializados como racematos, como o fenoprofeno.
Diante do exposto, ambicionou-se desenvolver, com o presente trabalho,
mtodos de separao enantiomrica para os frmacos, cetoprofeno e fenoprofeno,
os quais pudessem satisfazer s exigncias quanto resoluo mnima necessria
para se determinar quantitativamente, e com exatido aceitvel, os enantimeros de
cada frmaco.

19

2. REVISO DA LITERATURA

2.1 ESTEREOQUMICA: A QUMICA EM TRS DIMENSES

A estereoqumica a subdiviso da qumica que aborda o estudo do arranjo
espacial relativo dos tomos nas molculas.

2.1.1 HISTRICO

As origens da estereoqumica se encontram na primeira metade do sculo
dezenove, quando ento vrios cientistas franceses estudavam os fenmenos da
difrao, interferncia e polarizao da luz. Em particular, a polarizao linear da luz
e a rotao do plano de polarizao despertaram muito rapidamente a ateno dos
cientistas por causa da possvel relao entre esses fenmenos e a estrutura da
matria. Foi o fsico Jean-Baptiste Biot quem descobriu em 1815 a atividade ptica,
que a habilidade, possuda por uma dada substncia, de girar o plano de
polarizao da luz
1
.
Mas foi o cientista francs, Louis Pasteur, quem verdadeiramente deu incio
estereoqumica. poca (1848-1850), Pasteur estava especialmente interessado no
estudo dos cristais e, mais especificamente, num tipo peculiar de cristais: os cristais
hemidricos, cuja geometria caracterstica os faz no possuir um plano de simetria
1
.
Uma nota publicada em 1844 pelo qumico alemo Eilhard Mitscherlich
perturbava Pasteur. Essa nota afirmava que os sais duplos paratartarato e tartarato
Reviso da literatura

20

de sdio e amnio possuam a mesma composio qumica, a mesma forma
cristalina, com os mesmos ngulos, o mesmo peso especfico, a mesma dupla
refrao e, conseqentemente, a mesma inclinao em seus eixos pticos. Quando
dissolvidos em gua, a refrao de ambos era a mesma. Mas o tartarato dissolvido
desviava o plano de polarizao da luz, enquanto o paratartarato era indiferente. A
nota dizia ainda que a natureza e o nmero, bem como o arranjo e as distncias
entre os tomos eram as mesmas. Isso fazia com que, para Pasteur, essas duas
substncias to parecidas (sem, no entanto, serem idnticas) colocassem em dvida
a prpria definio de espcie qumica dada por Chevreul em 1823
1
.
Para Pasteur, Mitscherlich provavelmente se enganara ao no perceber uma
suposta diferena na geometria dos cristais que, ainda segundo Pasteur, deveria
estar relacionada capacidade de desviar o plano de polarizao da luz. Pasteur
desconfiava que o tartarato de sdio e amnio devesse ser hemidrico, como todos
os outros sais do cido tartrico j estudados por ele (e que desviavam o plano de
polarizao da luz) enquanto que o paratartarato no o seria. Ps-se ento a estudar
esses sais e, como desconfiava, os cristais do tartarato eram hemidricos, mas, para
sua surpresa, os cristais do paratartarato tambm o eram. A nica diferena
observada por Pasteur era que, nos cristais do tartarato, todas as facetas
hemidricas se voltavam para a mesma direo, enquanto que, nos cristais do
paratartarato, elas se voltavam ora para a direita, ora para a esquerda
1
.
Pasteur entra ento para a histria ao realizar a primeira resoluo de um
conglomerado racmico: munido de uma lente de aumento e pina, ele separa os
cristais de paratartarato em duas pores, de acordo com a direo para a qual se
voltavam suas facetas hemidricas. E examinando separadamente a soluo desses
diferentes cristais, observou que ambas produziam o mesmo desvio no plano de

21

polarizao da luz, s que em direes opostas. Observou ainda que uma soluo
preparada com a mesma massa de cada um dos dois cristais no produzia nenhum
desvio (ou, em outras palavras, que os desvios se anulavam)
1
.
Como a assimetria dos cristais era destruda com a sua solubilizao, Pasteur
concluiu, corretamente, que a causa dos desvios no plano de polarizao da luz
deveria residir na assimetria das molculas. Foi tambm Pasteur quem, pela
primeira vez, obteve uma resoluo enantiomrica empregando, separadamente, o
mtodo de formao de diasteremeros e o mtodo da fermentao estereosseletiva
por microorganismos
1
.
O desenvolvimento das idias estereoqumicas ingressou em um novo
estgio em 1858, quando August Kekul introduziu suas idias sobre valncia e
ligaes qumicas e props uma forma de represent-las. Sua tese principal era a de
que o carbono era tetravalente e capaz de se ligar a outros tomos de carbono para
formar longas cadeias ou mesmo anis. Os trabalhos de Kekul serviram de base
para que, em 1874, vant Hoff propusesse o modelo tetradrico para o tomo de
carbono ligado a quatro outros tomos, modelo esse que explicava corretamente o
nmero de ismeros encontrados para os metanos di-, tri- e tetrasubstitudos.
Tambm em 1874, Le Bel publicou suas idias estereoqumicas, com uma
abordagem diferente da de vant Hoff e bastante influenciado pelas idias de
Pasteur. Le Bel tratava da assimetria no de tomos individuais, mas de toda a
molcula. Hoje, molculas como os alenos substitudos, os espiranos e os bifenilos
so bastante conhecidas por sua assimetria sem, no entanto, possurem um carbono
assimtrico
1
.


22

2.1.2 TERMINOLOGIA BSICA DA ESTEREOQUMICA

Ismeros so compostos diferentes que possuem a mesma frmula
molecular. Os ismeros se dividem em ismeros constitucionais e estereoismeros
2
.
Os ismeros constitucionais so ismeros que se diferem uns dos outros
em virtude de os seus tomos estarem ligados em ordens diferentes, ou seja,
possuem conectividade diferente
2
. A figura 2.1 apresenta trs compostos que se
relacionam entre si como ismeros constitucionais.

Figura 2.1 Exemplos de ismeros constitucionais: 1-Propanol (I), 2-Propanol (II) e ter etil metlico
(III).

Os estereoismeros so ismeros que diferem somente pela disposio de
seus tomos no espao. Estereoismeros no so ismeros constitucionais, pois
tm os mesmos tomos constitutivos ligados na mesma seqncia. Podem ser
divididos em duas categorias gerais: os enantimeros e os diasteremeros
2
.
Os enantimeros so estereoismeros cujas molculas se relacionam como
imagens especulares que no se superpem. Os enantimeros possuem pontos de
fuso e ebulio idnticos, bem como os mesmos ndices de refrao e espectros de
absoro no infravermelho. Suas velocidades de reao com reagentes aquirais e
solubilidades em solventes aquirais tambm no se diferenciam entre si. Os
enantimeros, no entanto, exibiro comportamento diferente quando interagirem
com outras substncias quirais que se apresentem na forma enantiomericamente

23

pura ou com excesso de um dado enantimero. Os enantimeros tambm tero
comportamento distinto frente luz plano-polarizada. Quando um feixe de luz plano-
polarizada passa por uma soluo de um dado enantimero, o plano de polarizao
gira no espao. Alm disso, os enantimeros provocam o mesmo desvio angular no
plano de polarizao do feixe de luz, mas em sentidos opostos. Diz-se que os
enantimeros, quando separados, so compostos opticamente ativos, em razo de
seu efeito sobre a luz plano-polarizada
2
.
Os enantimeros s ocorrem com os compostos cujas molculas so quirais.
Diz-se que uma molcula quiral quando ela possui a propriedade da quiralidade.
Quiralidade a propriedade geomtrica de um objeto rgido (ou arranjo espacial de
pontos ou tomos) de ser no-sobreponvel sua imagem especular. Se um objeto
(ou molcula) sobreponvel sua imagem especular ento ele denominado
aquiral
2,3
. Em outras palavras, uma molcula aquiral se ela possuir um plano de
simetria. Um plano de simetria se define como um plano imaginrio que corta a
molcula de tal forma que as duas metades sejam uma a imagem especular da
outra
2
.
Uma maneira de reconhecer a possibilidade da existncia de enantimeros
quando a molcula contm um tomo tetradrico ao qual se ligam quatro diferentes
tomos ou grupos de tomos. Esse tomo pode ser chamado de estereocentro ou
centro quiral. Um estereocentro definido como um tomo ao qual esto ligados
grupos de tal natureza que a permuta de quaisquer dois grupos provoca a formao
de um estereoismero
2
. Nem todos os estereocentros, porm, so tetradricos. Os
tomos de carbono centrais (carbonos 2 e 3) do cis- e do trans-2-buteno so
exemplos de estereocentros planos triangulares, pois a permuta dos grupos em
qualquer dos dois tomos tambm produz um estereoismero
2
(figura 2.2).

24

cis-2-Buteno trans-2-Buteno
Figura 2.2 Exemplos de estereocentros planos triangulares no cis- e trans-2-buteno.

Em geral, em se tratando de compostos orgnicos, o termo estereocentro se
refere a um estereocentro tetradrico, a menos que se faa meno em contrrio.
Qualquer tomo tetradrico coordenado a quatro grupos diferentes constitui um
estereocentro, no s o carbono. O silcio e o germnio (ambos no mesmo grupo da
tabela peridica que o carbono), bem como o nitrognio, o fsforo e o enxofre so os
elementos que mais comumente desempenham o papel de estereocentros
2
. A figura
2.3 ilustra trs diferentes situaes onde tomos de carbono exercem o papel de
estereocentros.

Estereocentros Estereocentros
Estereocentro
Figura 2.3 Trs diferentes situaes onde tomos de carbono exercem o papel de estereocentros.

Molculas que no possuem um estereocentro ainda assim podem possuir
uma imagem especular no-sobreponvel, podendo existir como enantimeros.
Essas molculas contm um plano quiral ou eixo quiral e so, portanto, assimtricas

25

em relao quele plano ou eixo. As estruturas dos enantimeros da metaqualona,
um sedativo-hipntico, ilustram esse fato. Nessas molculas h um eixo quiral entre
o tomo de nitrognio ligado ao anel benznico e esse mesmo anel. A assimetria
dessas duas molculas se deve s interaes estricas entre os grupos metila, que
no permitem a livre rotao em torno do eixo quiral
4
. As frmulas estruturais dos
enantimeros da metaqualona so apresentadas na figura 2.4.

(+)-Metaqualona (-)-Metaqualona
Figura 2.4 Enantimeros da metaqualona.

Diasteremeros so estereoismeros cujas molculas no so imagens
especulares uma da outra. Diferentemente dos enantimeros, as propriedades
fsicas e qumicas dos diasteremeros podem diferir e no incomum que possuam
diferentes pontos de fuso e ebulio, ndices de refrao e solubilidades
2,4
.
O diastereoisomerismo comumente observado em molculas com mais de
um estereocentro. Uma regra til para se calcular o nmero mximo de
estereoismeros nos compostos cujo estereoisomerismo provm de estereocentros
tetradricos : o nmero total de estereoismeros no maior do que 2
n
, onde n o
nmero de estereocentros tetradricos. No entanto, uma estrutura com dois
estereocentros nem sempre possuir quatro estereoismeros. Algumas vezes,
possuir apenas trs. Isso acontece porque algumas molculas so aquirais embora

26

tenham estereocentros
2
. Um membro aquiral de um conjunto de diasteremeros que
inclui um ou mais membros quirais denominado composto meso
3
. A figura 2.5
apresenta as estruturas de todos os estereoismeros possveis para o 1,3-
dimetilciclopentano e para o 1,2-dibromocicloexano.

cis-1,3-Dimetilciclopentano trans-1,3-Dimetilciclopentano
Composto meso Enantimeros
cis-1,2-Dibromocicloexano trans-1,2-Dibromocicloexano
Composto meso Enantimeros
Figura 2.5 Estereoismeros possveis para o 1,3-dimetilciclopentano e para o 1,2-
dibromocicloexano.

O isomerismo cis-trans um caso particular de diastereoisomerismo onde
os diasteremeros se diferem pela estereoqumica nos tomos adjacentes a uma
dupla ligao ou em tomos diferentes em um anel. Os prefixos cis e trans so
usados para descrever a relao entre dois ligantes conectados a esses tomos. O
ismero ser tido como um cis-ismero se os dois ligantes se localizarem no mesmo
lado de um plano especfico. Se eles se localizarem em lados opostos, sua posio

27

relativa ser descrita como trans e o ismero ser tido como um trans-ismero. O
plano de referncia apropriado de uma dupla ligao perpendicular quele das
ligaes (sigma) relevantes e passa atravs da dupla ligao. Para um anel, o
plano principal do anel (o anel sendo uma conformao, real ou assumida, sem
ngulos reentrantes nos dois tomos ao qual se conectam os tomos ou grupos
substituintes). Se h mais do que dois substituintes ligados ao anel, o uso de cis e
trans requer a definio de um substituinte de referncia. Para os alcenos, os termos
cis e trans podem ser ambguos e tm sido amplamente substitudos pela conveno
E,Z para a nomenclatura de compostos orgnicos
2,3
.

2.1.2.1 OUTROS TERMOS COMUMENTE EMPREGADOS EM ESTEREOQUMICA

Excesso enantiomrico: Para uma mistura de (+)- e (-)-enantimeros, com a
composio representada pelas respectivas fraes molares (ou em peso) F
(+)
e F
(-)
,
onde F
(+)
+ F
(-)
= 1, o excesso enantiomrico definido como F(+) F(-)e o
excesso enantiomrico em porcentagem, como 100 x F(+) F(-)%.
Freqentemente, esse termo abreviado como e.e.
3
.

Enantiomericamente puro/enantiopuro: Diz-se que uma amostra
enantiomericamente pura ou enantiopura quando todas as suas molculas (dentro
dos limites de deteco) possuem o mesmo senso quiral (mesma configurao
espacial)
3
.


28

Epmeros: So diasteremeros que possuem a configurao oposta em apenas um
de dois ou mais estereocentros tetradricos presentes na respectiva entidade
molecular
3
.

Racemato: a mistura equimolar de um par de enantimeros. O racemato no
exibe atividade ptica. O nome qumico ou frmula de um racemato se distingue
daquele dos enantimeros pelo prefixo ()- ou rac- (ou racem-) ou ainda pelos
smbolos RS ou SR
3
.

Racmico: relativo a racemato
3
.

Composto racmico: um racemato cristalino no qual os dois enantimeros esto
presentes em iguais quantidades em um arranjo bem definido dentro da rede
cristalina de um composto de adio cristalino homogneo
3
.

Conglomerado racmico: uma mistura mecnica equimolar de cristais, os quais
contm apenas um dos dois enantimeros presentes em um racemato
3
.

Racemizao: a produo de um racemato a partir de um material de partida
quiral no qual um enantimero est presente em excesso
3
.

Resoluo: a separao de um racemato nos enantimeros que o compem
3
.


29

Configurao: No contexto da estereoqumica, o termo restrito ao arranjo espacial
de tomos de uma entidade molecular que diferencia os estereoismeros, onde o
isomerismo entre estes ltimos no se deve a diferenas conformacionais
3
.

Conformao: o arranjo espacial (temporrio) de tomos que possibilita a
distino entre estereoismeros os quais podem se interconverter pela rotao em
torno de suas ligaes simples
2,3
.

Os termos citados acima so os mais usuais. Para a relao completa de
termos relacionados estereoqumica, sugere-se uma consulta recomendao da
IUPAC, intitulada Basic Terminology of Stereochemistry, de 1996.

2.1.3 NOMENCLATURA DOS ENANTIMEROS

So trs os principais sistemas de nomenclatura usados para se diferenciar
os enantimeros, cada qual baseado num conjunto diferente de princpios ou regras.

I. Os enantimeros podem ser diferenciados de acordo com o sentido em
que giram o plano da luz plano-polarizada. O nome do enantimero
dextrgiro precedido do prefixo (+)- (ou d-) e isso significa que ele
gira o plano da luz plano-polarizada no sentido horrio. O enantimero
levgiro tem seu nome precedido do prefixo (-)- (ou -) e isso significa
que ele gira o plano da luz plano-polarizada no sentido anti-horrio. J a
magnitude da rotao ptica para um dado par de enantimeros

30

independe da configurao espacial, mas varia com a concentrao do
analito, temperatura, comprimento de onda, solvente, etc
2
.

II. O segundo sistema de nomenclatura difere os enantimeros
correlacionando suas configuraes configurao de um composto de
referncia, arbitrariamente escolhido como padro. Esse composto de
referncia o gliceraldedo. O (+)-gliceraldedo identificado como D-(+)-
gliceraldedo e o (-)-gliceraldedo como L-(-)-gliceraldedo. As
configuraes das molculas podem ser relacionadas entre si atravs de
reaes com a estereoqumica conhecida, como as reaes que no
provocam o rompimento das ligaes de um dado estereocentro. As
molculas tm a mesma configurao relativa quando grupos semelhantes
ou idnticos ocupam a mesma posio no espao. Se suas configuraes
se assemelham ao D-(+)-gliceraldedo, recebem o prefixo D-. Se, por
outro lado, se assemelham ao L-(-)-gliceraldedo, recebem o prefixo L-.
As designaes D e L no se relacionam, necessariamente, com o
sentido da rotao ptica dos compostos aos quais se aplicam. Assim,
pode-se encontrar compostos que sejam D-(+) ou D-(-) e ainda outros que
sejam L-(+) ou L-(-). Esse sistema de identificao, embora apresente
desvantagens, ainda persiste na nomenclatura de acares e
aminocidos, principalmente
2
.

III. Enquanto o primeiro sistema no fornece nenhuma informao quanto
configurao dos enantimeros e o segundo sistema fornece apenas sua
configurao relativa, o terceiro sistema fornece informao quanto

31

configurao absoluta dos enantimeros e permite que qualquer pessoa
conhecedora das regras de nomenclatura reproduza a estrutura de um
dado composto a partir apenas de seu nome qumico especfico. Esse
sistema denominado sistema (R-S) ou sistema Cahn-Ingold-Prelog (em
homenagem aos trs qumicos que o criaram). O R e o S vm das
palavras latinas rectus e sinister, significando direito e esquerdo,
respectivamente. Com base nesse sistema, o nome qumico tradicional
acrescido dos prefixos (R)- ou (S)- de acordo com a configurao dos
enantimeros
2
. Esse sistema de identificao adota o seguinte
procedimento:

a. Cada um dos quatro grupos ligados ao estereocentro numerado de
acordo com a sua prioridade. A prioridade atribuda, inicialmente,
com base no nmero atmico do tomo diretamente ligado ao
estereocentro. O grupo cujo tomo diretamente ligado ao estereocentro
possui o maior nmero atmico tem a maior prioridade e recebe o
nmero 1; o grupo cujo tomo diretamente ligado ao estereocentro
possui o segundo maior nmero atmico tem a prioridade seguinte e
recebe o nmero 2; e assim sucessivamente. No caso de istopos, o
istopo com a maior massa atmica tem a prioridade mais elevada
2
.

b. Quando dois ou mais tomos diretamente ligados ao estereocentro
possurem o mesmo nmero atmico, consideram-se os outros tomos
sucessivos presentes nos grupos e que no foram hierarquizados. O
processo continua at que se possa tomar uma deciso. Atribui-se a

32

prioridade com base no primeiro ponto de diferena (por diferena se
entende um tomo com maior nmero atmico). As regras para uma
cadeia ramificada exigem que seja seguida a cadeia com os tomos de
prioridade mais elevada
2
.

c. Orienta-se a frmula (ou o modelo) de modo que o grupo com a
prioridade mais baixa fique no ponto mais distante possvel em relao
ao observador
2
.

d. Traa-se ento uma curva ligando o grupo de nmero 1 ao grupo de
nmero 2 e este, por fim, ao de nmero 3. Se, nesse traado, o sentido
for horrio, o enantimero identificado por (R)-. Se o sentido for
anti-horrio, o enantimero identificado por (S)-
2
. A figura 2.6 ilustra
a aplicao do sistema Cahn-Ingold-Prelog de nomenclatura.

(S)-Alanina
Figura 2.6 Exemplo da aplicao do sistema de nomenclatura Cahn-Ingold-Prelog ao aminocido
(S)-alanina.

No caso de compostos com grupos contendo ligaes duplas ou triplas,
esses grupos so hierarquizados como se os dois tomos envolvidos

33

nessas ligaes fossem duplicados ou triplicados, respectivamente, ou
seja:
como se fosse

e
como se fosse

onde os smbolos entre parntesis so representaes duplas ou triplas
dos tomos na extremidade oposta da ligao mltipla. Dessa forma, o
grupo vinila tem prioridade mais elevada que o grupo isopropila, por
exemplo
2
. Existem outras regras para estruturas mais complexas, mas que
no sero apresentadas aqui.

2.2 A IMPORTNCIA BIOLGICA E FARMACUTICA DA QUIRALIDADE

A quiralidade aceita hoje como um dos principais pr-requisitos para a
existncia de vida seja na Terra, seja fora dela
5
. E, de fato, a quiralidade um
fenmeno que permeia todo o universo
2
. A vida essencialmente assimtrica, das
partculas elementares microscpicas aos nveis molecular e macroscpico
6
.
Nos anos 50, os fsicos puderam observar o fenmeno da quiralidade entre as
partculas elementares, as mesmas que compem as biomolculas, ao descobrirem
que os eltrons emitidos durante o decaimento (beta) de ncleos radioativos so
predominantemente levgiros
6
.

34

Alm disso, a maioria das molculas que constituem os seres vivos quiral e,
usualmente, apenas uma forma de cada molcula quiral ocorre numa determinada
espcie. Todos os 20 aminocidos que constituem as protenas de ocorrncia
natural, exceto um, so quirais, e todos so classificados como esquerdos
2
. Os
processos qumicos nas clulas vivas dependem dessas assimetrias e as mantm,
uma vez que so dirigidos por catlise enzimtica. As enzimas so molculas
proticas que possuem uma complexa estrutura tridimensional, capaz de fornecer
um stio ativo onde os substratos podem se encaixar. Apenas molculas com a
forma correta podem participar de reaes catalisadas por enzimas. Dessa maneira,
enzimas constitudas de L-aminocidos podem sintetizar mais L-aminocidos
7
. J as
molculas dos acares naturais so quase todas classificadas como direitas,
inclusive a desoxirribose, que o acar que ocorre no ADN (cido
desoxirribonuclico). O prprio ADN tem estrutura helicoidal e todos os ADNs que
ocorrem naturalmente espiralam para a direita
2
.
Recentemente, foi demonstrado que a escolha dos organismos vivos
terrestres pelos cidos nuclicos dextrgiros baseados em D-acares e pelas
protenas dextrgiras baseadas em L-aminocidos poderia ser devida ao campo de
fora helicoidal dextrgiro gerado pela quiralidade orbital da Terra (QOT), que faz
com que os enantimeros helicoidais dextrgiros sejam mais estveis que os
correspondentes enantimeros helicoidais levgiros. Esse campo de fora gerado
principalmente pelos movimentos de rotao e translao da Terra, ambos
dextrgiros. Como o campo gerado pela QOT sofre mudanas peridicas num dado
ponto da superfcie terrestre medida que o tempo evolui, a estabilidade e a
atividade das biomolculas helicoidais tambm se alteram e dariam origem aos
ritmos biolgicos nos organismos vivos
6
.

35

A vida tambm quiral em nvel macroscpico. As conchas marinhas so
quirais e as helicoidais tm uma hlice dextrgira. Muitos vegetais exibem
quiralidade na forma como se enroscam nos elementos de apoio e, por razes ainda
desconhecidas, a maioria das pessoas destra
2
.
Por fim, sabe-se que os enantimeros podem apresentar aes diferenciadas
quando interagem com seres vivos
8
. Um bom exemplo o composto denominado
limoneno; uma de suas formas enantiomricas a principal responsvel pelo odor
de laranja, enquanto a outra responsvel pelo odor de limo
2
. Outro exemplo
dado pelos feromnios quirais, que so substncias empregadas para comunicao
por alguns animais, onde um dos enantimeros geralmente bioativo, enquanto o
outro inativo ou antagoniza a atividade do primeiro
8
. O mesmo acontece com os
frmacos quirais, geralmente caracterizados por diferentes atividades
farmacolgicas, podendo apresentar tambm diferentes perfis farmacocinticos.

2.2.1 QUIRALIDADE E FARMACODINMICA

A maioria dos frmacos tem sua ao explicada com base na teoria dos
receptores. As molculas receptoras no organismo so protenas que exibem alta
afinidade por ligantes de certa estrutura molecular, de modo anlogo ligao
enzima-substrato. A ligao de um substrato a um receptor aciona um mecanismo
que se manifesta como uma resposta biolgica. Esse mecanismo pode ser uma
modificao na atividade de uma enzima ou o transporte de ons, etc. Qualquer que
seja sua funo fisiolgica, os receptores tm algo em comum: so molculas quirais

36

e podem, portanto, ser enantiosseletivos em suas ligaes com molculas
mensageiras
9
.
A enantiosseletividade na interao frmaco-receptor foi proposta por Cushny
em 1926, segundo o qual a diferena na atividade biolgica entre dois enantimeros
seria devida ligao destes a stios de mesma quiralidade. Suas idias,
posteriormente, inspiraram o amplamente aceito modelo de contato em trs pontos.
Segundo esse modelo, o enantimero mais ativo se ajusta melhor ao receptor
porque seus trs grupos, XYZ, adjacentes ao estereocentro, se apresentam numa
seqncia tal que melhor corresponde seqncia formada pelos grupos XYZ que
representam os pontos de ligao no stio de ligao quiral do receptor protico. O
enantimero menos ativo seria incapaz ento de se ligar to efetivamente ao
receptor, uma vez que representa a imagem especular do enantimero mais ativo. A
figura 2.7 ilustra a ligao dos enantimeros ao receptor, segundo o modelo de
contato em trs pontos. Esse mesmo modelo foi aplicado mais tarde para a
compreenso da especificidade enzimtica e tambm serviu de base para a
compreenso da separao cromatogrfica de enantimeros em colunas quirais
9
.

Enantimero R Enantimero S
Stio de ligao do receptor Stio de ligao do receptor
Figura 2.7 Ligao de enantimeros ao receptor, segundo o modelo de contato em trs pontos.

37

Pode-se dizer que quanto melhor o encaixe ou a ligao do frmaco com o
receptor, melhor o frmaco. Alm disso, se ambos os enantimeros conseguem se
encaixar no stio ativo, ento provvel que nenhum dos dois tenha um bom
encaixe. H ainda uma relao entre a afinidade de um frmaco por seu receptor e a
dose efetiva necessria para que sua ao farmacolgica seja observada. A assim
chamada regra de Pfeiffer diz que quanto menor a dose efetiva de um frmaco,
maior a diferena na ao farmacolgica entre os ismeros pticos do qual o
frmaco faz parte
9
.
razo entre a atividade do enantimero mais ativo (tambm chamado
eutmero) e aquela do enantimero menos ativo (tambm chamado distmero), d-
se o nome de razo eudsmica. H uma relao direta entre a razo eudsmica e a
potncia de um frmaco; que , quanto maior a razo eudsmica, mais potente o
frmaco ou menor sua dose efetiva. O desenvolvimento desse conceito
demonstrou que a enantiosseletividade na ao biolgica a regra e no a
exceo
9
.
Vrias situaes podem ser encontradas no que diz respeito ao
farmacolgica de enantimeros:

I. Toda a atividade farmacolgica devida a apenas um dos enantimeros.
Um exemplo desse caso a -metildopa, onde toda a atividade anti-
hipertensiva se deve ao (S)-ismero. Se considerarmos o (R)-ismero
inativo, devemos entender a inatividade como limitada aos testes
farmacolgicos realizados. O (R)-ismero pode ser considerado, nesse
caso, como uma impureza isomrica
9
.


38

II. Os enantimeros possuem idntica atividade farmacolgica, tanto
qualitativamente, como quantitativamente. A prometazina ilustra esse fato;
seus ismeros possuem propriedades quase equivalentes quanto ao
anti-histamnica e toxicidade
9
.

III. Os enantimeros possuem a mesma ao farmacolgica, mas potncias
diferentes. Os bloqueadores -adrenrgicos, como o propranolol,
exemplificam esse caso. A razo eudsmica entre os ismeros do
propranolol igual a 130, sendo o (S)-(-)-propranolol o enantimero mais
ativo
9
.

IV. Os enantimeros possuem diferentes aes farmacolgicas, mas que so
desejveis terapeuticamente. Nessa categoria se encontram os
enantimeros quinidina e quinina, com aes antiarrtmica e antimalrica,
respectivamente. O propoxifeno outro exemplo, onde o
dextropropoxifeno um agente analgsico e o levopropoxifeno, que
desprovido de ao analgsica, empregado como antitussgeno
9
.

V. Um dos enantimeros responsvel pela ao farmacolgica almejada e
o outro pelos efeitos colaterais indesejados. Vrios so os enantimeros
que se enquadram nesse grupo. O exemplo mais conhecido talvez seja o
da talidomida, onde o (R)-ismero tem ao sedativa e o (S)-ismero
responsvel por anomalias fetais
9
.


39

VI. A ao farmacolgica de um enantimero, ou mesmo seu efeito colateral,
antagonizada pelo outro enantimero. Como exemplo, o (R)-(+)-
enantimero do diurtico indacrinona apresenta o efeito colateral de reter
o cido rico, j o (S)-(-)-enantimero age como uricosrico, promovendo
a secreo de cido rico e, dessa forma, combatendo o efeito colateral
do (R)-ismero
9
.

Embora boa parte da diferena observada nas atividades farmacolgicas dos
enantimeros possa ser atribuda s suas diferentes afinidades pelos receptores,
essa tambm pode ser devida estereosseletividade presente nas diversas etapas
farmacocinticas.

2.2.2 QUIRALIDADE E FARMACOCINTICA

A farmacocintica a parte da farmacologia que estuda os processos de
absoro, distribuio, metabolizao e eliminao dos frmacos. Os processos de
absoro, distribuio e eliminao so fenmenos que geralmente no diferenciam
entre os enantimeros. No entanto, se o frmaco interage com uma enzima ou
sistema de transporte, ento pode haver discriminao quiral e, com isso, diferenas
farmacocinticas entre os enantimeros podem ser observadas.
Os processos farmacocinticos so regulados, em parte, pelo transporte
atravs de barreiras epiteliais. A pele e o trato gastrintestinal representam barreiras
epiteliais importantes absoro de um frmaco
10
. Durante a absoro pode ocorrer
estereosseletividade, principalmente se o frmaco se assemelhar a um nutriente

40

para o qual sistemas de transporte ativo esto disponveis; exemplos incluem a L-
dopa, o L-metotrexato e a L-cefalexina
11
.
O transporte atravs de clulas epiteliais tambm pode afetar a distribuio
de um frmaco. Por exemplo, sistemas de transporte no epitlio do plexo coride
podem ser necessrios para que um frmaco atinja o fluido crebro-espinhal e o
transporte atravs dos capilares especializados da barreira hematoenceflica
importante na distribuio de frmacos ao crebro
10
. A estereosseletividade tambm
pode ser observada, durante a distribuio, como conseqncia da ligao
preferencial de um dos enantimeros s protenas plasmticas (especialmente a
albumina e, em menor extenso, a glicoprotena
1
-cida), alm de protenas
teciduais
11
. Como, de um modo geral, apenas a frao livre (ou no ligada) do
frmaco capaz de atravessar as membranas celulares para exercer sua ao
teraputica, ou para ser metabolizada, fatores capazes de influenciar a ligao do
frmaco s protenas plasmticas podem afetar significativamente sua
farmacocintica e farmacodinmica
12
.
No tocante eliminao renal dos frmacos, espera-se que a filtrao
glomerular de estereoismeros livres no plasma seja a mesma para cada ismero.
Entretanto, a secreo e absoro ativas do frmaco nos tbulos renais podem
apresentar estereosseletividade, como j foi demonstrado para o metoprolol, o
pindolol e a cloroquina
11
. O (S)-(-)-enantimero do pindolol, por exemplo, tem uma
depurao renal 30% maior que a do (R)-(+)-enantimero
10
. No geral, essas
diferenas tendem a ser modestas, com as razes enantiomricas da ordem de dois
ou menos
11
; entretanto, excees a essa generalizao existem, como a quinidina
que depurada quatro vezes mais rapidamente que a quinina
10
. J para a
ocorrncia de excreo biliar, os frmacos tm de atravessar duas diferentes

41

membranas do hepatcito, a sinusoidal e a canalicular, onde os sistemas de
transporte podem novamente ter papel relevante
10
.
No entanto, a contribuio mais importante para as diferenas nos perfis
farmacocinticos de uma mistura de ismeros ocorre, geralmente, como resultado
da estereosseletividade em seu metabolismo. Esse fato no chega a ser
surpreendente, uma vez que as reaes de biotransformao envolvem a interao
direta entre um substrato e uma enzima quiral. Nessas reaes, um ismero pode
ser metabolizado mais rapidamente que o outro, ou um estereoismero em particular
pode ser produzido preferencialmente. Podem ainda ocorrer ambas as situaes,
onde um enantimero preferencialmente metabolizado para formar um
determinado ismero em particular
11
.
As conseqncias estereoqumicas das reaes de biotransformao se
enquadram em uma das seguintes categorias:

I. Um centro proquiral de uma molcula simtrica metabolizado de maneira
a formar preferencialmente um de dois enantimeros possveis
11
.

II. Os enantimeros so metabolizados de maneiras distintas, onde as
transformaes so observadas em stios da molcula distantes do centro
quiral, de modo que a molcula original quiral e o produto de sua
biotransformao tambm o
11
.

III. Um diasteremero formado pela introduo de um segundo centro quiral
molcula original do frmaco. Isso pode se dar atravs de reaes de
funcionalizao (tambm chamadas de reaes de fase I) em um centro

42

proquiral ou atravs de reaes de conjugao (fase II) com um agente de
conjugao quiral, como o cido glicurnico
11
.

IV. O substrato sofre uma transformao no centro quiral que resulta na perda
da assimetria, onde, como resultado, temos um metablito aquiral
11
.

V. O substrato quiral bioconvertido em sua imagem especular, sem
nenhuma outra mudana em sua estrutura, o que recebe o nome de
inverso quiral. Alguns frmacos da classe dos antiinflamatrios derivados
do cido propinico, coletivamente conhecidos como profenos, sofrem
inverso quiral
11
.

2.2.3 QUIRALIDADE E ESTUDOS DE BIOEQUIVALNCIA

O termo biodisponibilidade se aplica velocidade e extenso em que um
frmaco absorvido e se torna disponvel no local de ao. O termo bioequivalncia
se refere comparao entre as biodisponibilidades de diferentes formulaes, ou
lotes do mesmo produto farmacutico. A avaliao da biodisponibilidade de
medicamentos ou formulaes requer o monitoramento da concentrao do frmaco
no plasma (ou no soro) e/ou na urina
13
.
A importncia de mtodos de doseamento enantiosseletivos no estudo dos
processos farmacocinticos, farmacodinmicos e de interao entre frmacos
amplamente reconhecida e vrias revises recentes destacaram o papel que a
quiralidade exerce nesses processos, bem como a importncia da

43

enantiosseletividade em explicar resultados atpicos na relao concentrao-efeito
e na interao entre frmacos, em se tratando de frmacos racmicos. No entanto, a
necessidade de mtodos de doseamento enantiosseletivos em estudos de
bioequivalncia permanece sendo objeto de debates e controvrsias
14
.
Aqueles que defendem o uso dos mtodos enantiosseletivos de doseamento
o fazem com base no argumento de que, se a atividade farmacolgica ou a
toxicidade de um racemato devida inteira ou predominantemente a um dos
enantimeros, os estudos de bioequivalncia devem ento se fundamentar na
concentrao do ismero ativo, ao invs de se fundamentarem na concentrao total
dos ismeros (ativo + menos ativo ou inativo). Em favor desse argumento est o fato
de que hoje se encontram comercialmente disponveis excelentes reagentes para
derivatizao quiral, bem como vrias FEQs, o que torna possvel o desenvolvimento
de mtodos analticos enantiosseletivos para vrios frmacos quirais
15
.
J aqueles que so contrrios ao uso de mtodos enantiosseletivos em todos
os estudos de bioequivalncia argumentam que os mtodos enantiosseletivos
poderiam acrescentar uma maior dificuldade ao estudo, bem como iriam encarec-
lo, sem nenhuma vantagem aparente. Adicionalmente, argumentam que a
determinao individual de cada ismero no mudaria o resultado do estudo, em
virtude de os estudos tradicionais de bioequivalncia serem baseados em
planejamentos cruzados (crossover design) em que a mistura de ismeros
administrada na mesma proporo para todos os indivduos, nos quais a
concentrao mxima e a rea sobre a curva so comparadas sob condies
idnticas depois da administrao dos produtos teste e referncia
15,16
.
Entretanto, apesar das diferentes opinies que cercam o assunto, parece
haver um consenso geral de que no h a necessidade do emprego de mtodos

44

enantiosseletivos na determinao da bioequivalncia para racematos onde os
enantimeros so qualitativa e quantitativamente semelhantes em suas aes
farmacolgicas, toxicidades e perfis farmacocinticos
15
.
A primeira recomendao acerca do uso de mtodos enantiosseletivos de
doseamento, em estudos de bioequivalncia de medicamentos contendo frmacos
racmicos, foi proposta por uma agncia reguladora sueca, a Medicinal Product
Agency, em 1991. Em 1992, novas recomendaes foram propostas numa
conferncia intitulada Analytical Methods Validation: Bioavailability, Bioequivalence
and Pharmacokinetic Studies, ocorrida em Crystal City, Washington, nos Estados
Unidos. Tambm em 1992, num artigo de Nerukar et al., do U.S. Office of Generic
Drugs, foi declarado que esse escritrio, subordinado Food and Drug
Administration (FDA), no desejava impor o emprego de mtodos enantiosseletivos,
como exigncia para os estudos de bioequivalncia, na ausncia de razes que o
justificassem. No entanto, as razes que justificariam o emprego desses mtodos
no foram descritas em detalhes no artigo em questo. No ano seguinte, foi a vez de
a Comunidade Europia publicar um guia declarando que estudos de
bioequivalncia para o registro de genricos contendo frmacos quirais deveriam ser
baseados em mtodos enantiosseletivos de doseamento, a menos que os
enantimeros apresentassem cinticas lineares
14
.
Em 1996, Karim
17
publicou uma avaliao crtica das primeiras
recomendaes acerca do emprego de mtodos enantiosseletivos nos estudos de
bioequivalncia de medicamentos contendo frmacos racmicos e, diante das
limitaes dessas recomendaes, props um algoritmo com base no qual se pode
decidir quando tais mtodos devem ser empregados. De acordo com o algoritmo

45

proposto, os mtodos enantiosseletivos devem ser usados em apenas duas
situaes:

I. Quando o eutmero sofre elevado metabolismo de primeira passagem,
produzindo mudanas na razo plasmtica entre os enantimeros
relacionadas velocidade de absoro. (Razes plasmticas variveis so
observadas quando os processos de distribuio, metabolizao e/ou
eliminao so saturveis e os fatores que contribuem para essa variao,
alm da velocidade de absoro, incluem a via de administrao e a dose
administrada). Nessa situao, o algoritmo sugere que as concentraes
do eutmero e total (eutmero + distmero) devem ser determinadas. O
principal argumento, nesse caso, para a determinao da concentrao
plasmtica do eutmero, que a concentrao plasmtica total
determinada por mtodos no-enantioespecficos vai refletir
principalmente a concentrao do enantimero menos ativo.

II. Quando o eutmero sofre pequeno metabolismo de primeira passagem se
comparado ao metabolismo de primeira passagem que ocorre com o
distmero, e uma razo plasmtica especfica entre os enantimeros
importante para que o efeito teraputico timo seja alcanado. Nesse
caso, as caractersticas do metabolismo alteram a concentrao relativa
entre os enantimeros, favorecendo o aumento na concentrao do
ismero mais ativo. Nessa situao, o algoritmo sugere que as
concentraes de cada enantimero sejam determinadas separadamente.

46

Em 1997, foi a vez de Mehvar e Jamali
18
recomendarem o emprego de
mtodos enantiosseletivos nos estudos de bioequivalncia para os casos em que os
enantimeros apresentem farmacocintica no-linear ou em que os enantimeros
apresentem diferenas significativas no perfil farmacocintico, mesmo que possuam
farmacocintica linear. Esses autores tambm sugeriram o emprego dessa
abordagem para frmacos racmicos passveis de inverso quiral e para a maioria
dos medicamentos de liberao modificada que contenham enantimeros. Por outro
lado, ainda de acordo com esses autores, mtodos no enantiosseletivos seriam
adequados nos estudos de bioequivalncia para frmacos racmicos com
farmacocintica linear e enantiosseletividade mnima a moderada em seus
parmetros farmacocinticos.
As atuais recomendaes em vigor da European Medicines Agency
(EMEA)
19,20
e da FDA
21
acerca da conduo de estudos de bioequivalncia de
medicamentos contendo frmacos racmicos so conflitantes. A EMEA recomenda
que todos os estudos de bioequivalncia para registro de medicamentos genricos
contendo frmacos quirais devem ser baseados em mtodos analticos
enantiosseletivos, a menos que:

I. O medicamento candidato a genrico e o de referncia contenham apenas
um dos enantimeros como substncia ativa, sendo os enantimeros
idnticos e estveis em ambos os produtos.

II. Ambos os produtos contenham o racemato, onde os dois enantimeros
que o compem apresentam farmacocinticas lineares.


47

Por outro lado, a FDA recomenda o emprego de mtodos no-
enantiosseletivos nos estudos de bioequivalncia. Os mtodos enantiosseletivos so
indicados apenas quando todas as condies descritas a seguir so atendidas,
sendo, ento, os critrios de bioequivalncia aplicados aos ismeros
separadamente. As condies so:

I. Os enantimeros exibem diferentes caractersticas farmacodinmicas;

II. Os enantimeros exibem diferentes caractersticas farmacocinticas;

III. A eficcia/segurana se deve fundamentalmente ao enantimero presente
em menor concentrao plasmtica;

IV. O processo de absoro no-linear para pelo menos um dos
enantimeros (o que evidenciado por mudanas na concentrao
relativa entre os enantimeros em razo de mudanas na velocidade de
absoro do frmaco).

O ibuprofeno um frmaco capaz de ilustrar as divergncias entre ambas as
recomendaes
22
. Segundo as recomendaes da EMEA, um estudo de
bioequivalncia entre medicamentos formulados com ibuprofeno racmico deveria
ser conduzido com mtodos enantiosseletivos, j que os enantimeros desse
frmaco podem demonstrar farmacocinticas no-lineares. No entanto, de acordo
com a FDA, mtodos enantiosseletivos no seriam necessrios, j que, nesse caso,
o eutmero no o enantimero que apresenta a menor concentrao plasmtica.

48

Em um estudo onde o ibuprofeno foi utilizado como modelo, Garcia-Arieta et
al.
22
concluram que os mtodos no-enantiosseletivos seriam adequados para
estudos de bioequivalncia entre medicamentos desse frmaco, desde que as
velocidades de absoro no diferissem muito entre os dois produtos. Contudo, os
autores ressaltaram que as informaes a respeito das velocidades de absoro so
desconhecidas a priori. Esse estudo tambm demonstrou que mtodos no-
enantiosseletivos so capazes de mascarar a real diferena entre as formulaes,
em relao exposio ao eutmero, no apenas quando a razo plasmtica
eutmero/distmero muito pequena, mas tambm quando essa razo est acima
ou prxima a uma unidade. Esse fato levanta questionamentos em relao terceira
condio a ser atendida, segundo as recomendaes da FDA, para o emprego de
mtodos enantiosseletivos nos estudos de bioequivalncia.
Garcia-Arieta et al.
22
sugeriram ainda que mtodos enantiosseletivos devem
ser empregados quando a velocidade de absoro afetar a razo plasmtica entre
os enantimeros, uma vez que, ainda segundo os autores, quantificaes do
eutmero so mais capazes de detectar diferenas entre as formulaes, mesmo
que isso signifique, a princpio, resultados menos precisos. Os autores afirmam
ainda que a preciso poderia ser melhorada com o aumento do tamanho da amostra
(nmero de voluntrios) ou com o aumento do nmero de replicatas (nmero de
vezes em que repetida a quantificao dos enantimeros nas amostras), ao passo
que a exatido seria prejudicada se o racemato fosse escolhido como um marcador
substituto, j que este seria tendencioso.
Pelo acima exposto, fica evidente a necessidade de uma harmonizao entre
as atuais recomendaes internacionais em vigor, no tocante realizao dos
estudos de bioequivalncia. Cabe aqui ressaltar tambm que o Brasil, representado

49

pela Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria (ANVISA), ainda no dispe de
legislao prpria que, de maneira especfica, regulamente ou oriente a conduo
dos estudos de bioequivalncia de medicamentos contendo frmacos quirais. Nesse
contexto, o algoritmo desenvolvido por Karim
17
e as sugestes apresentadas por
Mehvar e Jamali
18
seriam um bom ponto de partida para as discusses necessrias
harmonizao das recomendaes existentes (bem como para o posicionamento
da ANVISA).
Parece racional supor que, qualquer que seja o texto final de uma
recomendao harmonizada, ele deveria contemplar a relevncia que o metabolismo
de primeira passagem pode exercer sobre a razo enantiomrica plasmtica, bem
como a importncia da possvel saturabilidade dos diversos processos envolvidos na
disposio dos enantimeros (distribuio, metabolismo e eliminao). Alm disso, a
influncia de outros fatores, como a dose administrada, a velocidade de absoro e
a inverso quiral, deve ser considerada.
At que haja essa harmonizao, o papel da quiralidade nos estudos de
bioequivalncia precisa continuar sendo objeto de pesquisas e debates; e ainda que
a necessidade de utilizao de mtodos enantiosseletivos se apresente mais como
exceo do que regra nesses estudos, para alguns frmacos racmicos tais
mtodos so fundamentais, especialmente em se tratando de formas farmacuticas
de liberao modificada.

50

2.2.4 QUIRALIDADE E FARMACOTCNICA

Algumas propriedades fsicas entre racematos e seus respectivos
enantimeros puros podem apresentar diferenas significativas, especialmente se as
substncias se encontram na forma cristalina. Comumente, observa-se que os
racematos apresentam pontos de fuso superiores queles de seus enantimeros
puros. Essa observao provavelmente se deve a uma organizao mais eficiente
das molculas dentro da rede cristalina nos compostos racmicos. Essa organizao
mais eficiente, por outro lado, leva a uma diminuio na solubilidade do composto
racmico em relao aos seus enantimeros puros. Em se tratando de frmacos
quirais, essa diferena de solubilidade, por sua vez, pode afetar a dissoluo do
frmaco a partir da forma farmacutica, o que, conseqentemente, capaz de
alterar a velocidade de absoro do mesmo pelo organismo. Dessa forma, para
contornar problemas de solubilidade, pode ser vantajoso utilizar-se do enantimero
puro ao invs do composto racmico. Entretanto, os compostos racmicos e seus
respectivos enantimeros puros formam, freqentemente, tipos diferentes de cristais;
portanto, em se tratando de formulaes slidas, a substituio de um pelo outro
capaz de alterar as caractersticas de fluidez da mistura frmaco-excipiente, o que
pode ser relevante no processo de produo do medicamento. J o ponto de fuso
geralmente mais baixo dos enantimeros puros pode significar uma melhor
penetrabilidade cutnea quando comparados aos compostos racmicos, o que faz
com que os primeiros sejam mais atrativos para o desenvolvimento de formulaes
transdrmicas
23
.
Por outro lado, um medicamento contm, normalmente, um ou mais
excipientes, que so usados para conferir estabilidade, facilitar a manipulao e a

51

administrao do frmaco, conferir caractersticas organolpticas aceitveis, etc.
Vrios dos excipientes comumente empregados so quirais, como os acares, a
celulose, o alginato e as ciclodextrinas. H, portanto, a possibilidade de interaes
diastereomricas entre frmacos e excipientes quirais, que podem resultar em perfis
de liberao diferentes entre dois enantimeros, especialmente em formulaes de
liberao sustentada. Quando essas formulaes so empregadas para veicular
racematos, o racemato, ao dissolver-se na gua que penetra na matriz de liberao
lenta, forma um ambiente quiral semelhante ao encontrado nas colunas
cromatogrficas quirais. Nessas circunstncias, os enantimeros podem ser
liberados a diferentes velocidades
23
.
Nos ltimos dez anos, alguns trabalhos
24-27
investigaram a
enantiosseletividade na liberao dos enantimeros do cetoprofeno a partir de
matrizes contendo derivados quirais da celulose, especialmente a
hidroxipropilmetilcelulose (HPMC). Esses trabalhos puderam comprovar a interao
preferencial entre a HPMC e um dos enantimeros do cetoprofeno, resultando em
velocidades de liberao diferentes para cada um dos enantimeros. Para formas
farmacuticas slidas de uso oral, a velocidade de absoro do frmaco depende da
velocidade com a qual o mesmo liberado pela forma farmacutica. Diferentes
velocidades de liberao podem resultar em diferentes velocidades de absoro.
Como j discutido anteriormente, no item 2.2.3, a evidncia de absoro
enantiosseletiva ou a formao de complexos entre frmacos e excipientes quirais
que resulte em dissoluo enantiosseletiva pode exigir a aplicao de mtodos
enantiosseletivos nos estudos de bioequivalncia. No entanto, diferentes
velocidades de liberao podem, em alguns casos, no apresentar grande
relevncia clnica ou biofarmacutica
26
. De qualquer maneira, o emprego de

52

excipientes quirais oferece uma linha de pesquisa para o desenvolvimento de formas
farmacuticas especialmente planejadas para liberarem seus frmacos
enantiosseletivamente.

2.2.5 A QUIRALIDADE NO DESENVOLVIMENTO DE NOVOS FRMACOS

Atualmente, a importncia e as implicaes da quiralidade no
desenvolvimento de novos frmacos so bem reconhecidas, seja no meio
acadmico, industrial ou regulatrio. H alguns anos, o desenvolvimento de
medicamentos contendo apenas o enantimero mais ativo no era considerado
vivel
28
. Contudo, aps dcadas de farmacologia e teraputica essencialmente
bidimensionais, nas quais o arsenal teraputico era dominado por racematos, uma
redescoberta da estereoqumica ocorreu no incio da dcada de 80. Essa
redescoberta foi motivada pelo surgimento de novas tecnologias que possibilitaram a
preparao de enantimeros puros em quantidade, levando a um interesse
renovado pelo papel da estereoqumica na ao dos frmacos
29
.
Hoje, h dois mtodos bsicos para a produo de enantimeros, que so: a
sntese assimtrica e a separao de misturas racmicas. Ambos so capazes de
fornecer enantimeros em pequena ou em larga escala, ajustando-se demanda
imposta pelo emprego de enantimeros em pesquisa e desenvolvimento, ou pela
produo de medicamentos. Os dois mtodos evoluram substancialmente nos
ltimos anos, facilitando o desenvolvimento de frmacos enantiopuros e diminuindo
os custos envolvidos com o mesmo
30
.

53

Embora o cenrio atual favorea o desenvolvimento de frmacos
enantiopuros, cabe ao laboratrio responsvel a deciso final quanto forma
estereoisomrica do frmaco a ser desenvolvido (forma enantiopura ou racmica,
por exemplo). No entanto, qualquer que seja a deciso tomada, as agncias
reguladoras iro exigir, para o registro, justificativas cientficas baseadas em
parmetros como qualidade, segurana e eficcia, bem como na relao risco-
benefcio atribuda ao emprego da forma escolhida. Por outro lado, as agncias se
mostram dispostas a analisar as decises em conjunto com as indstrias e a discuti-
las caso a caso
31
.
Como em vrias questes emergentes, a regulamentao do
desenvolvimento de frmacos quirais comeou sua histria lentamente, aparecendo
mais cedo em algumas declaraes das agncias reguladoras, mas aguardando
algum tempo at que uma verdadeira poltica se formasse
30
. A primeira abordagem
direta questo da quiralidade no desenvolvimento de novos frmacos, por parte
das agncias reguladoras, foi feita em 1992, com a publicao, pela FDA, do
documento intitulado FDA's Policy Statement for the Development of New
Stereoisomeric Drugs
32
. No ano seguinte, foi a vez da EMEA expor seu
posicionamento quanto matria, com a publicao do guia intitulado Investigation
of Chiral Active Substances
19
. Um pouco mais tarde, em 1998, a agncia reguladora
canadense, Health Canada, tambm publica seu guia, intitulado Stereochemical
Issues in Chiral Drug Development
33
.
Esses guias tm foco principalmente nos compostos quirais que se
relacionam como enantimeros, j que diasteremeros, de um modo geral, no
compartilham as mesmas propriedades qumicas e fsicas e no apresentam as

54

mesmas propriedades farmacolgicas (a menos que ocorra interconverso in vivo),
devendo ser tratados como frmacos distintos e desenvolvidos como tais
19,32,33
.
Apesar de diferirem em pequenos detalhes, quatro pontos importantes so
comuns entre as vrias recomendaes das agncias reguladoras supracitadas: (1)
os desenvolvedores devem reconhecer a ocorrncia de quiralidade em novos
frmacos, (2) tentar separar os estereoismeros, (3) determinar a contribuio de
cada estereoismero para a atividade farmacolgica de interesse e ento (4)
selecionar racionalmente a forma estereoisomrica que ser proposta para
comercializao
19,29,32,33
.
Desta forma, durante a pesquisa por novos frmacos, quando uma molcula
quiral identificada como a mais promissora, as questes estereoqumicas, como a
seleo do ismero desejado ou a opo pelo racemato, so consideradas durante o
desenvolvimento, preferencialmente, em seu estgio inicial. Hoje, as estratgias
potenciais para o desenvolvimento de frmacos quirais so: (1) desenvolvimento de
um racemato; (2) desenvolvimento de um frmaco contendo uma razo fixa (no-
racmica) dos enantimeros; (3) desenvolvimento de um frmaco enantiopuro
completamente novo (de novo); e (4) o desenvolvimento de um frmaco enantiopuro
a partir de um frmaco racmico j aprovado, o chamado quiral switch
28
.
No presente cenrio, a menos que os dois enantimeros ofeream benefcios
teraputicos sinrgicos ou complementares e no estejam associados a nenhuma
toxicidade aparente, o desenvolvimento de um racemato pode no ser uma opo
vivel economicamente. As atuais polticas das agncias reguladoras sugerem que,
para a aprovao de um racemato, no apenas este seja avaliado pr-clnica e
clinicamente, como tambm cada um de seus enantimeros individualmente. Em
outras palavras, caso o desenvolvedor escolha pelo racemato, isto ir significar um

55

custo muito mais elevado com pesquisas, se comparado aos custos e benefcios
decorrentes do desenvolvimento de um frmaco enantiopuro. Razes ainda existem
que podem justificar o registro de um racemato, como: (1) os enantimeros sofrem
pronunciada racemizao in vivo ou so desprovidos de estabilidade configuracional
in vitro; e (2) os enantimeros possuem perfis farmacocinticos, farmacodinmicos e
toxicolgicos semelhantes; entre outras poucas razes. No entanto, possvel
afirmar que o desenvolvimento de racematos cada vez menos a opo escolhida
pelas indstrias farmacuticas inovadoras
28,33
.
Em alguns casos, graas s diferentes propriedades farmacolgicas entre os
enantimeros, a razo entre eles pode ser manipulada de modo a oferecer o melhor
efeito teraputico ou o melhor perfil farmacolgico, com base no uso proporcional
dos dois enantimeros em uma razo fixa
28
. A indacrinona ilustra um desses casos:
seu ismero dextrgiro apresenta forte ao diurtica, mas tambm causa reteno
de cido rico; no entanto, seu ismero levgiro apresenta propriedades
antiuricosricas que se contrapem ao efeito colateral do ismero dextrgiro.
Embora a indacrinona seja comercializada como racemato, foi avaliado o
desenvolvimento clnico do frmaco nas razes de 1:4 e 1:8 entre seus ismeros
dextro e levorotatrios, respectivamente
34,35
. No obstante a comercializao de
frmacos contendo uma razo fixa (no-racmica) dos enantimeros ser racional e
desejada em algumas situaes, tais frmacos no representam uma poro
significativa dos frmacos quirais disponveis, considerando-se o nmero de
racematos e frmacos enantiopuros comercializados.
Em contrapartida, graas ao reconhecimento da importncia da quiralidade e
aos avanos tecnolgicos, tem sido observada uma onda de crescimento no
desenvolvimento de frmacos enantiopuros
28
. Atualmente, os frmacos enantiopuros

56

respondem por uma parcela cada vez maior das novas entidades teraputicas que
so introduzidas no mercado. Em 1992, correspondiam a 20% dos novos frmacos;
em 2002, essa proporo j alcanava 75%
29
. Os medicamentos contendo frmacos
quirais na forma enantiopura, por sua vez, representaram 33% e 34% do total das
vendas mundiais de medicamentos em 1999 e em 2000, respectivamente. Como
essas vendas aumentaram pouco mais de 8% em 2000, esses nmeros
representam um crescimento de aproximadamente 13% na venda de medicamentos
constitudos por frmacos enantiopuros no mesmo ano
36
.
Algumas das vantagens do desenvolvimento e emprego de frmacos
enantiopuros na teraputica so: a diminuio da dose total de frmaco
administrada, a simplificao da relao dose-resposta, a excluso de uma fonte de
variabilidade na resposta interindividual, bem como a eliminao da toxicidade
devida ao distmero
29
. O desenvolvimento de frmacos enantiopuros pode ser
especialmente vantajoso se os dois enantimeros possurem diferentes aes
farmacolgicas que conduzam a benefcios teraputicos exclusivos, como ocorre
com o j citado propoxifeno (subitem 2.2.1), onde cada ismero comercializado
separadamente, com finalidades teraputicas distintas
28
. Esses fatores
farmacocinticos e farmacodinmicos levaram a uma preferncia crescente por
frmacos enantiopuros nos crculos industrial e regulatrio
29
.
As principais razes (aqui excludas as de motivao econmica) que
justificam o desenvolvimento de um frmaco enantiopuro so: (1) o fato de que a
atividade farmacolgica desejada (ou o benefcio teraputico), com respeito a um
racemato, reside em apenas um dos enantimeros; e (2) o fato de que, a despeito
da igualdade na ao farmacolgica entre dois enantimeros, haja benefcios

57

inequvocos no emprego de apenas um dos ismeros, em virtude da diferena em
seus efeitos colaterais ou perfis toxicolgicos
28
.
Uma das alternativas para o desenvolvimento de frmacos enantiopuros,
juntamente com a sntese de novo, o chiral switch. Este ltimo apresenta, no
entanto, algumas vantagens exclusivas. Por um lado, h a questo do tempo
necessrio para o desenvolvimento e o custo envolvido, ambos consideravelmente
menores que os exigidos no desenvolvimento de um frmaco totalmente novo. Por
outro lado, a obteno de patentes para enantimeros de produtos racmicos pr-
existentes funciona como uma estratgia para inviabilizar a concorrncia promovida
pelos produtos genricos, estabelecendo uma nova reserva de mercado e
ampliando os prazos legais de proteo patentria
29,30
.
Entre os agentes antiinflamatrios no-esterides (AINEs), encontramos
alguns exemplos de chiral switch que deram origem a sucessos mercadolgicos. O
ibuprofeno e o cetoprofeno racmicos deram origem ao (S)-(+)-ibuprofeno e ao (S)-
(+)-cetoprofeno, respectivamente. O emprego do (S)-(+)-ibuprofeno possibilitou
algumas das vantagens observadas no uso de frmacos enantiopuros, como a
diminuio da dose total de frmaco administrada e a reduo da variabilidade na
resposta interindividual, aliadas a um melhor perfil toxicolgico e a um incio de ao
mais rpido. Por sua vez, o (S)-(+)-cetoprofeno comercializado como
dexcetoprofeno trometamol (sal formado pela reao entre o (S)-(+)-cetoprofeno e a
trometamina), o qual absorvido, a partir do estmago, em maior extenso e mais
rapidamente que o cido livre. Neste caso, o chiral switch, aliado nova forma
salina, oferece como resultado trs vantagens: (1) analgesia efetiva em doses
menores, (2) incio de ao mais rpido e (3) reduzida irritao gstrica, com melhor
tolerabilidade
29,31
.

58

Adicionalmente, muito embora ainda no esteja no mercado, o (R)-
enantimero do flurbiprofeno est em fase adiantada de pesquisa clnica como
frmaco promissor para o tratamento do cncer de prstata em estgio avanado.
Este mesmo frmaco tambm poder ser aplicado no tratamento do cncer de clon
e uma das promessas para a preveno e tratamento do mal de Alzheimer, o que
demonstra que a avaliao em separado de cada enantimero pode fornecer novas
indicaes para antigos frmacos
31
.
Entretanto, apesar das vantagens e dos sucessos do desenvolvimento de
frmacos enantiopuros atravs do chiral switch, a literatura registra tambm alguns
fracassos; em alguns casos, o benefcio teraputico pode no ser alcanado. Alguns
exemplos relativamente recentes indicam que embora o chiral switch possa melhorar
a eficcia de alguns frmacos, a segurana no emprego dos mesmos permanece
como exigncia fundamental para que obtenham aprovao e permaneam no
mercado. A dexfenfluramina, desenvolvida a partir da fenfluramina, deixou
rapidamente de ser comercializada devido a casos fatais de valvulopatia cardaca;
em um caso semelhante, o dilevalol (R,R-enantimero do labetalol) tambm foi
retirado do mercado por causa de sua hepatotoxicidade
28,30
.
Para que o desenvolvimento de um frmaco quiral tenha sucesso, vrias
questes so fundamentais e devem ser solucionadas. Uma dessas questes diz
respeito ao desenvolvimento dos mtodos necessrios para a determinao
qualitativa e quantitativa dos estereoismeros, que sejam suficientemente sensveis
e seletivos para dar suporte ao desenvolvimento do medicamento e ao
monitoramento do frmaco nos estudos pr-clnicos, clnicos e toxicolgicos
28
.
Nesse contexto, algumas das recomendaes das agncias reguladoras exigem,

59

direta ou indiretamente, o emprego de mtodos enantiosseletivos
19,32,33,37
e so
listadas a seguir:

Padres qumicos de referncia devem estar disponveis para ambos os
enantimeros e devem ser de pureza enantiomrica aceitvel.

Durante a sntese de um frmaco enantiopuro, a identidade e a pureza
enantiomrica dos materiais quirais de partida, bem como dos reagentes
quirais devem ser estabelecidas. Os controles em processo, que permitam
determinar a identidade e a pureza dos produtos intermedirios de sntese
nos quais centros quirais adicionais tenham sido introduzidos, devem ser
enantiosseletivos.

As especificaes para o frmaco devem incluir ensaios enantiosseletivos
para a determinao de sua identidade e de sua pureza ou composio. A
anlise da rotao ptica pode ser empregada para ambos os fins; mas
um mtodo mais especfico e sensvel exigido para a determinao
quantitativa dos enantimeros.

Em se tratando de um frmaco enantiopuro, um limite para a concentrao
do distmero, se presente, deve ser especificado. Esse limite deve ser
estabelecido com base nas concentraes encontradas nos lotes
empregados nos estudos pr-clnicos e clnicos. Nesses casos, o
distmero deve ser considerado uma impureza e mtodos validados para
sua identificao e quantificao devem ser empregados.

60

Em se tratando de uma mistura no racmica de enantimeros, limites
para a proporo de cada componente devem ser criados, com base na
composio dos lotes empregados nos estudos pr-clnicos e clnicos.

A estabilidade do frmaco enantiopuro, com relao ocorrncia de
racemizao ou inverso estereosseletiva cruzada, sob condies de
estresse ou nas condies padronizadas para os estudos de estabilidade
de longa durao, deve ser investigada.

A pureza enantiomrica do frmaco enantiopuro tambm deve ser
investigada na forma farmacutica, empregando-se um mtodo
enantiosseletivo validado, antes e durante os estudos de estabilidade
conduzidos para se determinar o prazo de validade do medicamento. Os
resultados dos estudos de estabilidade preliminares podem ser
considerados suficientes. Entretanto, um ensaio para a anlise da pureza
enantiomrica deve ser incorporado especificao do medicamento, se
os resultados da investigao assim o justificarem.

Um ensaio (com seus respectivos limites) que determine a composio da
mistura no-racmica, no que diz respeito proporo de cada
componente no medicamento exigido. A proporo relativa dos
componentes tambm deve ser monitorada nos estudos de estabilidade
de longa durao.


61

Durante as investigaes pr-clnicas e clnicas, realizadas com o frmaco
enantiopuro, estudos de estabilidade configuracional in vivo devem ser
conduzidos. Se ocorrer inverso quiral do eutmero, o distmero deve ser
considerado um metablito e dever ser tratado como tal no decorrer
dessas investigaes.

Em se tratando de um frmaco enantiopuro, mtodos enantiosseletivos de
determinao quantitativa so pr-requisito para a avaliao da
farmacocintica do frmaco, salvo casos especficos (como quando o
frmaco um composto endgeno animal, por exemplo). A
farmacocintica do enantimero deve ser seguida, empregando-se esses
mtodos em cada espcie animal usada nos estudos pr-clnicos, bem
como durante os estudos de fase I, em humanos. Se ficar comprovado
que racemizao ou inverso quiral no ocorrem, ento os mtodos
enantiosseletivos podem no ser necessrios em todos os estudos
subseqentes.

Para o desenvolvimento de racematos tambm so exigidos mtodos
enantiosseletivos durante os estudos farmacocinticos, realizados em
animais e em humanos e empregados para validar os resultados dos
estudos de toxicidade aguda e com doses mltiplas.

62

2.3 CETOPROFENO E FENOPROFENO: AGENTES ANTIINFLAMATRIOS NO-ESTERIDES

O cetoprofeno e o fenoprofeno pertencem classe dos frmacos conhecidos
como agentes antiinflamatrios no-esterides (AINEs). Os AINEs disponveis
atualmente, em sua maioria, inibem tanto a atividade da ciclooxigenase-1 (COX-1)
quanto da ciclooxigenase-2 (COX-2) e, dessa forma, inibem as snteses das
prostaglandinas e do tromboxano. A inibio da COX-2 parece mediar, pelo menos
em parte, as aes antipirtica, analgsica e antiinflamatria dos AINEs, porm a
inibio simultnea da COX-1 provoca efeitos colaterais indesejveis, principalmente
os que levam s lceras gstricas resultantes da produo reduzida de
prostaglandinas e tromboxano
38
.
Todos os AINEs so antipirticos, analgsicos e antiinflamatrios, porm
existem diferenas importantes em suas atividades. Quando utilizados como
analgsicos, esses frmacos geralmente so eficazes apenas contra dores de
intensidade leve a moderada. Embora seus efeitos mximos sejam muito mais
brandos, os AINEs apresentam vantagens sobre os opiides, por no produzirem os
efeitos colaterais indesejveis destes ltimos sobre o sistema nervoso central (SNC),
como depresso respiratria e desenvolvimento de dependncia fsica. So
indicados no controle da dor ps-operatria crnica ou no controle da dor devida a
inflamao, no sendo, em geral, capazes de aliviar a dor proveniente de vsceras
ocas. Os AINEs so particularmente eficazes nas situaes em que a inflamao
conduz sensibilizao dos receptores da dor aos estmulos mecnicos ou qumicos
normalmente indolores
38
.
Como antipirticos, os AINEs reduzem a temperatura corprea nos estados
febris. A regulao da temperatura corprea depende de um equilbrio delicado entre

63

a produo e a perda de calor; o nvel em que essa temperatura mantida
regulado pelo hipotlamo. Na febre, esse nvel est aumentado. A febre pode ser
devida a uma infeco ou a uma leso tecidual, inflamao, rejeio de enxertos,
neoplasia maligna ou outras doenas. Um aspecto comum a todas estas condies
o aumento da produo de citocinas. As citocinas, por sua vez, aumentam a
sntese da prostaglandina E
2
(PGE
2
) em regies do hipotlamo. A PGE
2
, por meio do
aumento do monofosfato de adenosina cclico (AMP cclico), estimula o hipotlamo a
elevar a temperatura corprea, promovendo aumento da produo de calor,
juntamente com a reduo da sua dissipao. Os AINEs desenvolvem sua ao
antipirtica inibindo a sntese da PGE
2
38
.
No entanto, a principal aplicao clnica dos AINEs como agentes
antiinflamatrios no tratamento de distrbios msculo-esquelticos como artrite
reumatide, osteoartrite e espondilite anquilosante. Embora a capacidade de
desencadear uma resposta inflamatria seja fundamental sobrevivncia, em
algumas situaes e doenas, a resposta inflamatria exagerada e persistente,
sem qualquer benefcio aparente. Os processos inflamatrios envolvem uma srie
de fenmenos que podem ser desencadeados por vrios estmulos, como agentes
infecciosos, isquemia, interaes antgeno-anticorpo e leso trmica ou provocada
por outros agentes fsicos. Em nvel macroscpico, a inflamao geralmente
evidenciada por sinais clnicos bem conhecidos como eritema, edema, hiperestesia
(hiperalgesia) e dor. As respostas inflamatrias ocorrem em trs fases diferentes,
cada qual aparentemente mediada por mecanismos diversos: (1) fase transitria
aguda caracterizada por vasodilatao localizada e aumento da permeabilidade
vascular; (2) fase subaguda, ou tardia, marcada principalmente pela infiltrao dos
leuccitos e clulas fagocitrias; e (3) fase proliferativa crnica, na qual h

64

degenerao tecidual e fibrose. Em geral, os AINEs proporcionam apenas alvio
sintomtico da dor e da inflamao associadas doena e no interrompem a
progresso da leso patolgica dos tecidos durante os episdios graves
38
.
Entre os efeitos colaterais do tratamento com AINEs esto includos o
bloqueio da agregao plaquetria (pela inibio da sntese dos tromboxanos),
prolongamento da gestao (pela inibio da motilidade uterina) ou ainda parto
espontneo, inibio da funo renal mediada pelas prostaglandinas, e ulcerao e
intolerncia gastrintestinais. Desses, o mais comum a ulcerao gstrica ou
intestinal. A leso gstrica originada por esses frmacos, embora possa ser causada
por irritao local (para medicamentos administrados por via oral), tambm pode ser
provocada por inibio da biossntese das prostaglandinas gstricas, especialmente
PGI
2
e PGE
2
, que atuam como protetoras da mucosa gstrica, inibindo a secreo
cida do estmago, aumentando o fluxo sanguneo da mucosa e estimulando a
secreo do muco citoprotetor do intestino
38
.
A maioria dos AINEs quirais representada por cidos arilalcanicos
contendo, pelo menos, um tomo de carbono tetradrico assimtrico. O cetoprofeno
e o fenoprofeno so agentes importantes da classe dos AINEs derivados do cido
propinico. Os membros dessa classe apresentam, em comum, um grupo
carboxlico separado de um ncleo aromtico por, em geral, um tomo de carbono.
A esse ncleo podem estar ligados grupos lipoflicos volumosos. A presena de um
substituinte -metila reala a potncia. So, portanto, molculas com carter cido
fraco
38,39
. As frmulas estruturais planas do cetoprofeno e do fenoprofeno esto
apresentadas na figura 2.8.


65

Cetoprofeno

Fenoprofeno
Figura 2.8 Frmulas estruturais planas do cetoprofeno e do fenoprofeno.

Alguns dos medicamentos comercializados no Brasil que contm o frmaco
cetoprofeno esto listados na tabela 1.1
40
. Para o fenoprofeno, no Brasil, existe uma
nica especialidade farmacutica, cujo nome comercial Trandor
. Todos os
medicamentos listados contm o respectivo frmaco sob a forma racmica.

Tabela 1.1 Alguns dos medicamentos que contm os frmacos cetoprofeno ou fenoprofeno.
Frmaco
Nome
Comercial
Forma Farmacutica Classificao Laboratrio
Cetoprofeno
Profenid

Cpsula gelatinosa dura
Referncia Aventis Pharma Ltda.
Comprimido de desintegrao lenta
Comprimido revestido
Gel
P liofilizado p/ soluo injetvel
Soluo oral
Supositrio
Cetoprofeno Comprimido de desintegrao lenta Genrico Apotex do Brasil Ltda.
Cetoprofeno P liofilizado p/ soluo injetvel Genrico Cristlia Prod. Qum. Farm. Ltda.
Cetoprofeno
Genrico EMS Indstria Farmacutica Ltda. Gel
Soluo oral
Cetoprofeno
P liofilizado p/ soluo injetvel
Genrico Eurofarma Laboratrios Ltda.
Soluo Injetvel
Cetoprofeno
Genrico Medley S/A Ind. Farmacutica
Comprimido revestido
Gel
Soluo oral
Cetoprofeno Comprimido revestido Genrico Ranbaxy Farmacutica Ltda.
Fenoprofeno Trandor
Cpsula gelatinosa dura Referncia Eli Lilly do Brasil Ltda.


66

Os derivados do cido propinico constituem um grupo de AINEs teis e
eficazes, podendo apresentar vantagens significativas sobre o cido acetilsaliclico e
a indometacina para muitos pacientes, mas apresentam tambm todos os
inconvenientes desse grupo de medicamentos. Os AINEs derivados do cido
propinico encontram indicao para o tratamento dos distrbios msculo-
esquelticos j citados, bem como para o tratamento da artrite gotosa aguda. Alm
disso, como analgsicos, so indicados para os casos de tendinite e bursite agudas
e para dismenorria primria. Em geral, a intensidade dos efeitos colaterais menor
do que a associada ingesto da indometacina ou de doses elevadas de cido
acetilsaliclico
38
.
Para os AINEs derivados do cido propinico, a habilidade de inibir as
ciclooxigenases e, conseqentemente, a biossntese das prostaglandinas
creditada quase que exclusivamente aos (S)-enantimeros
39,41,42
. Sabe-se que os
(R)-enantimeros so de 100 a 1000 vezes menos potentes que os (S)-
enantimeros na inibio da ciclooxigenase in vitro
43,44
. So tambm os (S)-
enantimeros os responsveis por vrios dos efeitos colaterais relatados para essa
classe de frmacos, j que muitos desses efeitos colaterais so conseqncia direta
da inibio da biossntese das prostaglandinas
38
. Muito embora essa diferena
farmacodinmica tenha levado ao interesse, relativamente recente, na avaliao do
valor teraputico dos enantimeros se administrados individualmente
45
, vrios
frmacos dessa classe ainda so comercializados na forma racmica, incluindo o
cetoprofeno e o fenoprofeno. No entanto, graas aos atuais incentivos
regulatrios
19,28,30,32,33,37
e conseqente expanso no desenvolvimento de novos
frmacos enantiopuros, bem como no assim chamado chiral switch
29,31,36
, alguns dos
AINEs se encontram disponveis como enantimeros puros. o caso do (S)-(+)-

67

naproxeno, j desenvolvido na forma enantiopura, e do (S)-(+)-ibuprofeno e do (S)-
(+)-cetoprofeno, resultados de chiral switch (subitem 2.2.5).
Por outro lado, apesar de a atividade antiinflamatria e a toxicidade gstrica
estarem principalmente associadas aos (S)-enantimeros, h evidncias de que os
(R)-enantimeros dos AINEs derivados do cido propinico apresentem ao
analgsica
46
, como j foi demonstrado para o (R)-(-)-cetoprofeno e para o (R)-(-)-
flurbiprofeno
43,47-50
. De especial interesse a aplicao do (R)-(-)-cetoprofeno no
tratamento da dor neuroptica
51
.
No que se refere sua farmacocintica, o cetoprofeno exibe pouca
estereosseletividade aps sua administrao na forma racmica
52,53
. Entretanto, sua
extensa ligao albumina srica humana (ASH) ocorre de maneira aparentemente
estereosseletiva, especialmente na ocorrncia de doenas hepticas
54-57
, enquanto
que os enantimeros do fenoprofeno, por outro lado, ligam-se ASH ambos na
mesma extenso
58
.
Um aspecto particularmente importante do metabolismo dos AINEs derivados
do cido propinico a inverso unidirecional que ocorre do (R)-enantimero para o
(S)-enantimero in vivo
45
. A extenso com a qual esta inverso ocorre varia de
frmaco para frmaco e tambm com a espcie animal considerada
59-62
. O (R)-(-)-
ibuprofeno pode exibir uma inverso a (S)-(+)-ibuprofeno superior a 70% aps
administrao sistmica, ao passo em que o (R)-(-)-flurbiprofeno sofre pouca ou
nenhuma inverso ao (S)-(+)-enantimero quando administrado a ratos ou
humanos
48
. Aproximadamente 10% do (R)-(-)-cetoprofeno convertido a (S)-(+)-
cetoprofeno aps administrao oral
52,63
, mas esta porcentagem pode ser maior na
ocorrncia de doenas renais
64
. Rubin et al.
65
determinaram as concentraes do
(R)- e (S)-enantimeros do fenoprofeno no plasma e na urina de voluntrios aps

68

administrao oral do (RS)-fenoprofeno. Alm disso, concentraes urinrias de
seus principais metablitos foram determinadas. Foi demonstrado que o (R)-
enantimero do fenoprofeno bioconvertido a (S)-fenoprofeno, o qual foi a principal
forma isomrica encontrada no plasma e na urina. A extenso da inverso quiral, do
(R)-fenoprofeno ao seu (S)-ismero, foi praticamente total.
H evidncias de que a inverso quiral observada com alguns AINEs ocorre
principalmente no trato gastrointestinal. Num estudo em ratos, observou-se que a
extenso da inverso quiral do benoxaprofeno maior aps administrao oral,
quando comparada s administraes intravascular e intraperitoneal. Tambm em
ratos, demonstrou-se que a extenso da inverso do (R)-cetoprofeno a (S)-
cetoprofeno semelhante aps as administraes intravascular e intraperitoneal,
mas trs vezes menor quando comparada que ocorre aps administrao oral,
sugerindo a importncia do trato gastrintestinal na interconverso entre os
enantimeros
14
. Esses achados podem vir a contribuir como argumentos em favor
do emprego dos mtodos estereosseletivos nos estudos de bioequivalncia entre
medicamentos que contenham esses frmacos e que sejam destinados
administrao oral, j que tanto a ocorrncia de inverso quiral como o metabolismo
pr-sistmico so fatores crticos a serem considerados nesses estudos,
principalmente se as formas farmacuticas em questo forem formas farmacuticas
de liberao modificada.
Alm disso, para vrios AINEs derivados do cido propinico, a ocorrncia de
inverso quiral, associada s demais etapas farmacocinticas possivelmente
enantiosseletivas, faz com que a concentrao plasmtica relativa entre os
enantimeros de um desses frmacos esteja sendo constantemente modificada em
favor do aumento relativo na concentrao do (S)-enantimero. Por essa razo, e

69

em virtude da diferena farmacodinmica entre os enantimeros, qualquer estudo
com esses frmacos que objetive correlacionar a concentrao plasmtica com um
dado efeito farmacolgico deve ser conduzido com mtodos estereoespecficos de
determinao quantitativa. Mtodos analticos incapazes de discriminar entre os
enantimeros, mas que apenas determinem a quantidade ou a concentrao total
presente desses ismeros, fornecero informaes no confiveis ou, na melhor das
hipteses, informaes de valor limitado que podem levar a erros de interpretao
45
.

2.3.1 CARACTERIZAO FSICO-QUMICA DOS FRMACOS

2.3.1.1 CETOPROFENO
66,67,68

O nome qumico do cetoprofeno cido (2RS)-2-(3-benzoilfenil)propanico.
Sua frmula molecular C
16
H
14
O
3
e sua massa molecular relativa 254,28. O
cetoprofeno se apresenta como p cristalino, branco ou quase branco. facilmente
solvel em acetona, em etanol e em diclorometano, sendo praticamente insolvel em
gua. Funde-se entre 92 e 97 C. Apresenta constante de dissociao (pK
a
) a 25 C
igual a 4,5 e seu coeficiente de partio (Log P) no sistema octanol/tampo pH 7,4
igual a 0. Seu espectro de absoro no infravermelho (obtido a partir de disperso
em pastilhas de brometo de potssio) mostrado na figura 2.9. A tabela 2.2, por sua
vez, apresenta as principais bandas observadas nesse espectro e suas provveis
atribuies.

70

T
r
a
n
s
m
i
t
n
c
i
a

/

%

Nmero de onda / cm
-1
Figura 2.9 Espectro de absoro no infravermelho do cetoprofeno, obtido a partir de disperso em
pastilhas de KBr (Espectro de Referncia).

Tabela 2.2 Bandas principais observadas no espectro de absoro no infravermelho do cetoprofeno
e suas provveis atribuies.

Posio da
banda / cm
-1

Atribuio
1693 Estiramento C=O no grupamento cido
69

1656 Estiramento C=O no grupamento cetona
69

1284 Acoplamento entre a deformao (no plano) O-H e o estiramento
C-O no dmero formado entre as molculas de cetoprofeno por
ligaes de hidrognio entre suas carboxilas
70

1226 Deformao (no plano) O-H na hidroxila alcolica livre
70

0714 Deformao C-H nos anis aromticos
69

0690 Deformao C-H nos anis aromticos
69

2.3.1.2 FENOPROFENO CLCICO DIIDRATADO
71,72,73

O fenoprofeno usualmente empregado em cpsulas e comprimidos sob a
forma de fenoprofeno clcico diidratado. O nome qumico do fenoprofeno clcico
diidratado (2RS)-2-(3-fenoxifenil)propionato de clcio diidratado. Sua frmula
molecular (C
15
H
13
O
3
)
2
Ca.2H
2
O e sua massa molecular relativa 558,63.

71

Figura 2.10 Frmula estrutural plana do fenoprofeno clcico diidratado.

O fenoprofeno clcico diidratado se apresenta como p cristalino, branco ou
quase branco, inodoro ou quase inodoro. solvel em etanol 96%, pouco solvel
em n-hexanol, em metanol e em gua, sendo praticamente insolvel em clorofrmio.
Funde-se entre 105 e 110 C. Apresenta constante de dissociao (pK
a
) a 25 C
igual a 4,5 e seu coeficiente de partio (Log P) no sistema octanol/tampo pH 7,4
igual a 0,8. Seu espectro de absoro no infravermelho (obtido a partir de disperso
em pastilhas de brometo de potssio) mostrado na figura 2.11. A tabela 2.3, por
sua vez, apresenta as principais bandas observadas nesse espectro e suas
provveis atribuies.

T
r
a
n
s
m
i
t
n
c
i
a

/

%

Nmero de onda / cm
-1
Figura 2.11 Espectro de absoro no infravermelho do fenoprofeno clcico diidratado, obtido a partir
de disperso em pastilhas de KBr (Espectro de Referncia).

72

Tabela 2.3 Bandas principais observadas no espectro de absoro no infravermelho do fenoprofeno
clcico e suas provveis atribuies.

Posio da
banda / cm
-1

Atribuio
1562 Estiramento simtrico e assimtrico no grupamento carboxilato
74

1268 Estiramento assimtrico no grupamento ther
74

74

74

74

0696 Deformao (fora do plano) C-H nos anis aromticos
74

2.4 TCNICAS DE SEPARAO ENANTIOMRICA

A cincia da separao enantiomrica evoluiu bastante desde os trabalhos
pioneiros de Pasteur
1
. Hoje, praticamente todo o conjunto de tcnicas de separao
pode ser empregado como ferramenta potencial para a resoluo, direta ou indireta,
de enantimeros
75
. No entanto, a maioria das tcnicas de separao pode ser
enquadrada em um de dois mtodos fundamentais, ambos originalmente
empregados por Pasteur, que so: (a) a resoluo aps a converso dos
enantimeros em diasteremeros e (b) a resoluo cintica de enantimeros.
No primeiro mtodo, os enantimeros podem ser convertidos em
diasteremeros pela formao de sais, atravs da reao com cidos ou bases
quirais, ou pela ligao covalente a outros reagentes quirais. Os diasteremeros,
assim formados, podem ser posteriormente separados, graas s suas diferentes
propriedades fsicas. A separao dos diasteremeros pode se dar pelo emprego
das tcnicas de destilao, extrao com solventes comuns, extrao em fluido
supercrtico, sublimao, separao mecnica, mas, mais comumente, a separao
realizada pela tcnica de cristalizao fracionada. Aps a separao, as molculas

73

originais dos enantimeros podem ser recuperadas atravs da liberao do auxiliar
quiral empregado (cido ou base) ou, ainda, pelo rompimento adequado da ligao
covalente com o reagente quiral. As tcnicas cromatogrficas e as tcnicas de
eletromigrao em capilares para separao enantiomrica, quer envolvam a
formao de compostos diastereomricos estveis ou apenas a formao de
complexos diastereomricos transitrios, tambm se enquadram aqui e sero
discutidas mais adiante.
Na reao com um reagente quiral ou um catalisador quiral, os enantimeros
exibem diferentes velocidades de reao. Se essa diferena suficientemente
grande, os enantimeros podem ser separados pela reao preferencial de um
deles, acarretando em um excesso enantiomrico em favor do enantimero menos
reativo. Como este mtodo se baseia na diferena entre as velocidades de reao, o
mtodo chamado de resoluo cintica. A resoluo bioqumica entre
enantimeros, atravs da converso enzimtica enantiosseletiva de apenas um dos
enantimeros, um caso particular de resoluo cintica.
Por outro lado, enantimeros puros podem ser obtidos no apenas pela
resoluo de racematos, mas tambm por meio de sntese assimtrica. Contudo,
muito embora um nmero cada vez maior de mtodos de sntese assimtrica esteja
sendo descrito e aplicado produo de substncias enantiomericamente puras,
relativamente poucos so selecionados para a produo em larga escala de
enantimeros, particularmente nos estgios iniciais do desenvolvimento de novos
frmacos. Apesar de a sntese assimtrica ser til quando grandes quantidades dos
enantimeros puros so requeridas, o tempo necessrio para o seu desenvolvimento
e os custos envolvidos podem fazer com que, nesses estgios iniciais, essa
abordagem seja inadequada para as pequenas quantidades dos enantimeros puros

74

que so exigidas. Uma desvantagem adicional da sntese assimtrica que ela
fornece apenas um dos enantimeros quando, na verdade, ambos so necessrios
para o desenvolvimento do novo frmaco. Portanto, tcnicas preparativas
fundamentadas em separaes enantiomricas representam uma boa alternativa
para a obteno de ambos os enantimeros
75,76
.
Entre as tcnicas que so capazes de separar enantimeros em escala
preparativa, as mais utilizadas so as tcnicas cromatogrficas
75
, em vrias de suas
diferentes abordagens, como a CLAE, a cromatografia a fluido super- ou subcrtico
(CFS)
77
e a cromatografia a gs
78
(CG), sendo as duas primeiras abordagens as
mais empregadas atualmente
76
. Outras tcnicas podem ser aplicadas, associadas
ou no s j citadas, como a tcnica de leito mvel simulado
79
(associada CLAE,
CFS ou CG) e a tcnica de cromatografia contra-corrente
80
(CCC). No tocante
CLAE, a utilizao da tcnica pelo mtodo direto atravs do emprego de FEQs
81

de especial interesse, devido recuperao facilitada dos enantimeros.
Porm, quando a separao de grandes quantidades (de quilos a toneladas)
de compostos quirais realizada pelo emprego das tcnicas cromatogrficas,
questes ecolgico-ambientais devem ser levadas em considerao, de modo a
reduzir a toxicidade e o risco potencial desses processos, em virtude da grande
quantidade de solventes que empregada. Ao mesmo tempo, esse grande consumo
de solventes usualmente requer a prtica de mtodos de reciclagem. Assim, as
tcnicas que empregam fases mveis alternativas, constitudas dos assim chamados
solventes verdes, tornam-se mais atraentes
75
. Entre essas tcnicas est a CFS, que
emprega CO
2
e pequenas quantidades de modificadores alcolicos. O emprego de
CO
2
como fase mvel apresenta como vantagens, alm do seu carter amigvel ao
meio ambiente, o seu baixo custo e a sua facilidade de remoo. Alm disso, por

75

possibilitar tempos de corrida reduzidos e a rpida remoo do solvente, a CFS tem
se tornado o mtodo de escolha para a separao de enantimeros durante a
pesquisa por novos frmacos. Adicionalmente, esta tcnica j capaz de fornecer,
em procedimentos preparativos de escala laboratorial, enantimeros puros em
quantidades equivalentes a algumas centenas de gramas
75,82
.
Por sua vez, a tcnica de leito mvel simulado (LMS) tambm de interesse
crescente na indstria farmacutica por combinar o uso efetivo de FEQs de elevado
custo com a reduo significativa no consumo total de solventes, durante a produo
de grandes quantidades de enantimeros puros. ainda mais promissora a
combinao de ambas as tcnicas, CFS e LMS, na produo de enantimeros em
larga escala
82
.
So tambm muito comuns, em processos industriais de separao
enantiomrica, as tcnicas de cristalizao fracionada e a resoluo cintica
(especialmente a resoluo bioqumica atravs de converso enzimtica),
empregadas isoladamente ou em conjunto com tcnicas cromatogrficas, como o
leito mvel simulado. Quando a cristalizao a tcnica escolhida, o emprego de
mtodos de racemizao do enantimero no desejado, o qual representa
normalmente 50% do material de partida (ou qualquer outra razo) bastante
vantajoso, por razes ecolgicas, mas tambm por razes econmicas
75
.
Outras tcnicas emergentes, como as membranas enantiosseletivas e a
extrao lquido-lquido, tambm possuem potencial para atender s finalidades
preparativas, embora alguns problemas tcnicos ainda tenham que ser superados
para que essas tcnicas sejam mais eficientes
75
.
De um modo geral, as tcnicas de separao servem a finalidades
preparativas ou analticas. Algumas tcnicas, com as devidas adaptaes, podem

76

servir s duas finalidades. Dependendo das caractersticas da molcula alvo e da
escala da separao, as necessidades a serem atendidas pela tcnica iro diferir.
Em se tratando de separaes em escala preparativa, alm de uma
enantiosseletividade adequada, uma elevada capacidade de carga outro
importante pr-requisito para a tcnica. Aliadas a essas caractersticas, outras se
fazem necessrias, como robustez, inrcia qumica e estabilidade trmica da FEQ,
bem como dos enantimeros a serem resolvidos. Outros parmetros devem ser
cuidadosamente considerados, por sua relao com a produtividade da tcnica,
como a solubilidade dos enantimeros no meio onde a separao ocorre (em
contraste com as tcnicas analticas, onde a solubilidade no usualmente um
problema)
75
.
As tcnicas analticas de separao enantiomrica, por sua vez, atendem a
objetivos diferentes. Essas tcnicas so necessrias para controlar a pureza
enantiomrica de materiais de partida e de produtos finais. O controle tambm
essencial no caso de reagentes, auxiliares e catalisadores quirais empregados na
sntese de substncias enantiopuras, pois a qualidade desses compostos ir definir
a pureza enantiomrica dos produtos resultantes. Alm disso, como j foi discutido
no subitem 2.2.5, as exigncias de algumas agncias reguladoras tornaram
obrigatria a disponibilidade de mtodos enantiosseletivos para a avaliao da
pureza enantiomrica de frmacos quirais. Dessa maneira, as caractersticas de
desempenho desejveis em um mtodo analtico de separao enantiomrica so:
elevada sensibilidade (o que se traduz em baixos limites de deteco), exatido,
preciso e seletividade adequadas, de modo a permitir a determinao de razes
enantiomricas extremas e a deteco de impurezas. Adicionalmente, o tempo

77

requerido para a realizao de uma anlise tambm deve ser considerado na
avaliao e escolha do mtodo
75
.
Assim sendo, adotando as caractersticas de desempenho desejveis como
critrios para a escolha do mtodo analtico de separao enantiomrica a ser
empregado, as seguintes tcnicas devem ser mencionadas como as mais
adequadas aos objetivos analticos: a cromatografia em camada delgada (CCD), a
CG, a CFS, a CLAE e as tcnicas de eletromigrao em capilares (TECs)
75
.

2.4.1 TCNICAS ANALTICAS DE SEPARAO ENANTIOMRICA

2.4.1.1 TCNICAS DE ELETROMIGRAO EM CAPILARES

As TECs so aquelas onde as separaes dos analitos ocorrem em capilares
de reduzido dimetro interno, por ao de um intenso campo eltrico. Essas tcnicas
incluem tcnicas eletroforticas capilares e tcnicas cromatogrficas capilares
eletricamente conduzidas, baseadas em diferentes princpios de separao. Em
alguns casos, esses princpios se sobrepem
83
. Como todas se baseiam no uso de
capilares de reduzido dimetro interno, elas so geralmente inadequadas para
separaes em escala preparativa. Contudo, tm sido aplicadas com sucesso na
separao, em escala analtica, de uma ampla variedade de molculas quirais
82
. A
literatura cientfica est repleta de trabalhos que demonstram a aplicao dessas
tcnicas objetivando a separao enantiomrica e vrios artigos de reviso foram
publicados nos ltimos anos
84-89
. Entre as diversas TECs, as mais comumente

78

empregadas para separao e determinao quantitativa de enantimeros so: a
eletroforese capilar, a cromatografia eletrocintica (e seus casos especiais, como a
cromatografia eletrocintica micelar e a cromatografia eletrocintica em
microemulso) e a eletrocromatografia capilar.
Foi durante a dcada de noventa que as TECs se estabeleceram como
ferramentas importantes para a separao enantiomrica com finalidades analticas,
sendo reconhecidas por apresentarem alto poder de resoluo aliado grande
flexibilidade no que diz respeito s condies de separao
82
. O maior poder de
resoluo das TECs, quando comparadas CLAE, deve-se diferena nos perfis
radiais de velocidade entre o fluxo eletroosmtico (TECs) e o fluxo laminar (CLAE),
nos sistemas eletro- e hidrodinmicos, respectivamente, onde o fluxo eletroosmtico
apresenta um perfil plano (sendo um pouco mais lento apenas nas proximidades da
parede do capilar), enquanto o perfil do fluxo laminar parablico (figura 2.12). Isso
equivale a dizer que nas TECs ocorre menor disperso dos analitos, resultando em
maior eficincia. Essa maior eficincia facilita a separao dos enantimeros, a qual
possvel com fatores de separao to baixos quanto = 1,01
90
.

Fluxo laminar (CLAE) Fluxo eletroosmtico (TECs)
Perfil parablico
Perfil plano
Presso
Figura 2.12 Diferena nos perfis radiais de velocidade entre o fluxo laminar (CLAE) e o fluxo
eletroosmtico (TECs).

79

A flexibilidade das TECs, por sua vez, uma de suas vantagens mais
atraentes. Usando a mesma instrumentao e o mesmo capilar, possvel,
simplesmente alterando a composio do eletrlito de corrida, encontrar o meio
timo para a separao
89
. Ao mesmo tempo, alterando somente a composio do
eletrlito de corrida, pode-se, inclusive, passar de uma para outra tcnica, entre as
vrias TECs existentes. H tambm grande liberdade na escolha dos seletores
quirais a serem empregados
84
, sendo que, na cromatografia eletrocintica, a maioria
dos seletores quirais utilizados j foi anteriormente empregada na CLAE, exceo
dos surfactantes quirais. No entanto, um novo seletor quiral, que viesse a ser
desenvolvido, seria mais facilmente aplicado nas TECs que na CLAE
89
. Nesta
ltima, FEQs so empregadas para promover o reconhecimento quiral ou, em uma
abordagem diferente, aditivos quirais so adicionados fase mvel com a mesma
funo. Contudo, na CLAE, o uso de fases estacionrias ou aditivos quirais eleva
significativamente os custos associados ao emprego da tcnica, uma vez que
quantidades relativamente grandes de fase estacionria ou aditivo quiral so
necessrias. J nas TECs, embora alguns dos seletores quirais sejam caros, as
quantidades comumente requeridas so consideravelmente reduzidas
87,89
.
H ainda a possibilidade de se combinar a grande eficincia das TECs com a
seletividade da cromatografia, atravs da eletrocromatografia capilar. A
eletrocromatografia capilar usualmente caracterizada como uma tcnica hbrida,
que combina os princpios cromatogrficos e eletroforticos de separao; ou seja,
combina a separao pela diferena nos coeficientes de partio entre duas fases,
com a separao pela diferena na velocidade de migrao dos analitos no campo
eltrico
86,88
. Na eletrocromatografia capilar, o capilar acomoda as fases estacionria
e mvel. Os analitos, por outro lado, so transportados atravs do capilar de acordo

80

com suas mobilidades eletroosmticas e tambm de acordo com suas mobilidades
eletroforticas efetivas, se carregados. Em alguns casos, com o objetivo de tornar a
anlise mais rpida e estabilizar o fluxo, um gradiente de presso adicional
aplicado externamente, mas isso ocasiona a perda parcial do perfil plano favorvel
do fluxo eletroosmtico
86
.
Adicionalmente, os tempos de anlise relativamente reduzidos (quando
comparados CLAE), o baixo custo das anlises, a necessidade de uma quantidade
muito pequena de amostra, o consumo praticamente nulo de solventes orgnicos e a
simplicidade instrumental so outras das vantagens que fazem as TECs se
estabelecerem entre as principais tcnicas utilizadas para a separao
enantiomrica
83,84,90
.
No obstante todas as vantagens oferecidas pelas TECs, h duas razes
normalmente apresentadas para que esse conjunto de tcnicas ainda no esteja
sendo amplamente empregado. Uma das razes sua baixa sensibilidade. A baixa
sensibilidade das TECs atribuda pequena quantidade de amostra injetada no
capilar e tambm ao pequeno caminho ptico que possibilita a deteco, o qual ,
normalmente, idntico ao dimetro interno do capilar. A segunda razo relacionada
a problemas com a validao dos mtodos que empregam as TECs, como a falta de
reprodutibilidade dos tempos de migrao e da resoluo entre os picos, e a menor
preciso relacionada quantificao
91
.
No entanto, h uma srie de alternativas para aumentar a sensibilidade das
TECs. Uma das alternativas usar clulas de deteco que propiciem um caminho
ptico aumentado, como as clulas do tipo bolha ou Z. Porm, o uso dessas clulas
s vantajoso nos casos em que o eletrlito de corrida no apresente absoro no
comprimento de onda empregado. Alm disso, com o emprego dessas clulas, a

81

sensibilidade s pode ser aumentada de 3 a 5 vezes (clulas bolha) ou ainda em 10
vezes (clula Z), sendo comum ocorrem turbulncias no eletrlito, as quais evitam
um aumento da sensibilidade e ainda reduzem a resoluo
91,92
.
Uma alternativa muito melhor para aumentar a sensibilidade o emprego de
procedimentos de concentrao on-line da amostra. Esses procedimentos permitem
injetar um maior volume da amostra, sem que haja alargamento das bandas e a
conseqente perda da eficincia. Dentre eles, o mais simples chamado de
empilhamento dos analitos (stacking), caracterizado, normalmente, pela dissoluo
da amostra em uma soluo tampo em geral mais diluda que aquela empregada
como eletrlito de corrida
90,91
. O empilhamento dos analitos pode, por sua vez,
aumentar a sensibilidade entre 10 a 100 vezes
91
.
Outras tcnicas vm sendo usadas para concentrar os analitos e, ao mesmo
tempo, eliminar interferentes e tornar a amostra mais compatvel com o sistema
empregado, como a extrao e a microextrao em fase slida, a extrao com
membranas e a extrao lquido-lquido
90
. H ainda a possibilidade de se aumentar
a sensibilidade empregando outros sistemas de deteco em substituio
deteco por espectrofotometria UV-Vis, como a deteco por espectrometria de
massas, a deteco por fluorescncia induzida a laser e a deteco
condutomtrica
91
. Todavia, todos esses sistemas de deteco apresentam tambm
suas desvantagens ou limitaes.
Em resumo, h um grande arsenal de mtodos robustos que podem melhorar
a sensibilidade das TECs. Apesar disso, devido s limitaes inerentes a esse
conjunto de tcnicas, freqentemente no se consegue atingir a mesma
sensibilidade que atingida com o emprego da CLAE
91
.

82

No tocante reprodutibilidade dos tempos de migrao e da resoluo entre
os picos, Holzgrabe et al.
91
afirmam que ela extremamente dependente do
condicionamento do capilar. Os autores afirmam ainda que a adoo de
procedimentos adequados de condicionamento necessria e, ao mesmo tempo,
suficiente para garantir tcnica a mesma reprodutibilidade observada na CLAE.
Alm disso, tambm sugerem o revestimento da superfcie interna dos capilares com
solues apropriadas e, em alguns casos, a prpria substituio do capilar, como
maneira de se assegurar a reprodutibilidade das TECs.
A temperatura qual o capilar exposto outro fator importante que deve ser
controlado para garantir a reprodutibilidade nas anlises, pois afeta a viscosidade e
a condutividade do eletrlito de corrida, influindo sobre os tempos de migrao. Um
controle de temperatura tambm exigido na CLAE. No entanto, ao passo em que,
na CLAE, fornos para o controle da temperatura da coluna j so acessrios
comuns, alguns equipamentos para TECs ainda no dispem de um controle
adequado da temperatura
91
.
Por fim, as TECs esto amplamente difundidas no meio acadmico, mas
ainda no ganharam a mesma projeo na indstria ou nas agncias reguladoras.
Nas farmacopias, por sua vez, h um predomnio dos ensaios de determinao da
rotao ptica como forma de se verificar a pureza enantiomrica para a grande
maioria dos frmacos quirais, ainda que a determinao da rotao ptica seja um
mtodo bastante insensvel. Apenas mais recentemente que TECs foram
introduzidas nas farmacopias e, ainda assim, mais notadamente na anlise de
aminocidos, peptdeos e compostos proticos, bem como outros produtos de
origem biolgica. Em raras excees, a pureza enantiomrica determinada atravs
de mtodos mais sensveis, como a CLAE ou as TECs
91
. Ser interessante

83

descobrir, no futuro, qual dessas duas tcnicas ter substitudo, mais amplamente, o
ensaio para determinao da rotao ptica. A julgar por sua prevalncia nas
farmacopias, a CLAE concorre com grande vantagem.

2.4.1.2 TCNICAS CROMATOGRFICAS

As tcnicas cromatogrficas so processos fsicos de separao nos quais os
componentes a serem separados so distribudos entre duas fases, onde uma das
fases estacionria e a outra se move em uma direo definida. A fase estacionria
pode ser um slido, um gel ou um lquido. Se lquida, ela pode estar distribuda
sobre um suporte slido, que pode ou no contribuir para o processo de separao.
O lquido pode estar ainda quimicamente ligado ao suporte slido (fase ligada) ou
pode ser imobilizado sobre o suporte por, por exemplo, polimerizao in situ. A fase
mvel, por sua vez, pode ser um gs, um lquido ou um fluido super- ou subcrtico.
As tcnicas cromatogrficas podem ser classificadas ou divididas de acordo com
vrios critrios, como a forma do leito cromatogrfico, o estado fsico da fase mvel,
ou ainda de acordo com o mecanismo de separao
93
. Aquelas que mais se
destacam no campo da separao enantiomrica so listadas e discutidas abaixo.

2.4.1.2.1 CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA

O senso comum entre vrios pesquisadores que a CCD est obsoleta e
incapaz de fornecer resultados reprodutveis e de permitir grande resoluo entre os

84

compostos em uma separao. No entanto, a disponibilidade de mtodos confiveis,
robustos e eficientes para a resoluo de enantimeros por CCD representaria uma
valiosa contribuio ao arsenal de tcnicas capazes de separar enantimeros
94
.
A CCD relativamente barata, rpida e amplamente difundida. Entre as
vrias outras vantagens oferecidas pela tcnica, destacam-se a possibilidade de
processamento paralelo de diversas amostras (com conseqente reduo do tempo
total de anlise por amostra) e o baixo consumo de solventes. Alm disso, a CCD
tambm pode ser empregada para a investigao de sistemas apropriados de
separao enantiomrica para o uso posterior em CLAE
94
.
Contudo, a CCD apresenta algumas desvantagens quando comparada s
tcnicas de CLAE e CG. Alm das j citadas, menor reprodutibilidade e menor poder
de resoluo, os limites de deteco so algumas vezes superiores aos alcanados
em outras tcnicas cromatogrficas (menor sensibilidade)
94,95
. Adicionalmente, a
CCD mais dependente das condies ambientais, tais como umidade relativa,
temperatura ou poluentes atmosfricos, bem como impe dificuldades na anlise de
substncias altamente volteis ou que sejam sensveis ao oxignio ou luz
95
.
Tambm bastante mais difcil automatizar completamente a CCD ao nvel que j
se provou possvel para a CLAE e para a CG, muito embora avanos importantes j
tenham sido realizados nessa direo
94
.
Entre esses avanos est a introduo de espectrodensmetros de varredura,
os quais permitem a quantificao dos analitos diretamente sobre a cromatoplaca.
Esses equipamentos permitem trabalhar em comprimentos de onda pertencentes s
regies ultravioleta e infravermelho do espectro eletromagntico, havendo tambm a
opo de deteco por fluorescncia. A aquisio de dados por
espectrodensitometria e a moderna anlise computadorizada de imagens

85

capturadas por cmeras de vdeo possibilitaram maior confiana na aplicao da
CCD em anlises quantitativas, alm de, obviamente, evitar uma srie de etapas
trabalhosas. Essas etapas, antes necessrias para a quantificao dos analitos, com
certeza contribuam para a inexatido e baixa reprodutibilidade da tcnica. Hoje, a
quantificao in situ nas anlises por CCD est bem estabelecida
94
e o termo
cromatografia planar mais freqentemente empregado para designar a moderna
CCD instrumental.
Outro avano importante, e que contribuiu para que a tcnica pudesse ser
considerada de alto desempenho, foi a comercializao de cromatoplacas que
empregam slica-gel com partculas de menor dimetro
95
. Essa reduo no dimetro
das partculas de slica-gel possibilitou um aumento significativo na preciso da
tcnica, bem como a diminuio dos tempos de anlise e do (j baixo) consumo de
solventes
96
. Entretanto, apenas um tipo de cromatoplaca especificamente destinado
separao enantiomrica est disponvel comercialmente. Seu mecanismo de
separao se baseia na troca de ligantes, sendo mais indicado para a separao de
aminocidos e seus derivados
94,96
. Apesar disso, h a possibilidade de se utilizar
cromatoplacas convencionais e impregn-las com seletores quirais ou adicion-los
diretamente fase mvel. Ao mesmo tempo, vrios pares enantiomricos foram
resolvidos em cromatoplacas convencionais contendo derivados da celulose como
fase estacionria, sem a adio de outros seletores quirais, graas quiralidade da
prpria celulose
94,97
.
Todavia, o nmero de separaes enantiomricas realizadas por CCD
pequeno se comparado quele por CLAE, mas o potencial para uma maior utilizao
j foi demonstrado
97
. No entanto, embora a CCD seja uma tcnica til e barata, ela
continuar sendo subutilizada para separaes enantiomricas at que uma maior

86

variedade de cromatoplacas com FEQs de elevada seletividade e ampla
aplicabilidade esteja disponvel comercialmente
82
.

2.4.1.2.2 CROMATOGRAFIA A GS

A CG continua sendo uma das mais importantes tcnicas de separao
enantiomrica, graas ao desenvolvimento de novas FEQs com maior estabilidade
trmica e aos avanos na tecnologia das colunas capilares. Alta resoluo, maior
eficincia da coluna e simplicidade na composio da fase mvel esto entre as
vantagens oferecidas pela tcnica. A CG particularmente til na resoluo de
compostos no-aromticos usados em sntese assimtrica, os quais no so
facilmente separados por cromatografia lquida. Entretanto, a CG limitada a
compostos naturalmente volteis e estveis a temperaturas elevadas, ou queles
que, aps derivatizao, possuam essas caractersticas. Alm disso, as FEQs
podem racemizar a altas temperaturas, o que, tipicamente, resulta em um
decrscimo no fator de separao ()
82
.

2.4.1.2.3 CROMATOGRAFIA A FLUIDO SUPERCRTICO

Nos ltimos anos, ficou evidente a utilidade atingida pela CFS com o emprego
de FEQs empacotadas, especialmente na pesquisa por novos frmacos. A CFS, a
qual emprega fluido super- ou subcrtico (mais comumente CO
2
), muitas vezes
possibilita uma separao de 3 a 5 vezes mais rpida que a CLAE em fase normal,

87

devido maior difusibilidade e menor viscosidade da fase mvel. Essa maior
velocidade muito interessante para as separaes analticas e extremamente
importante para as separaes preparativas
82
.
As vantagens da CFS ainda incluem: (a) maior resoluo por unidade de
tempo, menor tempo exigido para o reequilbrio da coluna e maior simplicidade na
composio da fase mvel, resultando em desenvolvimento mais rpido de mtodos
e anlises mais rpidas quando comparados queles por CLAE; (b) a habilidade
nica de variar a fora da fase mvel por meio de alteraes em sua densidade, ou
seja, variando-se as condies de temperatura e presso; (c) a possibilidade de
explorar diferentes seletividades, complementares quelas observadas com a CLAE,
pois as interaes com a fase mvel no so equivalentes na CLAE e na CFS, alm
da compatibilidade com praticamente todos os seletores quirais usados na CLAE e
na CG; (d) comparado ao hexano, o CO
2
possui maior compatibilidade com os
solventes polares, possibilitando maior flexibilidade na escolha do modificador
orgnico e, conseqentemente, da fase mvel; (e) menor consumo de solvente
orgnico e o carter ambientalmente amigvel do CO
2
e (f) uma combinao das
vantagens inerentes da CG, sem as limitaes causadas pela elevada temperatura
sobre a seletividade, bem como a compatibilidade com os detectores comumente
empregados na CLAE e na CG
82
.
A CFS, juntamente com a CLAE, est entre as tcnicas mais difundidas e que
mais rapidamente ganharam destaque no campo da separao enantiomrica
82
.
Contudo, parece que o grande aproveitamento da tcnica ocorreu principalmente na
obteno de compostos enantiopuros, onde, mais especificamente, outras
vantagens do mtodo podem ser aproveitadas, como a maior velocidade na
obteno dos enantimeros e a facilidade de remoo do solvente. Na rea

88

analtica, no entanto, a despeito do crescimento constante no nmero de usurios
industriais e do aumento dramtico na venda de equipamentos
82
, ainda ser preciso
mais tempo, especialmente em pases em desenvolvimento, para que a CFS possa
competir com a CLAE, devido ao nmero relativamente grande de cromatgrafos a
lquido j instalados. Tambm contribui para a predominncia da CLAE a ausncia
de uma descrio da tcnica de CFS nos mtodos gerais das farmacopias, bem
como a ausncia, em qualquer monografia especfica dos cdigos oficiais de
farmcia, de ensaios que a empreguem.

2.4.1.2.4 CROMATOGRAFIA A LQUIDO DE ALTA EFICINCIA

A CLAE , dentre as tcnicas de separao enantiomrica, a mais
amplamente utilizada
98
. Suas vantagens sobre outras tcnicas cromatogrficas
incluem: (a) a possibilidade de ser aplicada tanto em escala analtica, quanto em
escala preparativa, de modo eficiente, simples e flexvel, permitindo sua efetiva
adaptao quantidade requerida de enantimeros puros, quando para fins
preparativos; (b) apresenta, com o emprego de detectores por espectrofotometria no
UV-Vis, boa sensibilidade, que pode ainda ser aumentada com o emprego de outros
detectores, como o detector de massas; (c) boa reprodutibilidade em relao aos
tempos de reteno e em relao resoluo entre os picos (mas que pode ser
prejudicada pelo desgaste da fase estacionria, por exemplo); (d) relativa facilidade
de hifenizao com outras tcnicas; (e) elevado grau de automao e de
aperfeioamento dos equipamentos (o que permite, por exemplo, o controle
adequado sobre a temperatura da coluna); (f) possibilidade de se trabalhar

89

temperatura ambiente ou a temperaturas inferiores; (g) possibilidade de se trabalhar
com compostos volteis e no-volteis; (h) grande variedade de seletores quirais
disponveis para serem empregados na resoluo dos enantimeros; (i) grande
aceitao por parte das agncias reguladoras, alm da vasta presena nas
farmacopias e (j) a presena de um nmero relativamente grande de equipamentos
j instalados nas indstrias, nas instituies de ensino e pesquisa e nos laboratrios
fiscais, o que faz com que a tcnica seja escolhida tambm para o desenvolvimento
de mtodos de separao de enantimeros, entre outras vantagens.

2.5 MTODOS DE SEPARAO ENANTIOMRICA POR CLAE

H dois mtodos distintos de se empregar a CLAE para separar
enantimeros. So eles: o mtodo indireto e o mtodo direto.

2.5.1 MTODO INDIRETO

Se dois compostos quirais, racemato A e racemato B, em uma reao que
no afete seus centros assimtricos, reagem de modo a formar ligaes covalentes,
ento quatro diferentes produtos podem ser formados, de acordo com a reao
qumica abaixo:
()-A + ()-B [+A+B] + [+AB] + [A+B] + [AB] ;
[1] [2] [3] [4]

onde os produtos 1 e 4 se relacionam como enantimeros entre si, bem como os
produtos 2 e 3. J os produtos 1 e 3 se relacionam como diasteremeros um do

90

outro, assim como os produtos 2 e 4. A princpio, a anlise de uma mistura dos
quatro ismeros acima, por CLAE convencional (no-quiral), poderia fornecer um
cromatograma constitudo de dois picos, onde um dos picos representaria a co-
eluio dos ismeros 1 e 4 e o outro pico, a co-eluio dos ismeros 2 e 3. A razo
da co-eluio desses picos que a CLAE convencional pode separar
diasteremeros, mas no enantimeros
99
.
Por outro lado, se o racemato A reagisse com uma forma enantiomericamente
pura de B, por exemplo, ()-B, a reao teria como produtos apenas os
diasteremeros 2 e 4. A princpio, a anlise da mistura contendo os produtos dessa
reao, por CLAE convencional, tambm poderia fornecer um cromatograma
constitudo de dois picos. Contudo, nesse caso, cada um dos picos representaria
apenas um dos diasteremeros, agora eluindo isoladamente. Se assumirmos que as
respostas do detector aos dois diasteremeros so iguais, a razo entre as reas
dos picos dos diasteremeros ser igual razo enantiomrica de A, sendo esse o
fundamento do mtodo indireto. O mtodo recebe esse nome, pois, atravs dele,
so separados solutos que se relacionam como diasteremeros e no como
enantimeros
99
.
No exemplo acima, o reagente ()-B, usado para converter os enantimeros
de A em dois diasteremeros, chamado de reagente de derivatizao quiral
(RDQ). As reaes mais comuns envolvendo os RDQs so aquelas que levam
formao de amidas, carbamatos e urias quirais, entre outras
98,99
. Alm disso,
usualmente se obtm a separao dos diasteremeros formados empregando-se
uma fase estacionria aquiral, embora uma FEQ tambm possa ser utilizada. Pode-
se, ainda, empregar a CLAE em fase reversa ou normal. No entanto, a ltima
preferida, devido sua melhor seletividade para ismeros
98
.

91

Durante o desenvolvimento de um mtodo indireto de anlise enantiosseletiva
por CLAE, uma srie de precaues especiais devem ser tomadas para garantir
exatido, preciso e a prpria aplicabilidade do mtodo. Uma dessas precaues
garantir a pureza enantiomrica do RDQ, pois, conforme anteriormente explicado, a
presena de ambos os enantimeros em um RDQ, que a princpio deveria ser
enantiomericamente puro, leva formao de pares enantiomricos que no sero
separados por CLAE convencional e, portanto, formao de produtos que podem
no mais refletir a razo enantiomrica da amostra original
99,100
. Se no for possvel
o emprego de um RDQ enantiomericamente puro, ao menos se deve conhecer sua
razo enantiomrica, para que possam ser aplicados fatores apropriados de
correo aos resultados das determinaes
100
. Entretanto, a validade dessas
correes em algumas situaes questionvel
99
.
Outros fatores podem levar formao de produtos que no mais
representem a razo enantiomrica da amostra original, como a ocorrncia de
racemizao durante as etapas de derivatizao ou, ainda, a ocorrncia de
resoluo cintica. A primeira pode ocorrer tanto com a amostra a ser analisada,
como com o prprio RDQ, e pode ser facilitada pelas condies necessrias
derivatizao, no que diz respeito temperatura, umidade, pH, interaes com
solventes, etc. J a resoluo cintica ocorre quando os enantimeros que
constituem a amostra reagem com o RDQ a diferentes velocidades. De maneira a
evitar a resoluo cintica, fundamental garantir que ambos os enantimeros
reajam completamente. Para tanto, importante otimizar a quantidade do RDQ
empregado, bem como o tempo de reao. Novamente, assumem importncia
fatores como temperatura, pH, tipo e fora das solues tampo empregadas, entre
outros, devendo ser investigada a influncia de cada um deles
100
.

92

Tambm necessrio construir curvas analticas para cada diasteremero,
relacionando suas concentraes com as respectivas respostas do detector, para
garantir que no h diferenas na sensibilidade deste ltimo frente a cada um dos
ismeros
100
.
Diante do exposto, fica evidente que a aplicao do mtodo indireto requer
uma srie de investigaes e experimentos adicionais, o que o torna muito mais
trabalhoso que o mtodo direto, a ser discutido mais adiante. Alm disso, sua
utilizao fica limitada a molculas enantiomricas que possuam grupos funcionais
facilmente derivatizveis, o que outro inconveniente.
No entanto, apesar das inmeras desvantagens do mtodo indireto, algumas
situaes podem fazer com que seu emprego seja desejvel. H casos, por
exemplo, em que, na ausncia de um grupamento cromforo na molcula original, a
reao com um RDQ apropriado no s poderia propiciar a seletividade necessria,
como tambm poderia aumentar a sensibilidade do mtodo, introduzindo o
grupamento cromforo ausente. Do mesmo modo, h casos em que, mesmo com o
uso de FEQs, a derivatizao continua a ser fundamental para que haja o
reconhecimento quiral ou, ainda, para que os analitos tenham um comportamento
cromatogrfico adequado
99
. Apesar desses casos em que o mtodo indireto se torna
desejvel, seu emprego hoje muito menos freqente, graas aos avanos no
desenvolvimento e na oferta de colunas quirais, o que favorece a aplicao do
mtodo direto na CLAE enantiosseletiva.


93

2.5.2 MTODO DIRETO

Um mtodo de separao enantiomrica por CLAE considerado direto se
ele realmente envolve a separao de molculas que se relacionam entre si como
enantimeros, ou seja, molculas no convertidas, atravs de ligaes covalentes
com um RDQ, em seus derivados diastereomericamente relacionados. No entanto,
mesmo em um mtodo direto, os enantimeros originais podem ou no ser
derivatizados atravs da reao com um reagente aquiral
98
.
O mtodo direto se fundamenta na formao de complexos moleculares
diastereomricos transitrios entre os enantimeros a serem separados e um seletor
quiral
98
. Um seletor quiral o componente quiral do sistema de separao capaz de
interagir enantiosseletivamente com os enantimeros a serem separados
101
e pode
ser representado, no mtodo direto, por aditivos quirais adicionados fase mvel ou
pela FEQ.
Os aditivos quirais so empregados menos freqentemente devido aos
problemas que lhes so inerentes, como a necessidade de seu fornecimento
contnuo que, aliada aos preos geralmente elevados dos seletores quirais, torna
essa abordagem menos atraente. Alm disso, seu uso comumente associado a
picos de formato inadequado e com baixo nmero de pratos, assim como tambm
est associado a problemas relacionados deteco
98
. Se os aditivos quirais no
so transparentes radiao aplicada na deteco, seu emprego eleva a
absortividade da prpria fase mvel e, conseqentemente, diminui a sensibilidade
em relao aos analitos de interesse.
Por outro lado, desde 1980, a utilizao de FEQs tem sido predominante nas
separaes enantiomricas por CLAE
98
. Apesar do custo relativamente elevado das

94

FEQs (normalmente mais caras que as fases estacionrias convencionais
empregadas em CLAE), sua utilizao mais econmica quando comparada ao uso
de aditivos quirais e no est associada aos inconvenientes deste ltimo.
Adicionalmente, se comparado ao mtodo indireto de separao enantiomrica por
CLAE, o emprego de FEQs requer muito menos trabalho e, provavelmente, muito
mais confivel.

2.6 PRINCPIOS DO RECONHECIMENTO QUIRAL

A expresso reconhecimento quiral se refere habilidade de um seletor quiral
de interagir de forma distinta com cada um dos enantimeros. No mtodo direto de
separao enantiomrica por CLAE, os analitos e o seletor quiral formam complexos
diastereomricos transitrios, atravs de diferentes mecanismos de interao, como
ligaes de hidrognio, interaes -, empilhamento de dipolos (dipole stacking),
complexos de incluso, complexos de coordenao com metais, interaes
estricas, entre outros
98
. No raro, um seletor quiral especfico pode exibir mltiplos
mecanismos de reconhecimento quiral
99
. Os tipos de interao que iro ocorrer em
um caso em particular dependem dos grupos funcionais presentes no seletor quiral,
nos prprios analitos e tambm na fase mvel, sendo que essas interaes podero
ser de natureza atrativa ou repulsiva
102
.
Os complexos diastereomricos transitrios formados devem possuir
diferenas em suas energias livres, sendo mais estvel aquele cuja energia livre for
menor. O enantimero que formar o complexo mais estvel, por sua vez, ser
aquele que ficar mais tempo retido pela coluna. A diferena de energia livre entre

95

os complexos diastereomricos transitrios formados determina a magnitude da
enantiosseletividade demonstrada nas interaes quirais entre o seletor quiral e os
analitos, ao passo em que a reteno e a eficincia observadas so determinadas
pela soma das interaes quirais e aquirais entre os mesmos
99
.
Conforme o modelo mais amplamente aceito, proposto por Dalgliesh em
1952, ao menos trs interaes so necessrias entre o seletor quiral e um dos
enantimeros a serem separados. Alm disso, pelo menos uma dessas interaes
deve depender da configurao estereoqumica do analito (ver subitem 2.2.1)
98,99
.
No entanto, Wainer e Doyle
103
propuseram um modelo que requer quatro stios de
ligao e uma quinta interao repulsiva (estrica), sendo esta a responsvel pelo
reconhecimento quiral. Este ltimo modelo, de fato, mostrou excelente correlao
com parmetros cromatogrficos obtidos na resoluo de derivados do 1-fenil-2-
aminopropano, onde foi empregada uma coluna do tipo Pirkle.

2.7 FASES ESTACIONRIAS QUIRAIS

Duas estratgias podem ser aplicadas para se alcanar a separao direta de
enantimeros por CLAE com o emprego de FEQs. A primeira estratgia consiste em
selecionar a melhor FEQ disponvel para resolver os enantimeros de um dado
racemato de interesse, enquanto a segunda consiste em modificar (derivatizar) os
enantimeros de maneira que eles possam ento ser separados numa FEQ em
particular
81
.
A primeira estratgia a mais aplicada (provavelmente por causa de sua
maior simplicidade). Atravs dela, tenta-se identificar a FEQ capaz de apresentar a

96

maior seletividade em relao aos compostos que se pretende separar. Para isso,
algumas ferramentas podem ser usadas, como bancos de dados eletrnicos, guias
do usurio (fornecidos pelos fabricantes de colunas), mas a experimentao de
umas poucas colunas ainda o mtodo mais usado na prtica
81
. A seleo dessas
colunas para a experimentao deve ser feita de modo racional, com base no
conhecimento das estruturas dos analitos e do seletor quiral, e tambm com base no
mecanismo de reconhecimento quiral das FEQs disponveis.
Estima-se que mais de 1300 FEQs tenham sido preparadas e que mais de
200 tenham sido comercializadas. Dessa maneira, importante compreender e
classificar as diferentes FEQs para que se possa selecionar a mais adequada para
uma dada separao que se deseje
82
. As FEQs mais comumente utilizadas so
descritas a seguir:

2.7.1 FASES ESTACIONRIAS QUIRAIS DO TIPO DOADOR-ACEPTOR

As FEQs do tipo doador-aceptor so tambm conhecidas como FEQs do tipo
Brush ou, em homenagem ao seu inventor, FEQs do tipo Pirkle. Pirkle se baseou na
teoria da reciprocidade para planejar racionalmente diversas colunas do tipo doador-
aceptor. Essa teoria afirma que o reconhecimento quiral um evento recproco, ou
seja, se um dos enantimeros de Y pode separar os enantimeros de X, ento um
dos enantimeros de X pode separar os enantimeros de Y
98
.
Nas FEQs do tipo Pirkle, um seletor quiral de peso molecular relativamente
baixo ligado a um substrato de slica ou zircnio. As molculas individuais do
seletor quiral so igualmente distribudas sobre o substrato e geralmente atuam

97

independentemente em suas interaes com o soluto. Esse seletor quiral possui ao
menos um grupo aromtico, o qual capaz de realizar interaes - com o soluto.
O grupo aromtico pode ser -doador ou -aceptor. Alguns seletores possuem
ambos os tipos de grupo aromtico. A FEQ forma com o soluto um complexo -
doador/-aceptor e esse complexo ento estabilizado por ligaes adicionais, que
podem ser do tipo ligaes de hidrognio, interaes de dipolo ou repulso
estrica
102
.
As FEQs do tipo Pirkle so geralmente utilizadas em fase normal, devido ao
fato de as interaes - serem favorecidas em solventes no-polares. Contudo,
separaes em fase reversa tambm podem ser realizadas com essas FEQs,
particularmente para compostos altamente polares ou inicos, como cidos
carboxlicos
82
. Em fase reversa, no entanto, a enantiosseletividade usualmente
inferior quela obtida em fase normal; em alguns casos, pode ser observada a
inverso na ordem de eluio dos enantimeros, indicando uma mudana no
mecanismo de reconhecimento quiral
102
. A influncia da fase mvel pode inviabilizar
a previso da ordem de eluio dos solutos, a despeito do tamanho relativamente
pequeno dos seletores quirais.
Entretanto, uma das vantagens das FEQs do tipo Pirkle que vrias delas
esto disponveis em ambas as formas enantiomricas, permitindo a alterao
intencional da ordem de eluio dos enantimeros atravs da simples substituio
de uma das colunas por sua equivalente enantiomrica. Essa capacidade til em
aplicaes analticas e preparativas. Alm disso, em algumas separaes, alguns
picos podem ser largos e possurem cauda. A quantificao de um enantimero
presente em menores concentraes e que elua junto cauda do outro enantimero
(este ltimo presente em maiores concentraes) normalmente requer maiores

98

valores de , se comparada situao oposta, onde o enantimero presente em
menor concentrao elui antes
98
.
As FEQs do tipo Pirkle possuem ainda outras vantagens, como a boa
capacidade de transferncia de massa, a durabilidade (conseqncia da
estabilidade qumica e trmica que exibem) e a compatibilidade com uma grande
variedade de solventes, o que permite, inclusive, seu uso nos modos super- e
subcrtico
102
.

2.7.1.1 A COLUNA WHELK-O 1

A coluna Whelk-O 1 uma coluna do tipo Pirkle, que deriva do 4-(3,5-
dinitrobenzamido)tetraidrofenantreno, covalentemente ligado slica (figura 2.13). A
Whelk-O 1 foi especialmente planejada para a separao do naproxeno e seu
desenvolvimento foi baseado na teoria da reciprocidade. Primeiramente, utilizou-se o
prprio naproxeno como seletor quiral, em uma coluna que foi empregada para
separar uma srie de compostos em seus respectivos enantimeros. Mais tarde, um
dos enantimeros de um dos compostos do qual se obteve boa separao, atuando
como seletor quiral, revelou-se capaz de separar os enantimeros do naproxeno.
Modificaes e melhoramentos posteriores deram origem coluna Whelk-O 1
98
.


99

Figura 2.13 Representao da estrutura qumica da FEQ (S,S)-Whelk-O 1.

A coluna Whelk-O 1 possui um grupo doador e um grupo aceptor de eltrons
, representados, respectivamente, pelos grupos aromticos tetraidrofenantreno e
dinitrobenzamida. Assim sendo, capaz de resolver enantimeros que contenham
grupos -cidos ou -bsicos. De fato, a coluna Whelk-O 1 capaz de separar
diversos tipos de enantimeros, exibindo uma versatilidade superior apresentada
pelas FEQs derivadas de polissacardeos
98
. Entre os compostos que podem ser
resolvidos pela Whelk-O 1 esto amidas, epxidos, steres, urias, carbamatos,
teres, aziridinas, fosfonatos, aldedos, cetonas, cidos carboxlicos, alcois e os
antiinflamatrios no-esterides derivados do cido arilpropanico
104
.
Alm disso, como o seletor quiral ligado covalentemente slica, a coluna
Whelk-O 1 compatvel com todos os solventes normalmente empregados como
fase mvel em cromatografia, o que representa mais uma vantagem sobre boa parte

100

das FEQs derivadas de polissacardeos. Portanto, como outras colunas do tipo
Pirkle, a Whelk-O 1 pode ser operada em fase normal, reversa ou, ainda, nos modos
super- ou subcrtico. Em fase reversa, a fase mvel pode apresentar qualquer
polaridade, mas o pH deve permanecer entre 2,5 e 7,5. gua, acetato de etila,
acetonitrila, butanol, clorofrmio, diclorometano, etanol, heptano, hexano,
isopropanol, metanol e tetraidrofurano so alguns dos solventes normalmente
empregados com a coluna Whelk-O 1. Entre os aditivos que comumente participam
da composio da fase mvel se encontram o cido actico, o acetato de amnio, a
di- e a trietilamina. Para que se mantenha a integridade da coluna, recomenda-se
que o cido trifluoroactico no seja utilizado
104
.

2.7.2 FASES ESTACIONRIAS QUIRAIS DERIVADAS DE POLISSACARDEOS

Os polissacardeos so polmeros de condensao de carboidratos
(acares). A amilose e a celulose so dois dos polissacardeos de ocorrncia
natural mais comuns. Os polissacardeos naturais no so muito teis para o
preparo de FEQs, devido baixa capacidade de resoluo que oferecem e a pouca
resistncia mecnica que possuem. Contudo, compostos obtidos pela derivatizao
desses dois polissacardeos naturais apresentam propriedades cromatogrficas e
enantiosseletivas superiores
102
.
Diversas FEQs constitudas de trifenilsteres ou trifenilcarbamatos de amilose
ou celulose esto disponveis comercialmente. Essas FEQs esto entre as que
apresentam a mais ampla aplicabilidade entre as FEQs disponveis e so capazes
de resolver uma grande e variada seleo de compostos quirais. Tambm so

101

bastante flexveis, pois podem ser usadas em fase normal ou reversa, em modo
polar orgnico ou, ainda, super- ou subcrtico
102
.
O reconhecimento quiral nas FEQs derivadas de polissacardeos atribudo
formao de complexos de incluso, aliada a interaes adicionais que dependem
do modo cromatogrfico, como ligaes de hidrognio, interaes de dipolo e , e
foras de van der Waals. A enantiosseletividade dessas FEQs pode variar em
funo do polissacardeo e do composto empregado na derivatizao do mesmo. Os
componentes da fase mvel, a temperatura e o modo cromatogrfico tambm
podem afetar a enantiosseletividade
102
.
Em fase normal, o reconhecimento quiral ocorre pelo encaixe estrico em
cavidades quirais, com a contribuio de ligaes de hidrognio e interaes de
dipolo e . O modificador orgnico, normalmente um lcool, capaz de alterar a
enantiosseletividade. Solventes aprticos so capazes de melhorar a resoluo
onde as ligaes de hidrognio forem importantes para o reconhecimento quiral. No
entanto, com a maioria das FEQs derivadas de polissacardeos, o uso desses
solventes no normalmente recomendado
102
. Alis, o nmero reduzido de
solventes com os quais as FEQs derivadas de polissacardeos so compatveis
representa uma limitao para vrias dessas fases, exceo feita para aquelas onde
o seletor quiral ligado covalentemente slica, como as colunas Chiralpak IA,
Chiralpak IB e Chiralpak IC.
J em fase reversa, o uso das FEQs derivadas de polissacardeos tem
crescido rapidamente. Aqui, o mecanismo de reconhecimento quiral dominante
creditado incluso forma-dependente em cavidades quirais. Dadas as
caractersticas dos eluentes normalmente empregados, interaes secundrias
ficam enfraquecidas em relao ao modo normal. A fase reversa particularmente

102

til para solutos que no podem ser analisados em fase normal devido
insolubilidade ou s caractersticas de reteno desfavorveis. O modo polar
orgnico, por outro lado, mais comumente empregado em separaes preparativas
e apresenta seletividade diferente daquela observada em fase reversa
102
.

2.7.3 FASES ESTACIONRIAS QUIRAIS DERIVADAS DE CICLODEXTRINAS

As ciclodextrinas (CDs) so polmeros macrocclicos da glicopiranose (figura
2.14), de ocorrncia natural, e tm forma toroidal assimtrica, assemelhando-se a
um cone truncado (figura 2.15). As CDs esto disponveis como -, - e -CDs, que
se diferenciam entre si pelo nmero de unidades de glicopiranose que as compem,
a saber: 6, 7 e 8 unidades, respectivamente
98,102
. Entretanto, a -CD e seus
derivados so as CDs mais amplamente empregadas nas separaes
enantiomricas
98
.
As CDs possuem cavidades relativamente no-polares que permitem, atravs
de interaes hidrofbicas, a incluso de grupamentos no-polares de molculas
hspedes. O tamanho (dimetro) da molcula do analito, em geral, determina se o
mesmo ser capaz de se encaixar na cavidade da CD. Para que haja um bom
encaixe e, conseqentemente, para que haja reconhecimento quiral, a poro
hidrofbica da molcula do analito no deve ser nem muito menor, nem muito maior
que a cavidade da CD
98
. Interaes adicionais tambm podem ocorrer por
impedimento estrico ou atravs de ligaes de hidrognio entre a molcula
hspede e as hidroxilas presentes na borda da cavidade. Esses grupos hidroxila
podem ser modificados por derivatizao e tanto as CDs originais como as CDs

103

derivatizadas tm sido extensivamente utilizadas para a separao de
enantimeros
102
. As CDs tambm so empregadas, na CLAE, como aditivos quirais
na composio da fase mvel. Alm disso, seu uso tambm bastante comum nas
separaes enantiomricas por TECs e por CG.

Figura 2.14 Estrutura molecular da -CD, polmero constitudo de 7 monmeros de glicopiranose,
conectados por ligaes -(1,4)-glicosdicas.

Interior hidrofbico
Exterior hidroflico
Figura 2.15 Forma toroidal assimtrica da CD, que se assemelha a um cone truncado.


104

As FEQs derivadas de CDs, assim como as derivadas de polissacardeos,
tambm podem ser usadas em fase normal ou reversa, no modo polar orgnico ou,
ainda, super- ou subcrtico. Um mecanismo de incluso ocorre em fase reversa e
essa interao tanto mais forte quanto maior o contedo de gua na fase mvel.
Ainda em fase reversa, a seletividade dependente da hidrofobicidade e da
compatibilidade estrica dos enantimeros. Molculas que possuam anis
aromticos na posio ou , com tamanho comparvel cavidade da CD, e pelo
menos um grupo capaz de formar ligaes de hidrognio, prximos ao centro quiral,
tm a separao favorecida. Em fase reversa, vantajoso modificar o pH ou a fora
inica da fase mvel para melhorar o mecanismo de incluso. Em outros modos de
separao, o soluto tem que competir com os componentes no polares da fase
mvel pela cavidade da CD e o mecanismo de reconhecimento quiral alterado. No
modo polar orgnico, as interaes predominantes so ligaes de hidrognio com
as hidroxilas no exterior da CD. A separao favorecida para solutos que possuam
um mnimo de dois grupos distintos capazes de formar ligaes de hidrognio (um
dos quais deve estar ligado ao centro quiral ou estar prximo a ele) e um grupo
volumoso prximo ao centro quiral
82,102
.

2.7.4 FASES ESTACIONRIAS QUIRAIS DERIVADAS DE TERES DE COROA

teres de coroa so compostos cclicos heteroatmicos que, diferentemente
das ciclodextrinas, possuem uma cavidade hidroflica e a superfcie exterior
hidrofbica. A cavidade dos teres de coroa possui uma forte afinidade por ctions,
predominantemente atravs de interaes eletrostticas. Os teres de coroa 18-

105

coroa-6 podem complexar no apenas ctions inorgnicos, mas tambm aminas
aromticas primrias. Essa interao ocorre principalmente atravs da formao de
ligaes triplas de hidrognio entre os tomos de hidrognio do grupo amnio e os
tomos de oxignio do ter de coroa. A introduo de grupos volumosos no exterior
desses teres propicia barreiras estricas e induz interaes enantiosseletivas com
a molcula hspede. Se a molcula hspede capaz de formar complexos
razoavelmente estveis com o ter de coroa, ento as interaes repulsivas ou
atrativas com essas barreiras diminuem a estabilidade do complexo formado com
um dos enantimeros, resultando no reconhecimento quiral
102
.
Geralmente, as duas formas enantiomricas das FEQs derivadas de teres
de coroa esto disponveis, permitindo o controle da ordem de eluio dos
enantimeros. Alm disso, tambm esto disponveis colunas onde o ter de coroa
(ou seu derivado) est covalentemente ligado slica, o que permite maior
flexibilidade no uso de solventes orgnicos na fase mvel. Essa maior flexibilidade
no uso de solventes orgnicos possibilita a separao de uma variedade maior de
compostos nessas colunas
102
.

2.7.5 FASES ESTACIONRIAS QUIRAIS DO TIPO TROCA DE LIGANTES

O mecanismo de separao com as FEQs do tipo troca de ligantes baseado
na formao de complexos diastereomricos ternrios que envolvem: os
enantimeros que se pretende separar (R e S), um on de um metal de transio
(M), usualmente Cu
2+
, e uma terceira molcula quiral (L), normalmente um
aminocido, que fornecida ao sistema pela FEQ. Os quelatos diastereomricos

106

formados nesse sistema so representados pela forma L-M-R e L-M-S. Quando
esses complexos possuem diferentes estabilidades, o enantimero que participa do
complexo menos estvel elui antes, permitindo a separao dos enantimeros
105
.
Os solutos capazes de serem separados nas FEQs do tipo troca de ligantes
devem ser capazes de formar complexos de coordenao com metais de transio,
o que limita esses solutos a -aminocidos e seus derivados e a -hidroxicidos
mono- e dicarboxlicos. So empregadas fases mveis aquosas e os seguintes
fatores podem ser manipulados para controlar a reteno: a concentrao do on
metlico, o pH, o tipo e a concentrao do modificador orgnico, alm da
temperatura
105
. Os compostos a serem separados no precisam possuir grupos
cromforos para serem detectados por espectrofotometria de absoro no
ultravioleta, uma vez que os complexos com o cobre absorvem radiao pertencente
a essa regio do espectro. No entanto, a sensibilidade da deteco fica
comprometida devido ao sinal de fundo
100
.

2.7.6 FASES ESTACIONRIAS QUIRAIS DERIVADAS DE PROTENAS

As protenas so polmeros complexos de elevada massa molecular
especfica, compostos de subunidades quirais (L-aminocidos). A habilidade das
protenas de se ligarem estereoespecificamente a molculas menores foi usada para
desenvolver uma srie de FEQs que se encontram comercialmente disponveis
105
.
Entre as protenas empregadas na fabricao dessas FEQs esto a glicoprotena
1
-
acida (a principal protena plasmtica na ligao a frmacos bsicos), a albumina
srica humana (a principal protena plasmtica na ligao a frmacos fracamente

107

cidos), a albumina srica bovina, a ovomucide, a celobioidrolase e a pepsina
98,102
.
As FEQs desenvolvidas com quaisquer dessas protenas so teis na resoluo de
racematos e todas possuem uma variedade extremamente ampla de aplicaes,
com destaque especial para a glicoprotena
1
-cida
105
. Contudo, a aplicao
dessas FEQs vem diminuindo nos ltimos anos, devido ao fato de serem menos
estveis e, normalmente, mais caras que outras FEQs, alm de s poderem ser
utilizadas em fase reversa. Tambm contribui para sua menor utilizao o fato de
no serem adequadas s aplicaes preparativas, graas sua baixa capacidade
de carga, a menor entre as FEQs
82
.
O mecanismo pelo qual as protenas interagem estereoespecificamente com
molculas quirais complexo e no muito bem compreendido. As principais
interaes com enantimeros parecem ser hidrofbicas e eletrostticas, mas
ligaes de hidrognio e interaes de transferncia de carga tambm podem
contribuir para o reconhecimento quiral. Pores diferentes da protena podem estar
envolvidas nessas interaes estereosseletivas, e a incluso do enantimero na
estrutura tridimensional da protena tambm pode contribuir para a
enantiosseletividade
98
.
As interaes responsveis pela ligao do soluto com a protena usualmente
envolvem outros mecanismos no-estereoespecficos, alm dos estereoespecficos
j citados. A soma desses mecanismos faz com que parmetros como a composio
e a vazo da fase mvel, a temperatura, a fora inica do tampo e o pH afetem
sensivelmente as separaes
98,102,105
. Esses parmetros podem ser ajustados para
melhorar a separao dos solutos nas FEQs proticas e, no raro, inverses na
ordem de eluio so observadas com a alterao desses parmetros
102
.


108

2.7.7 FASES ESTACIONRIAS QUIRAIS DERIVADAS DE ANTIBITICOS GLICOPEPTDICOS

H trs antibiticos glicopeptdicos que tm sido bastante utilizados como
seletores quirais e esto disponveis como FEQs: a ristocetina A, a teicoplanina e a
vancomicina. Esses antibiticos macrocclicos possuem diversas caractersticas que
os permitem interagir enantiosseletivamente com compostos quirais, como mltiplos
centros quirais e uma diversidade de grupos funcionais, que inclui carboidratos,
anis aromticos, fenis, cidos, steres, aminas e ligaes do tipo amida.
Conseqentemente, eles podem interagir com solutos atravs de ligaes de
hidrognio, interaes de dipolo, -, hidrofbicas e eletrostticas, alm de
impedimentos estricos
102
.
H dois tipos de FEQs que derivam da teicoplanina. Em uma dessas fases, os
carboidratos foram removidos da estrutura original do antibitico glicopeptdico
102
. A
enantiosseletividade entre elas diferente
102
, mas, em geral, superior quela
exibida pela ristocetina A ou pela vancomincina
82
. As FEQs derivadas de antibiticos
glicopeptdicos apresentam boa seletividade para aminocidos e cidos carboxlicos
e tambm podem ser empregadas para resolver compostos neutros ou bsicos.
Alm disso, apresentam como vantagens a boa estabilidade e a boa capacidade de
carga
98
, aliadas possibilidade de serem utilizadas em vrios modos
cromatogrficos
102
.
Em fase reversa, as interaes predominantes so as eletrostticas e as
hidrofbicas. No modo polar orgnico, acredita-se que as interaes eletrostticas
tambm sejam predominantes. Entretanto, as interaes hidrofbicas ficam
enfraquecidas e h um favorecimento das ligaes de hidrognio e interaes de
dipolo, em relao fase reversa. Em fase normal, uma fase mvel constituda de

109

hexano/lcool geralmente utilizada, alm de, normalmente, serem empregados
cido trifluoroactico e trietilamina como aditivos. Esses aditivos ionizam a fase
estacionria e os solutos, alm de reduzirem as interaes no-especficas
secundrias. No modo super- ou subcrtico, as interaes so semelhantes s que
ocorrem em fase normal
102
.

2.7.8 OUTRAS FASES ESTACIONRIAS QUIRAIS

Mais recentemente, foram introduzidas no mercado FEQs derivadas dos
alcalides da Cinchona, quinina e quinidina. Esses alcalides, na forma de
carbamatos, foram imobilizados em slica como suporte, dando origem a FEQs cujos
nomes comerciais so: ProntoSIL Chiral AX QN-1 e Chiralpak QN-AX, derivadas da
quinina, e ProntoSIL Chiral AX QD-1 e Chiralpak QD-AX, derivadas da quinidina.
Essas FEQs demonstraram boa enantiosseletividade para cidos quirais e, embora
apresentem boa enantiosseletividade em fase normal, so mais utilizadas em fase
reversa. Em fase reversa possvel tirar vantagens das interaes por pareamento
inico (os alcalides quinina e quinidina so contra-ons efetivos para cidos
carboxlicos e sulfnicos). Conseqentemente, essas fases so classificadas como
trocadoras de nions quirais fracos. J nas separaes em fase normal, no h
interaes por pareamento inico e se acredita que as interaes encontradas sejam
semelhantes quelas que ocorrem com FEQs do tipo Pirkle
102
.
Kromasil CHI-DMB, Kromasil CHI-TBB, e Chiraspher NT so FEQs
polimricas e tambm se encontram entre as FEQs de maior sucesso,
especialmente em aplicaes preparativas
82
.

110

2.8 OUTRAS TCNICAS ANALTICAS IMPORTANTES

A pureza enantiomrica de substncias quirais tambm pode ser determinada
por tcnicas que no envolvem a separao dos enantimeros. Dentre essas
tcnicas, a mais clssica a determinao da rotao ptica, atravs da
polarimetria. A polarimetria , ainda hoje, a tcnica mais empregada pelas
farmacopias para a diferenciao entre racematos e frmacos enantiopuros. No
entanto, sabe-se que essa uma tcnica muito pouco sensvel. Em um trabalho de
Thunberg et al.
106
, a polarimetria no foi capaz de diferenciar entre racematos e
misturas enantiomricas cujo excesso enantiomrico variava de 40% a 80%, devido
pequena razo sinal-rudo apresentada. Isso significa que o emprego da
polarimetria como teste de identificao ou teste de pureza nem sempre relevante.
Esse mesmo trabalho demonstrou que a tcnica espectroscpica de dicrosmo
circular pode determinar com maior exatido a pureza enantiomrica de misturas
no-racmicas, devido sua maior sensibilidade.
O dicrosmo circular (DC) faz parte das tcnicas ditas quirpticas, que so as
tcnicas pticas capazes de diferenciar entre dois enantimeros. As tcnicas
quirpticas incluem a polarimetria, a disperso rotatria ptica (DRO) e o DC.
Nessas tcnicas, a deteco de molculas quirais baseada na interao entre um
centro quiral do analito e a onda eletromagntica polarizada incidente
107
.
A polarimetria e a DRO determinam, ambas, a extenso com a qual um raio
de luz linearmente polarizada rotacionado durante sua transmisso atravs de um
meio contendo uma amostra quiral. As duas tcnicas so inteiramente equivalentes
para espcies quirais que no absorvem e diferem somente no fato de que a DRO
fornece uma resposta espectral, enquanto que medidas polarimtricas so

111

normalmente restritas a um nmero limitado de comprimentos de onda pr-
selecionados. A DRO preterida enquanto tcnica analtica por faltar-lhe
especificidade e por causa da dificuldade de se determinar a linha de base com
exatido
107
.
O DC, por sua vez, a mais sofisticada das trs tcnicas quirpticas, pois
medidas de rotao e absorbncia so feitas simultaneamente. De fato, o DC
baseado na diferena apresentada pelos enantimeros na absoro de ondas
eletromagnticas circularmente polarizadas dextro- e levorotatrias. Na aplicao do
DC a problemas analticos, as duas propriedades, quiralidade e absoro, fornecem
a informao necessria para determinaes qualitativas e quantitativas,
respectivamente. No que diz respeito s determinaes qualitativas, o DC fornece
espectros que possuem caractersticas bastante peculiares, de tal forma que
permitem caracterizar o analito. As determinaes quantitativas, por outro lado, so
baseadas nas reas ou alturas de bandas que se apresentam no espectro, tal como
na espectrofotometria de absoro UV-Vis. Alm disso, como no h sinal referente
a dicrosmo circular em comprimentos de onda onde no h absoro pelo analito, a
linha de base facilmente definida, o que por si s torna o DC superior DRO para
fins analticos
107
.
As tcnicas quirpticas tambm tm sido utilizadas associadas CLAE, como
alternativa s tcnicas de deteco convencionais. Na CLAE, os detectores
quirpticos auxiliam na determinao da ordem de eluio dos analitos e podem
oferecer a sensibilidade ou seletividade exigidas quando se trabalha nos extremos
da escala de excesso enantiomrico.
Recentemente, em um trabalho de Linder, Yanik e Bobbitt
108
, foram
confrontadas as vantagens entre o emprego de detectores de absorbncia UV-Vis e

112

polarimtrico a laser na determinao de excessos enantiomricos superiores a
99%. Comparados aos polarmetros comuns, os detectores polarimtricos a laser
tm sua sensibilidade bastante aumentada, de tal modo que, nesse trabalho, a
deteco polarimtrica a laser possibilitou a quantificao de impurezas
enantiomricas em quantidades inferiores a 0,2%. Com base na razo sinal-rudo do
detector durante os experimentos, e desde que obedecidas algumas condies para
a separao cromatogrfica, seria possvel detectar impurezas enantiomricas
presentes em quantidades iguais a 0,1%.
Ao mesmo tempo, alm de ter se mostrado bastante sensvel, a deteco
polarimtrica a laser tambm considerada seletiva, pois somente molculas quirais
so detectadas. Alm disso, no h necessidade de que o analito apresente
absoro, o que faz da polarimetria a laser a tcnica de deteco quirptica de
escolha para compostos como acares e outras molculas quirais que no
possuem grupos cromforos
109
.
A deteco por DC, por sua vez, ainda mais seletiva que a polarimetria a
laser, pois, para que um analito apresente dicrosmo circular, necessrio que
possua, alm do centro quiral, um grupo cromforo, e ambos devem estar
localizados de maneira a formar um quirforo. Quirforo o nome dado ao arranjo
formado por um centro quiral e um grupo cromforo quando se encontram
estruturalmente adjacentes um ao outro, e a poro da molcula responsvel pelo
aparecimento das bandas Cotton, que caracterizam um espectro de dicrosmo
circular
110
. Todas essas exigncias fazem com que a deteco por DC seja muito
mais seletiva que a deteco por espectrofotometria de absoro UV-Vis comum
107
,
alm de torn-la especialmente atraente quando componentes da matriz interferem
no cromatograma.

113

Adicionalmente, a deteco polarimtrica a laser e a deteco por DC ainda
apresentam outras diferenas importantes em relao deteco por
espectrofotometria no UV-Vis. Nesta ltima, a resposta fornecida pelo detector
unimodal e idntica em relao ao sinal e magnitude para os dois enantimeros de
um par enantiomrico. Por outro lado, os detectores polarimtricos a laser e os
detectores por DC respondem diretamente atividade ptica intrnseca dos analitos,
de tal modo que cada enantimero de um par enantiomrico produz respostas iguais
em magnitude, mas de sinais opostos. Alm disso, com o emprego desses
detectores, racematos e compostos aquirais no produzem nenhum sinal
109
.
Essa resposta bimodal nica, aliada resposta de outro detector no-
quirptico, assume importncia fundamental em determinaes quantitativas onde
no h resoluo entre os enantimeros ou onde a resoluo apenas parcial
109
.
Nessas situaes, onde os dois enantimeros co-eluem, nem um detector
convencional, nem um detector exclusivamente quirptico seriam adequados para
determinar o excesso enantiomrico, caso fossem empregados isoladamente.
Porm, se ambos os detectores so colocados em srie, uma distino quantitativa
pode ser feita. Medidas da absorbncia ou do ndice de refrao, por exemplo,
fornecem a soma das concentraes dos dois ismeros e o sinal do detector
quirptico fornece a informao a partir da qual se pode calcular a diferena entre as
duas concentraes. Assim, a concentrao de cada ismero prontamente obtida
atravs da soluo dessas equaes (soma e diferena)
107
. Todavia, atualmente,
no necessrio que dois detectores sejam colocados em srie, uma vez que j so
oferecidos detectores capazes de determinar, simultaneamente, a absoro no UV-
Vis e o dicrosmo circular, a partir de uma nica clula de deteco.

114

Entretanto, alm das tcnicas quirpticas, existem outras tcnicas que
dispensam a separao dos enantimeros na determinao da pureza
enantiomrica de substncias quirais e que tambm merecem ser citadas, como a
ressonncia magntica nuclear (RMN)
111-113
, a calorimetria exploratria diferencial
114

e as tcnicas eletroqumicas com o emprego de sensores enantiosseletivos
115-117
.
Paralelamente, tambm so importantes, no contexto da anlise de frmacos
quirais, as tcnicas capazes de determinar a configurao absoluta desses
frmacos. Algumas das tcnicas j mencionadas, que permitem quantificar os
enantimeros, tambm podem ser aplicadas na determinao da configurao
absoluta de molculas assimtricas, como o caso da RMN
118
e das tcnicas
quirpticas
119-123
.
Entre as tcnicas quirpticas empregadas com esse objetivo se encontram a
polarimetria
119-121
, o DC
119,121
(eletrnico), o dicrosmo circular vibracional
119,122,123

(DCV) e o espalhamento Raman, anlogo ao DCV, chamado atividade ptica Raman
vibracional
119
(AORV). Todos esses mtodos quirpticos apresentam como
desvantagem o fato de que, atravs deles, a determinao da configurao absoluta
no realizada diretamente, mas sim atravs da comparao de dados
experimentais com previses obtidas atravs de clculos mecnico-qunticos. Por
outro lado, eles permitem a anlise de compostos em soluo, o que amplia o
nmero de compostos que podem ser analisados por essas tcnicas. A AORV
uma tcnica relativamente recente. Das tcnicas quirpticas j mais consagradas
pelo uso, a mais praticada, poderosa e confivel o DCV. Alm disso, o DCV requer
clculos um pouco menos complexos que aqueles exigidos pelo DC eletrnico e pela
polarimetria.

115

A RMN, por sua vez, tem a seu favor o fato de ser uma tcnica j bastante
conhecida. No entanto, apresenta como desvantagem a necessidade de reagentes
de deslocamento quirais, aditivos quirais ou reaes de derivatizao.
Tambm merece ser citada aqui a cristalografia de raios-x
124
, que com seus
recentes melhoramentos tcnicos se tornou a tcnica padro para a determinao a
priori da configurao absoluta de molculas assimtricas. Contudo, uma grande
dificuldade com essa tcnica conseguir um cristal adequado para a determinao.
Alis, essa necessidade limita a tcnica a amostras slidas, o que outra de suas
desvantagens.
Outras tcnicas podem ainda ser aplicadas na determinao da configurao
absoluta de frmacos quirais, como a resoluo enzimtica e a sntese
estereosseletiva, embora nem sempre sejam de muita praticidade. Alm disso, tem
havido interesse crescente na determinao da configurao absoluta de compostos
assimtricos com base somente na anlise de dados obtidos por estudos de
modelagem, associados s informaes fornecidas pela reteno cromatogrfica
desses compostos em FEQs empregadas na CLAE
125
.

2.9 REVISO DOS MTODOS PARA SEPARAO E DETERMINAO QUANTITATIVA DOS
ENANTIMEROS DO CETOPROFENO E DO FENOPROFENO POR CLAE

Os primeiros mtodos desenvolvidos para separar e quantificar os
enantimeros do cetoprofeno e do fenoprofeno, por CLAE, foram mtodos indiretos
de separao enantiomrica
126,127
. Conforme discutido no subitem 2.5.1, os mtodos
indiretos empregam RDQs na derivatizao dos enantimeros, conduzindo

116

formao de diasteremeros, os quais so posteriormente separados, em sua
maioria, em fases estacionrias aquirais. Como os profenos possuem em suas
estruturas qumicas um grupo funcional carboxila, o qual facilmente convertido em
um grupo amida pela reao com uma amina, diversas aminas quirais j foram
empregadas para a derivatizao quiral dos profenos. Entre as aminas mais
comumente empregadas, destacam-se a 1-feniletilamina (ou -metilbenzilamina)
128-
135
, a L-leucinamida
136-140
e a 1-(1-naftil)-etilamina
131,141-143
. A reao entre o profeno
e a amina quiral normalmente ocorre de modo indireto, passando primeiro pela
transformao do profeno em um intermedirio mais reativo, como um cloreto de
acila ou um derivado imidazlico. Para tanto, faz-se reagir o profeno com cloreto de
tionila ou 1,1-carbonildiimidazol, respectivamente. Outra opo a formao de um
anidrido misto como intermedirio, pela reao do profeno com cloroformato de etila,
por exemplo. O emprego do 1,1-carbonildiimidazol usualmente requer temperaturas
mais elevadas e/ou um tempo relativamente longo para que a reao se complete. O
emprego do cloroformato de etila, por sua vez, permite que a reao se complete
rapidamente, mesmo temperatura ambiente
126
. H ainda outros mtodos para se
promover a reao entre o profeno e a amina quiral, como o mtodo proposto por
Thomason et al.
131
.
Outras aminas quirais, especialmente desenvolvidas para possibilitar a
deteco por fluorescncia, tambm foram sintetizadas e empregadas como RDQs
na derivatizao de profenos
143-145
. Nesse contexto, Santa et al.
143
sintetizaram
algumas aminas fluorescentes que permitiram o desenvolvimento de mtodos de
separao bastante sensveis, empregando deteco por fluorescncia e por
espectrometria de massas. Com a utilizao de algumas das aminas sintetizadas, foi
possvel alcanar excelente resoluo entre os enantimeros do cetoprofeno, dentro

117

de tempos de eluio razoveis. No entanto, no procedimento de derivatizao
descrito pelos autores, os enantimeros que se pretende separar so colocados
para reagir com a amina quiral por um perodo de 12 horas, o que inviabiliza a
aplicao do mtodo em anlises de rotina, as quais exigem mtodos cada vez mais
rpidos. J no trabalho de Iwaki et al.
144
, o tempo de reao na etapa de
derivatizao de 3 horas. O trabalho publicado por Al-Kindy et al.
145
, por sua vez,
descreve um procedimento de derivatizao no qual o tempo de reao de apenas
30 minutos. Nesse trabalho, os autores sintetizaram uma nova amina quiral
fluorescente e a empregaram no desenvolvimento de mtodos indiretos de
separao para diversos compostos. Contudo, no conseguiram obter a resoluo
dos enantimeros do fenoprofeno e, embora tenham conseguido separar os
enantimeros de cetoprofeno, s o fizeram custa de um longo tempo de eluio
para os solutos. Alm disso, a intensidade da fluorescncia observada para o
derivado do (S)-cetoprofeno foi equivalente metade daquela observada para o
derivado do (R)-cetoprofeno.
De fato, os mtodos indiretos de separao enantiomrica por CLAE podem,
em algumas situaes, ser mais apropriados para a determinao de enantimeros
em matrizes biolgicas, devido sua sensibilidade e versatilidade
145
. Entretanto,
diante da alternativa oferecida pelos mtodos diretos, tendem a cair em desuso para
a anlise da pureza de frmacos quirais em medicamentos. Embora trabalhos
relativamente recentes envolvendo mtodos indiretos de separao enantiomrica
tenham sido publicados
133-135,142
, tais mtodos tm sido preteridos em virtude de
suas vrias desvantagens, j discutidas no subitem 2.5.1.
A tabela 2.4 traz alguns exemplos de mtodos indiretos de separao por
CLAE para os enantimeros do cetoprofeno e do fenoprofeno.

Tabela 2.4 Exemplos de mtodos indiretos de separao por CLAE para os enantimeros do cetoprofeno e do fenoprofeno (continua).

Frmaco(s)

RDQs Coluna Fase mvel Deteco Referncia
CET/FEN 1-feniletilamina e
cloreto de tionila
Hypersil APS
(125 x 5 mm, 5 m)
i-OCT:DCM:MeOH
(55:44,8:0,2) (CET)
i-OCT:DCM:MeOH
(75:24:1) (FEN)
UV
308 nm
128
cloreto de tionila
Lichrosorb Si-60
(250 x 4 mm, 5 m)
DCM:ACN (95:5) (CET)
DCM:ACN (96:4) (FEN)

UV
254 nm (CET)
272 nm (FEN)
129
CET 1-feniletilamina e
cloreto de tionila
SGE (Slica)
(250 x 4 mm, 5 m)
HEP:IPA (92:8) UV
254 nm
130
CET/FEN 1-feniletilamina,
DEC e 1-HBT
Techsphere ODS*
(250 x 5 mm, 5 m)
NaH
2
PO
4
75 mM:ACN:H
3
PO
4

(50:50:0,15)** (CET)
NaH
2
PO
4
75 mM:ACN:H
3
PO
4

(45:55:0,21)** (FEN)
UV
254 nm
131
cloroformato de etila
Nova-Pak C
18
*
(100 x 8 mm, 4 m)
H
2
O:ACN:HAc:Et
3
N
(57:43:0,1:0,03)
UV
255 nm
132
CET L-leucinamida e
LiChroCart RP-18*
(250 x 4 mm, 7 m)
Tampo fosfato***
10 mM pH 6,5:ACN
(62:38)
UV
260 nm
136
CET L-leucinamida e
Partisil 5 ODS-3*
(100 x 4,6 mm, 5 m)
KH
2
PO
4
60 mM:ACN:Et
3
N
(64:36:0,02)
UV
275 nm
137

Tabela 2.4 Exemplos de mtodos indiretos de separao por CLAE para os enantimeros do cetoprofeno e do fenoprofeno (concluso).

Frmaco(s)

RDQs Coluna Fase mvel Deteco Referncia
CET/FEN L-leucinamida e
Partisil 5 ODS-3*
(100 x 4,6 mm, 5 m)
KH
2
PO
4
70 mM:ACN:Et
3
N
(65:35:0,02)
pH 6,0
UV
275 nm (CET)
232 nm (FEN)
138
CET 1-(1-naftil)-etilamina e
Partisil 5 ODS-3*
(100 x 4,6 mm, 5 m)
H
2
O:ACN:HAc:Et
3
N
(45:55:0,1:0,02)
UV
232 nm
141
CET DBD-Apy ou NBD-
Apy, DPDS e TPP
TSKgel
ODS-80TS
(150 x 4,6 mm, 5 m)
DBD-Apy: H
2
O:ACN (35:65)
NBD-Apy: H
2
O:ACN (50:50)
Fluorescncia
e
ESI-MS
143
FEN DAPEA, DPDS e
TPP
TSKgel
ODS-80TM
(150 x 4,6 mm, 5 m)
NaAc 50 mM pH 6,5:ACN
(35:65)
Fluorescncia
Ex.: 338 nm
Em.: 535 nm
144
CET DNS-Apy, DPDS e
TPP
TSKgel
ODS-80TM
(150 x 4,6 mm, 5 m)
H
2
O:ACN (50:50) Fluorescncia
Ex.: 340 nm
Em.: 530 nm
145

RDQs, reagentes de derivatizao quiral; CET, cetoprofeno; FEN, fenoprofeno; DEC, cloridrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida; 1-HBT,
1-hidroxibenzotriazol; DBD-Apy, (S)-4-(N,N-dimetilaminossulfonil)-7-(3-aminopirrolidin-1-il)-2,1,3-benzoxadiazol; NBD-Apy, (R)-4-nitro-7-(3-
aminopirrolidin-1-il)-2,1,3-benzoxadiazol; DPDS, dissulfeto de 2,2'-dipiridina; TPP, trifenilfosfina; DAPEA, 1-(4-dansilaminofenil)etilamina; DNS-Apy, 1-
(5-dimetilamino-1-naftalenossulfonil)-(S)-3-aminopirrolidona; i-OCT, isooctano; DCM, diclorometano; MeOH, metanol; ACN, acetonitrila; HEP, n-
heptano; IPA, 2-propanol; NaH
2
PO
4
, fosfato monobsico de sdio; H
3
PO
4
, cido fosfrico; HAc, cido actico; Et
3
N, trietilamina; KH
2
PO
4
, fosfato
monobsico de potssio; NaAc, acetato de sdio; UV, ultravioleta; ESI-MS, espectrometria de massa acoplada ionizao por eletrospray; Ex.,
excitao; Em., emisso. *Equipada com coluna de guarda. **A fase mvel contm ainda pentanossulfonato de sdio (5 mM) e seu pH aparente
igual a 2,8. ***O autor omite, no artigo em questo, qual o sal utilizado no preparo do tampo fosfato.

120

Todavia, reaes de derivatizao no so privilgio exclusivo dos mtodos
indiretos de separao enantiomrica. Os mtodos diretos tambm podem envolver
reaes de derivatizao com reagentes aquirais, objetivando incorporar um
grupamento qumico que aumente a sensibilidade do detector ao analito, minimizar
interaes indesejadas com a fase estacionria, ou ainda promover ou melhorar o
reconhecimento quiral e a resoluo
126,127
.
Na literatura, dentre os mtodos diretos de separao enantiomrica por
CLAE que se aplicam aos enantimeros do cetoprofeno e/ou do fenoprofeno, h
exemplos de utilizao da abordagem acima. De fato, foram encontrados trabalhos
em que mtodos aquirais de derivatizao foram utilizados para promover a
resoluo dos enantimeros em uma determinada FEQ
146-152
e/ou para aumentar a
sensibilidade do detector ao analito (via derivatizao aquiral fluorognica)
143,153
.
Nos trabalhos que correspondem s referncias 146 a 149 foram utilizadas
FEQs do tipo Pirkle. O emprego de FEQs do tipo Pirkle na separao dos
enantimeros do cetoprofeno e do fenoprofeno ser discutido mais adiante.
J no trabalho correspondente referncia 143 e nos que correspondem s
referncias 150 a 153 foram utilizadas FEQs polimricas que empregam o tris(4-
metilbenzoato) de celulose
150-152
ou o tris(3,5-dimetilfenilcarbamato) de celulose
143,153

como seletor quiral. Uma das desvantagens comumente associadas ao emprego de
FEQs derivadas de carboidratos o baixo nmero de pratos alcanado, conforme
exemplificado na tabela 2.5. Essa mesma tabela apresenta, para os trabalhos que
correspondem s referncias 150 a 152, os reagentes empregados na derivatizao,
a fase mvel utilizada e alguns indicadores de desempenho das separaes.
Os dois primeiros mtodos que constam na tabela 2.5 so muito semelhantes
e foram desenvolvidos pelos mesmos autores
150,151
.

Empregando o primeiro

121

mtodo
150
, os autores conseguiram obter uma resoluo apenas parcial para os
enantimeros do cetoprofeno, conforme evidenciado nos cromatogramas
apresentados no artigo correspondente. J no mtodo posterior
151
, um aumento no
fator de separao e na resoluo pode ser observado. No entanto, no se pode
afirmar, com certeza, que com este aumento os autores tenham alcanado a
completa resoluo entre os enantimeros do cetoprofeno, uma vez que o artigo
correspondente no apresenta nenhum cromatograma referente a essa separao.
Melhores resultados foram atingidos pela aplicao do mtodo desenvolvido por
Aboul-Enein et al.
152
, onde o emprego do 9-aminofenantreno, como reagente de
derivatizao aquiral, possibilitou a resoluo em linha de base dos enantimeros do
cetoprofeno. Contudo, os mtodos propostos em qualquer desses trabalhos
compartilham algumas desvantagens comuns a todos os mtodos que envolvem
reaes de derivatizao: so trabalhosos e demorados.

Tabela 2.5 Alguns dos mtodos diretos de separao por CLAE para os enantimeros do
cetoprofeno e/ou fenoprofeno que envolvem derivatizao com reagentes aquirais.

Frmaco

Reagente(s) de
derivatizao
Fase mvel N
1
R
s
Referncia
CET Benzilamina, EDC
e HOBT
TP 50 mM
pH 1,5:MeOH
(25:75)
- 1,33 1,22 150
CET Benzilamina, EDC
e HOBT
TP 100 mM
pH 2,0:MeOH
(30:70)
623 1,40 1,58 151
FEN Benzilamina, EDC
e HOBT
TP 100 mM
pH 2,0:MeOH
(30:70)
633 1,46 2,04 151
CET 9-aminofenantreno TP 20 mM
pH 2,0:ACN:MeOH
(15:60:25)
- 1,76 6,44 152

CET, cetoprofeno; FEN, fenoprofeno; N
1
, nmero de pratos referente ao primeiro pico; , fator de
separao; R
s
, resoluo; EDC, cloridrato de 1-etil-3-dimetilaminopropil-carbodiimida; HOBT, 1-
hidroxibenzotriazol; TP, tampo perclorato; MeOH, metanol; ACN, acetonitrila.

122

A literatura tambm registra, dentre os mtodos diretos de separao
enantiomrica por CLAE desenvolvidos para a separao dos enantimeros do
cetoprofeno e/ou do fenoprofeno, alguns poucos trabalhos envolvendo o emprego de
aditivos quirais
154-157
. Em CLAE, os aditivos quirais so, por definio, seletores
quirais adicionados fase mvel.
Em um desses trabalhos, Ameyibor e Stewart
154
empregaram -CDs como
aditivos quirais na tentativa de promover a separao do cetoprofeno, do
fenoprofeno e do ibuprofeno. As -CDs testadas foram a -CD natural, a metil--CD,
a hidroxipropil--CD e a -CD sulfatada. Dentre essas, somente a hidroxipropil--CD
se revelou capaz de promover a separao dos enantimeros do cetoprofeno e do
fenoprofeno. Os autores, porm, no foram capazes de obter uma resoluo
completa entre esses enantimeros. Alm disso, nenhuma das -CDs testadas foi
capaz de promover a separao dos enantimeros do ibuprofeno. Em um trabalho
publicado posteriormente, onde foram empregadas condies cromatogrficas
praticamente idnticas, Ameyibor e Stewart
155
conseguiram, enfim, resolver os
enantimeros do cetoprofeno em linha de base. Para tanto, foram injetados apenas
10 L de uma soluo muito diluda do frmaco em soro humano, cuja concentrao
correspondia a 150 ng.mL
-1
. Uma observao interessante, com relao a esses
dois trabalhos, foi o emprego de uma coluna do tipo C18 com partculas de slica
no-porosa com dimetro mdio de 1,5 m, o que possibilitou a rpida eluio dos
enantimeros, sem que isso, no entanto, resultasse em prejuzos para a separao.
Tambm j foram empregados como aditivos quirais, para promover a
separao dos enantimeros do cetoprofeno, antibiticos macrocclicos como a
vancomicina
156,157
e a norvancomicina
157
. Aparentemente, o emprego desses
antibiticos como aditivos quirais permite alcanar maiores valores de resoluo

123

entre os enantimeros do cetoprofeno que aqueles alcanados com o emprego da
hidroxipropil--CD. Outra vantagem que essa maior resoluo pode ser obtida
utilizando-se concentraes inferiores de vancomicina ou norvancomicina
(especialmente desta ltima) na fase mvel.
De qualquer maneira, ficou demonstrado que com qualquer desses aditivos
quirais possvel desenvolver mtodos sensveis, exatos e precisos para a
separao e quantificao dos enantimeros do cetoprofeno. Contudo, devido s
desvantagens inerentes ao uso de aditivos quirais, j discutidas no subitem 2.5.2, e
grande oferta de colunas com os mais variados tipos de seletores quirais, incluindo
-CDs e antibiticos macrocclicos, essa abordagem tem sido relativamente pouco
adotada.
De fato, FEQs derivadas de -CDs e antibiticos macrocclicos j foram
utilizadas para promover a resoluo entre os enantimeros do cetoprofeno e/ou do
fenoprofeno.
Zhong et al.
158
obtiveram a separao parcial dos enantimeros do
cetoprofeno empregando uma FEQ experimental derivada da -CD, onde esta foi
modificada pela reao com 4-cloro-3,5-dinitro-trifluorometilbenzeno. Entretanto,
como o cetoprofeno foi um dos quase duzentos compostos usados para se avaliar a
aplicabilidade e a enantiosseletividade dessa coluna em fase reversa, muito
provvel que as condies para a separao no tenham sido totalmente
otimizadas. Assim, possvel que essa FEQ seja capaz de resolver os enantimeros
do cetoprofeno em linha de base. Armstrong et al.
159
, em um trabalho publicado
anteriormente, tambm conseguiram separar parcialmente os enantimeros do
cetoprofeno, mas para isso tiveram que utilizar duas colunas de -CD (25 cm de
comprimento cada) conectadas em srie.

124

Por outro lado, Beeson e Vigh
160
no conseguiram resolver os enantimeros
do cetoprofeno ou do fenoprofeno em nenhuma das cinco diferentes FEQs
derivadas de CDs que empregaram. As CDs utilizadas como seletores quirais foram
a - e a -CDs naturais, a (S)-hidroxipropil--CD, a (R,S)-hidroxipropil--CD e a (S)-
naftiletilcarbamoil--CD. importante notar que os autores falharam em promover a
separao dos enantimeros do cetoprofeno e do fenoprofeno inclusive com o
emprego de uma FEQ derivada da hidroxipropil--CD, j que essa foi a nica das
CDs utilizadas por Ameyibor e Stewart
154
capaz de promover a separao desses
enantimeros quando empregada como aditivo quiral. No entanto, Beeson e Vigh
empregaram exclusivamente a acetonitrila como modificador orgnico e operaram as
diferentes colunas apenas em fase reversa. Os autores deveriam ter explorado
tambm a enantiosseletividade proporcionada por diferentes modificadores
orgnicos (ainda em fase reversa), bem como a enantiosseletividade proporcionada
por outros modos cromatogrficos, como o modo polar orgnico ou o modo normal,
quando compatveis com as colunas empregadas. Infelizmente, sem que todas as
possibilidades oferecidas por essas colunas tenham sido exploradas no se pode
concluir a respeito de sua aplicabilidade na separao dos enantimeros do
cetoprofeno ou do fenoprofeno.
Em outro trabalho, cujo objetivo era comparar duas FEQs derivadas da
vancomicina, Boskov, Cunov e Tesaov
161
tambm fracassaram ao tentar
promover a separao dos enantimeros do cetoprofeno e do fenoprofeno. As FEQs
comparadas foram a Chirobiotic V e a Chirobiotic V2. Aqui, mais uma vez, o
insucesso pode ser atribudo ao fato de os autores terem limitado a pesquisa
utilizao de um nico solvente como modificador orgnico (mais especificamente, o
metanol). Isso porque Phourcq, Jarry e Bannwarth
162
, por outro lado, conseguiram

125

uma boa separao entre os enantimeros do cetoprofeno empregando a mesma
Chirobiotic V, mas investigando uma maior variedade de modificadores orgnicos.
Entre estes, foram investigados o 1,4-dioxano, o 2-propanol e o tetraidrofurano, alm
do metanol, sendo que a melhor resoluo foi alcanada com o emprego do
tetraidrofurano. Ainda empregando a FEQ Chirobiotic V, Ye e Yu
156
tambm foram
capazes de resolver os enantimeros do cetoprofeno em linha de base. Para isso,
utilizaram condies cromatogrficas bastante semelhantes quelas desenvolvidas
por Phourcq, Jarry e Bannwarth
162
. A FEQ denominada Chirobiotic R, por sua vez,
tambm se mostrou capaz de separar os enantimeros do cetoprofeno, conforme
demonstrado por Andersson et al.
163
. A Chirobiotic R uma FEQ derivada da
ristocetina, outro antibitico macrocclico. De acordo com o trabalho de Andersson et
al., e dentro das condies em que ambas as FEQs foram avaliadas, a Chirobiotic R
apresentou desempenho superior Chirobiotic V na separao dos enantimeros do
cetoprofeno.
Tambm j foram utilizadas com sucesso na separao de diversos profenos
FEQs derivadas de polissacardeos. Dentre os seletores quirais que compem essas
fases, dois, em especial, mostraram-se capazes de promover a separao dos
enantimeros do cetoprofeno e do fenoprofeno, so eles: o tris(3,5-
dimetilfenilcarbamato) de amilose
164-166
e o tris(4-metilbenzoato) de celulose
163,167,168
.
Esses seletores so empregados nas FEQs cujos nomes comerciais so Chiralpak
AD e Chiralcel OJ, respectivamente. Essas duas FEQs so originalmente
constitudas de partculas de slica com dimetro mdio de 10 m revestidas pelos
respectivos seletores polimricos quirais (adsorvidos slica). Mais recentemente,
foram introduzidas FEQs de maior eficincia, semelhantes s originais, constitudas
de partculas de slica com menor dimetro mdio (5 m), as quais so denominadas

126

Chiralpak AD-H e Chiralcel OJ-H. Empregando esta ltima, Kang, Ko e Cheong
169

conduziram um estudo termodinmico da separao dos enantimeros de alguns
profenos, entre os quais o cetoprofeno e o fenoprofeno. De acordo com os trabalhos
encontrados na literatura, quando empregada qualquer dessas colunas, a fase
mvel ideal para a separao desses enantimeros sempre composta por uma
mistura entre hexano e isopropanol (em propores adequadas), acrescida de uma
pequena porcentagem (inferior a 0,5%) de um cido orgnico, normalmente cido
actico ou cido trifluoroactico. A presena desses aditivos essencial para
promover a resoluo entre os enantimeros, conforme Tang
168
pde demonstrar
para o cetoprofeno. Em alguns casos, a derivatizao com reagentes de
derivatizao aquirais pode melhorar o reconhecimento quiral e, conseqentemente,
a resoluo
167
.
Devido s restries impostas pelas primeiras FEQs derivadas de
polissacardeos (relacionadas compatibilidade com diferentes solventes), novas
FEQs derivadas de polissacardeos foram desenvolvidas, nas quais o seletor quiral
se encontra quimicamente ligado slica (imobilizado). Essas novas fases permitem,
inclusive, a cromatografia em modo reverso. Todavia, profundas diferenas na
enantiosseletividade podem ser observadas entre essas novas FEQs e aquelas
originalmente desenvolvidas, mesmo quando so comparadas fases estacionrias
com idnticos seletores quirais. Essas diferenas podem significar a perda total da
enantiosseletividade e a necessidade de derivatizao para que a resoluo entre os
enantimeros possa ser alcanada
150,151,167
.
Outras FEQs derivadas de polissacardeos foram especificamente
desenvolvidas para serem usadas com fases mveis orgnico-aquosas, como as
FEQs utilizadas nas colunas Chiralpak AD-RH e Chiralcel OJ-RH. Essas colunas

127

empregam os mesmos seletores quirais encontrados nas colunas Chiralpak AD e
Chiralcel OJ. No entanto, seu desempenho bastante inferior ao destas ltimas
quando consideradas as separaes obtidas para os enantimeros do cetoprofeno e
do fenoprofeno, conforme foi demonstrado por Perrin et al.
170
. Alm disso, foi
observada uma enantiosseletividade limitada apenas, ou ausncia total de
enantiosseletividade, na tentativa de se separar os mesmos enantimeros atravs
do emprego das colunas Chiralpak AD-RH e Chiralcel OJ-RH (entre outras) em
modo polar orgnico
171
. Por fim, empregando a coluna Chiralcel OJ-R e sem recorrer
ao recurso da derivatizao, Overbeke et al.
172
no foram capazes de separar os
enantimeros do cetoprofeno. Por outro lado, os autores conseguiram separar os
enantimeros do fenoprofeno, muito embora isso s tenha sido possvel custa de
um tempo de corrida relativamente longo.
Outros seletores quirais polimricos tambm se mostraram capazes de
promover a separao entre os enantimeros do cetoprofeno e do fenoprofeno,
como a O,O-bis(3,5-dimetilbenzoil)-N,N-dialil-L-tartardiamida
173
e a O,O-bis(4-ter-
butilbenzoil)-N,N-dialil-L-tartardiamida
174,175
. Esses seletores so utilizados nas
FEQs cujos nomes comerciais so Kromasil CHI-DMB e Kromasil CHI-TBB,
respectivamente. Embora essas fases estacionrias possam ser empregadas em
modo reverso, na maioria das vezes a enantiosseletividade maior em modo
normal. Os enantimeros do cetoprofeno, por exemplo, podem ser resolvidos em
ambas as fases estacionrias empregando-se uma fase mvel constituda por
hexano, ter ter-butil metlico e cido actico, nas seguintes propores relativas:
75:25:0,1 (v/v/v). De acordo com o publicado por Aboul-Enein
173
, os enantimeros do
fenoprofeno, por sua vez, podem ser resolvidos pelo emprego da fase estacionria

128

Kromasil DMB e de uma fase mvel constituda por hexano, ter diisoproplico e
cido actico, nas respectivas propores relativas: 75:25:0,1 (v/v/v).
Com base no conhecimento de que os AINEs se ligam em grande extenso
s protenas plasmticas, vrias FEQs derivadas de protenas foram desenvolvidas
e tiveram sua enantiosseletividade testada frente aos profenos. Encontram-se, entre
aquelas j empregadas para a separao dos enantimeros do cetoprofeno e/ou do
fenoprofeno, FEQs derivadas da glicoprotena
1
-cida
176-179
, da ovomucide
180-183
,
das albuminas sricas bovina
184
e humana
185-187
, da avidina
182,188-190
, da
flavoprotena
182,191
e da -quimotripsina
192
. Haginaka, Seyama e Kanasugi
193

demonstraram, porm, que a protena ovomucide no possui aprecivel
capacidade de promover o reconhecimento quiral. De fato, essa capacidade foi
atribuda a outra protena, a qual comumente encontrada como impureza em meio
ovomucide. Ainda segundo os autores, essa outra protena responsvel pelo
reconhecimento quiral seria, provavelmente, a ovoglicoprotena.
Contudo, apesar da grande variedade de FEQs derivadas de protenas
disponveis comercialmente, tais fases vm sendo preteridas em razo de sua
menor durabilidade e de seu preo mais elevado quando comparado ao de outras
FEQs, conforme j mencionado no subitem 2.7.6.
Alm disso, com algumas FEQs derivadas de protenas, a adio de
modificadores inicos fase mvel fundamental para o controle da reteno e da
enantiosseletividade, alm de influenciar significativamente o formato dos picos
98
.
Entre os modificadores inicos empregados com esse propsito, so comuns os
reagentes de pareamento inico catinicos, como a dimetiloctilamina, e os cidos
carboxlicos hidrofbicos, como os cidos hexanico e octanico. No trabalho de
Menzel-Soglowek, Geisslinger e Brune
178
, por exemplo, ficou demonstrado que, sem

129

a adio de dimetiloctilamina, a separao entre os enantimeros impossvel (no
caso do cetoprofeno) ou insatisfatria (no caso do fenoprofeno). Entretanto, esses
modificadores inicos podem, em alguns casos, danificar a coluna
178
. Ao mesmo
tempo, difcil remov-los da fase estacionria, o que pode ser necessrio caso se
pretenda realizar diferentes separaes com a mesma coluna. De um modo geral, a
utilizao de modificadores inicos no recomendada quando se almeja o
desenvolvimento de mtodos mais robustos
98
.
A tabela 2.6 apresenta alguns exemplos de condies cromatogrficas em
que foram utilizadas FEQs derivadas de protenas para promover a separao dos
enantimeros do cetoprofeno e do fenoprofeno.
Os enantimeros de diversos profenos tambm podem ser resolvidos
empregando-se algumas das FEQs do tipo Pirkle disponibilizadas comercialmente.
Contudo, a maioria das FEQs do tipo Pirkle capazes de separar os enantimeros do
cetoprofeno e do fenoprofeno requer a prvia derivatizao desses frmacos para
que haja o reconhecimento quiral ou ainda para proporcionar uma
enantiosseletividade apropriada. Algumas dessas fases estacionrias permitem a
separao de ambos os frmacos sem que estes tenham que ser derivatizados. No
obstante, sem a derivatizao, a enantiosseletividade freqentemente inadequada
ou insatisfatria
194-197
. Em alguns casos, mesmo com a derivatizao, a
enantiosseletividade alcanada apenas razovel
143,146
.
O desenvolvimento da coluna Whelk-O 1, porm, conduziu a uma FEQ do tipo
Pirkle capaz de separar diversos profenos, exibindo tima enantiosseletividade em
grande parte dessas separaes sem que, para isso, a derivatizao dos
enantimeros seja necessria
198,199
. Conforme j mencionado no subitem 2.7.1.1, a
coluna Whelk-O 1 pode ser operada sob condies de fase normal ou reversa. No

Tabela 2.6 Exemplos de condies cromatogrficas empregadas na separao dos enantimeros do cetoprofeno e do fenoprofeno, envolvendo
diferentes FEQs derivadas de protenas.

FEQ

Protena Temperatura Fase mvel
Vazo da
fase mvel
Deteco Referncia
EnantioPac
100 x 4,0 mm
Glicoprotena
1
-cida
15 C DMOA 5 mM + NaCl 100 mM
em tampo fosfato 20 mM
pH 6,7:IPA (99,5:0,5)
0,5 mL.min
-1
UV
260 nm (CET)
220 nm (FEN)

178
Chiral-HSA*
100 x 4,0 mm
Albumina srica
humana
30 C HOct 5 mM em [tampo
fosfato 10 mM:IPA (94:6)],
pH 5,5
0,6 mL.min
-1
UV
260 nm (CET)

187
Bioptic AV-1
150 x 4,6 mm
Avidina 30 C Tampo fosfato 125 mM
pH 7,5:ACN (95:5)
0,8 mL.min
-1
UV
254 nm (CET)
254 nm (FEN)
190

FEQ, fase estacionria quiral; CET, cetoprofeno; FEN, fenoprofeno; DMOA, dimetiloctilamina; NaCl, cloreto de sdio; IPA, 2-propanol; HOct, cido
octanico; ACN, acetonitrila; UV, ultravioleta. *Equipada com coluna de guarda.

131

entanto, em todos os trabalhos encontrados na literatura nos quais a coluna Whelk-
O 1 foi empregada para separar os enantimeros do cetoprofeno ou do fenoprofeno,
o modo cromatogrfico adotado pelos respectivos autores foi o modo normal
63,64,200-
203
. Portanto, h uma carncia de informaes acerca do emprego da coluna Whelk-
O 1 em fase reversa objetivando a separao desses frmacos.
Os seletores quirais empregados em algumas das FEQs do tipo Pirkle
capazes de promover a resoluo entre os enantimeros do cetoprofeno e/ou do
fenoprofeno so apresentados na tabela 2.7, juntamente com o nome comercial de
algumas das colunas onde esses seletores so encontrados. A tabela 2.7 apresenta,
ainda, exemplos das fases mveis utilizadas em conjunto com essas colunas para
separar os frmacos supracitados, bem como a enantiosseletividade proporcionada
pelas condies cromatogrficas adotadas nessas separaes.
Por fim, a literatura cientfica relativamente rica em trabalhos onde FEQs
experimentais foram utilizadas para separar os enantimeros do cetoprofeno e/ou do
fenoprofeno. Castellani, Flieger e Sinibaldi
204
, por exemplo, desenvolveram uma
FEQ experimental que serviu para o estudo da separao de vrios profenos e cujo
seletor quiral derivava de um alcalide do Ergot. Em um trabalho posterior, Terfloth
et al.
205
incorporaram em polimetilidrossiloxano o mesmo seletor quiral empregado
na coluna Whelk-O 1. O polmero resultante foi imobilizado em slica gel como
suporte e empacotado em uma coluna para CLAE. A FEQ assim obtida foi ento
avaliada frente a diversos profenos e exibiu, de um modo geral, tima
enantiosseletividade. Tambm j foram desenvolvidas FEQs utilizando-se de
tcnicas de impresso em polmeros onde o prprio cetoprofeno serviu como
modelo
206,207
. Todavia, todas essas FEQs experimentais, ao que parece, no
chegaram a ser disponibilizadas comercialmente.

Tabela 2.7 Alguns dos seletores quirais empregados nas FEQs do tipo Pirkle utilizadas para promover a separao dos enantimeros do cetoprofeno
e/ou do fenoprofeno (continua).

Seletor quiral Coluna(s) Fase(s) mvel(is) Referncia
N-(3,5-dinitrobenzoil)-(R)-fenilglicina
1

Bakerbond DNBPG
3

ChiraSep DNBPG
4

Chirex 3001
5

D-Phenylglycine
6

Sumichiral OA-2000
7

HEX:IPA (97:3)

-
-
-
-
1,10 (FEN)
8

-
-
-
-
146

-
-
-
-
N-(3,5-dinitrobenzoil)-(R)-1-(-naftil)glicina

Chirex 3005
5

Sumichiral OA-2500
7

NH
4
Ac 0,02 M em MeOH
NH
4
Ac 0,03 M em H
2
O:MeOH (5:95)
pH 3,5 (ajustado com cido frmico)

NH
4
Ac 0,03 M em H
2
O:MeOH (5:95)
pH aparente 6,2
NH
4
Ac 0,1 M em H
2
O:MeOH (60:40)
NH
4
Ac 0,02 M em MeOH
NH
4
Ac 0,02 M em MeOH
ND (CET)
ND (CET)

ND (CET)

1,16 (CET)
1,12 (CET)
1,12 (FEN)
196
197

194

195
195
195
3,5-dinitrofenilaminocarbonil-(S)-valina

Chirex 3010
5

Sumichiral OA-3100
7

-

NH
4
Ac 0,01 M em MeOH
NH
4
Ac 0,01 M em MeOH
-

1,10 (CET)
1,13 (FEN)
-

195
195
3,5-dinitrofenilaminocarbonil-(R)-fenilglicina

Chirex 3012
5

Sumichiral OA-3300
7

-

NH
4
Ac 0,01 M em MeOH
NH
4
Ac 0,01 M em MeOH
-

1,05 (CET)
1,07 (FEN)
-

195
195

Tabela 2.7 Alguns dos seletores quirais empregados nas FEQs do tipo Pirkle utilizadas para promover a separao dos enantimeros do cetoprofeno
e/ou do fenoprofeno (concluso).

Seletor quiral Coluna(s) Fase(s) mvel(is) Referncia
4-(3,5-
dinitrobenzamido)tetraidrofenantreno
2

Whelk-O 1
6
HEX:EtOH:HAc (90:10:0,1)

HEX:EtOH:HAc (90:10:0,1)

HEX:DCM:EtOH:HAc (95:2:3:0,5)

HEX:IPA:HAc (95:5:0,5)

HEX:IPA:HAc (70:30:0,5)
ND (CET)

1,28 (CET)

1,03 (CET)

1,12 (CET)

1,36 (FEN)
63

200

201

202

202

, fator de separao; HEX, hexano; IPA, 2-propanol; NH
4
Ac, acetato de amnio; MeOH, metanol; EtOH, etanol; HAc, cido actico; DCM,
diclorometano; CET, cetoprofeno; FEN, fenoprofeno; ND, o fator de separao no foi divulgado no artigo em questo.
1
A forma enantiomrica S
deste seletor quiral tambm est disponvel, sendo encontrada nas colunas L-Phenylglycine.
2
Este seletor quiral est disponvel nas formas
enantiomricas R,R e S,S.
3
Fabricada por Mallinckrodt Baker, Inc.
4
Fabricada por Merck KGaA.
5
Fabricada por Phenomenex, Inc.
6
Fabricada por Regis
Technologies, Inc.
7
Fabricada por Sumika Chemical Analysis Service, Ltd.
8
Os enantimeros foram separados aps a derivatizao do frmaco, a qual
ocorreu pela reao com cloreto de tionila e posterior reao com 1-naftilmetilamina.

135

3. OBJ ETIVOS

O presente trabalho foi elaborado com os seguintes objetivos:

Desenvolver, para o cetoprofeno e para o fenoprofeno, mtodos por CLAE
que permitam que os enantimeros desses frmacos venham a ser
separados e quantificados utilizando a coluna Whelk-O 1 como FEQ.

Frente a ambos os frmacos, explorar a enantiosseletividade da coluna
Whelk-O 1 tanto em fase normal quanto em fase reversa, embora a
literatura registre, de um modo geral, um melhor desempenho da coluna
Whelk-O 1 quando utilizada sob condies de fase normal.

Eleger, dentre os mtodos desenvolvidos para cada frmaco, aquele mais
adequado separao dos respectivos enantimeros.

Determinar a ordem de eluio dos enantimeros de acordo com as
condies timas de separao estabelecidas para cada um dos mtodos
eleitos.
Objetivos

137

4. J USTIFICATIVAS

Mtodos capazes de separar e/ou quantificar enantimeros podem ser
fundamentais em estudos farmacodinmicos, farmacocinticos (aqui includos os
estudos de bioequivalncia) e toxicolgicos que envolvam frmacos quirais. Alm
disso, frmacos quirais exigem mtodos enantiosseletivos para garantir sua
identidade e pureza enantiomrica, bem como para estudar os fenmenos de
racemizao ou inverso estereosseletiva cruzada que podem prejudicar sua
estabilidade. Tais mtodos tambm podem ser aplicados na obteno de padres de
trabalho, uma vez que a forma enantiopura de muitos frmacos quirais no se
encontra disponvel comercialmente.
Consideradas as diferenas farmacocinticas
54-57
e, sobretudo, as diferenas
farmacodinmicas
39,41-44
observadas entre os enantimeros do cetoprofeno e do
fenoprofeno, a mistura racmica desses frmacos no pode mais ser vista seno
como a associao de dois frmacos distintos. Tal mudana de percepo impe a
necessidade de mtodos capazes no somente de separar os enantimeros, mas
tambm de quantific-los em matrizes to diversas como medicamentos e fluidos
biolgicos.
Como j foi dito, o fenmeno da inverso quiral, que ocorre com o
fenoprofeno
65
e, em menor grau, com o cetoprofeno
52,63,64
, associado s demais
etapas farmacocinticas possivelmente enantiosseletivas, faz com que a
concentrao plasmtica relativa entre os enantimeros seja constantemente
alterada aps a administrao da forma racmica. Por essa razo, e em virtude da
diferena farmacodinmica entre os enantimeros, qualquer estudo com esses
frmacos que objetive correlacionar a concentrao plasmtica com um dado efeito
Justificativas

138

Justificativas
farmacolgico, se conduzido com mtodos analticos no enantiosseletivos, pode
resultar em informaes no confiveis ou em concluses de muito pouco valor
cientfico.
Adicionalmente, a tendncia de comercializao de frmacos quirais sob a
forma enantiopura tambm se verifica entre os profenos. Medicamentos contendo
apenas o S-cetoprofeno como substncia ativa j esto disponveis comercialmente.
Tambm razovel supor que possam surgir novos medicamentos contendo apenas
o R-cetoprofeno ou mesmo um dos enantimeros do fenoprofeno, a julgar pelas
pesquisas que apontam novas indicaes teraputicas para esses estereoismeros.
Os R-enantimeros, em especial, apresentam grandes chances de virem a ser
comercializados isoladamente, por possurem ao analgsica e serem desprovidos
de efeitos colaterais sobre a mucosa gstrica
51
. Ao mesmo tempo, em se tratando
de frmacos enantiopuros ou de medicamentos que os contenham, o antpoda, se
presente, deve ser tratado como impureza. Para tanto, mais uma vez os mtodos
enantiosseletivos se fazem necessrios.
J no tocante tcnica escolhida para o desenvolvimento de tais mtodos, a
opo por desenvolv-los por CLAE se deve grande aceitao da tcnica,
associada sua sensibilidade, reprodutibilidade e aplicabilidade a um grande
nmero de compostos com caractersticas fsico-qumicas distintas.

139

5. MATERIAIS E MTODOS

5.1 MATERIAIS

5.1.1 REAGENTES E SOLVENTES

1,2-Dicloroetano, grau analtico (Synth);
1,4-Dioxano, grau cromatogrfico - linha LiChrosolv (Merck);
1-Butanol, grau analtico (Merck);
2-Butanol, grau analtico (Merck);
2-Propanol, grau cromatogrfico - linha LiChrosolv (Merck);
2-Propanol, grau cromatogrfico - linha OmniSolv (EMD);
Acetato de etila, grau cromatogrfico (J .T.Baker);
Acetonitrila, grau cromatogrfico - linha OmniSolv (EMD);
cido actico glacial, grau analtico (Merck);
cido clordrico fumegante, grau analtico (Merck);
cido frmico, grau analtico (Merck);
gua ultrapurificada atravs do sistema Milli-Q Plus, com resistividade
igual a 18,2 M.cm a 25 C;
Brometo de potssio, grau analtico (Merck);
Diclorometano, grau cromatogrfico - linha OmniSolv (EMD);
Etanol, grau cromatogrfico - linha LiChrosolv (Merck);
Materiais e mtodos

140

Hexanos (teor de n-hexano 85,0%), grau cromatogrfico - linha
OmniSolv (EMD);
Hexanos (teor de n-hexano 95,0%), grau cromatogrfico - linha UltimAR
(Mallinckrodt);
Hidrxido de amnio, grau analtico (Merck);
Metanol anidro, grau analtico - linha AQUASTAR (EMD);
Metanol, grau cromatogrfico - linha LiChrosolv (Merck);
Oxalato de amnio monoidratado, grau analtico (Merck);
Reagente de Karl Fischer HYDRA-POINT 5 Comp (J .T.Baker).

5.1.2 SUBSTNCIA QUMICA DE REFERNCIA

(S)-(+)-Cetoprofeno - Pureza: 99% (Aldrich).

5.1.3 AMOSTRAS DOS FRMACOS E MEDICAMENTOS

5.1.3.1 FRMACOS

As amostras dos frmacos empregados neste trabalho foram gentilmente
doadas por diferentes indstrias farmacuticas. Por motivos ticos, no sero
apresentados os nomes das indstrias doadoras, bem como o nome dos fabricantes
dos frmacos.
Materiais e mtodos

141

Todas as amostras vieram acompanhadas de seus respectivos certificados de
anlise.

Cetoprofeno - Lote: 02729/2004 - Teor: 99,5% (Amostra 1);
Cetoprofeno - Lote: J Z04092411 - Teor: 99,6% (Amostra 2);
Fenoprofeno clcico diidratado - Lote: 0400008035 - Teor: 99,2%.

5.1.3.2 MEDICAMENTOS

As amostras dos medicamentos empregados neste trabalho tambm foram
gentilmente doadas por diferentes indstrias farmacuticas. Ainda por motivos
ticos, essas amostras foram identificadas por nmeros e os nomes de seus
fabricantes foram substitudos por letras, conforme listado na tabela 5.1.

Tabela 5.1 Amostras dos medicamentos empregados neste trabalho.

Amostra Laboratrio Frmaco Apresentao
Concentrao
do frmaco
1 A Cetoprofeno Comprimidos revestidos 100 mg/comprimido
2 B Cetoprofeno Comprimidos revestidos 100 mg/comprimido
3 B Cetoprofeno Cpsulas 50 mg/cpsula
4 C Fenoprofeno Cpsulas 200 mg/cpsula

Materiais e mtodos

142

5.1.4 EQUIPAMENTOS

Agitador magntico com aquecimento, marca Fisatom, modelo 753-A;
Aparelho para banho de ultra-som, marca Unique, modelo USC 1450;
Aparelho para determinao de faixa de fuso, marca Stuart Scientific,
modelo SMP1, equipado com termmetro calibrado do tipo coluna de
mercrio, com escala de -10 a 360 C;
Balana analtica, marca Mettler-Toledo, modelo AB204;
Bomba de vcuo, marca Primar, modelo 141;
Cromatgrafo a lquido de alta eficincia, marca Shimadzu, composto
pelos seguintes mdulos: dois sistemas de bombeamento de solvente,
ambos do modelo LC-10ADvp; sistema de degaseificao on-line, modelo
DGU-14A; injetor automtico com loop de volume varivel (de 0,1 L a 50
L), modelo SIL-10ADvp; forno para coluna, modelo CTO-10ACvp;
detector com arranjo de diodos UV-Vis, modelo SPD-M10Avp; controlador
de sistema, modelo SCL-10Avp; operado em conjunto com o software
Class-VP, verso 5.032, para aquisio e tratamento dos dados;
Espectrofotmetro de UV-Vis, marca Shimadzu, modelo UV-1601, operado
em conjunto com o software Personal Spectroscopy Software (UVPC),
verso 3.91, para aquisio e tratamento dos dados;
Espectrmetro de infravermelho, marca Bomem, srie Michelson MB,
modelo MB-100, operado em conjunto com o software GRAMS/AI, verso
7.00, para aquisio e tratamento dos dados;
Estufa para secagem, marca Fanem, modelo 315-SE;
Materiais e mtodos

143

Medidor de pH, marca Digimed, modelo DM-21, equipado com eletrodo
combinado de pH, marca Digimed, modelo DME-CV1;
Prensa hidrulica manual, marca Carver;
Purificador de gua, marca Millipore, modelo Milli-Q Plus;
Termobalana, marca Shimadzu, modelo TGA-50, operada em conjunto
com a interface controladora TA-50 e com o software TA60, verso 1.40,
para aquisio e tratamento dos dados;
Titulador automtico para determinao de gua pelo mtodo de Karl
Fischer, marca Metrohm, modelo 787 KF Titrino.

5.1.5 CONSUMVEIS E OUTROS MATERIAIS

Coluna para CLAE (S,S)-Whelk-O 1, medindo 250 x 4,6 mm, com
partculas de 5 m (100 ), marca Regis;
Cubetas de quartzo, com caminho tico de 10,00 mm, marca Hellma;
Gral e pistilo de gata;
Membranas filtrantes em politetrafluoretileno (PTFE), com 47 mm de
dimetro e poros de 0,45 m, marca Phenomenex;
Pipeta automtica de volume fixo, marca Celm, modelo Petcelm 10 L;
Sistema a vcuo para filtrao de solventes, marca Millipore;
Unidades filtrantes para seringa, com carcaa em polipropileno e
membrana interna em polister com 15 mm de dimetro e poros de 0,45
m, marca CHROMAFIL (Macherey Nagel);
Vidrarias diversas.
Materiais e mtodos

144

5.2 MTODOS

5.2.1 QUALIFICAO DOS FRMACOS: ENSAIOS DE IDENTIFICAO

5.2.1.1 ESPECTROSCOPIA DE ABSORO NO INFRAVERMELHO

Em um gral de gata, foram adicionados cerca de 1 mg do frmaco e 400 mg
de brometo de potssio, previamente dessecado em estufa, a 105 C, por 3 horas.
Com o auxlio de um pistilo, tambm de gata, o frmaco e o brometo de potssio
foram triturados e misturados at a obteno de um p fino e homogneo.
Utilizando-se de uma prensa hidrulica, uma quantidade apropriada do material
assim obtido foi transformada em uma pastilha de espessura adequada e
transparncia uniforme, a qual foi empregada para a obteno do espectro de
absoro no infravermelho. Esse espectro compreendeu a regio entre os nmeros
de onda 670 e 2000 cm
-1
, inclusive. Posteriormente, as posies e intensidades
relativas das bandas de transmitncia do espectro assim obtido foram comparadas
quelas observadas no espectro de referncia, fornecido pela farmacopia britnica
e que apresentado no subitem 2.3.1. Alm disso, no espectro obtido
experimentalmente, procurou-se localizar as bandas tidas como principais e que so
caractersticas de cada frmaco. Os nmeros de onda a que correspondem essas
bandas so fornecidos pela literatura e podem ser consultados no subitem 2.3.1.
Todo o procedimento descrito acima foi igualmente adotado para ambos os
frmacos.
Materiais e mtodos

145

5.2.1.2 ESPECTROFOTOMETRIA DE ABSORO NO ULTRAVIOLETA

Para a obteno do espectro de absoro no ultravioleta do cetoprofeno,
foram pesados exatamente 50,0 mg do frmaco, os quais foram solubilizados em
etanol de modo a obter uma soluo com concentrao do frmaco igual a 10
g/mL.
Para a obteno do espectro de absoro no ultravioleta do fenoprofeno
clcico diidratado, foram pesados exatamente 100,0 mg do frmaco, os quais foram
transferidos para um balo volumtrico de 100,0 mL. Em seguida, adicionou-se a
esse balo 5 mL de cido actico glacial. Aps a completa solubilizao do frmaco,
a soluo assim obtida foi diluda a 100,0 mL com metanol. A nova soluo,
resultante dessa diluio, foi ento homogeneizada e uma alquota de 5,0 mL da
mesma foi transferida para um balo volumtrico de 50,0 mL. Por fim, essa alquota
foi diluda a 50,0 mL com metanol, de modo a obter uma soluo com concentrao
do frmaco igual a 100 g/mL.
Os espectros de absoro para ambos os frmacos foram obtidos em regio
correspondente ao ultravioleta, compreendida entre 230 e 350 nm, inclusive. A
aquisio de dados foi realizada a cada 0,2 nm. Para a obteno do espectro
referente ao cetoprofeno, foi utilizado etanol como branco; j para a obteno do
espectro referente ao fenoprofeno clcico diidratado, utilizou-se, como branco, uma
soluo de cido actico em metanol a 0,5% v/v. Todas as leituras foram realizadas
empregando-se cubetas de quartzo com 10,00 mm de caminho tico. As
informaes obtidas a partir dos espectros de absoro foram ento confrontadas
com as respectivas especificaes apresentadas pela farmacopia britnica.

Materiais e mtodos

146

5.2.1.3 DETERMINAO DA FAIXA DE FUSO

O procedimento adotado para determinao da faixa de fuso foi baseado
naquele descrito pela farmacopia americana (USP 30), em seus mtodos gerais, no
captulo intitulado Melting Range or Temperature, para frmacos que se enquadram
na classe I (class I) e com a utilizao do aparelho I (apparatus I). Procurou-se
reproduzir, to fielmente quanto possvel, o procedimento descrito na USP 30,
exceo do aparelho realmente empregado, que no descrito por essa
farmacopia. As determinaes foram realizadas em triplicata, para cada uma das
amostras de cetoprofeno.

5.2.1.4 ENSAIO PARA IDENTIFICAO DE CLCIO

O mtodo adotado para a identificao de clcio foi aquele descrito pela
farmacopia americana (USP 30), na monografia do fenoprofeno clcico (teste de
identificao C). Como complementao a esse teste, foi realizado tambm o teste
de chama, conforme descrito pela mesma farmacopia em seus mtodos gerais, no
captulo intitulado Identification Tests-General. O procedimento completo pode ser
visto abaixo.
Cerca de 1 g de fenoprofeno clcico diidratado foram transferidos para um
bcker ao qual se adicionou cido actico em quantidade suficiente para 50 mL. O
contedo do bcker foi ento aquecido, sob agitao, at a completa solubilizao
do frmaco, com o auxlio de uma placa aquecedora/agitador magntico.
Posteriormente, filtrou-se a soluo em papel de filtro. Ao filtrado, foram ento
Materiais e mtodos

147

adicionados 2 mL de uma soluo de oxalato de amnio a 3,5%. Formou-se um
precipitado branco, o qual foi recolhido por filtrao, novamente em papel de filtro.
Em seguida, o precipitado foi solubilizado em soluo de cido clordrico 3 N,
obtendo-se a soluo empregada no teste de chama. Esse teste, por sua vez,
consistiu em aspergir essa soluo sobre a poro no-luminosa da chama
produzida pela queima de gs em um bico de Bunsen, para que se observasse a
colorao produzida.
Alm disso, recorreu-se anlise termogravimtrica para obteno de prova
adicional de que a amostra em questo realmente correspondia ao sal clcico
diidratado de fenoprofeno. Para tanto, foram obtidas curvas TG empregando-se
cadinhos de platina com aproximadamente 10 mg da amostra, alm da adoo dos
seguintes parmetros instrumentais: atmosfera dinmica de ar a 50 mL.min
-1
e razo
de aquecimento igual a 10 C.min
-1
, partindo da temperatura ambiente at atingir
900 C. A massa do resduo obtido aps a decomposio trmica da amostra foi
ento comparada massa prevista por clculo estequiomtrico, sendo ambas
expressas em relao massa original da amostra, sob a forma de porcentagem.

5.2.1.5 DETERMINAO DO TEOR DE GUA PELO MTODO DE KARL FISCHER

Adicionou-se ao vaso de titulao 20 mL de metanol anidro, os quais foram
titulados com o reagente de Karl Fischer at o ponto final amperomtrico,
determinado automaticamente pelo titulador. Em seguida, cerca de 200 mg de
fenoprofeno clcico diidratado foram adicionados ao vaso de titulao. A amostra
permaneceu sob agitao por um minuto e foi ento titulada com o reagente de Karl
Materiais e mtodos

148

Fischer, at o ponto final amperomtrico. Efetuou-se a titulao da amostra em
triplicata. O reagente de Karl Fischer foi fatorado previamente, atravs da titulao,
em separado, de trs alquotas de gua ultrapurificada equivalentes a 10 L cada,
onde se adotou o mesmo mtodo empregado para a titulao da amostra.

5.2.1.6 DETERMINAO DO TEOR DE GUA POR TERMOGRAVIMETRIA

Foram obtidas curvas TG/DTG empregando-se cadinhos de platina com
aproximadamente 5 e 10 mg de fenoprofeno clcico diidratado. Alm disso, os
seguintes parmetros instrumentais foram adotados: atmosfera dinmica de
nitrognio a 50 mL.min
-1
e razo de aquecimento igual a 10 C.min
-1
, partindo da
temperatura ambiente at atingir 200 C.

5.2.2 DESENVOLVIMENTO DO MTODO DE SEPARAO PARA OS ENANTIMEROS DO
FENOPROFENO POR CLAE EM FASE REVERSA

5.2.2.1 PREPARAO DA AMOSTRA

Sempre que necessrio, foram pesados 25,0 mg de fenoprofeno clcico
diidratado racmico, os quais foram transferidos para um balo volumtrico de 50,0
mL. Em seguida, adicionou-se a esse balo 5 mL de metanol e 1 mL de cido
actico glacial. O balo foi ento levado ao banho de ultra-som, onde permaneceu
Materiais e mtodos

149

at a completa solubilizao do frmaco. Posteriormente, a soluo assim obtida foi
diluda a 50,0 mL com metanol. A nova soluo, resultante dessa diluio, foi ento
homogeneizada e parte dela foi filtrada para um frasco apropriado, com o auxlio de
uma unidade filtrante para seringa com membrana interna em polister e poros de
0,45 m.

5.2.2.2 PREPARAO DAS FASES MVEIS

Foram preparadas diversas fases mveis, sempre constitudas por um tampo
(solvente A) e um modificador orgnico (solvente B). Ambos foram filtrados
separadamente e sob presso reduzida, atravs de membranas filtrantes de
politetrafluoretileno com poros de 0,45 m, previamente umedecidas com etanol. A
combinao entre os solventes A e B, em propores definidas, foi realizada pelo
prprio cromatgrafo, bem como a degaseificao dos solventes, realizada on-line.
Foram empregados dois diferentes tampes, a saber: tampo acetato e
tampo formato, ambos de amnio. A escolha entre os tampes variou em funo do
pH exigido nos ensaios. Ambos foram preparados pela adio, a 900 mL de gua,
de volumes apropriados do cido correspondente e de hidrxido de amnio. Esses
volumes variaram em funo da molaridade desejada para o tampo (expressa
como a concentrao molar do sal formado). Posteriormente, o pH era ajustado at
o valor desejado titulando-se o tampo com uma soluo a 20% v/v do cido
correspondente. Por fim, adicionava-se gua ultrapurificada em quantidade
suficiente para 1,0 L. O volume requerido de cada reagente, para a preparao dos
tampes a diferentes molaridades, est listado na tabela 5.2.
Materiais e mtodos

150

Tabela 5.2 Volume requerido de cada reagente para a preparao dos tampes.

Reagente Volume requerido / mL
Tampo acetato Tampo formato
20 mM 25 mM 40 mM 20 mM 40 mM 50 mM
cido actico
1
1,1 1,4 2,3 - - -
cido frmico
2
- - - 0,8 1,5 1,9
Hidrxido de amnio
3
1,5 1,9 3,0 1,5 3,0 3,7

1
Densidade =1,049 g/mL e concentrao =99,8%;
2
densidade =1,220 g/mL e concentrao =98%;
3
densidade =0,910 g/mL e concentrao equivalente a 25% de NH
3
.

5.2.2.3 CONDIES COMUNS A TODOS OS ENSAIOS

A coluna empregada foi a (S,S)-Whelk-O 1, descrita no subitem 5.1.5. Para a
deteco dos analitos, empregou-se um detector com arranjo de diodos UV-Vis,
operado na faixa de comprimentos de onda de 225 a 370 nm. Os cromatogramas
apresentados no subitem 6.2 correspondem deteco em 270 nm (comprimento de
onda de mxima absoro). O volume de injeo adotado, por sua vez, corresponde
sempre a 20 L.

5.2.2.4 ENSAIOS PRELIMINARES

A estratgia para o desenvolvimento de um mtodo de separao por CLAE
em fase reversa para os enantimeros do fenoprofeno envolveu a execuo de um
planejamento experimental fatorial fracionrio, o qual est descrito no subitem
5.2.2.5. Para alguns fatores envolvidos nesse planejamento, o campo experimental
pde ser definido a priori. No entanto, o mesmo no foi possvel para outros fatores
seno aps a realizao de alguns ensaios preliminares. Assim sendo, uma srie de
Materiais e mtodos

151

experimentos iniciais foi realizada com o intuito de se definir os nveis (mnimo e
mximo) em que alguns desses fatores seriam estudados. Nessa etapa, foram
investigadas: (1) a natureza do modificador orgnico utilizado, (2) a concentrao
desse modificador orgnico na fase mvel e (3) a vazo da fase mvel empregada
(F). Os modificadores orgnicos avaliados foram o metanol e a acetonitrila. As
condies cromatogrficas desses ensaios preliminares esto listadas na tabela 5.3.

Tabela 5.3 Condies cromatogrficas empregadas nos ensaios preliminares.

Ensaio Solvente (A) Solvente (B)
Proporo
1
A:B
1

Vazo da
fase mvel
2

1 Tampo acetato de amnio Metanol 40:60 1,0
6 Tampo acetato de amnio Acetonitrila 50:50 1,0
7 Tampo acetato de amnio Acetonitrila 63,5:36,5 1,0

1
Em v/v;
2
em mL.min
-1
. Molaridade do tampo =25 mM; pH do tampo =4,5; temperatura da coluna
(T
c
) =24 C.

5.2.2.5 PLANEJ AMENTO FATORIAL FRACIONRIO
208

Com a escolha do modificador orgnico a ser empregado e com a
determinao dos nveis em que seriam estudados os outros dois fatores
anteriormente citados, passou-se ento prxima etapa do desenvolvimento. Essa
etapa teve por objetivo selecionar os fatores que mais influenciam as respostas de
interesse e descartar aqueles de menor influncia, para que, posteriormente, outro
planejamento experimental pudesse ser empregado, o qual permitisse a obteno
de superfcies de resposta. Para tanto, foram executados os ensaios previstos em
um planejamento experimental fatorial fracionrio de resoluo trs, envolvendo 5
Materiais e mtodos

152

fatores e um total de 8 ensaios ( )
2 5
2
III
. Nesse planejamento, os fatores investigados
foram:

Fator A: temperatura da coluna (T
c
);
Fator B: vazo da fase mvel (F);
Fator C: porcentagem de metanol na fase mvel, em v/v;
Fator D: pH do tampo;
Fator E: molaridade do tampo ([Tampo]).

O planejamento fatorial fracionrio em questo foi construdo a partir de um
planejamento fatorial completo para os trs primeiros fatores. O nvel dos dois
fatores restantes foi definido atravs das relaes geradoras I =-BCD e I =-ACE.
Com isso, o planejamento empregado ficou definido conforme a tabela 5.4, onde os
nveis dos fatores se encontram codificados.

Tabela 5.4 Planejamento fatorial fracionrio com os nveis dos fatores codificados.

Ensaio
Fator
A B C D E
1 - - - - -
2 + - - - +
3 - + - + -
4 + + - + +
5 - - + + +
6 + - + + -
7 - + + - +
8 + + + - -

A, temperatura da coluna; B, vazo da fase mvel; C, porcentagem de metanol na fase mvel (v/v); D,
pH do tampo; E, molaridade do tampo.

A tabela 5.5 apresenta o mesmo planejamento, agora com os nveis dos
fatores apresentados conforme seus valores reais ou no-codificados.
Materiais e mtodos

153

Tabela 5.5 Planejamento fatorial fracionrio com os nveis dos fatores em seus valores no-
codificados.
Ensaio
Fator
Temperatura
da coluna
1

Vazo da
fase mvel
2
% B
pH do
tampo
Molaridade
do tampo
3

1 14,0 1,0 45,0 3,5 20
2 26,0 1,0 45,0 3,5 40
3 14,0 2,0 45,0 5,5 20
4 26,0 2,0 45,0 5,5 40
5 14,0 1,0 55,0 5,5 40
6 26,0 1,0 55,0 5,5 20
7 14,0 2,0 55,0 3,5 40
8 26,0 2,0 55,0 3,5 20

% B, porcentagem de metanol na fase mvel (v/v).
1
Em C;
2
em mL.min
-1
;
3
em mM.

Todos os ensaios do planejamento fatorial fracionrio mostrado anteriormente
foram realizados em duplicata, para que fosse possvel estimar o erro experimental
e, a partir da, avaliar a significncia estatstica dos efeitos ( =0,05). As duplicatas
se basearam em repeties autnticas de cada ensaio, incluindo novas preparaes
da amostra e da fase mvel. Os ensaios, por sua vez, foram realizados em ordem
aleatria, para evitar a ocorrncia de distoro estatstica nos resultados. Alm
disso, foram realizadas duas injees da amostra em cada ensaio e, antes de cada
um deles, o sistema foi equilibrado com a fase mvel correspondente por no menos
que 1 hora, para assegurar a estabilizao da linha de base.
Foram ento investigados os efeitos exercidos pela mudana de nvel de cada
um dos fatores sobre seis diferentes respostas. Essas respostas foram escolhidas
entre os parmetros cromatogrficos utilizados na avaliao dos cromatogramas
(descritos no subitem 5.2.2.8), ou neles se basearam. Assim sendo, as variveis
escolhidas como respostas foram:

Materiais e mtodos

154

Tempo de reteno referente ao segundo pico (t
R2
);
Fator de reteno referente ao segundo pico (k
2
);
Fator de separao entre os picos ();
Resoluo entre os picos (R
s
);
Nmero mdio de pratos tericos (N
M
);
Funo de resposta cromatogrfica proposta por Bylund, Bergens e
J acobsson
209,210
(FRC).

A funo de resposta cromatogrfica proposta por Bylund, Bergens e
J acobsson, doravante denominada apenas funo de resposta cromatogrfica,
definida pela Equao 5.1:

a b
a b
FRC Q T
+
=
, (0 <FRC <1) ; (Eq. 5.1)

onde: Q uma varivel que descreve a qualidade da separao; T uma varivel
relacionada ao fator de reteno referente ao segundo pico, e a e b so constantes
de atribuio de peso. Neste trabalho se atribuiu o mesmo peso (ou importncia) s
variveis Q e T definindo-se a e b como iguais a 1.

A varivel Q, por sua vez, definida pela Equao 5.2:

( )
( )
s
1
1
K d R
Q
e

=
+
, (0 <Q <1) ; (Eq. 5.2)

Materiais e mtodos

155

onde se atribuiu o valor 15,2008 constante K, e a d, o valor 2,5 (resoluo
mnima pretendida), de tal modo que Q se aproxima de 1 quando R
s
igual a 3,0
(valor desejado ou tido como timo para a resoluo). Se R
s
igual a 2,5, entretanto,
ento Q igual a 0,5.

A varivel T, por outro lado, definida pela Equao 5.3:

2
2
2
1
2
2
1
4
k
C
k
T C
C C

= +

e

, (0 <T 1) ; (Eq. 5.3)

onde se atribuiu o valor 2 a C, de tal modo que T assume seu valor mximo
quando k
2
igual a 4 (valor desejado ou tido como timo para k
2
).

5.2.2.6 PLANEJ AMENTO COMPOSTO CENTRAL
211

Aps a anlise do planejamento fatorial fracionrio exposto acima, foram
selecionados os fatores considerados mais importantes para a otimizao do mtodo
de separao, com base nos efeitos desses fatores sobre as respostas de interesse.
Assim sendo, dos cinco fatores iniciais, foram selecionados para o planejamento
composto central os seguintes:

Porcentagem de metanol na fase mvel (v/v) Varivel independente
1
;
pH do tampo Varivel independente
2
;
Temperatura da coluna Varivel independente
3
.
Materiais e mtodos

156

Os dois fatores restantes, excludos do novo planejamento, foram ento
fixados em valores considerados adequados aos propsitos do mtodo em
desenvolvimento. A concentrao molar do tampo foi fixada em 50 mM e a vazo
da fase mvel em 1,0 mL.min
-1
. Os nveis dos fatores efetivamente investigados no
novo planejamento tambm foram otimizados. O campo experimental para o fator pH
do tampo, por exemplo, ficou estabelecido entre 3,06 e 4,74. Por essa razo,
empregou-se apenas o tampo formato de amnio.
O planejamento composto central escolhido envolveu a realizao de 23
ensaios. A parte fatorial desse planejamento compreende 8 ensaios e a parte axial,
outros seis. Os ensaios restantes correspondem ao ponto central e suas replicatas,
totalizando 9 ensaios. A distncia axial, que representa a distncia entre os pontos
axiais e o ponto central do planejamento, foi estabelecida em 1,682. Com isso, o
planejamento composto central empregado ficou definido conforme a tabela 5.6,
onde os nveis das variveis independentes se encontram codificados.

Tabela 5.6 Planejamento composto central com os nveis das variveis independentes codificados.

Ensaio
Varivel independente
1

2

3

1 - 1,000000 - 1,000000 - 1,000000
2 +1,000000 - 1,000000 - 1,000000
3 - 1,000000 +1,000000 - 1,000000
4 +1,000000 +1,000000 - 1,000000
5 - 1,000000 - 1,000000 +1,000000
6 +1,000000 - 1,000000 +1,000000
7 - 1,000000 +1,000000 +1,000000
8 +1,000000 +1,000000 +1,000000
9 - 1,682000 0,000000 0,000000
10 +1,682000 0,000000 0,000000
11 0,000000 - 1,682000 0,000000
12 0,000000 +1,682000 0,000000
13 0,000000 0,000000 - 1,682000
14 0,000000 0,000000 +1,682000
15.1 a 15.9 0,000000 0,000000 0,000000

1
, porcentagem de metanol na fase mvel (v/v);
2
, pH do tampo;
3
, temperatura da coluna.
Materiais e mtodos

157

A tabela 5.7 apresenta os valores no-codificados correspondentes aos cinco
nveis adotados para cada uma das variveis independentes.

Tabela 5.7 Planejamento composto central: valores no-codificados correspondentes aos cinco
nveis adotados para cada uma das variveis independentes.

Fator
Nvel
-1,682 -1 0 1 1,682
% B
1
40,1 42,9 47,0 51,1 53,9
pH do tampo 3,06 3,40 3,90 4,40 4,74
Temp. da coluna
2
12,0 14,0 17,0 20,0 22,0

% B, porcentagem de metanol na fase mvel.
1
Em v/v;
2
em C.

Como no planejamento fatorial fracionrio, os ensaios do planejamento
composto central tambm foram realizados em ordem aleatria, para evitar a
ocorrncia de distoro estatstica nos resultados. Novamente, foram realizadas
duas injees da amostra em cada ensaio e, antes de cada um deles, o sistema foi
equilibrado com a fase mvel por no menos que 1 hora, para assegurar a
estabilizao da linha de base.
Com a realizao dos ensaios previstos pelo planejamento composto central,
os cromatogramas obtidos foram ento avaliados calculando-se os parmetros
cromatogrficos descritos no subitem 5.2.2.8, assim como a funo de resposta
cromatogrfica, descrita anteriormente.
Efetuados os clculos, partiu-se ento para a construo de modelos
matemticos empricos, lineares e quadrticos, na tentativa de se descrever a
relao existente entre as variveis independentes estudadas e as seguintes
respostas (ou variveis dependentes):

Materiais e mtodos

158

Funo de resposta cromatogrfica;
Resoluo entre os picos;
Tempo de reteno referente ao segundo pico.

Cada uma das respostas foi modelada de acordo com as seguintes equaes
gerais:

Para um modelo linear,
y =
0
+
1
1
+
2
2
+
3
3
+ ; (Eq. 5.4)
Para um modelo quadrtico,
y =
0
+
1
1
+
2
2
+
3
3
+
12
2
+
13
3
+
23
3
+
11
1
2
+
22
2
2
+
33
3
2
+ ; (Eq. 5.5)

onde: y a resposta considerada e o erro aleatrio associado sua
determinao;
1
,
2
e
3
so as variveis porcentagem de metanol na fase mvel
(v/v), pH do tampo e temperatura da coluna, respectivamente;
0
,
1
,
2
,
3
,
12
,
13
,
23
,
11
,
22
e
33
so parmetros dos modelos a que se referem, para os quais foram
calculados os respectivos estimadores, b
0
, b
1
, b
2
, ..., b
33
.

Esses parmetros foram avaliados em um nvel de significncia igual a 0,05.
Na forma final da equao que representa cada modelo foram excludos os termos
cujos parmetros foram considerados no-significativos. O grau de ajuste de cada
modelo s respostas observadas foi determinado, por sua vez, pela anlise do perfil
de distribuio dos resduos e pelo emprego do mtodo de anlise da varincia
(ANOVA) da regresso.
Materiais e mtodos

159

5.2.2.7 DETERMINAO DAS CONDIES TIMAS PARA A SEPARAO

Para se estabelecer o melhor compromisso entre a resoluo e o tempo de
corrida almejados, foi empregado o mtodo de otimizao simultnea proposto por
Derringer e Suich
212
. Esse mtodo se baseia na definio de uma funo de
desejabilidade (d) para cada resposta, com valores restritos ao intervalo [0,1], onde
0 significa um valor inaceitvel e 1, o valor desejado. Posteriormente, essas
funes de desejabilidade so combinadas em uma desejabilidade global (D) que,
neste caso, dada pela Equao 5.6:

s 2
2
R t
D d d = , (0 <D 1) ; (Eq. 5.6)

onde
s
R
d

e
2
t
d
so a funo de desejabilidade para a resoluo entre os picos e
a funo de desejabilidade para o tempo de reteno referente ao segundo pico,
respectivamente.

A funo de desejabilidade para a resoluo entre os picos, por sua vez,
definida neste trabalho pelas seguintes equaes:

s
s
R
R LI
d
A LI
, para LI R
s
A ; (Eq. 5.7)
s
1
R
d = , para R
s
>A ; (Eq. 5.8)
s
0
R
d = , para R
s
<LI ; (Eq. 5.9)

onde A igual a 3,0 (valor desejado para a resoluo entre os picos) e LI igual a
2,0 (valor mnimo aceitvel para a resoluo).
Materiais e mtodos

160

Materiais e mtodos
J a funo de desejabilidade para o tempo de reteno referente ao segundo
pico definida neste trabalho pelas seguintes equaes:

R2
R2
t
t L
d
I
A LI

, para LI t
R2
A ; (Eq. 5.10)
R2
R2
t
t L
d
S
A LS

, para A t
R2
LS ; (Eq. 5.11)
R2
0
t
d =

, para t
R2
<LI ou para t
R2
>LS ; (Eq. 5.12)

onde A igual a 15,0 (valor desejado para o tempo de reteno referente ao
segundo pico, em minutos), e LI e LS so iguais a 12,0 e a 18,0, respectivamente
(valores mnimo e mximo aceitveis para o tempo de reteno referente ao
segundo pico, em minutos).

Com o emprego conjunto de todas essas equaes, a otimizao simultnea
das duas respostas ficou reduzida maximizao da desejabilidade global. Assim
sendo, foi elaborada uma planilha no programa Excel, da Microsoft, onde foram
introduzidos os modelos escolhidos para descrever a relao existente entre os
fatores porcentagem de metanol na fase mvel (v/v), pH do tampo e temperatura
da coluna e as respostas R
s
e t
R2
. Essa planilha foi construda de tal modo que,
inseridos os nveis desses fatores, o Excel fosse capaz de fornecer os valores
previstos para a resoluo e para o tempo de reteno referente ao segundo pico.
Essas previses, por sua vez, foram associadas s suas respectivas funes de
desejabilidade, possibilitando o clculo da desejabilidade global. Por fim, para se
descobrir o nvel ideal de cada um dos fatores citados acima, foi utilizada a funo
Solver do Excel.

161

______________________
Adicionalmente, foram construdos grficos do tipo superfcie de resposta,
com o objetivo de se visualizar o efeito da mudana de nvel dos fatores sobre as
respostas de interesse. Para tanto, foram empregados os mesmos modelos
matemticos utilizados no clculo da funo de desejabilidade.

5.2.2.8 AVALIAO DOS CROMATOGRAMAS

Na avaliao dos cromatogramas obtidos foram considerados os seguintes
parmetros cromatogrficos:

Tempo de reteno do composto no retido (t
M
);
Tempos de reteno referentes ao primeiro e ao segundo pico (t
R1
e t
R2
,
respectivamente);
Fatores de reteno referentes ao primeiro e ao segundo pico (k
1
e k
2
,
respectivamente);
Fator de separao entre os picos;
Nmeros de pratos referentes ao primeiro e ao segundo pico (N
1
e N
2
,
respectivamente);
reas do primeiro e do segundo pico;
Alturas do primeiro e do segundo pico;
Larguras* do primeiro e do segundo pico (w
1
e w
2
, respectivamente);
Assimetrias do primeiro e do segundo pico, calculadas a 10% de suas
alturas (As
1
e As
2
, respectivamente).
*Calculadas conforme a farmacopia americana (United States Pharmacopeia).

162

As frmulas adotadas para calcular alguns desses parmetros so
apresentadas abaixo:

Fator de reteno:
R M
M
i
i
t t
k
t
=

(Eq. 5.13)

Fator de separao entre os picos:
R2 M
R1 M
t t
t t

(Eq. 5.14)

Resoluo entre os picos:
( )
R2 R1
s
1 2
2 t t
R
w w
=
+

(Eq. 5.15)

Nmero de pratos:
2
R
16
w
i
i
i
t
N

=

(Eq. 5.16)

Assimetria de um pico a 10% de
sua altura:
BC
AB
i
i
i
As =
; (Eq. 5.17)

onde AB
i
a distncia entre os pontos A e B, e BC
i
a distncia entre os
pontos B e C, conforme ilustra a figura 5.1.

Figura 5.1 Assimetria de um pico a 10% de sua altura. O segmento de reta DE parte do pice do
pico em direo linha de base e perpendicular a esta. O segmento de reta AC se localiza a uma
altura equivalente a 10% da altura do pico, perpendicular ao segmento de reta DE e parte da lateral
anterior do pico em direo lateral posterior do mesmo. O ponto B a interseo entre os dois
segmentos de reta.
Materiais e mtodos

163

FENOPROFENO POR CLAE EM FASE NORMAL


Para a realizao dos ensaios 1 a 12, foram pesados 25,0 mg de fenoprofeno
clcico diidratado racmico, os quais foram transferidos para um balo volumtrico
de 50,0 mL. Em seguida, adicionou-se a esse balo 5 mL de etanol. O balo foi
ento levado ao banho de ultra-som, onde permaneceu at a completa solubilizao
do frmaco. Posteriormente, a soluo assim obtida foi diluda a 50,0 mL com uma
combinao de ismeros do hexano. A nova soluo, resultante dessa diluio, foi
ento homogeneizada e parte dela foi filtrada para um frasco apropriado, com o
auxlio de uma unidade filtrante para seringa com membrana interna em polister e
poros de 0,45 m.
A partir do ensaio 13, foram pesados 25,0 mg de fenoprofeno clcico
diidratado racmico, os quais foram transferidos para um balo volumtrico de 25,0
mL. Em seguida, adicionou-se a esse balo 2,5 mL de etanol. O balo foi ento
levado ao banho de ultra-som, onde permaneceu at a completa solubilizao do
frmaco. Posteriormente, a soluo assim obtida foi diluda a 25,0 mL com uma
combinao de ismeros do hexano. A nova soluo, resultante dessa diluio, foi
ento homogeneizada e uma alquota de 5,0 mL da mesma foi transferida para um
balo volumtrico de 50,0 mL. Em seguida, essa alquota foi diluda a 50,0 mL com a
mesma combinao de ismeros do hexano. Por fim, esta ltima soluo foi
Materiais e mtodos

164

0,45 m.
Para um dado ensaio qualquer, a combinao de ismeros do hexano
utilizada na preparao da amostra foi sempre a mesma utilizada na preparao da
fase mvel correspondente. Todas as solues da amostra foram utilizadas
exclusivamente dentro de um prazo mximo de 24 horas aps a sua preparao.
Findo esse prazo, as solues foram substitudas por outras recm-preparadas,
sempre que necessrio.


Foram preparadas diversas fases mveis, constitudas, de um modo geral,
por uma combinao de ismeros do hexano, com teor de n-hexano igual ou
superior a 85,0%, acrescida de um segundo solvente orgnico e uma pequena
quantidade de cido actico. A partir do ensaio 25, a combinao de ismeros do
hexano utilizada - doravante denominada apenas hexano - possua teor de n-hexano
igual ou superior a 95,0%. A combinao entre os constituintes da fase mvel, em
propores definidas, foi realizada manualmente e no pelo cromatgrafo (exceto
onde especificado), com o auxlio de pipetas e bales volumtricos, sendo ento
filtrada sob presso reduzida, atravs de membrana filtrante de politetrafluoretileno
com poros de 0,45 m. A degaseificao dos solventes (ou da combinao de
solventes) foi realizada on-line.

Materiais e mtodos

165


Antes da realizao de cada ensaio, o sistema cromatogrfico foi equilibrado
com a fase mvel correspondente por no menos que 1 hora, para se garantir a
estabilizao da linha de base. Alm disso, foram realizadas ao menos duas
injees da amostra em cada ensaio, para que tambm fosse possvel verificar o
equilbrio do sistema cromatogrfico comparando-se os tempos de reteno dos
analitos nas diferentes corridas cromatogrficas.
apresentados no subitem 6.3 correspondem deteco em 272 nm. O volume de
injeo adotado, por sua vez, corresponde sempre a 20 L.

5.2.3.4 INVESTIGAO DA SELETIVIDADE DE DIFERENTES MODIFICADORES ORGNICOS

Inicialmente, foram investigadas as seletividades proporcionadas por 4
diferentes modificadores orgnicos, com o intuito de selecionar aquele que,
juntamente com o hexano e pequena quantidade de cido actico, pudesse
proporcionar uma boa separao entre os enantimeros do fenoprofeno. Nessa
primeira etapa, os 4 modificadores orgnicos investigados foram o diclorometano, o
acetato de etila, o dioxano e o 2-propanol. As fases mveis correspondentes aos
diversos ensaios dessa etapa se encontram descritas na tabela 5.8. Em todos os
Materiais e mtodos

166

ensaios, a vazo da respectiva fase mvel foi mantida a 1,0 mL.min
-1
e a
temperatura da coluna, a 24 C.

Tabela 5.8 Fases mveis empregadas nos ensaios 1 a 12.

Ensaio Solvente (A) Solvente (B) Proporo A:B
1
1 Hexano
2
- 100:0
2 Hexano* Diclorometano:cido actico 100:1 v/v 60:40
4 Hexano* Acetato de etila:cido actico 100:5 v/v 90:10
7 Hexano* Dioxano:cido actico 100:5 v/v 90:10
10 Hexano* 2-Propanol:cido actico 100:5 v/v 90:10

1
Em v/v;
2
na verdade, no ensaio 1, o solvente A consistiu em uma combinao hexano:cido actico
100:0,5 v/v. A combinao entre os solventes A e B das fases mveis correspondentes aos ensaios 2
a 12 foi realizada pelo prprio cromatgrafo.

Aps anlise dos cromatogramas obtidos nos ensaios 1 a 12, o mtodo de
preparao da amostra foi modificado, conforme descrito no subitem 5.2.3.1. Os
ensaios 2 e 3 foram repetidos e um novo modificador orgnico, o 1,2-dicloroetano,
teve sua seletividade investigada, dando origem aos ensaios 13 a 16. As fases
mveis empregadas nesses ensaios se encontram descritas na tabela 5.9. Todas as
demais condies cromatogrficas permaneceram as mesmas empregadas nos
ensaios 1 a 12.

Materiais e mtodos

167


Ensaio Solvente (A) Solvente (B) Proporo A:B
1
15 Hexano* 1,2-Dicloroetano:cido actico 100:0,5 v/v 60:40
16 Hexano* 1,2-Dicloroetano:cido actico 100:0,5 v/v 80:20

1
Em v/v. Em todos os ensaios, a combinao entre os respectivos solventes A e B foi realizada pelo
prprio cromatgrafo.

Avaliados todos os cromatogramas obtidos at ento, e tendo o 2-propanol se
mostrado o modificador orgnico mais adequado para o desenvolvimento do
mtodo, decidiu-se investigar outros solventes com propriedades semelhantes ao 2-
propanol. Mais especificamente, decidiu-se investigar a influncia do tamanho da
cadeia carbnica de alguns alcois na separao dos enantimeros do fenoprofeno.
Os novos alcois investigados foram: o etanol, o 1-butanol e o 2-butanol. Para tanto,
foram realizados os ensaios 17 a 20. Contudo, esses ensaios tambm foram
aproveitados para se otimizar a reteno dos analitos diminuindo-se a proporo do
modificador orgnico escolhido para compor a respectiva fase mvel. Desse modo,
as fases mveis empregadas nos ensaios 17 a 20 foram preparadas combinando-se
os seus componentes de acordo com as propores descritas na tabela 5.10. Em
todos os ensaios, mais uma vez, a vazo da respectiva fase mvel foi mantida a 1,0
mL.min
-1
e a temperatura da coluna, a 24 C.

Materiais e mtodos

168


Ensaio Solvente (A) Solvente (B) Aditivo (C)
Proporo
1
A:B:C
1

17 Hexano Etanol cido actico 99:1:0,5
18 Hexano 2-Propanol cido actico 99:1:0,5
19 Hexano 1-Butanol cido actico 99:1:0,5
20 Hexano 2-Butanol cido actico 99:1:0,5

1
Em v/v/v.

Considerando-se a seletividade proporcionada pelos diferentes alcois, entre
outras informaes extradas da anlise dos cromatogramas obtidos nos ensaios 17
a 20, estabeleceu-se o 2-propanol como modificador orgnico, bem como sua
proporo na fase mvel. Posteriormente, partiu-se para a otimizao de outras 3
condies cromatogrficas, a saber: vazo da fase mvel, temperatura da coluna e
quantidade de cido actico adicionada fase mvel.

5.2.3.5 OTIMIZAO DA VAZO DA FASE MVEL

Para otimizar a vazo da fase mvel, foram realizados os ensaios 21 a 25,
sendo que o ensaio 21 corresponde, de fato, repetio do ensaio 18. Esses
ensaios tiveram por objetivo observar o efeito que a diminuio da vazo iria exercer
sobre a resoluo e, em caso de aumento desta ltima, encontrar o melhor
compromisso entre esse aumento e o aumento do tempo de corrida (este ltimo
representado pelo aumento do tempo de reteno referente ao segundo pico). As
respectivas condies cromatogrficas empregadas nos ensaios 21 a 25 se
encontram descritas na tabela 5.11.

Materiais e mtodos

169

Tabela 5.11 Condies cromatogrficas empregadas nos ensaios 21 a 25.

Ensaio Fase mvel
1

Vazo da
fase mvel
2

Temperatura
da coluna
3

21 Hexano:2-propanol:cido actico 99:1:0,5 1,0 24

1
Propores entre os componentes dadas em v/v/v;
2
em mL.min
-1
;
3
em C.

5.2.3.6 OTIMIZAO DA TEMPERATURA DA COLUNA

Para otimizar a temperatura da coluna, foram realizados os ensaios 26 a 30,
sendo que o ensaio 26 corresponde, de fato, repetio do ensaio 24. Esses novos
ensaios tiveram por objetivo observar o efeito que a diminuio da temperatura iria
exercer sobre a resoluo. Novamente, procurou-se determinar o melhor conjunto de
condies cromatogrficas com base em um compromisso entre a resoluo obtida
em cada ensaio e o tempo de corrida correspondente. As respectivas condies
cromatogrficas empregadas nos ensaios 26 a 30 se encontram descritas na tabela
5.12.


Ensaio Fase mvel
1

Vazo da
fase mvel
2

Temperatura
da coluna
3


1
Propores entre os componentes dadas em v/v/v;
2
em mL.min
-1
;
3
em C. A combinao de
ismeros do hexano aqui empregada possua teor de n-hexano igual ou superior a 95,0%.
Materiais e mtodos

170

Materiais e mtodos
5.2.3.7 OTIMIZAO DA QUANTIDADE DE CIDO ACTICO EMPREGADA NA FASE MVEL

Para otimizar a quantidade de cido actico empregada na fase mvel, foram
realizados os ensaios 31 a 36, sendo que o ensaio 31 corresponde, de fato,
repetio do ensaio 30. Nesta etapa, o melhor conjunto de condies
cromatogrficas foi determinado com base no apenas na resoluo e no tempo de
corrida obtidos em cada ensaio, mas tambm em diversas outras respostas, como a
assimetria dos picos, o nmero mdio de pratos tericos e o fator de reteno
referente ao segundo pico. As respectivas condies cromatogrficas empregadas
nos ensaios 31 a 36 se encontram descritas na tabela 5.13.


Ensaio Fase mvel
1

Vazo da
fase mvel
2

Temperatura
da coluna
3

36 Hexano:2-propanol 99:1 0,7 12

1
Propores entre os componentes dadas em v/v/v (ensaios 31 a 35) ou em v/v (ensaio 36);
2
em
mL.min
-1
;
3
em C. A combinao de ismeros do hexano aqui empregada possua teor de n-hexano
igual ou superior a 95,0%.


Os cromatogramas obtidos nos ensaios 17 a 35 foram avaliados da mesma
maneira j descrita no subitem 5.2.2.8.

171

______________________
CETOPROFENO POR CLAE EM FASE REVERSA


Para o ensaio 1, a amostra foi preparada da seguinte maneira: 25,0 mg de
cetoprofeno racmico foram pesados e transferidos para um balo volumtrico de
50,0 mL. Em seguida, adicionou-se a esse balo 5 mL de etanol. O balo foi ento
levado ao banho de ultra-som, onde permaneceu at a completa solubilizao do
frmaco. Posteriormente, a soluo assim obtida foi diluda a 50,0 mL com tampo
acetato de amnio 25 mM pH 4,5. A nova soluo, resultante dessa diluio, foi
ento homogeneizada e parte dela foi filtrada para um frasco apropriado, com o
auxlio de uma unidade filtrante para seringa com membrana interna em polister e
poros de 0,45 m. Porm, diante da necessidade de diminuio do sinal analtico, a
concentrao da amostra foi reduzida para os ensaios posteriores, conforme
apresentado abaixo.
Para todos os demais ensaios, foram pesados (sempre que necessrio) 25,0
mg de cetoprofeno racmico, os quais foram transferidos para um balo volumtrico
de 25,0 mL. Em seguida, adicionou-se a esse balo 5 mL de etanol. O balo foi
ento levado ao banho de ultra-som, onde permaneceu at a completa solubilizao
do frmaco. Posteriormente, a soluo assim obtida foi diluda a 25,0 mL com o
tampo apropriado*. A nova soluo, resultante dessa diluio, foi ento
homogeneizada e uma alquota de 5,0 mL da mesma foi transferida para um balo
volumtrico de 50,0 mL. Em seguida, essa alquota foi diluda a 50,0 mL com o
*A amostra e a fase mvel utilizadas num dado ensaio qualquer foram preparadas sempre com o
mesmo tampo.

172

______________________
mesmo tampo empregado anteriormente. Por fim, esta ltima soluo foi
0,45 m.


As diversas fases mveis utilizadas foram preparadas de modo idntico ao j
descrito no subitem 5.2.2.2.
As quantidades de cido frmico* e de hidrxido de amnio** requeridos para
preparar 1,0 L de tampo formato de amnio 25 mM correspondem a 1,0 mL e a 1,9
mL, respectivamente. Todavia, uma quantidade adicional de cido frmico
necessria para ajustar o pH do tampo ao valor desejado.


apresentados no subitem 6.4 correspondem deteco em 254 nm (embora o
comprimento de onda de mxima absoro tenha variado entre 258 e 260 nm,
dependendo da fase mvel utilizada). O volume de injeo adotado, por sua vez,
corresponde sempre a 20 L.
*Densidade = 1,220 g/mL e concentrao = 98%; **densidade = 0,910 g/mL e concentrao
equivalente a 25% de NH
3
.

173

5.2.4.4 DESENVOLVIMENTO DO MTODO

As condies cromatogrficas correspondentes aos diversos ensaios
realizados durante a tentativa de desenvolvimento do mtodo se encontram
descritas nas tabelas 5.14, 5.15 e 5.16. Os cromatogramas obtidos nesses ensaios
foram avaliados da mesma maneira j descrita no subitem 5.2.2.8.

Tabela 5.14 Investigao da seletividade de diferentes modificadores orgnicos.

Ensaio Solvente A Solvente B
Proporo
1
A:B
1

1 Tampo acetato de amnio 25 mM pH 4,5 Metanol 50:50
2 Tampo acetato de amnio 25 mM pH 4,5 Metanol 70:30
3 Tampo acetato de amnio 25 mM pH 4,5 Etanol 74,8:25,2
4 Tampo acetato de amnio 25 mM pH 4,5 2-propanol 77,3:22,7
5 Tampo acetato de amnio 25 mM pH 4,5 Acetonitrila 77,2:22,8

1
Em v/v. F =1,0 mL.min-
1
; T
c
=24 C.

Tabela 5.15 Experimentos com diferentes valores de pH para o tampo.

Ensaio Solvente A Solvente B
Proporo
1
A:B
1

6 Tampo formato de amnio25 mM pH 3,0 Etanol 75:25
7 Tampo acetato de amnio 25 mM pH 5,5 Etanol 75:25

1
Em v/v. F =1,0 mL.min-
1
; T
c
=24 C.

Tabela 5.16 Diminuio da temperatura da coluna e diminuio da vazo da fase mvel.

Ensaio Fase mvel
1

Vazo da
fase mvel
2

Temperatura
da coluna
3

8 Tampo acetato de amnio:etanol 75:25 1,0 12

1
Propores entre os componentes dadas em v/v;
2
em mL.min
-1
;
3
em C. Molaridade do tampo =25
mM; pH do tampo =5,5.
Materiais e mtodos

174

______________________
CETOPROFENO POR CLAE EM FASE NORMAL


Sempre que necessrio, foram pesados 25,0 mg de cetoprofeno racmico, os
quais foram transferidos para um balo volumtrico de 25,0 mL. Em seguida,
adicionou-se a esse balo 2,5 mL de diclorometano. O balo foi ento levado ao
banho de ultra-som, onde permaneceu at a completa solubilizao do frmaco.
Posteriormente, a soluo assim obtida foi diluda a 25,0 mL com hexano*. A nova
soluo, resultante dessa diluio, foi ento homogeneizada e uma alquota de 5,0
mL da mesma foi transferida para um balo volumtrico de 50,0 mL. Em seguida,
essa alquota foi diluda a 50,0 mL com hexano. Por fim, esta ltima soluo foi
0,45 m.


Foram preparadas diversas fases mveis, constitudas, de um modo geral,
por hexano e/ou diclorometano, acrescido(s) de um modificador orgnico alcolico e
uma pequena quantidade de cido actico ou acetato de amnio. Este ltimo,
quando empregado, foi adicionado fase mvel previamente solubilizado em etanol.
*Em todo o subitem 5.2.5, o termo hexano se refere, na verdade, a uma combinao de ismeros do
hexano com teor de n-hexano igual ou superior a 95,0%.

175

Os alcois empregados como modificadores orgnicos foram o 2-propanol e o
etanol. A combinao entre os constituintes da fase mvel, em propores definidas,
foi realizada manualmente e no pelo cromatgrafo (exceto onde especificado), com
o auxlio de pipetas e bales volumtricos, sendo ento filtrada sob presso
reduzida, atravs de membrana filtrante de politetrafluoretileno com poros de 0,45
m. A degaseificao dos solventes (ou da combinao de solventes) foi realizada
on-line.


Antes da realizao de cada ensaio, o sistema cromatogrfico foi equilibrado
com a fase mvel correspondente por no menos que 1 hora, para assegurar a
estabilizao da linha de base. Alm disso, foram realizadas ao menos duas
injees da amostra em cada ensaio, para que tambm fosse possvel verificar o
equilbrio do sistema cromatogrfico comparando-se os tempos de reteno dos
analitos nas diferentes corridas cromatogrficas. A vazo adotada para a fase mvel
corresponde sempre a 1,0 mL.min
-1
.
apresentados no subitem 6.5 correspondem deteco em 254 nm. O volume de
injeo adotado, por sua vez, corresponde sempre a 20 L.

Materiais e mtodos

176

5.2.5.4 ENSAIOS PRELIMINARES

A estratgia para o desenvolvimento de um mtodo de separao por CLAE
em fase normal para os enantimeros do cetoprofeno foi baseada na execuo de
um planejamento experimental do tipo planejamento de mistura, o qual est descrito
no subitem 5.2.5.5. Esse planejamento teve por objetivo determinar a melhor fase
mvel para o mtodo estabelecendo a proporo ideal entre aqueles componentes
previamente selecionados para compor essa fase mvel. Por proporo ideal,
entende-se aquela capaz de conduzir ao melhor compromisso entre a resoluo e o
tempo de corrida.
Os solventes hexano e diclorometano foram escolhidos a priori para compor,
juntamente com um lcool e um aditivo de fase mvel, as diversas fases mveis
empregadas na execuo do planejamento em questo. Contudo, antes que os
ensaios previstos pelo planejamento de mistura pudessem ser realizados, alguns
ensaios preliminares tiveram que ser conduzidos com o intuito de se definir qual
modificador orgnico alcolico e qual aditivo de fase mvel viriam a ser adotados. As
fases mveis empregadas nesses ensaios preliminares se encontram descritas na
tabela 5.17.

Tabela 5.17 Fases mveis empregadas nos ensaios preliminares.
Ensaio Solvente (A) Solvente (B) Aditivo (C) Proporo
1
3 Diclorometano 2-Propanol cido actico 90:10:0,1
4 Diclorometano 2-Propanol cido actico 99:1:0,10
5 Hexano Etanol cido actico 90:10:0,1
6 Hexano Etanol Acetato de amnio
2
90:10:00
7 Diclorometano Etanol Acetato de amnio
2
90:10:00

1
Proporo A:B:C, em v/v/v, para os ensaios em que o cido actico foi o aditivo empregado, e
proporo A:B, em v/v, para os ensaios onde o acetato de amnio foi o aditivo empregado;
2
empregado em concentrao equivalente a 0,02 M. T
c
=24 C.
Materiais e mtodos

177

5.2.5.5 PLANEJ AMENTO DE MISTURA
213

Com base na avaliao das separaes obtidas nos ensaios preliminares,
estabeleceu-se o etanol como o modificador orgnico alcolico a ser utilizado, de tal
modo que, para compor as misturas binrias e tercirias empregadas no
planejamento de mistura, fez-se uso dos seguintes solventes:

Hexano Componente 1;
Diclorometano Componente 2;
Etanol Componente 3.

No entanto, para manter o tempo de eluio dos enantimeros dentro de
limites razoveis, a participao do etanol na composio das diversas fases mveis
foi restringida a concentraes entre 10,0% e 20,0% (inclusive). Essa deciso limitou
a participao dos outros componentes a concentraes entre 0,0% e 90,0% (todas
as porcentagens expressas em v/v). Alm disso, adicionou-se acetato de amnio,
em concentrao equivalente a 1,0 g/L, a todas as fases mveis empregadas neste
planejamento. A deciso por empregar esse aditivo em particular tambm foi
fundamentada na avaliao das separaes obtidas nos ensaios preliminares.
O planejamento de mistura adotado envolveu a realizao de 9 ensaios
distintos (9 diferentes fases mveis ou misturas), tendo sido definido conforme a
tabela 5.18. Nessa tabela, so apresentadas as propores reais dos componentes
em cada uma das misturas (c
i
). Na tabela 6.19, por sua vez, as propores entre os
componentes so apresentadas em termos de pseudocomponentes (
i
).

Materiais e mtodos

178

Tabela 5.18 Proporo real de cada solvente nas diversas fases mveis empregadas no
planejamento de mistura.

Mistura c
1
c
2
c
3

1 0,900 0,000 0,100
2 0,000 0,900 0,100
3 0,800 0,000 0,200
4 0,000 0,800 0,200
5 0,000 0,850 0,150
6 0,850 0,000 0,150
7 0,450 0,450 0,100
8 0,400 0,400 0,200
9 0,425 0,425 0,150

c
1
, proporo real de hexano; c
2
, proporo real de diclorometano; c
3
, proporo real de etanol.

Tabela 5.19 Proporo de cada solvente nas diversas fases mveis empregadas no planejamento
de mistura, agora expressa em termos de pseudocomponentes.

Mistura
1

2

3

1 1,000 0,000 0,000
2 0,000 1,000 0,000
3 0,889 0,000 0,111
4 0,000 0,889 0,111
5 0,000 0,944 0,056
6 0,944 0,000 0,056
7 0,500 0,500 0,000
8 0,444 0,444 0,111
9 0,472 0,472 0,056

1
, proporo de hexano em termos de pseudocomponentes;
2
, proporo de diclorometano em
termos de pseudocomponentes;
3
, proporo de etanol em termos de pseudocomponentes.

Para expressar em termos de pseudocomponentes a proporo de cada
solvente nas diversas fases mveis, empregou-se a seguinte equao:

1
1
i i
i q
i
i
c a
X
a
=

;

(Eq. 5.18)

onde a
i
o limite inferior estabelecido para a proporo de um dado solvente.
Materiais e mtodos

179

A temperatura da coluna foi mantida a 12 C durante todos os ensaios do
planejamento de mistura. Estes, por sua vez, foram realizados em duplicata, as
quais se basearam em repeties autnticas de cada ensaio, incluindo novas
preparaes da amostra e da fase mvel. Para evitar a ocorrncia de distoro
estatstica nos resultados, os experimentos foram realizados em ordem aleatria.
Aps a realizao dos ensaios previstos pelo planejamento de mistura, os
cromatogramas obtidos foram avaliados calculando-se os parmetros
cromatogrficos j descritos no subitem 5.2.2.8. Efetuados os clculos, partiu-se
ento para a construo de modelos matemticos empricos (lineares, quadrticos e
cbicos especiais), na tentativa de se descrever a relao existente entre a
proporo de cada componente na fase mvel e as seguintes respostas:

Tempo de reteno referente ao segundo pico;
Logaritmo neperiano do fator de reteno referente ao segundo pico
[ln(k
2
)].

Cada uma das respostas foi modelada de acordo com as seguintes equaes
gerais:

Para um modelo linear,
* * *
1 1 2 2 3 3
= y + + + ; (Eq. 5.19)
Para um modelo quadrtico,
* * * * * *
1 1 2 2 3 3 12 1 2 13 1 3 23 2 3
= y + + + + + + ; (Eq. 5.20)

Materiais e mtodos

180

+
Para um modelo cbico especial,
* * * * * *
1 1 2 2 3 3 12 1 2 13 1 3 23 2 3
= y + + + + +
*
123 1 2 3
+ ; (Eq. 5.21)

onde: y a resposta considerada e o erro aleatrio associado sua
determinao;
1
,
2
e
3
so as propores (expressas em termos de
pseudocomponentes) de hexano, diclorometano e etanol na fase mvel,
respectivamente;
*
1
,
*
2
,
*
3
,
*
12
,
*
13
,
*
23
, e
*
123
so parmetros dos modelos a que
se referem, para os quais foram calculados os estimadores correspondentes,
..., .
*
1
b ,
*
2
b ,
*
3
b ,
*
123
b

Esses parmetros foram avaliados em um nvel de significncia igual a 0,05.
O grau de ajuste de cada modelo s respostas observadas foi determinado pela
anlise do perfil de distribuio dos resduos e pelo emprego do mtodo de anlise
da varincia (ANOVA) da regresso.

5.2.5.6 DETERMINAO DAS CONDIES TIMAS PARA A SEPARAO

Para se estabelecer o melhor compromisso entre a resoluo e o tempo de
corrida almejados, foi empregado novamente, e de modo semelhante ao j
apresentado no subitem 5.2.2.7, o mtodo de otimizao simultnea proposto por
Derringer e Suich. Entretanto, a desejabilidade global (D), neste caso, dada pela
Equao 5.22:
Materiais e mtodos

181

s 2
2
ln( ) R k
D d d = , (0 <D 1) ; (Eq. 5.22)

onde
s
R
d

e
2
ln( ) k
d

so a funo de desejabilidade para a R
s
e a funo de dese-
jabilidade para o ln(k
2
), respectivamente.

A funo de desejabilidade para a R
s
definida, aqui, pelas mesmas
equaes apresentadas no subitem 5.2.2.7 (equaes 5.7, 5.8 e 5.9). J a funo de
desejabilidade para o ln(k
2
) definida, neste trabalho, pelas seguintes equaes:

2
0,1
2
ln( )
ln
k
k LI
d
A LI
,
para LI A ;
2
ln( ) k
d (Eq. 5.23)
2
0,1
2
ln( )
ln
k
k LS
d
A LS
,
para A LS ;
2
ln( ) k
d (Eq. 5.24)
2
ln( )
0
k
d = ,
para <LI ou
2
ln( ) k
d
para >LS ;
2
ln( ) k
d
(Eq. 5.25)

onde A aproximadamente igual a 1,3863 [valor desejado para o ln(k
2
), sendo k
2

igual a 4,0], e LI e LS so aproximadamente iguais a 1,0986 e a 1,7918,
respectivamente [valores mnimo e mximo aceitveis para o ln(k
2
), sendo k
2
igual a
3,0 e a 6,0, respectivamente].

Mais uma vez, com o emprego conjunto de todas essas equaes, a
otimizao simultnea das duas respostas ficou reduzida maximizao da
desejabilidade global. Assim sendo, uma nova planilha foi elaborada no programa
Excel, da Microsoft, onde foram introduzidos os modelos escolhidos para descrever
Materiais e mtodos

182

Materiais e mtodos
a relao existente entre a proporo de cada componente na fase mvel e as
respostas R
s
e ln(k
2
). Essa planilha foi construda de tal modo que, inserida a
proporo de cada componente, o Excel fosse capaz de fornecer os valores
previstos para a resoluo e para o tempo de reteno referente ao segundo pico
[este ltimo obtido a partir do ln(k
2
) e da equao 5.13]. Essas previses, por sua
vez, foram associadas s suas respectivas funes de desejabilidade, possibilitando
o clculo da desejabilidade global. Finalmente, para se descobrir a proporo ideal
de cada solvente, foi utilizada a funo Solver do Excel.


Os cromatogramas obtidos durante a realizao dos ensaios previstos pelo
planejamento de mistura foram avaliados da mesma maneira j descrita no subitem
5.2.2.8.

5.2.5.8 DETERMINAO DA ORDEM DE ELUIO DOS ENANTIMEROS

Para determinar a ordem de eluio dos enantimeros foram preparadas trs
diferentes solues. A primeira delas consistiu em uma soluo de cetoprofeno
racmico, preparada conforme descrito anteriormente, no subitem 5.2.5.1 (Soluo
1). A segunda soluo foi preparada de modo semelhante primeira, substituindo-se
a amostra de cetoprofeno racmico pelo padro de (S)-(+)-cetoprofeno (Soluo 2).
A terceira e ltima soluo foi preparada a partir das duas primeiras, adicionando-se

183

______________________
2,0 mL da soluo de (S)-(+)-cetoprofeno a 5,0 mL da soluo de cetoprofeno
racmico (Soluo 3). Posteriormente, essas solues foram analisadas de acordo
com as condies estabelecidas para o mtodo (j otimizado vide subitem 6.5.2.4).
A ordem de eluio dos enantimeros pde ento ser determinada por meio do
aumento observado na rea de um dos picos, quando comparados os
cromatogramas obtidos a partir da anlise das solues 1 e 3*.

5.2.6 APLICAO DOS MTODOS SELECIONADOS S AMOSTRAS DE MEDICAMENTOS

As amostras de medicamentos listadas no subitem 5.1.3.2 foram analisadas
de acordo com os mtodos escolhidos para a separao dos enantimeros de seus
respectivos frmacos, cetoprofeno ou fenoprofeno. Essas amostras foram
preparadas para as anlises pesando-se o equivalente a 25 mg do frmaco
correspondente e procedendo-se s diluies conforme descrito nos subitens 5.2.3.1
e 5.2.5.1, de acordo com o frmaco em questo. Em ambos os casos, o mtodo
selecionado foi aquele em que os enantimeros so separados por CLAE em fase
normal. A seletividade desses mtodos frente s amostras analisadas foi avaliada
por meio dos recursos oferecidos pelo detector de arranjo de diodos (anlise da
pureza dos picos). Os excipientes que compem as matrizes dos medicamentos
analisados so apresentados a seguir:

Amostra 1: acar refinado, amido de milho, dextrina, estearato de
magnsio, lactose monoidratada, OpadryEnteric YP-6-2125 e polacrilina
potssica;
*A soluo 2 foi analisada apenas para se assegurar a qualidade do padro empregado.

184

Materiais e mtodos
Amostra 2: amarelo de quinolina (laca), bicarbonato de sdio, celulose
microcristalina, citrato de trietila, copolmero do cido metacrlico,
copovidona, dixido de silcio, dixido de titnio, estearato de magnsio,
hipromelose, lactose monoidratada, laurilsulfato de sdio, macrogol,
silicato de magnsio e simeticona;
Amostra 3: carboxipolimetileno, estearato de magnsio, lactose
monoidratada e talco;
Amostra 4: celulose microcristalina e dimeticona.

185

6. RESULTADOS

6.1 QUALIFICAO DOS FRMACOS: ENSAIOS DE IDENTIFICAO

6.1.1 ESPECTROMETRIA DE ABSORO NO INFRAVERMELHO

As figuras 6.1, 6.2 e 6.3 apresentam os espectros de absoro na regio do
infravermelho obtidos a partir das amostras de cetoprofeno e de fenoprofeno clcico
diidratado.

T
r
a
n
s
m
i
t
n
c
i
a

/

%

Nmero de onda / cm
-1

Figura 6.1 Cetoprofeno (Amostra 1): espectro de absoro no infravermelho, obtido a partir de
disperso em pastilhas de KBr.

Resultados

186

/

%

T
r
a
n
s
m
i
t
n
c
i
a

Nmero de onda / cm
-1

Figura 6.2 Cetoprofeno (Amostra 2): espectro de absoro no infravermelho, obtido a partir de

/

%
T
r
a
n
s
m
i
t
n
c
i
a
Nmero de onda / cm
-1

Figura 6.3 Fenoprofeno clcico diidratado: espectro de absoro no infravermelho, obtido a partir de

Resultados

187

A tabela 6.1 apresenta os nmeros de onda referentes s bandas principais,
de acordo com os espectros de absoro no infravermelho obtidos
experimentalmente a partir das amostras j citadas. Para fins de comparao, a
tabela tambm apresenta os nmeros de onda referentes s bandas principais
conforme encontrados na literatura. As provveis atribuies dessas bandas foram
descritas no subitem 2.3.1 (tabelas 2.2 e 2.3).

Tabela 6.1 Nmeros de onda referentes s bandas principais: valores experimentais e aqueles
descritos pela literatura.

Frmaco

Nmeros de onda referentes s bandas principais / cm
-1

CET
(Referncia)
690 714 1226 1284 1656 1693
CET
(Amostra 1)
691 717 1229 1285 1655 1697
CET
(Amostra 2)
691 717 1229 1285 1655 1697
FCD
(Referncia)
696 1211 1225 1248 1268 1562
FCD
(Amostra)
696 1211 1226 1246 1266 1560

CET, cetoprofeno; FCD, fenoprofeno clcico diidratado. Em negrito esto os valores descritos pela
literatura, tomados como referncia.

Resultados

188

6.1.2 ESPECTROFOTOMETRIA DE ABSORO NO ULTRAVIOLETA

As figuras 6.4, 6.5 e 6.6 apresentam os espectros de absoro no ultravioleta
obtidos a partir das amostras de cetoprofeno e de fenoprofeno clcico diidratado.

A
b
s
o
r
v
n
c
i
a
Comprimento de onda / nm
Figura 6.4 Cetoprofeno (Amostra 1): espectro de absoro no ultravioleta. O nmero 1 indica a
absorvncia em 255 nm.

A
b
s
o
r
v
n
c
i
a
Figura 6.5 Cetoprofeno (Amostra 2): espectro de absoro no ultravioleta. O nmero 1 indica a
absorvncia em 255 nm.
Resultados

189

A
b
s
o
r
v
n
c
i
a


Figura 6.6 Fenoprofeno clcico diidratado: espectro de absoro no ultravioleta. Os nmeros 1, 2 e
3 indicam as absorvncias em 266, 272 e 278 nm, respectivamente.

A tabela 6.2 traz os valores experimentais que foram confrontados com as
especificaes pertinentes fornecidas pela farmacopia britnica, na monografia do
cetoprofeno.

Tabela 6.2 Cetoprofeno: valores de absorvncia e absorvncia especfica, em
comprimentos de onda de interesse.

Amostra Absorvncia
% 1
cm 1

Cetoprofeno (Amostra 1)
254,0* 0,6670 667,0
255,0* 0,6649 664,9

Cetoprofeno (Amostra 2)
254,2* 0,6555 655,5
255,0* 0,6547 654,7

, comprimento de onda, em nm; , absorvncia especfica. *Comprimento de onda
referente ao mximo de absoro obtido experimentalmente.
% 1
cm 1

Resultados

190

A tabela 6.3 traz os valores experimentais que foram confrontados com as
especificaes pertinentes fornecidas pela farmacopia britnica, na monografia do
fenoprofeno clcico.

Tabela 6.3 Fenoprofeno clcico diidratado: valores de absorvncia e absorvncia
especfica, em comprimentos de onda de interesse.

Amostra Absorvncia
% 1
cm 1

Fenoprofeno clcico
diidratado
266,0* 0,5820 58,2
272,0* 0,6709 67,1
278,0* 0,6053 60,5
278,2* 0,6056 60,6

, comprimento de onda (em nm); , absorvncia especfica. *Comprimentos de
onda referentes aos mximos de absoro obtidos experimentalmente.
% 1
cm 1

6.1.3 DETERMINAO DA FAIXA DE FUSO

Para ambas as amostras de cetoprofeno, a fuso foi observada entre 92 e 97
C.

6.1.4 ENSAIO PARA IDENTIFICAO DE CLCIO

Na realizao do ensaio para identificao de clcio, pde-se observar a
formao de um precipitado branco insolvel, aps a reao do frmaco com o
oxalato de amnio, em meio constitudo por cido actico. Posteriormente, esse
precipitado se mostrou solvel em cido clordrico 3 M. O teste de chama, por sua
vez, evidenciou o aparecimento de uma colorao vermelho-amarelada transitria.
Resultados

191

Alm disso, a decomposio trmica da amostra de fenoprofeno clcico
diidratado, durante a anlise termogravimtrica, conduziu obteno de um resduo
cuja massa se revelou equivalente a 10,81% da massa originalmente submetida
anlise (mdia de duas determinaes).

Tabela 6.4 Valores terico e experimental para a porcentagem de resduo obtida aps
decomposio trmica do fenoprofeno clcico diidratado em presena de oxignio.

Massa molecular
relativa
Valor
terico
Valor
experimental
Fenoprofeno clcico diidratado 558,64 100,00% -
xido de clcio (resduo) 056,08 010,04% 010,81%*

*Mdia de duas determinaes.

0 1000
120
-89.062%
200 400 600 800
100
80
60
40
20
0

M
a
s
s
a

/

%

Temperatura / C
Figura 6.7 Fenoprofeno clcico diidratado: curva TG obtida a 10 C/min e sob atmosfera dinmica
de ar Ensaio 1 (tomada de ensaio = 10,203 mg).

0 1000
120
-89.323%
200 400 600 800
100
80
60
40
20
0

M
a
s
s
a

/

%

Temperatura / C
Figura 6.8 Fenoprofeno clcico diidratado: curva TG obtida a 10 C/min e sob atmosfera dinmica
de ar Ensaio 2 (tomada de ensaio = 10,443 mg).
Resultados

192

6.1.5 DETERMINAO DO TEOR DE GUA PELO MTODO DE KARL FISCHER

As tabelas 6.5 e 6.6 se referem padronizao da soluo de Karl Fischer e
determinao do teor de gua na amostra de fenoprofeno clcico diidratado,
respectivamente. Segundo o mtodo de Karl Fischer, essa amostra contm 6,18%
de gua (mdia de trs determinaes). A quantidade de gua na molcula do
(C
15
H
13
O
3
)
2
Ca.2H
2
O, calculada estequiometricamente, corresponde a 6,45%.

Tabela 6.5 Padronizao da soluo de Karl Fischer.

Amostra TE Volume gasto
1
Mdia DP CV
gua
ultrapurificada
10 2,126
2,131 0,058 2,73% 10 2,076
10 2,192

TE, tomada de ensaio (em L); DP, desvio padro; CV, coeficiente de variao.
1
Referente soluo
de Karl Fischer (em mL).

Tabela 6.6 Determinao do teor de gua na amostra de fenoprofeno clcico diidratado.

Amostra TE
Volume
gasto
1

Teor de gua Mdia DP CV
Fenoprofeno
clcico
diidratado
206,0 2,802 6,38%
6,18% 0,27% 4,30% 202,1 2,702 6,27%
203,9 2,554 5,88%

TE, tomada de ensaio (em mg); DP, desvio padro; CV, coeficiente de variao.
1
Referente soluo
de Karl Fischer (em mL).

Resultados

193

6.1.6 DETERMINAO DO TEOR DE GUA POR TERMOGRAVIMETRIA

A determinao do teor de gua por termogravimetria indicou que a amostra
de fenoprofeno clcico diidratado contm 6,30% de gua (mdia de duas
determinaes), conforme pode ser observado nas figuras 6.9 e 6.10.

40 80 120 160 200
95.0
100.0
-3.0
-2.0
-1.0
0.0
1.0
-6.276%
90.62 C

D
T
G

/

%
.
m
i
n
-
1

M
a
s
s
a

/

%

Temperatura / C
Figura 6.9 Fenoprofeno clcico diidratado: curvas TG/DTG obtidas a 10 C/min e sob atmosfera
dinmica de nitrognio Ensaio 1 (tomada de ensaio = 5,035 mg).

40 80 120 160 200
95.0
100.0
-3.0
-2.0
-1.0
0.0
1.0
-6.331%
96.52 C

D
T
G

/

%
.
m
i
n
-
1

M
a
s
s
a

/

%

Temperatura / C
Figura 6.10 Fenoprofeno clcico diidratado: curvas TG/DTG obtidas a 10 C/min e sob atmosfera
dinmica de nitrognio Ensaio 2 (tomada de ensaio = 10,299 mg).
Resultados

194

6.2 DESENVOLVIMENTO DO MTODO DE SEPARAO PARA OS ENANTIMEROS DO

6.2.1 ENSAIOS PRELIMINARES

O quadro 6.1 apresenta os cromatogramas obtidos durante os ensaios
preliminares.

Resultados

195

Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
m
A
U
0
20
40
60
80
Ensaio 1
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14
m
A
U
0
10
20
30
40
50
Ensaio 2
m
U
A

m
U
A

Minutos Minutos
Minutes
0,0 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 20,0 22,5 25,0 27,5 30,0 32,5 35,0
m
A
U
0
5
10
15
20
Ensaio 3
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
m
A
U
0
10
20
30
40
50
Ensaio 4
m
U
A

m
U
A

Minutos Minutos
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
m
A
U
0
5
10
15
20
25
Ensaio 5
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
m
A
U
0
50
100
150
Ensaio 6
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14
m
A
U
0
20
40
60
Ensaio 7

m
U
A

m
U
A

Minutos Minutos
m
U
A

Minutos

Quadro 6.1 Separao dos enantimeros do fenoprofeno por CLAE em fase reversa: ensaios
preliminares Ensaios 1 a 5 Fase mvel = tampo CH
3
CO
2
NH
4
25 mM pH 4,5:metanol; T
c
= 24 C
(Ensaio 1: % B = 60,0%, F = 1,0 mL.min
-1
; ensaio 2: % B = 50,0%, F = 1,0 mL.min
-1
; ensaio 3: % B =
40,0%, F = 1,0 mL.min
-1
; ensaio 4: % B = 50,0%, F = 0,5 mL.min
-1
; ensaio 5: % B = 50,0%, F = 2,0
mL.min
-1
) Ensaios 6 e 7 Fase mvel = tampo CH
3
CO
2
NH
4
25 mM pH 4,5:acetonitrila; F = 1,0
mL.min
-1
; T
c
= 24 C (Ensaio 6: % B = 50,0%; ensaio 7: % B = 36,5%).

Resultados

196

Resultados
6.2.2 PLANEJAMENTO FATORIAL FRACIONRIO

6.2.2.1 AVALIAO DOS CROMATOGRAMAS OBTIDOS

As tabelas 6.7 e 6.8 apresentam a avaliao dos cromatogramas obtidos com
a realizao dos ensaios previstos no planejamento fatorial fracionrio. Cada
resultado apresentado nessas tabelas representa a mdia entre outros dois
resultados obtidos atravs da injeo em duplicata da amostra.
Aps as tabelas, so apresentados cromatogramas que exemplificam as
separaes atingidas nas condies cromatogrficas correspondentes a cada ensaio
(quadro 6.2).

Tabela 6.7 Avaliao dos cromatogramas obtidos com a realizao dos ensaios 1 a 4 previstos no planejamento fatorial fracionrio.

Resposta
Ensaio
1 1* 2 2* 3 3* 4 4*
Tempo de reteno (no-retido) 3,18 3,17 3,15 3,17 1,67 1,66 1,60 1,59
Tempo de reteno (1 pico) 18,55 17,78 13,96 13,43 3,61 3,69 3,27 3,15
Fator de reteno (2 pico) 5,84 5,59 4,01 3,81 1,46 1,53 1,26 1,20
Fator de separao 1,21 1,21 1,17 1,18 1,26 1,26 1,22 1,22
Resoluo 2,64 2,59 2,11 2,12 1,85 1,80 1,58 1,55
Pratos tericos (1 pico) 4.720 4.420 4.743 4.599 3.441 3.201 3.821 3.756
Pratos tericos (mdia) 4.470 4.218 4.666 4.561 3.269 3.028 3.708 3.604
rea (1 pico) 1.823.132 1.883.798 1.872.535 1.857.359 0.957.974 0.983.241 0.932.788 0.930.740
rea (2 pico) 1.829.968 1.892.667 1.910.283 1.892.609 0.988.513 1.016.895 0.974.641 0.976.264
rea (mdia) 1.826.550 1.888.232 1.891.409 1.874.984 0.973.243 1.000.068 0.953.715 0.953.502
rea% (1 pico) 49,91% 49,89% 49,50% 49,53% 49,22% 49,16% 48,91% 48,81%
rea% (2 pico) 50,10% 50,12% 50,50% 50,47% 50,79% 50,84% 51,10% 51,19%
Altura (1 pico) 43.644 44.157 59.735 59.850 100.429 97.021 115.447 116.768
Altura (2 pico) 35.330 35.740 52.519 52.593 84.755 81.084 101.650 101.642
Altura (mdia) 39.487 39.948 56.127 56.221 92.592 89.052 108.548 109.205
Largura USP (1 pico) 1,08 1,07 0,81 0,79 0,25 0,26 0,21 0,21
Largura USP (2 pico) 1,34 1,32 0,94 0,91 0,30 0,32 0,24 0,24
Largura USP (mdia) 1,21 1,20 0,87 0,85 0,27 0,29 0,23 0,23
Assimetria - 10% (1 pico) 1,39 1,54 1,23 1,31 1,19 1,25 1,25 1,32
Assimetria - 10% (2 pico) 1,69 1,86 1,37 1,47 1,32 1,40 1,29 1,35
Assimetria - 10% (mdia) 1,54 1,70 1,30 1,39 1,26 1,32 1,27 1,34
CRF 0,9251 0,8772 0,0535 0,0551 0,0067 0,0047 0,0009 0,0007

*Duplicata do ensaio correspondente.

Tabela 6.8 Avaliao dos cromatogramas obtidos com a realizao dos ensaios 5 a 8 previstos no planejamento fatorial fracionrio.

Resposta
Ensaio
5 5* 6 6* 7 7* 8 8*
Tempo de reteno (no-retido) 3,22 3,20 3,17 3,19 1,64 1,62 1,59 1,59
Fator de separao 1,24 1,25 1,16 1,22 1,20 1,19 1,16 1,16
Resoluo 1,58 1,44 1,15 1,01 1,46 1,41 1,16 1,10
rea (1 pico) 1.854.054 1.846.552 1.751.022 1.782.140 0.947.565 0.986.610 0.894.085 0.939.250
rea (2 pico) 1.991.944 1.954.333 1.916.753 2.024.448 0.977.050 1.028.725 0.944.976 1.003.928
rea (mdia) 1.922.999 1.900.443 1.833.888 1.903.294 0.962.307 1.007.667 0.919.531 0.971.589
rea% (1 pico) 48,21% 48,59% 47,73% 46,82% 49,24% 48,96% 48,62% 48,34%
rea% (2 pico) 51,80% 51,42% 52,27% 53,18% 50,77% 51,05% 51,39% 51,67%
Altura (1 pico) 194.596 165.738 214.831 165.470 80.782 82.518 88.752 92.321
Altura (2 pico) 162.651 146.475 218.262 176.317 73.218 74.164 83.442 86.838
Altura (mdia) 178.623 156.106 216.546 170.893 77.000 78.341 86.097 89.580
Largura USP (1 pico) 0,25 0,29 0,22 0,28 0,31 0,32 0,27 0,27
Largura USP (2 pico) 0,30 0,32 0,22 0,34 0,35 0,35 0,29 0,30
Largura USP (mdia) 0,27 0,31 0,22 0,31 0,33 0,34 0,28 0,28
Assimetria - 10% (1 pico) 1,18 1,20 - - 1,16 0,60 - -
Assimetria - 10% (2 pico) 1,27 1,33 - - 1,18 1,23 - -
Assimetria - 10% (mdia) 1,23 1,27 - - 1,17 0,91 - -
CRF 0,0008 0,0003 0,0000 0,0000 0,0004 0,0002 0,0000 0,0000

*Duplicata do ensaio correspondente; (-) no foi possvel calcular devido sobreposio dos picos.

199

Minutes
0,0 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 20,0 22,5 25,0 27,5 30,0
m
A
U
0
10
20
30
40
Ensaio 1
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
m
A
U
0
10
20
30
40
50
60
Ensaio 2
m
U
A

m
U
A

Minutos Minutos
Minutes
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0
m
A
U
0
20
40
60
80
100
Ensaio 3
Minutes
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0
m
A
U
0
20
40
60
80
100
120
Ensaio 4
m
U
A

A

m
U
Minutos Minutos
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
m
A
U
0
50
100
150
200
Ensaio 5
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
m
A
U
0
50
100
150
200
Ensaio 6
m
U
A

m
U
A

Minutos Minutos
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
m
A
U
0
20
40
60
80
Ensaio 7
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8
m
A
U
0
20
40
60
80
Ensaio 8
m
U
A

m
U
A

Minutos Minutos

Quadro 6.2 Separao dos enantimeros do fenoprofeno por CLAE em fase reversa: planejamento
fatorial fracionrio Ensaios 1 a 8 (Ensaio 1: fase mvel = tampo HCO
2
NH
4
20 mM pH 3,5:metanol
55:45, F = 1,0 mL.min
-1
, T
c
= 14 C; ensaio 2: fase mvel = tampo HCO
2
NH
4
40 mM pH 3,5:metanol
55:45, F = 1,0 mL.min
-1
, T
c
= 26 C; ensaio 3: fase mvel = tampo CH
3
CO
2
NH
4
20 mM pH
5,5:metanol 55:45, F = 2,0 mL.min
-1
, T
c
3
CO
2
NH
4
40 mM
pH 5,5:metanol 55:45, F = 2,0 mL.min
-1
, T
c
3
CO
2
NH
4
40
mM pH 5,5:metanol 45:55, F = 1,0 mL.min
-1
, T
c
3
CO
2
NH
4

20 mM pH 5,5:metanol 45:55, F = 1,0 mL.min
-1
, T
c
2
NH
4

-1
, T
c
2
NH
4

-1
, T
c
= 26 C).
Resultados

200

6.2.2.2 CLCULO E AVALIAO DOS EFEITOS

As tabelas 6.9 a 6.14 apresentam, para cada uma das seis variveis
escolhidas como resposta, os resultados referentes s estimativas calculadas para
os efeitos principais (relacionados ao isolada de cada um dos 5 fatores
investigados) e para os efeitos relacionados a duas das 10 interaes possveis
entre dois desses fatores. As mesmas tabelas apresentam, ainda, o valor calculado
para a estimativa da mdia global das respostas que seriam obtidas com a
realizao de todos os ensaios previstos pelo planejamento fatorial completo
correspondente. Adicionalmente, so fornecidos dados que permitem concluir acerca
da significncia estatstica dessas estimativas ( = 0,05).

Tabela 6.9 Anlise do planejamento fatorial fracionrio ( )
2 5
2

III
, tendo como resposta a varivel tempo
de reteno referente ao segundo pico (em minutos).

Contraste Efeito Erro puro Estatstica t
1
Valor-p Intervalo de confiana
2

Mdia -7,92 0,07 -119,28 0,000 7,77 a -8,07

Efeitos principais
l
A
-1,89 0,13 0-14,24 0,000 -2,20 a -1,59
l
B
-7,76 0,13 0-58,41 0,000 -8,06 a -7,45
l
C
-6,44 0,13 0-48,46 0,000 -6,74 a -6,13
l
D
-6,79 0,13 0-51,17 0,000 -7,10 a -6,49
l
E
-1,31 0,13 00-9,84 0,000 -1,61 a -1,00

Interaes
l
AB
-1,26 0,13 00-9,51 0,000 0,96 a -1,57
l
AD
-1,33 0,13 0-10,03 0,000 1,03 a -1,64

l, contraste; A, temperatura da coluna (C); B, vazo da fase mvel (mL.min
-1
); C, porcentagem de
metanol na fase mvel (v/v); D, pH do tampo; E, molaridade do tampo.
1
Calculada com 8 graus de
liberdade;
2
= 0,05. Os valores considerados significativos se encontram em negrito.

Resultados

201

2 5
2

III
, tendo como resposta a varivel fator
de reteno referente ao segundo pico.

1
2

Mdia -2,10 0,02 -95,37 0,000 2,05 a -2,16

Efeitos principais
l
A
-0,64 0,04 -14,47 0,000 -0,74 a -0,54
l
B
-1,22 0,04 -27,75 0,000 -1,33 a -1,12
l
C
-1,97 0,04 -44,61 0,000 -2,07 a -1,87
l
D
-2,22 0,04 -50,36 0,000 -2,32 a -2,12
l
E
-0,40 0,04 0-8,98 0,000 -0,50 a -0,29

Interaes
l
AB
-0,34 0,04 0-7,59 0,000 0,23 a -0,44
l
AD
-0,43 0,04 0-9,85 0,000 0,33 a -0,54

-1
1
liberdade;
2

2 5
2

III
, tendo como resposta a varivel fator
de separao entre os picos.

1
2

Mdia -1,21 0,00 -310,01 0,000 1,20 a -1,21

Efeitos principais
l
A
-0,04 0,01 00-5,20 0,001 -0,06 a -0,02
l
B
-0,00 0,01 -000,32 0,759 -0,02 a -0,02
l
C
-0,02 0,01 00-2,17 0,062 -0,03 a -0,00
l
D
-0,04 0,01 -005,60 0,001 0,03 a -0,06
l
E
-0,00 0,01 -000,33 0,747 -0,02 a -0,02

Interaes
l
AB
-0,00 0,01 -000,50 0,631 -0,01 a -0,02
l
AD
-0,01 0,01 00-0,64 0,537 -0,02 a -0,01

-1
1
liberdade;
2

Resultados

202

2 5
2

III
, tendo como resposta a varivel
resoluo entre os picos.

1
2

Mdia -1,66 0,01 -119,20 0,000 1,63 a -1,69

Efeitos principais
l
A
-0,37 0,03 0-13,42 0,000 -0,44 a -0,31
l
B
-0,34 0,03 0-12,26 0,000 -0,41 a -0,28
l
C
-0,74 0,03 0-26,60 0,000 -0,81 a -0,68
l
D
-0,33 0,03 0-11,76 0,000 -0,39 a -0,26
l
E
-0,00 0,03 00-0,16 0,874 -0,07 a -0,06

Interaes
l
AB
-0,09 0,03 -003,30 0,011 0,03 a -0,16
l
AD
-0,03 0,03 -001,03 0,334 -0,04 a -0,09

-1
1
liberdade;
2

2 5
2

III
nmero mdio de pratos tericos.

1
2

Mdia -4070 267 -15,21 0,000 3453 a -4686

Efeitos principais
l
A
0-369 535 -00,69 0,510 -865 a -1602
l
B
-1955 535 0-3,65 0,006 -3189 a 0-721
l
C
0-258 535 -00,48 0,642 -975 a -1492
l
D
0-879 535 -01,64 0,139 -355 a -2112
l
E
00-20 535 -00,04 0,972 -1214 a -1253

Interaes
l
AB
00-62 535 0-0,12 0,911 -1296 a -1172
l
AD
0-181 535 -00,34 0,744 -1053 a -1414

-1
1
liberdade;
2

Resultados

203

2 5
2

III
funo de resposta cromatogrfica.

1
2

Mdia -0,1204 0,0030 -40,19 0,000 0,1134 a -0,1273

Efeitos principais
l
A
-0,2131 0,0060 -35,58 0,000 -0,2270
a
-0,1993
l
B
-0,2373 0,0060 -39,62 0,000 -0,2511
a
-0,2235
l
C
-0,2403 0,0060 -40,11 0,000 -0,2541
a
-0,2264
l
D
-0,2372 0,0060 -39,60 0,000 -0,2510
a
-0,2234
l
E
-0,2127 0,0060 -35,52 0,000 -0,2266
a
-0,1989

Interaes
l
AB
-0,2106 0,0060 -35,15 0,000 0,1967
a
-0,2244
l
AD
-0,2104 0,0060 -35,13 0,000 0,1966
a
-0,2242

-1
1
liberdade;
2

As figuras 6.11 a 6.16 apresentam grficos que ilustram mais claramente o
efeito provocado pela mudana de nvel de cada fator sobre as seis respostas de
interesse, segundo as estimativas apresentadas nas tabelas 6.9 a 6.14. Esses
grficos pressupem que as interaes entre os fatores no so significativas e que,
portanto, a alterao nas respostas atribuda apenas aos efeitos principais. Os
intervalos de confiana em todos os grficos correspondem a um coeficiente de
confiana de 95%.

Resultados

204

Fator
Temp. coluna Vazo % B pH [Tampo]
E
s
t
i
m
a
t
i
v
a

d
o

e
f
e
i
t
o

/

m
i
n
-12
-10
-8
-6
-4
-2
0
2
Temp. coluna: -1,89
Vazo: -7,76
% B: -6,44
pH: -6,79
[Tampo]: -1,31

Figura 6.11 Grfico da estimativa do efeito provocado pela mudana de nvel de cada fator sobre o
tempo de reteno referente ao segundo pico ( = 0,05).

Fator
E
s
t
i
m
a
t
i
v
a

d
o

e
f
e
i
t
o
-2,5
-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
0,5
Temp. coluna: -0,64
Vazo: -1,22
% B: -1,97
pH: -2,22
[Tampo]: -0,40

fator de reteno referente ao segundo pico ( = 0,05).

Resultados

205

Fator
E
s
t
i
m
a
t
i
v
a

d
o

e
f
e
i
t
o
-0,08
-0,06
-0,04
-0,02
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
Temp. coluna: -0,04
Vazo: 0,00
% B: -0,02
pH: 0,04
[Tampo]: 0,00

fator de separao entre os picos ( = 0,05).

Fator
E
s
t
i
m
a
t
i
v
a

d
o

e
f
e
i
t
o
-1,0
-0,8
-0,6
-0,4
-0,2
0,0
0,2
Temp. coluna: -0,37
Vazo: -0,34
% B: -0,74
pH: -0,33
[Tampo]: -0,00

Figura 6.14 Grfico da estimativa do efeito provocado pela mudana de nvel de cada fator sobre a
resoluo entre os picos ( = 0,05).

Resultados

206

Fator
E
s
t
i
m
a
t
i
v
a

d
o

e
f
e
i
t
o
-4000
-2000
0
2000
4000
Temp. coluna: 369
Vazo: -1955
% B: 258
pH: 879
[Tampo]: 20

nmero mdio de pratos tericos ( = 0,05).

Fator
E
s
t
i
m
a
t
i
v
a

d
o

e
f
e
i
t
o
-0,5
-0,4
-0,3
-0,2
-0,1
0,0
0,1
Temp. da coluna: -0,2131
Vazo: -0,2373
% B: -0,2403
pH: -0,2372
[Tampo]: -0,2127

Figura 6.16 Grfico da estimativa do efeito provocado pela mudana de nvel de cada fator sobre a
funo de resposta cromatogrfica ( = 0,05).

Resultados

207

A tabela 6.15 resume a influncia dos fatores investigados sobre as respostas
de interesse, ainda pressupondo que as interaes entre os fatores no so
significativas.

Tabela 6.15 Resumo da influncia dos fatores investigados sobre as respostas de interesse.

Fator
Resposta
t
R2
1
k
2
1

2
R
s
2
N
M
FRC
T
c
-
F -
% B - -
pH do tampo -
[Tampo] - - -

, aumento; , diminuio.
1
Respostas relacionadas ao tempo de corrida;
2
respostas relacionadas
separao entre os enantimeros.

O emprego do planejamento fatorial fracionrio , no entanto, confunde os
efeitos principais com as interaes entre os fatores e no h garantias de que estas
sejam insignificantes. Portanto, para a adequada interpretao dos resultados j
apresentados, os padres de confundimento relacionados aos efeitos principais, de
acordo com o planejamento empregado, so apresentados na tabela 6.16.
2 5
2

III

Tabela 6.16 Relao entre os contrastes da frao e os efeitos do fatorial
completo 2
5
.
2 5
2

III

Padres de confundimento
l
I
Mdia + ABDE - (ACE + BCD)
l
A
A + BDE - (CE + ABCD)
l
B
B + ADE - (CD + ABCE)
l
C
C + ABCDE - (AE + BD)
l
D
D + ABE - (BC + ACDE)
l
E
E + ABD - (AC + BCDE)
l
AB
AB + DE - (ACD + BCE)
l
AD
AD + BE - (ABC + CDE)

l, contraste.

Resultados

208

Resultados
6.2.3 PLANEJAMENTO COMPOSTO CENTRAL


As tabelas 6.17, 6.18 e 6.19 apresentam a avaliao dos cromatogramas
obtidos com a realizao dos ensaios previstos no planejamento composto central.
Cada resultado apresentado nessas tabelas representa a mdia entre outros dois
separaes atingidas nas diferentes condies cromatogrficas empregadas em
cada ensaio (quadros 6.3 e 6.4).

Tabela 6.17 Avaliao dos cromatogramas obtidos com a realizao dos ensaios 1 a 8 previstos no planejamento composto central.

Resposta
Ensaio
1 2 3 4 5 6 7 8
Tempo de reteno (no-retido)
1
3,03 3,03 3,03 3,03 3,03 3,03 3,03 3,03
Fator de separao 1,19 1,20 1,22 1,21 1,19 1,18 1,20 1,19
Resoluo 2,34 1,86 2,46 1,82 2,29 1,53 2,24 1,57
rea (1 pico) 1.878.325 1.837.350 1.909.646 1.857.201 1.836.233 1.844.380 1.901.986 1.846.196
rea (2 pico) 1.896.430 1.884.753 1.923.856 1.902.486 1.856.045 1.920.639 1.940.880 1.924.728
rea (mdia) 1.887.377 1.861.051 1.916.751 1.879.843 1.846.139 1.882.509 1.921.433 1.885.462
rea% (1 pico) 49,76% 49,36% 49,82% 49,40% 49,73% 48,99% 49,50% 48,96%
rea% (2 pico) 50,24% 50,64% 50,19% 50,60% 50,27% 51,02% 50,51% 51,04%
Altura (1 pico) 45.083 72.962 49.099 82.228 48.617 79.547 60.326 89.816
Altura (2 pico) 37.210 65.584 39.148 73.129 40.961 73.696 50.489 81.938
Altura (mdia) 41.146 69.273 44.124 77.678 44.789 76.622 55.407 85.877
Largura USP (1 pico) 1,03 0,64 0,96 0,57 0,94 0,59 0,78 0,52
Largura USP (2 pico) 1,25 0,72 1,20 0,65 1,11 0,64 0,93 0,58
Largura USP (mdia) 1,14 0,68 1,08 0,61 1,03 0,62 0,86 0,55
Assimetria - 10% (1 pico) 1,56 1,30 1,71 1,37 1,50 1,30 1,61 1,36
Assimetria - 10% (2 pico) 1,83 1,42 2,04 1,50 1,74 1,35 1,88 1,43
Assimetria - 10% (mdia) 1,70 1,36 1,87 1,43 1,62 1,33 1,74 1,39
CRF 0,2733 0,0078 0,5897 0,0054 0,1958 0,0006 0,1345 0,0008

1
Tempo mdio em que ocorreu o primeiro distrbio na linha de base, considerando-se todos os ensaios.

Tabela 6.18 Avaliao dos cromatogramas obtidos com a realizao dos ensaios 9 a 15.2 previstos no planejamento composto central.

Resposta
Ensaio
9 10 11 12 13 14 15.1 15.2
1
3,03 3,03 3,03 3,03 3,03 3,03 3,03 3,03
Fator de separao 1,20 1,19 1,19 1,21 1,21 1,17 1,19 1,19
Resoluo 2,48 1,45 1,97 2,03 2,27 1,68 2,05 2,00
rea (1 pico) 1.909.291 1.915.389 1.868.499 1.823.827 1.904.063 1.920.230 1.934.049 1.844.545
rea (2 pico) 1.914.092 2.019.511 1.913.713 1.877.543 1.930.674 1.989.725 1.974.011 1.885.781
rea (mdia) 1.911.691 1.967.450 1.891.106 1.850.685 1.917.368 1.954.978 1.954.030 1.865.163
rea% (1 pico) 49,94% 48,68% 49,40% 49,28% 49,65% 49,11% 49,49% 49,45%
rea% (2 pico) 50,06% 51,33% 50,60% 50,73% 50,35% 50,89% 50,51% 50,56%
Altura (1 pico) 39.214 93.939 63.655 76.552 56.665 73.836 65.314 63.334
Altura (2 pico) 31.201 87.594 56.378 66.074 47.593 66.703 56.513 55.392
Altura (mdia) 35.208 90.766 60.016 71.313 52.129 70.269 60.913 59.363
Largura USP (1 pico) 1,19 0,52 0,73 0,60 0,84 0,65 0,74 0,73
Largura USP (2 pico) 1,50 0,57 0,84 0,70 1,00 0,74 0,86 0,84
Largura USP (mdia) 1,34 0,55 0,78 0,65 0,92 0,69 0,80 0,79
Assimetria - 10% (1 pico) 1,78 1,31 1,34 1,47 1,47 1,38 1,42 1,40
Assimetria - 10% (2 pico) 2,13 1,34 1,48 1,66 1,72 1,48 1,61 1,57
Assimetria - 10% (mdia) 1,96 1,32 1,41 1,56 1,60 1,43 1,52 1,49
CRF 0,6306 0,0003 0,0171 0,0282 0,1774 0,0020 0,0325 0,0216

1

Tabela 6.19 Avaliao dos cromatogramas obtidos com a realizao dos ensaios 15.3 a 15.9 previstos no planejamento
composto central.

Resposta
Ensaio
15.3 15.4 15.5 15.6 15.7 15.8 15.9
1
3,03 3,03 3,03 3,03 3,03 3,03 3,03
Tempo de reteno (1 pico) 11,43 10,54 11,08 11,31 11,42 11,45 11,42
Tempo de reteno (2 pico) 13,01 11,94 12,62 12,93 13,06 13,11 13,06
Fator de reteno (2 pico) 3,29 2,94 3,17 3,27 3,31 3,33 3,31
Fator de separao 1,19 1,19 1,19 1,20 1,20 1,20 1,20
Resoluo 1,99 1,86 1,97 2,04 2,05 2,06 2,07
Pratos tericos (1 pico) 3.807 3.605 3.734 3.790 3.801 3.777 3.843
Pratos tericos (2 pico) 3.714 3.558 3.654 3.700 3.713 3.685 3.765
Pratos tericos (mdia) 3.761 3.582 3.694 3.745 3.757 3.731 3.804
rea (1 pico) 1.928.581 1.822.544 1.896.130 1.944.462 1.891.093 1.903.110 1.834.952
rea (2 pico) 1.973.400 1.878.793 1.936.414 1.985.744 1.934.044 1.947.015 1.876.662
rea (mdia) 1.950.990 1.850.668 1.916.272 1.965.103 1.912.568 1.925.062 1.855.807
rea% (1 pico) 49,43% 49,24% 49,48% 49,48% 49,44% 49,43% 49,44%
rea% (2 pico) 50,58% 50,76% 50,53% 50,53% 50,56% 50,57% 50,56%
Altura (1 pico) 65.273 65.101 65.475 66.041 64.085 63.918 62.469
Altura (2 pico) 57.020 57.708 57.180 57.506 55.494 55.468 54.155
Altura (mdia) 61.146 61.404 61.328 61.774 59.789 59.693 58.312
Largura USP (1 pico) 0,74 0,70 0,73 0,73 0,74 0,75 0,74
Largura USP (2 pico) 0,86 0,80 0,84 0,85 0,86 0,87 0,85
Largura USP (mdia) 0,80 0,75 0,78 0,79 0,80 0,81 0,80
Assimetria - 10% (1 pico) 1,42 1,41 1,41 1,41 1,43 1,41 1,40
Assimetria - 10% (2 pico) 1,60 1,56 1,59 1,58 1,62 1,60 1,59
Assimetria - 10% (mdia) 1,51 1,48 1,50 1,50 1,52 1,50 1,50
CRF 0,0203 0,0078 0,0179 0,0309 0,0331 0,0353 0,0376

1

212

Resultados

Minutes
0,0 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 20,0 22,5 25,0 27,5 30,0
m
A
U
0
10
20
30
40
50
Ensaio 1
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16
m
A
U
0
20
40
60
80
Ensaio 2
Minutes
0,0 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 20,0 22,5 25,0 27,5 30,0
m
U
A

m
U
A

Minutos Minutos
50
m
A
U
0
10
20
30
40
Ensaio 3
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16
m
A
U
0
20
40
60
80
Ensaio 4
Minutes
0,0 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 20,0 22,5 25,0 27,5 30,0
m
A
U
0
10
20
30
40
50
Ensaio 5
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16
m
A
U
0
20
40
60
80
Ensaio 6
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
m
A
U
0
10
20
30
40
50
60
Ensaio 7
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16
m
A
U
0
20
40
60
80
100
Ensaio 8
m
U
A

m
U
A

Minutos Minutos
m
U
A

m
U
A

Minutos Minutos
m
U
A

m
U
A

Minutos Minutos

composto central Ensaios 1 a 8 Fase mvel = tampo HCO
2
NH
4
50 mM:metanol; F = 1,0 mL.min
-1

(Ensaio 1: % B = 42,9%, pH do tampo = 3,40, T
c
= 14 C; ensaio 2: % B = 51,1%, pH do tampo =
3,40, T
c
= 14 C; ensaio 3: % B = 42,9%, pH do tampo = 4,40, T
c
= 14 C; ensaio 4: % B = 51,1%,
pH do tampo = 4,40, T
c
c
= 20 C; ensaio 6:
% B = 51,1%, pH do tampo = 3,40, T
c
c
=
20 C; ensaio 8: % B = 51,1%, pH do tampo = 4,40, T
c
= 20 C).

213

Minutes
0,0 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 20,0 22,5 25,0 27,5 30,0 32,5 35,0
m
A
U
0
10
20
30
40
Ensaio 9
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
m
A
U
0
20
40
60
80
100
Ensaio 10
m
U
A

m
U
A

Minutos Minutos
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
m
A
U
0
10
20
30
40
50
60
70
Ensaio 11
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
m
A
U
0
20
40
60
80
Ensaio 12
m
U
A

m
U
A

Minutos Minutos
80
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
m
A
U
0
10
20
30
40
50
60
Ensaio 13
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
m
A
U
0
20
40
60
Ensaio 14
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
m
A
U
0
10
20
30
40
50
60
70
Ensaio 15.1

m
U
A

m
U
A

Minutos Minutos
m
U
A

Minutos

composto central Ensaios 9 a 15.1 Fase mvel = tampo HCO
2
NH
4
50 mM:metanol; F = 1,0
mL.min
-1
(Ensaio 9: % B = 40,1%, pH do tampo = 3,90, T
c
= 17 C; ensaio 10: % B = 53,9%, pH do
tampo = 3,90, T
c
c
= 17 C; ensaio 12: %
B = 47,0%, pH do tampo = 4,74, T
c
c
= 12
C; ensaio 14: % B = 47,0%, pH do tampo = 3,90, T
c
= 22 C; ensaio 15.1: % B = 47,0%, pH do
tampo = 3,90, T
c
= 17 C).

Resultados

214

6.2.3.2 CONSTRUO DOS MODELOS MATEMTICOS

Partindo-se dos dados obtidos com a realizao dos ensaios previstos no
planejamento composto central, foram construdos modelos matemticos lineares e
quadrticos, na tentativa de se descrever a relao existente entre as variveis
independentes estudadas e as respostas de interesse. As equaes matemticas
obtidas seguem a forma geral descrita no subitem 5.2.2.5. Os intervalos de
confiana calculados para os parmetros dessas equaes so apresentados na
tabela 6.20 (o nvel de significncia adotado corresponde a 0,05).

Tabela 6.20 Intervalos de confiana calculados para os parmetros das equaes que descrevem
os modelos lineares e quadrticos, apresentados em funo das respostas s quais esses modelos
se aplicam.

Modelo
Resposta
FRC R
s
t
R2

Linear
0
= -0,100 0,005 -2,004 0,031 -13,214 0,182
1
= -0,164 0,006 -0,313 0,041 0-4,168 0,236
2
= -0,020 0,006 -0,014 0,041 0-0,739 0,236
3
= -0,061 0,006 -0,135 0,041 0-1,021 0,236

Quadrtico
0
= -0,026 0,008 -2,010 0,050 -12,844 0,290
1
= -0,164 0,006 -0,313 0,041 0-4,168 0,236
2
= -0,020 0,006 -0,014 0,041 0-0,739 0,236
3
= -0,061 0,006 -0,135 0,041 0-1,021 0,236
12
= -0,032 0,008 -0,009 0,053 -00,362 0,308
13
= -0,065 0,008 -0,039 0,053 -00,327 0,308
23
= -0,047 0,008 -0,010 0,053 0-0,136 0,308
11
= -0,102 0,006 -0,009 0,038 -00,956 0,218
22
= -0,001 0,006 -0,003 0,038 0-0,385 0,218
33
= -0,023 0,006 -0,005 0,038 -00,052 0,218

Os valores em negrito indicam parmetros significativos em um nvel de significncia igual a 0,05.

Foram excludos dos modelos originais os termos cujos parmetros no se
mostraram estatisticamente diferentes de zero. Posteriormente, os parmetros
restantes foram recalculados, de tal modo que os modelos finais obtidos so
descritos conforme as equaes a seguir:
Resultados

215

Resposta: funo de resposta cromatogrfica.

Modelo linear: FRC = 0,100 - 0,164
1
+ 0,020
2
- 0,061
3

Modelo quadrtico: FRC = 0,026 - 0,164
1
+ 0,020
2
- 0,061
3
-
0,032
1
2
+ 0,065
1
3
- 0,047
2
3
+ 0,102
1
2
+ 0,023
3
2

Resposta: resoluo entre os picos.

Modelo linear: R
s
= 2,004 - 0,313
1
- 0,135
3

Modelo quadrtico: excludos os termos cujos parmetros no so
estatisticamente significantes, o modelo quadrtico fica reduzido a um
modelo linear.

Resposta: tempo de reteno referente ao segundo pico.

Modelo linear: t
R2
= 13,214 - 4,168
1
- 0,739
2
- 1,021
3

Modelo quadrtico: t
R2
= 12,875 - 4,168
1
- 0,739
2
- 1,021
3
+
0,362
1
2
+ 0,327
1
3
+ 0,956
1
2
- 0,385
2
2

6.2.3.3 AVALIAO DO GRAU DE AJUSTE DOS MODELOS

A seguir, so apresentados o grfico de distribuio dos resduos e a anlise
da varincia (ANOVA) referentes a cada modelo.

Resultados

216

Resposta: funo de resposta cromatogrfica modelo linear.

-0,3
0,0
0,3
0 5 10 15 20 25
Ensaio
R
e
s
d
u
o
Figura 6.17 Grfico da distribuio dos resduos deixados pelo modelo linear para FRC = f(
1
,
2
,
3
).

Tabela 6.21 Anlise da varincia do modelo linear para FRC = f(
1
,
2
,
3
).

Fonte de variao Soma quadrtica v Mdia quadrtica
Regresso 0,424 03 0,141
Resduos 0,262 19 0,014
Falta de ajuste 0,261 11 0,024
Erro puro 0,001 08 0,000
Total 0,686 22
% de variao explicada: 61,80%
% mxima de variao explicvel: 99,89%
MQ
R
/MQ
r
= 10,25 MQ
faj
/MQ
ep
= 242,17
F
3
,
19
= 03,13 F
11
,
8
= 003,31
(MQ
R
/MQ
r
)/F
3
,
19
= 03,28 (MQ
faj
/MQ
ep
)/F
11
,
8
= 073,10

v, graus de liberdade; MQ
R
, mdia quadrtica devida regresso; MQ
r
, mdia quadrtica residual;
MQ
faj
, mdia quadrtica devida falta de ajuste; MQ
ep
, mdia quadrtica devida ao erro puro. As
estatsticas F foram calculadas em um nvel de significncia igual a 0,05.

Resultados

217

Resposta: funo de resposta cromatogrfica modelo quadrtico.

-0,3
0,0
0,3
0 5 10 15 20 25
Ensaio
R
e
s
d
u
o
Figura 6.18 Grfico da distribuio dos resduos deixados pelo modelo quadrtico para FRC = f(
1
,
2
,
3
).

Tabela 6.22 Anlise da varincia do modelo quadrtico para FRC = f(
1
,
2
,
3
).

Regresso 0,658 08 0,082
Resduos 0,028 14 0,002
Erro puro 0,001 08 0,000
Total 0,686 22
MQ
R
/MQ
r
= 41,58 MQ
faj
/MQ
ep
= 45,74
F
8
,
14
= 02,70 F
6
,
8
= 03,58
(MQ
R
/MQ
r
)/F
8
,
14
= 15,41 (MQ
faj
/MQ
ep
)/F
6
,
8
= 12,77

R
r
MQ
faj
ep

Resultados

218

Resposta: resoluo entre os picos modelo linear.

-0,3
0,0
0,3
0 5 10 15 20 25
Ensaio
R
e
s
d
u
o
Figura 6.19 Grfico da distribuio dos resduos deixados pelo modelo linear para R
s
= f(
1
,
3
).

Tabela 6.23 Anlise da varincia do modelo linear para R
s
= f(
1
,
3
).

Regresso 1,593 02 0,796
Resduos 0,082 20 0,004
Erro puro 0,034 08 0,004
Total 1,674 22
MQ
R
/MQ
r
= 195,14 MQ
faj
/MQ
ep
= 0,92
F
2
,
20
= 003,49 F
12
,
8
= 3,28
(MQ
R
/MQ
r
)/F
2
,
20
= 055,87 (MQ
faj
/MQ
ep
)/F
12
,
8
= 0,28

R
r
MQ
faj
ep

Resultados

219

Resposta: tempo de reteno referente ao segundo pico modelo linear.

-3,5
0,0
3,5
0 5 10 15 20 25
Ensaio
R
e
s
d
u
o

/

m
i
n
Figura 6.20 Grfico da distribuio dos resduos deixados pelo modelo linear para t
R2
= f(
1
,
2
,
3
).

Tabela 6.24 Anlise da varincia do modelo linear para t
R2
= f(
1
,
2
,
3
).

Regresso 258,939 03 86,313
Resduos 021,825 19 01,149
Falta de ajuste 020,685 11 01,880
Erro puro 001,140 08 00,143
Total 280,764 22
MQ
R
/MQ
r
= 75,14 MQ
faj
/MQ
ep
= 13,20
F
3
,
19
= 03,13 F
11
,
8
= 03,31
(MQ
R
/MQ
r
)/F
3
,
19
= 24,03 (MQ
faj
/MQ
ep
)/F
11
,
8
= 03,98

R
r
MQ
faj
ep

Resultados

220

Resposta: tempo de reteno referente ao segundo pico modelo
quadrtico.

-3,5
0,0
3,5
0 5 10 15 20 25
Ensaio
R
e
s
d
u
o

/

m
i
n
Figura 6.21 Grfico da distribuio dos resduos deixados pelo modelo quadrtico para t
R2
= f(
1
,
2
,
3
).

Tabela 6.25 Anlise da varincia do modelo linear para t
R2
= f(
1
,
2
,
3
).

Regresso 277,760 07 39,680
Resduos 002,971 15 00,198
Falta de ajuste 001,831 07 00,262
Erro puro 001,140 08 00,143
Total 280,764 22
MQ
R
/MQ
r
= 200,32 MQ
faj
/MQ
ep
= 1,84
F
7
,
15
= 002,71 F
7
,
8
= 3,50
(MQ
R
/MQ
r
)/F
7
,
15
= 074,01 (MQ
faj
/MQ
ep
)/F
7
,
8
= 0,52

R
r
MQ
faj
ep
Resultados

221

As figuras 6.22 e 6.23 apresentam, respectivamente, o histograma e o grfico
de probabilidade normal dos resduos brutos deixados pelo modelo linear que
descreve a resoluo entre os picos em funo das variveis porcentagem de
metanol na fase mvel (v/v) e temperatura da coluna. As figuras 6.24 e 6.25
apresentam, respectivamente, o histograma e o grfico de probabilidade normal dos
resduos brutos deixados pelo modelo quadrtico que descreve o tempo de reteno
referente ao segundo pico em funo das variveis porcentagem de metanol na fase
mvel (v/v), pH do tampo e temperatura da coluna.

-0,25 -0,20 -0,15 -0,10 -0,05 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25
Categoria
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
F
r
e
q
n
c
i
a
-0,20 -0,15 -0,10 -0,05 0,00 0,05 0,10 0,15
Resduo
-3,0
-2,5
-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
V
a
l
o
r

n
o
r
m
a
l

e
s
p
e
r
a
d
o
,01
,05
,15
,35
,55
,75
,95
,99
Figura 6.22 Histograma dos resduos brutos
deixados pelo modelo linear para R
s
= f(
1
,
3
).
Os resduos so iguais ou menores que o limite
da categoria.
Figura 6.23 Grfico de probabilidade normal
dos resduos brutos deixados pelo modelo
linear para R
s
= f(
1
,
3
).

-1,4 -1,2 -1,0 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4
Categoria
0
1
2
3
4
5
6
7
8
F
r
e
q
u
n
c
i
a
-1,2 -1,0 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8
Resduo
-3,0
-2,5
-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
V
a
l
o
r

n
o
r
m
a
l

e
s
p
e
r
a
d
o
,01
,05
,15
,35
,55
,75
,95
,99
deixados pelo modelo quadrtico para t
R2
=
f(
1
,
2
,
3
). Os resduos so iguais ou
menores que o limite da categoria.
quadrtico para t
R2
= f(
1
,
2
,
3
).
Resultados

222

6.2.3.4 OBTENO DAS SUPERFCIES DE RESPOSTA

Modelo empregado: linear.

2,8
2,6
2,4
2,2
2,0
1,8
1,6
1,4
1,2

Resoluo
3,0
Temp. da coluna / C
% B
38,8
52,2 23,0
11,0
0,6
Figura 6.26 Resoluo em funo da temperatura da coluna e da porcentagem de metanol na fase
mvel (v/v): plano descrito pela equao R
s
= 2,004 - 0,313
1
- 0,135
3
(pH do tampo fixado em
3,90).

2,8
2,6
2,4
2,2
2,0
1,8
1,6
1,4
1,2
38,8 42,9 47,0 51,1 55,2
% B
11,0
14,0
17,0
20,0
23,0
T
e
m
p
.

d
a

c
o
l
u
n
a

/

C

Figura 6.27 Resoluo em funo da temperatura da coluna e da porcentagem de metanol na fase
mvel (v/v): perfil de resposta descrito pela equao R
s
= 2,004 - 0,313
1
- 0,135
3
.

Resultados

223

Modelo empregado: quadrtico.

28
24
20
16
12
8

4
segundo pico / min
38,8
23,0
30
Tempo de reteno
referente ao
Figura 6.28 Tempo de reteno referente ao segundo pico em funo da temperatura da coluna e
da porcentagem de metanol na fase mvel (v/v): superfcie quadrtica descrita pela equao t
R2
=
12,875 - 4,168
1
- 0,739
2
- 1,021
3
+ 0,362
1
2
+ 0,327
1
3
+ 0,956
1
2
- 0,385
2
2
(pH do tampo
fixado em 3,90).

26
22
18
14
10

Temp. da
coluna / C
% B
52,2 11,0
pH do tampo
2
Tempo de reteno
referente ao
segundo pico / min
2,90
4,90
38,8
55,2
28
% B
Figura 6.29 Tempo de reteno referente ao segundo pico em funo do pH do tampo e da
porcentagem de metanol na fase mvel (v/v): superfcie quadrtica descrita pela equao t
R2
=
12,875 - 4,168
1
- 0,739
2
- 1,021
3
+ 0,362
1
2
+ 0,327
1
3
+ 0,956
1
2
- 0,385
2
2
(temperatura da
coluna fixada em 17 C).
Resultados

224

15
14
13
12
11
10
9
Tempo de reteno
referente ao
segundo pico / min
Temp. da
coluna / C
pH do tampo
4,90
2,90
11,0
23,0
9
16

Figura 6.30 Tempo de reteno referente ao segundo pico em funo do pH do tampo e da
temperatura da coluna: superfcie quadrtica descrita pela equao t
R2
= 12,875 - 4,168
1
- 0,739
2
-
1,021
3
+ 0,362
1
2
+ 0,327
1
3
+ 0,956
1
2
- 0,385
2
2
[porcentagem de metanol na fase mvel (v/v)
fixada em 47%].

Resultados

225

6.2.4 DETERMINAO DAS CONDIES TIMAS PARA A SEPARAO

Empregando-se o mtodo proposto por Derringer e Suich, a otimizao
simultnea das respostas R
s
e t
R2
estabeleceu os seguintes nveis para as variveis:

Porcentagem de metanol na fase mvel (v/v): 44,6%;
pH do tampo: 4,74;
Temperatura da coluna: 12 C.

De acordo com os modelos empregados, essas condies corresponderiam a
uma resoluo igual a 2,41 e a um tempo de reteno referente ao segundo pico
igual a 14,98 minutos. As desejabilidades individuais alcanadas para essas
respostas foram 0,4128 e 0,9927, respectivamente, correspondendo a uma
desejabilidade global igual a 0,6401.
Incluindo a molaridade do tampo e a vazo da fase mvel, as condies
cromatogrficas estabelecidas pelo mtodo ento so:

Fase mvel: tampo formato de amnio (50 mM, pH 4,74):metanol
55,4:44,6 (v/v);
Vazo da fase mvel: 1,0 mL.min
-1
;

Resultados

226


6.3.1 INVESTIGAO DA SELETIVIDADE DE DIFERENTES MODIFICADORES ORGNICOS

Em conjunto, os quadros 6.5 e 6.6 apresentam cromatogramas que
exemplificam as separaes atingidas nas diferentes condies cromatogrficas
representadas pelos ensaios 1 a 16.
A tabela 6.26, por sua vez, apresenta a avaliao dos cromatogramas obtidos
com a realizao dos ensaios 17 a 20 (os quais correspondem investigao da
seletividade dos diferentes alcois empregados na presente etapa). Cada resultado
apresentado nessa tabela representa a mdia entre outros dois resultados obtidos
atravs da injeo em duplicata da amostra.
Aps a tabela 6.26, so apresentados cromatogramas que exemplificam as
separaes atingidas nas diferentes condies cromatogrficas representadas pelos
ensaios 17 a 20 (quadro 6.7).

Resultados

227

Minutes
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
m
A
U
0
10
20
30
40
50
Ensaio 1
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
m
A
U
0
20
40
60
80
Ensaio 2
m
U
A

m
U
A

Minutos Minutos
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
m
A
U
-5
0
5
10
15
20
25
Ensaio 3
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16
m
A
U
0
50
100
150
200
Ensaio 4
m
U
A

m
U
A

Minutos Minutos
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
m
A
U
0
20
40
60
80
100
120
Ensaio 5
Minutes
0,0 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 20,0 22,5 25,0 27,5 30,0
m
A
U
0
20
40
60
80
Ensaio 6
m
U
A

m
U
A

Minutos Minutos
800 1200
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
m
A
U
0
200
400
600
800
1000
Ensaio 7
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
m
A
U
0
200
400
600
Ensaio 8
m
U
A

m
U
A

Minutos Minutos

Quadro 6.5 Separao dos enantimeros do fenoprofeno por CLAE em fase normal: investigao
da seletividade de diferentes modificadores orgnicos Ensaios 1 a 8 F = 1,0 mL.min
-1
; T
c
= 24 C
[Ensaio 1: fase mvel = hexano:cido actico 100:0,5; ensaio 2: fase mvel = hexano:
(diclorometano:cido actico 100:1) 60:40; ensaio 3: fase mvel = hexano:(diclorometano:cido
actico 100:1) 80:20; ensaio 4: fase mvel = hexano:(acetato de etila:cido actico 100:5) 90:10;
ensaio 5: fase mvel = hexano:(acetato de etila:cido actico 100:5) 95:5; ensaio 6: fase mvel =
hexano:(acetato de etila:cido actico 100:5) 98:2; ensaio 7: fase mvel = hexano:(dioxano:cido
actico 100:5) 90:10; ensaio 8: fase mvel = hexano:(dioxano:cido actico 100:5) 95:5].
Resultados

228

Resultados

0,0 2,5 5,0 7,
Minutes
5 10,0 12,5 15,0 17,5 20,0 22,5 25,0 27,5 30,0
m
A
U
0
100
200
300
400
Ensaio 9
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
m
A
U
0
200
400
600
800
Ensaio 10
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
m
A
U
0
100
200
300
400
Ensaio 11
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
m
A
U
0
50
100
150
200
Ensaio 12
m
U
A

m
U
A

Minutos Minutos
m
U
A

m
U
A

Minutos Minutos
12,5
0 1 2
Minutes
3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
m
A
U
-5,0
-2,5
0,0
2,5
5,0
7,5
10,0
Ensaio 13
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
m
A
U
-1
0
1
2
3
4
Ensaio 14
m
U
A

m
U
A

Minutos Minutos
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16
m
A
U
-30
-20
-10
0
10
20
Ensaio 15
Minutes
0,0 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 20,0 22,5 25,0 27,5 30,0
m
A
U
-15
-10
-5
0
5
10
Ensaio 16
m
U
A

m
U
A

Minutos Minutos

-1
; T
c
= 24 C
[Ensaio 9: fase mvel = hexano:(dioxano:cido actico 100:5) 98:2; ensaio 10: fase mvel =
hexano:(2-propanol:cido actico 100:5) 90:10; ensaio 11: fase mvel = hexano:(2-propanol:cido
actico 100:5) 95:5; ensaio 12: fase mvel = hexano:(2-propanol:cido actico 100:5) 98:2; ensaio
13: fase mvel = hexano:(diclorometano:cido actico 100:1) 60:40; ensaio 14: fase mvel =
hexano:(diclorometano:cido actico 100:1) 80:20; ensaio 15: fase mvel = hexano:(1,2-
dicloroetano:cido actico 100:0,5) 60:40; ensaio 16: fase mvel = hexano:(1,2-dicloroetano:cido
actico 100:0,5) 80:20].

229

Tabela 6.26 Avaliao dos cromatogramas obtidos com a realizao dos ensaios 17 a 20, durante a
investigao da seletividade de diferentes alcois.

Resposta
Ensaio
17 18 19 20
1
2,65 2,65 2,65 2,65
Tempo de reteno (1 pico) 9,14 8,14 7,48 8,28
Tempo de reteno (2 pico) 9,99 9,12 8,27 9,29
Fator de reteno (2 pico) 2,78 2,45 2,13 2,51
Fator de separao 1,13 1,18 1,16 1,18
Resoluo 2,53 3,44 3,12 3,41
Pratos tericos (1 pico) 16.943 15.103 14.393 14.490
Pratos tericos (2 pico) 10.535 14.172 16.454 13.337
Pratos tericos (mdia) 13.739 14.638 15.423 13.913
rea (1 pico) 372.339 379.455 099.796 091.190
rea (2 pico) 385.951 387.133 101.481 091.132
rea (mdia) 379.145 383.294 100.638 091.161
rea% (1 pico) 49,11% 49,50% 49,58% 50,02%
rea% (2 pico) 50,90% 50,50% 50,42% 49,99%
Altura (1 pico) 30.185 32.974 09.580 07.632
Altura (2 pico) 23.203 28.482 09.012 06.455
Altura (mdia) 26.694 30.728 09.296 07.043
Largura USP (1 pico) 0,28 0,26 0,25 0,28
Largura USP (2 pico) 0,39 0,31 0,26 0,32
Largura USP (mdia) 0,34 0,29 0,26 0,30
Assimetria - 10% (1 pico) 1,34 1,39 1,35 1,40
Assimetria - 10% (2 pico) 1,19 1,41 1,35 1,37
Assimetria - 10% (mdia) 1,27 1,40 1,35 1,38

1
Calculado de acordo com as seguintes frmulas: t
M
= V
M
/F e V
M
0,5.L.d
c
2
, onde t
M
corresponde
ao tempo de reteno de um composto no-retido, V
M
corresponde ao volume intersticial da coluna e
L e d
c
correspondem ao comprimento e ao dimetro interno da coluna, respectivamente.

Resultados

230

Resultados

0 2
Minutes
4 6 8 10 12 14 16
m
A
U
0
5
10
15
20
25
30
35
Ensaio 17
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16
m
A
U
0
10
20
30
40
Ensaio 18
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
m
A
U
-2
0
2
4
6
8
10
Ensaio 19
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
m
A
U
0
2
4
6
8
Ensaio 20
m
U
A

m
U
A

Minutos Minutos
m
U
A

m
U
A

Minutos Minutos

-1
; T
c
= 24
C (Ensaio 17: fase mvel = hexano:etanol:cido actico 99:1:0,5; ensaio 18: fase mvel = hexano:2-
propanol:cido actico 99:1:0,5; ensaio 19: fase mvel = hexano:1-butanol:cido actico 99:1:0,5;
ensaio 20: fase mvel = hexano:2-butanol:cido actico 99:1:0,5).

6.3.2 OTIMIZAO DA VAZO DA FASE MVEL

A tabela 6.27 apresenta a avaliao dos cromatogramas obtidos com a
realizao dos ensaios 21 a 25. Cada resultado apresentado nessa tabela
representa a mdia entre outros dois resultados obtidos atravs da injeo em
duplicata da amostra.
A tabela 6.28, por sua vez, apresenta a avaliao do efeito observado sobre a
resoluo e sobre o tempo de reteno referente ao segundo pico, quando da
diminuio da vazo da fase mvel. Anlise semelhante apresentada sob a forma
de um grfico de barras na figura 6.31.

231

Aps a figura 6.31, so apresentados cromatogramas que exemplificam as

otimizao da vazo da fase mvel.

Resposta
Ensaio
21 22 23 24 25
1
2,65 2,94 3,31 3,78 4,41
Tempo de reteno (1 pico) 8,14 9,51 10,81 12,37 14,47
Fator de reteno (2 pico) 2,45 2,43 2,67 2,68 2,69
Fator de separao 1,18 1,18 1,18 1,18 1,18
Resoluo 3,44 3,55 3,60 3,64 3,65
Pratos tericos (1 pico) 15.103 16.114 16.412 16.193 16.240
Pratos tericos (mdia) 14.638 15.454 15.768 15.870 15.937
rea (1 pico) 0.379.455 0.423.029 0.480.123 0.552.042 0.643.555
rea (2 pico) 0.387.133 0.422.506 0.480.130 0.553.884 0.643.345
rea (mdia) 0.383.294 0.422.767 0.480.126 0.552.963 0.643.450
rea% (1 pico) 49,50% 50,03% 50,00% 49,92% 50,01%
rea% (2 pico) 50,50% 49,97% 50,00% 50,09% 49,99%
Altura (1 pico) 32.974 32.009 32.274 32.371 32.480
Altura (2 pico) 28.482 27.310 27.741 28.282 28.313
Altura (mdia) 30.728 29.659 30.007 30.327 30.397
Largura USP (1 pico) 0,26 0,30 0,34 0,39 0,46
Largura USP (2 pico) 0,31 0,35 0,39 0,45 0,52
Largura USP (mdia) 0,29 0,33 0,37 0,42 0,49
Assimetria - 10% (1 pico) 1,39 1,37 1,36 1,37 1,36
Assimetria - 10% (2 pico) 1,41 1,37 1,37 1,37 1,37
Assimetria - 10% (mdia) 1,40 1,37 1,37 1,37 1,36

1
M
= V
M
/F e V
M
0,5.L.d
c
2
, onde t
M
corresponde
M
L e d
c

Resultados

232

Tabela 6.28 Avaliao do efeito observado sobre a resoluo e sobre o tempo de reteno
referente ao segundo pico, quando da diminuio da vazo da fase mvel.

Ensaio Vazo da fase mvel
1
R
s
(A1) t
R2
(A2) Razo A2/A1
21 1,0 - - -
22 0,9 3,09 (0,00) 16,91 (00,00) 05,47
23 0,8 1,52 (4,66) 13,71 (32,94) 08,99
24 0,7 1,06 (5,77) 14,55 (52,28) 13,74
25 0,6 0,39 (6,19) 16,96 (78,11) 42,99

R
s
,

aumento da resoluo (em %); t
R2
, aumento do tempo de reteno referente ao segundo
pico (em %).
1
Em mL.min
-1
. Todos os aumentos foram calculados em relao ao ensaio
imediatamente anterior; os valores entre parntesis, contudo, expressam os aumentos quando
calculados em relao ao ensaio 21.

0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
0,9
0,8
0,7
0,6
Aumento da resoluo / % (A1)
Aumento do tempo de reteno
referente ao segundo pico / % (A2)
Razo entre A2 e A1

Vazo da fase mvel / mL.min
-1

Figura 6.31 Avaliao do efeito observado sobre a resoluo e sobre o tempo de reteno referente
ao segundo pico, quando da diminuio da vazo da fase mvel. Os aumentos foram calculados em
relao ao ensaio imediatamente anterior.

Resultados

233

Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16
m
A
U
0
10
20
30
Ensaio 21
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16
m
A
U
0
10
20
30
Ensaio 22
m
U
A

m
U
A

Minutos Minutos
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
m
A
U
0
10
20
30
Ensaio 23
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
m
A
U
0
10
20
30
Ensaio 24
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
m
A
U
0
10
20
30
Ensaio 25

m
U
A

m
U
A

Minutos Minutos
m
U
A

Minutos

Quadro 6.8 Separao dos enantimeros do fenoprofeno por CLAE em fase normal: otimizao da
vazo da fase mvel Ensaios 21 a 25 Fase mvel = hexano:2-propanol:cido actico 99:1:0,5; T
c

= 24 C (Ensaio 21: F = 1,0 mL.min
-1
; ensaio 22: F = 0,9 mL.min
-1
-1
;
ensaio 24: F = 0,7 mL.min
-1
-1
).

6.3.3 OTIMIZAO DA TEMPERATURA DA COLUNA

Resultados

234

diminuio da temperatura da coluna. A mesma anlise apresentada sob a forma
de um grfico de barras na figura 6.32.

otimizao da temperatura da coluna.
Resposta
Ensaio
26 27 28 29 30
1
3,78 3,78 3,78 3,78 3,78
Fator de separao 1,18 1,19 1,19 1,20 1,21
Resoluo 3,70 3,85 3,96 4,12 4,36
rea (1 pico) 0.591.028 0.595.033 0.599.220 0.600.407 0.602.538
rea (2 pico) 0.598.285 0.605.620 0.603.773 0.608.540 0.610.171
rea (mdia) 0.594.656 0.600.326 0.601.496 0.604.473 0.606.354
rea% (1 pico) 49,70% 49,56% 49,82% 49,67% 49,69%
rea% (2 pico) 50,31% 50,44% 50,19% 50,33% 50,32%
Altura (1 pico) 35.649 35.596 35.421 34.929 34.591
Altura (2 pico) 30.825 30.391 30.401 29.795 29.289
Altura (mdia) 33.237 32.993 32.911 32.362 31.940
Largura USP (1 pico) 0,38 0,38 0,39 0,39 0,39
Largura USP (2 pico) 0,44 0,45 0,45 0,46 0,47
Largura USP (mdia) 0,41 0,42 0,42 0,43 0,43
Assimetria - 10% (1 pico) 1,41 1,39 1,38 1,39 1,40
Assimetria - 10% (2 pico) 1,43 1,41 1,41 1,42 1,43
Assimetria - 10% (mdia) 1,42 1,40 1,39 1,40 1,41

1
M
= V
M
/F e V
M
0,5.L.d
c
2
, onde t
M
corresponde
M
L e d
c
Resultados

235

referente ao segundo pico, quando da diminuio da temperatura da coluna.

Ensaio
Temperatura da
Coluna
1

R
s
(A1) t
R2
(A2) Razo A1/A2
26 24 - - -
27 21 04,11 2,07 1,99
28 18 07,07 3,38 2,09
29 15 11,60 4,69 2,47
30 12 18,01 6,34 2,84

R
s
,

R2
pico (em %).
1
Em C. Todos os aumentos foram calculados em relao ao ensaio 26.

0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
21
18
15
12
Razo entre A1 e A2

Temperatura da coluna / C

ao segundo pico, quando da diminuio da temperatura da coluna. Todos os aumentos foram
calculados em relao ao ensaio 26.

Resultados

236

Resultados

Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
m
A
U
0
10
20
30
40
Ensaio 26
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
m
A
U
0
10
20
30
40
Ensaio 27
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
m
A
U
0
10
20
30
40
Ensaio 28
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
m
A
U
0
10
20
30
40
Ensaio 29
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
m
A
U
0
10
20
30
40
Ensaio 30

m
U
A

m
U
A

Minutos Minutos
m
U
A

m
U
A

Minutos Minutos
m
U
A

Minutos

temperatura da coluna Ensaios 26 a 30 Fase mvel = hexano:2-propanol:cido actico 99:1:0,5; F
= 0,7 mL.min
-1
(Ensaio 26: T
c
= 24 C; ensaio 27: T
c
c
c
=
15 C; ensaio 30: T
c
= 12 C).

6.3.4 OTIMIZAO DA QUANTIDADE DE CIDO ACTICO EMPREGADA NA FASE MVEL


237

diminuio da quantidade de cido actico empregada na fase mvel. A mesma
anlise apresentada sob a forma de um grfico de barras na figura 6.33.

otimizao da quantidade de cido actico empregada na fase mvel.
Resposta
Ensaio
31 32 33 34 35
1
3,78 3,78 3,78 3,78 3,78
Fator de separao 1,23 1,23 1,25 1,27 1,37
Resoluo 4,75 4,84 5,29 5,77 5,90
rea (1 pico) 0.577.643 0.556.895 0.574.609 0.822.134 0.414.864
rea (2 pico) 0.580.316 0.558.311 0.574.195 0.803.933 0.400.690
rea (mdia) 0.578.980 0.557.603 0.574.402 0.813.034 0.407.777
rea% (1 pico) 49,89% 49,95% 50,02% 50,56% 50,87%
rea% (2 pico) 50,12% 50,05% 49,98% 49,44% 49,13%
Altura (1 pico) 32.898 30.082 29.687 40.515 26.026
Altura (2 pico) 27.408 25.229 24.371 32.769 20.606
Altura (mdia) 30.153 27.655 27.029 36.642 23.316
Largura USP (1 pico) 0,40 0,42 0,44 0,46 0,35
Largura USP (2 pico) 0,48 0,50 0,53 0,56 0,43
Largura USP (mdia) 0,44 0,46 0,49 0,51 0,39
Assimetria - 10% (1 pico) 1,45 1,43 1,44 1,43 1,53
Assimetria - 10% (2 pico) 1,46 1,43 1,47 1,49 1,52
Assimetria - 10% (mdia) 1,45 1,43 1,45 1,46 1,52

1
M
= V
M
/F e V
M
0,5.L.d
c
2
, onde t
M
corresponde
M
L e d
c
Resultados

238

referente ao segundo pico, quando da diminuio da quantidade de cido actico empregada na fase
mvel.

Ensaio
Proporo entre os
componentes da fase
mvel
1

R
s
(A1) t
R2
(A2) Razo A1/A2
31 99:1:0,5 - - -
32 99:1:0,4 01,79 -05,34 0,34
33 99:1:0,3 11,36 -11,11 1,02
34 99:1:0,2 21,27 -18,07 1,18
35 99:1:0,1 24,09 -16,21 -

R
s
,

R2
pico (em %).
1
Em v/v/v (os componentes da fase mvel so: hexano:2-propanol:cido actico, nessa
ordem). Todos os aumentos foram calculados em relao ao ensaio 31.

-20
-15
-10
-5
0
5
10
15
20
25
99:1:0,4
99:1:0,3
99:1:0,2
99:1:0,1
Razo entre A1 e A2

Proporo entre os componentes
da fase mvel / v/v/v

ao segundo pico, quando da diminuio da quantidade de cido actico empregada na fase mvel.
Todos os aumentos foram calculados em relao ao ensaio 31.

Resultados

239

0 2
Minutes
4 6 8 10 12 14 16 18 20
m
A
U
0
5
10
15
20
25
30
35
Ensaio 31
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
m
A
U
0
5
10
15
20
25
30
Ensaio 32
m
U
A

m
U
A

Minutos Minutos
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
m
A
U
0
5
10
15
20
25
30
Ensaio 33
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
m
A
U
0
10
20
30
40
Ensaio 34
m
U
A

m
U
A

Minutos Minutos
30
Minutes
0 2
4
4 6 8 10 12 14 16 18 20
m
A
U
0
5
10
15
20
25
Ensaio 35
Minutes
0 5 10 15 20 25 30 35 40
m
A
U
0
1
2
3
Ensaio 36
m
U
A

m
U
A

Minutos Minutos

quantidade de cido actico empregada na fase mvel Ensaios 31 a 36 F = 0,7 mL.min
-1
; T
c
= 12
C (Ensaio 31: fase mvel = hexano:2-propanol:cido actico 99:1:0,5; ensaio 32: fase mvel =
hexano:2-propanol:cido actico 99:1:0,4; ensaio 33: fase mvel = hexano:2-propanol:cido actico
99:1:0,3; ensaio 34: fase mvel = hexano:2-propanol:cido actico 99:1:0,2; ensaio 35: fase mvel =
hexano:2-propanol:cido actico 99:1:0,1; ensaio 36: fase mvel = hexano:2-propanol 99:1).

Resultados

240


Por meio da anlise dos dados gerados durante as diversas etapas de
desenvolvimento e otimizao do mtodo, as seguintes condies cromatogrficas
foram estabelecidas:

Fase mvel: hexano:2-propanol:cido actico 99:1:0,2 v/v/v;
-1
;

A figura 6.34 apresenta uma ampliao do cromatograma correspondente ao
ensaio 34 (j apresentado no quadro 6.10). As condies cromatogrficas
posteriormente estabelecidas para o mtodo foram as mesmas empregadas nesse
ensaio.

Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
m
A
U
0
10
20
30
40

m
U
A

Minutos
Figura 6.34 Cromatograma representativo das separaes alcanadas com o emprego das
condies cromatogrficas estabelecidas para o mtodo.
Resultados

241

Resultados

6.4.1 AVALIAO DOS CROMATOGRAMAS OBTIDOS

A tabela 6.33 apresenta a avaliao dos cromatogramas obtidos durante a
tentativa de desenvolvimento do mtodo. Cada resultado apresentado nessa tabela
(quadros 6.11 e 6.12).

Tabela 6.33 Avaliao dos cromatogramas.

Resposta
Ensaio
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
1
2,65 2,65 2,65 2,65 2,65 2,65 2,65 2,65 2,65 2,65 2,65
Tempo de reteno (1 pico) 5,00 14,17 14,03 16,41 8,64 19,45 7,33 9,42 10,41 11,73 13,61
Tempo de reteno (2 pico) 5,16 15,02 15,10 17,81 8,83 20,64 7,94 10,50 11,62 13,09 15,19
Fator de reteno (2 pico) 0,95 4,68 4,71 5,73 2,34 6,80 2,00 2,97 3,39 3,95 4,74
Fator de separao 1,07 1,07 1,09 1,10 1,03 1,07 1,13 1,16 1,16 1,15 1,14
Resoluo 0,40 0,93 1,19 1,31 0,30 1,01 1,27 1,45 1,50 1,53 1,59
Pratos tericos (1 pico) 2.919 4.655 4.642 4.354 2.456 5.088 4.345 3.076 3.253 3.394 3.629
Pratos tericos (2 pico) 2.549 3.572 3.978 3.916 3.391 4.174 3.706 2.648 2.795 2.912 3.103
Pratos tericos (mdia) 2.734 4.113 4.310 4.135 2.923 4.631 4.025 2.862 3.024 3.153 3.366
rea (1 pico) 13.187.900 3.226.104 3.379.255 3.510.340 2.708.518 3.432.820 3.342.529 3.422.130 3.790.759 4.285.796 4.911.655
rea (2 pico) 21.561.607 4.048.400 3.823.144 3.853.582 4.877.353 4.072.974 3.746.187 3.644.394 4.020.113 4.528.139 5.182.285
rea (mdia) 17.374.753 3.637.252 3.601.199 3.681.961 3.792.935 3.752.897 3.544.358 3.533.262 3.905.436 4.406.968 5.046.970
rea% (1 pico) 37,96% 44,35% 46,92% 47,67% 35,71% 45,74% 47,16% 48,43% 48,53% 48,63% 48,66%
rea% (2 pico) 62,05% 55,65% 53,08% 52,33% 64,29% 54,26% 52,85% 51,58% 51,47% 51,37% 51,34%
Altura (1 pico) 1.587.155 107.319 106.437 90.004 244.921 83.596 194.040 128.468 130.874 133.426 135.648
Altura (2 pico) 1.768.898 99.851 97.261 81.776 280.752 79.756 172.870 108.978 111.411 113.252 114.323
Altura (mdia) 1.678.027 103.585 101.849 85.890 262.837 81.676 183.455 118.723 121.143 123.339 124.986
Largura USP (1 pico) 0,37 0,83 0,83 1,00 0,70 1,09 0,45 0,68 0,73 0,81 0,90
Largura USP (2 pico) 0,41 1,01 0,96 1,14 0,61 1,28 0,52 0,82 0,88 0,97 1,09
Largura USP (mdia) 0,39 0,92 0,89 1,07 0,66 1,19 0,48 0,75 0,81 0,89 1,00
Assimetria - 10% (1 pico) - - - - - - - 1,54 1,57 1,62 1,67
Assimetria - 10% (2 pico) - - - - - - - 1,64 1,69 1,75 1,84
Assimetria - 10% (mdia) - - - - - - - 1,59 1,63 1,69 1,76

1
M
= V
M
/F e V
M
0,5.L.d
c
2
, onde t
M
corresponde ao tempo de reteno de um composto no-retido,
V
M
corresponde ao volume intersticial da coluna e L e d
c
correspondem ao comprimento e ao dimetro interno da coluna, respectivamente; (-) no foi
possvel calcular devido sobreposio dos picos.

243

0 1
Minutes
2 3 4 5 6 7 8 9 10
m
A
U
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
Ensaio 1
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
m
A
U
0
20
40
60
80
100
120
Ensaio 2
m
U
A

m
U
A

Minutos Minutos
100 120
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
m
A
U
-20
0
20
40
60
80
100
Ensaio 3
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
m
A
U
-20
0
20
40
60
80
Ensaio 4
m
U
A

m
U
A

Minutos Minutos
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
m
A
U
-100
0
100
200
300
Ensaio 5
Minutes
0,0 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 20,0 22,5 25,0 27,5 30,0
m
A
U
-20
0
20
40
60
80
Ensaio 6
m
U
A

m
U
A

Minutos Minutos
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
m
A
U
0
50
100
150
200
Ensaio 7
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16
m
A
U
-25
0
25
50
75
100
125
Ensaio 8
m
U
A

m
U
A

Minutos Minutos

Quadro 6.11 Separao dos enantimeros do cetoprofeno por CLAE em fase reversa: Ensaios 1 a
8 (Ensaio 1: FM = tampo CH
3
CO
2
NH
4
-1
, T
C
= 24 C;
ensaio 2: FM = tampo CH
3
CO
2
NH
4
-1
, T
C
= 24 C;
3
CO
2
NH
4
25 mM pH 4,5:etanol 74,8:25,2, F = 1,0 mL.min
-1
, T
C
= 24 C;
3
CO
2
NH
4
25 mM pH 4,5:2-propanol 77,3:22,7, F = 1,0 mL.min
-1
, T
C
= 24
C; ensaio 5: FM = tampo CH
3
CO
2
NH
4
25 mM pH 4,5:acetonitrila 77,2:22:8, F = 1,0 mL.min
-1
, T
C
=
24 C; ensaio 6: FM = tampo HCO
2
NH
4
25 mM pH 3,0:etanol 75:25, F = 1,0 mL.min
-1
, T
C
= 24 C;
3
CO
2
NH
4
-1
, T
C
= 24 C;
3
CO
2
NH
4
-1
, T
C
= 12 C).
Resultados

244

Resultados

0 2 4
Minutes
6 8 10 12 14 16 18 20
m
A
U
-25
0
25
50
75
100
125
Ensaio 9
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
m
A
U
-25
0
25
50
75
100
125
150
Ensaio 10
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
m
A
U
-25
0
25
50
75
100
125
150
Ensaio 11

m
U
A

m
U
A

Minutos Minutos
m
U
A

Minutos

Quadro 6.12 Separao dos enantimeros do cetoprofeno por CLAE em fase reversa: Ensaios 9 a
11 (Ensaio 9: FM = tampo CH
3
CO
2
NH
4
-1
, T
C
= 12 C;
3
CO
2
NH
4
-1
, T
C
= 12 C;
3
CO
2
NH
4
-1
, T
C
= 12 C).

245


6.5.1 ENSAIOS PRELIMINARES

O quadro 6.13 apresenta os cromatogramas obtidos durante os ensaios
preliminares.

Resultados

246

Resultados

0 1 2
Minutes
3 4 5 6 7 8 9 10
m
A
U
0
100
200
300
400
500
Ensaio 1
Minutes
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
m
A
U
0
10
20
30
40
50
60
Ensaio 2
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
m
A
U
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
Ensaio 3
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
m
A
U
0
200
400
600
800
Ensaio 4
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
m
A
U
0
100
200
300
400
Ensaio 5
Minutes
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
m
A
U
-20
0
20
40
60
80
Ensaio 6
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
m
A
U
0
50
100
150
200
250
Ensaio 7

m
U
A

m
U
A

Minutos Minutos
m
U
A

m
U
A

Minutos Minutos
m
U
A

m
U
A

Minutos Minutos
m
U
A

Minutos

Quadro 6.13 Separao dos enantimeros do cetoprofeno por CLAE em fase normal: ensaios
preliminares F = 1,0 mL.min
-1
; T
c
= 24 C (Ensaio 1: fase mvel = hexano:2-propanol:cido actico
90:10:0,1; ensaio 2: fase mvel = hexano:2-propanol:cido actico 99:1:0,1; ensaio 3: fase mvel =
diclorometano:2-propanol:cido actico 90:10:0,1; ensaio 4: fase mvel = diclorometano:2-
propanol:cido actico 99:1:0,1; ensaio 5: fase mvel = hexano:etanol:cido actico 90:10:0,1;
ensaio 6: fase mvel = hexano:etanol 90:10 + CH
3
CO
2
NH
4
0,02 M; ensaio 7: fase mvel =
diclorometano:etanol 90:10 + CH
3
CO
2
NH
4
0,02 M).

247

Resultados
6.5.2 PLANEJAMENTO DE MISTURA


As tabelas 6.34 e 6.35 apresentam a avaliao dos cromatogramas obtidos
com a realizao dos ensaios previstos no planejamento de mistura. Cada resultado
apresentado nessas tabelas representa a mdia entre outros dois resultados obtidos
atravs da injeo em duplicata da amostra.
(quadros 6.14 e 6.15).

Tabela 6.34 Avaliao dos cromatogramas obtidos com a realizao dos ensaios 1 a 5 previstos no planejamento de mistura.

Resposta
Ensaio
1 1* 2 2* 3 3* 4 4* 5 5*
Tempo de reteno (no-retido)** 2,65 2,65 2,65 2,65 2,65 2,65 2,65 2,65 2,65 2,65
Tempo de reteno (1 pico) 33,08 34,59 10,89 11,09 14,88 15,96 6,14 6,32 7,40 7,56
Tempo de reteno (2 pico) 36,64 38,25 11,40 11,62 16,20 17,40 6,34 6,52 7,67 7,85
Fator de reteno (2 pico) 12,85 13,46 3,31 3,39 5,13 5,58 1,40 1,47 1,90 1,97
Fator de separao 1,12 1,11 1,06 1,06 1,11 1,11 1,05 1,06 1,06 1,06
Resoluo 2,87 2,90 1,14 1,16 2,15 2,20 0,68 0,71 0,87 0,88
Pratos tericos (1 pico) 12.812 13.088 10.298 10.242 10.363 10.551 8.313 8.539 9.765 9.859
Pratos tericos (2 pico) 12.530 13.489 9.557 9.587 9.996 10.165 7.496 7.640 8.633 8.654
Pratos tericos (mdia) 12.671 13.288 9.927 9.914 10.179 10.358 7.904 8.089 9.199 9.256
rea (1 pico) 3.616.510 3.474.795 3.712.458 3.736.680 3.529.685 3.538.471 3.283.924 3.218.016 3.452.555 3.316.552
rea (2 pico) 3.662.175 3.508.264 4.173.254 4.206.887 3.648.953 3.643.909 4.252.511 4.052.089 4.234.076 4.065.971
rea (mdia) 3.639.342 3.491.529 3.942.856 3.971.783 3.589.319 3.591.190 3.768.217 3.635.053 3.843.316 3.691.261
rea% (1 pico) 49,69% 49,76% 47,08% 47,04% 49,17% 49,27% 43,39% 44,07% 44,92% 44,93%
rea% (2 pico) 50,32% 50,24% 52,92% 52,96% 50,83% 50,74% 56,62% 55,93% 55,09% 55,08%
Altura (1 pico) 75.607 70.205 226.884 222.859 149.216 140.906 369.574 347.536 320.311 302.650
Altura (2 pico) 67.537 64.430 220.014 216.757 135.856 128.138 398.438 369.714 325.400 305.761
Altura (mdia) 71.572 67.317 223.449 219.808 142.536 134.522 384.006 358.625 322.855 304.205
Largura USP (1 pico) 1,17 1,21 0,43 0,44 0,59 0,62 0,27 0,27 0,30 0,31
Largura USP (2 pico) 1,31 1,32 0,47 0,48 0,65 0,69 0,29 0,30 0,33 0,34
Largura USP (mdia) 1,24 1,27 0,45 0,46 0,62 0,66 0,28 0,29 0,32 0,32
Assimetria - 10% (1 pico) 1,23 1,22 - - 1,28 1,26 - - - -
Assimetria - 10% (2 pico) 1,29 1,28 - - 1,33 1,31 - - - -
Assimetria - 10% (mdia) 1,26 1,25 - - 1,31 1,28 - - - -

*Duplicata do ensaio correspondente; **calculado de acordo com as seguintes frmulas: t
M
= V
M
/F e V
M
0,5.L.d
c
2
, onde t
M
corresponde ao tempo de
reteno de um composto no-retido, V
M
c
correspondem ao comprimento e ao dimetro interno
da coluna, respectivamente; (-) no foi possvel calcular devido sobreposio dos picos.

Tabela 6.35 Avaliao dos cromatogramas obtidos com a realizao dos ensaios 6 a 9 previstos no planejamento de mistura.
Resposta
Ensaio
6 6* 7 7* 8 8* 9 9*
Tempo de reteno (no-retido)** 2,65 2,65 2,65 2,65 2,65 2,65 2,65 2,65
Fator de separao 1,11 1,11 1,09 1,09 1,08 1,08 1,09 1,09
Resoluo 2,46 2,48 1,85 1,86 1,35 1,31 1,55 1,57
rea (1 pico) 3.582.850 3.600.019 3.665.541 3.799.926 3.600.558 3.458.469 3.693.622 3.600.350
rea (2 pico) 3.647.297 3.671.297 3.824.022 3.951.540 3.964.169 3.878.236 3.930.760 3.839.268
rea (mdia) 3.615.073 3.635.658 3.744.782 3.875.733 3.782.363 3.668.352 3.812.191 3.719.809
rea% (1 pico) 49,56% 49,51% 48,94% 49,03% 47,60% 47,14% 48,45% 48,40%
rea% (2 pico) 50,45% 50,49% 51,06% 50,98% 52,41% 52,86% 51,56% 51,61%
Altura (1 pico) 115.163 113.040 154.868 162.023 278.477 281.384 226.655 219.573
Altura (2 pico) 103.415 101.316 143.517 149.349 265.314 269.176 212.528 205.902
Altura (mdia) 109.289 107.178 149.192 155.686 271.896 275.280 219.591 212.737
Largura USP (1 pico) 0,77 0,79 0,60 0,59 0,33 0,32 0,41 0,42
Largura USP (2 pico) 0,85 0,88 0,65 0,65 0,36 0,35 0,45 0,45
Largura USP (mdia) 0,81 0,83 0,62 0,62 0,35 0,33 0,43 0,43
Assimetria - 10% (1 pico) 1,26 1,25 1,21 1,21 - - 1,25 1,26
Assimetria - 10% (2 pico) 1,32 1,32 1,21 1,22 - - 1,20 1,22
Assimetria - 10% (mdia) 1,29 1,28 1,21 1,21 - - 1,23 1,24

*Duplicata do ensaio correspondente; **calculado de acordo com as seguintes frmulas: t
M
= V
M
/F e V
M
0,5.L.d
c
2
, onde t
M

corresponde ao tempo de reteno de um composto no-retido, V
M
c

correspondem ao comprimento e ao dimetro interno da coluna, respectivamente; (-) no foi possvel calcular devido
sobreposio dos picos.

250

Resultados

Minutes
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
m
A
U
0
20
40
60
80
Ensaio 1
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16
m
A
U
0
50
100
150
200
250
Ensaio 2
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
m
A
U
0
25
50
75
100
125
150
Ensaio 3
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
m
A
U
0
100
200
300
400
Ensaio 4
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
m
A
U
0
100
200
300
Ensaio 5
Minutes
0,0 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 20,0 22,5 25,0 27,5 30,0
m
A
U
0
20
40
60
80
100
120
Ensaio 6
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
m
A
U
0
50
100
150
Ensaio 7
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
m
A
U
0
50
100
150
200
250
300
Ensaio 8
m
U
A

m
U
A

Minutos Minutos
m
U
A

m
U
A

Minutos Minutos
m
U
A

m
U
A

Minutos Minutos
m
U
A

m
U
A

Minutos Minutos

Quadro 6.14 Separao dos enantimeros do cetoprofeno por CLAE em fase normal: planejamento
de mistura ensaios 1 a 8 F = 1,0 mL.min
-1
; T
c
= 12 C (Ensaio 1: fase mvel = hexano:etanol
90:10; ensaio 2: fase mvel = diclorometano:etanol 90:10; ensaio 3: fase mvel = hexano:etanol
80:20; ensaio 4: fase mvel = diclorometano:etanol 80:20; ensaio 5: fase mvel =
diclorometano:etanol 85:15; ensaio 6: fase mvel = hexano:etanol 85:15; ensaio 7: fase mvel =
hexano:diclorometano:etanol 45:45:10; ensaio 8: fase mvel = hexano:diclorometano:etanol
40:40:20). Todas as fases mveis continham ainda CH
3
CO
2
NH
4
em concentrao equivalente a 1,0
g/L.

251

Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16
m
A
U
0
50
100
150
200
250
Ensaio 9

m
U
A

Minutos

Quadro 6.15 Separao dos enantimeros do cetoprofeno por CLAE em fase normal: planejamento
de mistura ensaio 9 F = 1,0 mL.min
-1
; T
c
= 12 C (Ensaio 9: fase mvel =
hexano:diclorometano:etanol 42,5:42,5:15). A fase mvel continha ainda CH
3
CO
2
NH
4
em
concentrao equivalente a 1,0 g/L.

6.5.2.2 CONSTRUO DOS MODELOS MATEMTICOS

Partindo-se dos dados obtidos com a realizao dos ensaios previstos no
planejamento de mistura, foram construdos modelos matemticos lineares,
quadrticos e cbicos especiais, na tentativa de se descrever a relao existente
entre a proporo de cada componente na fase mvel e as respostas de interesse.
As equaes matemticas obtidas seguem a forma geral descrita no subitem 5.2.5.5.
Os intervalos de confiana calculados para os parmetros dessas equaes so
apresentados na tabela 6.36 (o nvel de significncia adotado corresponde a 0,05).

Resultados

252

Tabela 6.36 Intervalos de confiana calculados para os parmetros das equaes que descrevem
os modelos lineares, quadrticos e cbicos especiais, apresentados em funo das respostas s
quais esses modelos se aplicam.

Modelo
Resposta
R
s
t
R2
ln(k
2
)
Linear
*
1
=
-02,795 0,076 -030,17 4,1800 -02,491 0,1310
*
2
=
-01,099 0,076 -011,76 4,1800 -01,062 0,1310
*
3
=
0-3,128 0,773 0-79,21 42,580 0-5,981 1,3390

Quadrtico
*
1
=
-02,876 0,027 -036,25 1,8000 -02,576 0,0450
*
2
=
-01,145 0,027 -011,16 1,8000 -01,201 0,0450
*
3
=
-09,946 6,162 -571,49 402,75 -20,196 10,123
*
12
=
0-0,573 0,095 0-23,86 6,2200 0-0,980 0,1560
*
13
=
-15,081 6,926 -798,39 452,70 -28,965 11,378
*
23
=
-14,396 6,926 -667,96 452,70 -30,028 11,378

Cbico
especial
*
1
=
-02,881 0,028 -036,90 1,3200 -02,575 0,0500
*
2
=
-01,150 0,028 -011,81 1,3200 -01,200 0,0500
*
3
=
-10,041 5,951 -583,06 282,23 -20,178 10,672
*
12
=
0-0,637 0,133 0-31,62 6,3200 0-0,968 0,2390
*
13
=
-15,295 6,695 -824,31 317,51 -28,926 12,006
*
23
=
-14,610 6,695 -693,88 317,51 -29,988 12,006
*
123
=
-01,365 2,055 -165,39 97,460 0-0,254 3,6850

s valores em negrito indicam parmetros significativos em um nvel de significncia igual a 0,05. O

O que diferencia o modelo quadrtico do modelo cbico especial a incluso,
neste ltimo, de um termo que expressa a interao entre os 3 componentes da fase
mvel. Em outras palavras, se for excludo o termo
*
123 1 2 3
do modelo cbico
especial, este fica reduzido a um modelo quadrtico. Como pode ser observado na
tabela acima, no modelo cbico especial ajustado s respostas R
s
e ln(k
2
), o
parmetro
*
123
foi considerado no-significativo, o que equivale a dizer que no h
razes para se acreditar que
*
123
seja diferente de zero. Assim sendo, se
*
123

igual a zero, ento o respectivo termo
*
123 1 2 3
nulo. Conseqentemente, a
adoo de um modelo cbico especial no se justifica e, portanto, para as respostas
R
s
e ln(k
2
), esses modelos no sero mais abordados.
Resultados

253

Assim sendo, os modelos obtidos para cada resposta foram os seguintes:


Modelo linear:
R
s
= 2,795
1
+ 1,099
2
- 3,128
3

ou
R
s
= 3,454c
1
+ 1,569c
2
- 3,128c
3

Modelo quadrtico:
R
s
= 2,876
1
+ 1,145
2
+ 9,946
3
- 0,573
1
2
- 15,081
1
3
- 14,396
2
3

ou
R
s
= 3,952c
1
+ 1,944c
2
+ 9,946c
3
- 0,707c
1
c
2
- 18,619c
1
c
3
- 17,773c
2
c
3


Modelo linear:
t
R2
= 30,17
1
+ 11,76
2
- 79,21
3
ou
t
R2
= 42,32c
1
+ 21,87c
2
- 79,21c
3

Modelo quadrtico:
t
R2
= 36,25
1
+ 11,16
2
+ 571,49
3
- 23,86
1
2
- 798,39
1
3
-
667,96
2
3

ou
t
R2
= 75,35c
1
+ 31,37c
2
+ 571,49c
3
- 29,45c
1
c
2
- 985,67c
1
c
3
- 824,64c
2
c
3

Resultados

254

Modelo cbico especial:
t
R2
= 36,90
1
+ 11,81
2
+ 583,06
3
- 31,62
1
2
- 824,31
1
3
-
693,88
2
3
+ 165,39
1
3

ou
t
R2
= 77,98c
1
+ 34,00c
2
+ 583,06c
3
- 61,72c
1
c
2
- 1017,66c
1
c
3
-
856,64c
2
c
3
+ 226,88c
1
c
2
c
3

Resposta: logaritmo neperiano do fator de reteno referente ao segundo
pico.

Modelo linear:
ln(k
2
) = 2,491
1
+ 1,062
2
5,981
3

ou
ln(k
2
) = 3,433c
1
+ 1,844c
2
- 5,981c
3

Modelo quadrtico:
ln(k
2
) = 2,576
1
+ 1,201
2
+ 20,196
3
- 0,980
1
2
- 28,965
1
3
-
30,028
2
3

ou
ln(k
2
) = 4,194c
1
+ 2,797c
2
+ 20,196c
3
- 1,210c
1
c
2
- 35,760c
1
c
3
-
37,072c
2
c
3

6.5.2.3 AVALIAO DO GRAU DE AJUSTE DOS MODELOS

A seguir, so apresentados o grfico de distribuio dos resduos e a anlise
da varincia (ANOVA) referentes a cada modelo.

Resultados

255

Resposta: resoluo entre os picos modelo linear.

-0,2
0,0
0,2
0 5 10 15 20
Ensaio
R
e
s
d
u
o
Figura 6.35 Grfico da distribuio dos resduos deixados pelo modelo linear para R
s
= f(
1
,
2
,
3
).

Tabela 6.37 Anlise da varincia do modelo linear para R
s
= f(
1
,
2
,
3
).

Regresso 8,670 02 4,335
Resduos 0,082 15 0,005
Erro puro 0,003 09 0,000
Total 8,751 17
MQ
R
/MQ
r
= 796,59 MQ
faj
/MQ
ep
= 34,08
F
2
,
15
= 003,68 F
6
,
9
= 03,37
(MQ
R
/MQ
r
)/F
2
,
15
= 216,33 (MQ
faj
/MQ
ep
)/F
6
,
9
= 10,10

R
r
MQ
faj
ep

Resultados

256

Resposta: resoluo entre os picos modelo quadrtico.

-0,2
0,0
0,2
0 5 10 15 20
Ensaio
R
e
s
d
u
o
Figura 6.36 Grfico da distribuio dos resduos deixados pelo modelo quadrtico para R
s
= f(
1
,
2
,
3
).

Tabela 6.38 Anlise da varincia do modelo quadrtico para R
s
= f(
1
,
2
,
3
).

Regresso 8,747 05 1,749
Resduos 0,005 12 0,000
Erro puro 0,003 09 0,000
Total 8,751 17
MQ
R
/MQ
r
= 4551,24 MQ
faj
/MQ
ep
= 1,02
F
5
,
12
= 0003,11 F
3
,
9
= 3,86
(MQ
R
/MQ
r
)/F
5
,
12
= 1465,36 (MQ
faj
/MQ
ep
)/F
3
,
9
= 0,26

R
r
MQ
faj
ep

Resultados

257

Em relao resposta tempo de reteno referente ao segundo pico, todos
os modelos propostos apresentaram significativa falta de ajuste. Por essa razo, so
apresentados o grfico de distribuio dos resduos e a anlise completa da
varincia referentes apenas ao modelo com menor falta de ajuste (modelo cbico
especial). A tabela 6.39, entretanto, apresenta alguns dados extrados da anlise da
varincia dos 3 modelos, com o intuito de possibilitar a comparao entre eles.

Tabela 6.39 Anlise da varincia do modelos linear, quadrtico e cbico especial para t
R2
= f(
1
,
2
,
3
).
Modelo
MQ
faj
/MQ
ep v
faj
v
ep
F
faj
,
ep
R
2

Linear 153,11 6 9 3,37 0,8377
Quadrtico 021,57 3 9 3,86 0,9871
Cbico especial 011,75 2 9 4,26 0,9943

MQ
faj
ep
, mdia quadrtica devida ao erro puro; v
faj
,
graus de liberdade associados ao clculo de MQ
faj
; v
ep
, graus de liberdade associados ao clculo de
MQ
ep
; R
2
, coeficiente de determinao. As estatsticas F foram calculadas em um nvel de
significncia igual a 0,05.

Resultados

258

Resposta: tempo de reteno referente ao segundo pico modelo cbico
especial.

-2,0
0,0
2,0
0 5 10 15 20
Ensaio
R
e
s
d
u
o

/

m
i
n
Figura 6.37 Grfico da distribuio dos resduos deixados pelo modelo cbico especial para t
R2
=
f(
1
,
2
,
3
).

Tabela 6.40 Anlise da varincia do modelo cbico especial para t
R2
= f(
1
,
2
,
3
).

Regresso 1519,8 06 253,3
Resduos 0008,7 11 000,8
Erro puro 0002,4 09 000,3
Total 1528,4 17
MQ
R
/MQ
r
= 320,73 MQ
faj
/MQ
ep
= 11,75
F
6
,
11
= 003,09 F
2
,
9
= 04,26
(MQ
R
/MQ
r
)/F
6
,
11
= 103,64 (MQ
faj
/MQ
ep
)/F
2
,
9
= 02,76

R
r
MQ
faj
ep
Resultados

259

pico modelo linear.

-0,3
0,0
0,3
0 5 10 15 20
Ensaio
R
e
s
d
u
o
Figura 6.38 Grfico da distribuio dos resduos deixados pelo modelo linear para ln(k
2
) = f(
1
,
2
,
3
).

Tabela 6.41 Anlise da varincia do modelo linear para ln(k
2
) = f(
1
,
2
,
3
).

Regresso 7,712 02 3,856
Resduos 0,245 15 0,016
Erro puro 0,009 09 0,001
Total 7,957 17
MQ
R
/MQ
r
= 235,89 MQ
faj
/MQ
ep
= 39,09
F
2
,
15
= 003,68 F
6
,
9
= 03,37
(MQ
R
/MQ
r
)/F
2
,
15
= 064,06 (MQ
faj
/MQ
ep
)/F
6
,
9
= 11,59

R
r
MQ
faj
ep
Resultados

260

pico modelo quadrtico.

-0,3
0,0
0,3
0 5 10 15 20
Ensaio
R
e
s
d
u
o
Figura 6.39 Grfico da distribuio dos resduos deixados pelo modelo quadrtico para ln(k
2
) =
f(
1
,
2
,
3
).

Tabela 6.42 Anlise da varincia do modelo quadrtico para ln(k
2
) = f(
1
,
2
,
3
).

Regresso 7,945 05 1,589
Resduos 0,012 12 0,001
Erro puro 0,009 09 0,001
Total 7,957 17
MQ
R
/MQ
r
= 1531,78 MQ
faj
/MQ
ep
= 1,12
F
5
,
12
= 0003,11 F
3
,
9
= 3,86
(MQ
R
/MQ
r
)/F
5
,
12
= 0493,19 (MQ
faj
/MQ
ep
)/F
3
,
9
= 0,29

R
r
MQ
faj
ep
Resultados

261

As figuras 6.40 e 6.41 apresentam, respectivamente, o histograma e o grfico
de probabilidade normal dos resduos brutos deixados pelo modelo quadrtico que
descreve a relao existente entre a proporo de cada componente na fase mvel
e a resoluo entre os picos. As figuras 6.42 e 6.43 apresentam, respectivamente, o
histograma e o grfico de probabilidade normal dos resduos brutos deixados pelo
modelo quadrtico que descreve a relao existente entre a proporo de cada
componente na fase mvel e o logaritmo neperiano do fator de reteno referente ao
segundo pico.

-0,05 -0,04 -0,03 -0,02 -0,01 0,00 0,01 0,02 0,03 0,04
Categoria
0
1
2
3
4
5
F
r
e
q
u
n
c
i
a
-0,04 -0,03 -0,02 -0,01 0,00 0,01 0,02 0,03 0,04
Resduo
-3,0
-2,5
-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
V
a
l
o
r

n
o
r
m
a
l

e
s
p
e
r
a
d
o
,01
,05
,15
,35
,55
,75
,95
,99
deixados pelo modelo quadrtico para R
s
=
f(
1
,
2
,
3
quadrtico para R
s
= f(
1
,
2
,
3
).

-0,06 -0,04 -0,02 0,00 0,02 0,04 0,06
Categoria
0
1
2
3
4
F
r
e
q
u
n
c
i
a
-0,06 -0,04 -0,02 0,00 0,02 0,04 0,06
Resduo
-3,0
-2,5
-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
V
a
l
o
r

n
o
r
m
a
l

e
s
p
e
r
a
d
o
,01
,05
,15
,35
,55
,75
,95
,99
deixados pelo modelo quadrtico para ln(k
2
) =
f(
1
,
2
,
3
quadrtico para ln(k
2
) = f(
1
,
2
,
3
).
Resultados

262


Empregando-se o mtodo proposto por Derringer e Suich, a otimizao
simultnea das respostas R
s
e ln(k
2
) conduziu seguinte proporo entre os
componentes da fase mvel:

Hexano:diclorometano:etanol 81,5:0:18,5 (v/v/v).

De acordo com os modelos empregados, essa proporo corresponderia a
uma resoluo igual a 2,25 e a um tempo de reteno referente ao segundo pico
igual a 18,06 minutos [ln(k
2
) = 1,76; k
2
= 5,83]. As desejabilidades individuais
alcanadas para essas respostas foram 0,2538 e 0,7678, respectivamente,
correspondendo a uma desejabilidade global igual a 0,4414.
Incluindo a vazo da fase mvel e a temperatura da coluna, as condies
cromatogrficas estabelecidas pelo mtodo ento so:

Fase mvel: hexano:etanol 81,5:18,5 (v/v) + acetato de amnio 1,0 g/L;
-1
;

Resultados

263

6.5.4 DETERMINAO DA ORDEM DE ELUIO DOS ENANTIMEROS

A tabela 6.43 apresenta as reas de cada pico (em relao soma das reas
de ambos os picos, e expressas em porcentagem), nos cromatogramas obtidos a
partir da anlise das solues 1 e 3, conforme subitem 5.2.5.8.

Tabela 6.43 Determinao da ordem de eluio dos enantimeros

Soluo
A
1
% A
2
%
1 49,48 50,52
3 35,49 64,52

A
1
%, rea do primeiro pico; A
2
%, rea do segundo pico (relativas soma das reas de ambos os
picos e expressas em porcentagem). Soluo 1 = cetoprofeno racmico; Soluo 3 = cetoprofeno
racmico + padro de (S)-(+)-cetoprofeno.

6.6 APLICAO DOS MTODOS SELECIONADOS S AMOSTRAS DE MEDICAMENTOS

A tabela 6.44 apresenta a anlise dos cromatogramas que foram obtidos
aplicando-se os mtodos selecionados s amostras de medicamentos, conforme
descrito no subitem 5.2.6. A anlise dos cromatogramas se limitou ao clculo dos
parmetros cromatogrficos t
R2
e R
s
, alm da avaliao da pureza dos picos. Cada
resultado apresentado na tabela 6.44 representa a mdia entre outros dois
(quadros 6.16).

Resultados

264

Resultados
Tabela 6.44 Aplicao dos mtodos selecionados s amostras de medicamentos.

Amostra Frmaco t
R2
R
s
PP
T1
PP
T2
PP
3P1
PP
3P2

1 CET 21,19 2,48 100,0 100,0 0,9800 0,9912
2 CET 21,48 2,50 100,0 100,0 0,9832 0,9997
3 CET 21,89 2,51 100,0 100,0 0,9970 0,9969
4 FCD 34,65 5,29 100,0 100,0 0,9972 0,9841

PP
T1
, pureza de pico total (total peak purity) referente ao primeiro pico; PP
T2
, pureza de pico total
referente ao segundo pico; PP
3P1
, pureza de pico em trs pontos (three point peak purity) referente ao
primeiro pico; PP
3P2
, pureza de pico em trs pontos referente ao segundo pico; CET, cetoprofeno;
FCD, fenoprofeno clcico diidratado.

Minutes
0,0 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 20,0 22,5 25,0 27,5 30,0
m
A
U
0
20
40
60
80
100
120
Amostra 1
Minutes
0,0 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 20,0 22,5 25,0 27,5 30,0
m
A
U
0
20
40
60
80
100
Amostra 2
Minutes
0,0 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 20,0 22,5 25,0 27,5 30,0
m
A
U
0
20
40
60
80
100
120
Amostra 3
Minutes
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
m
A
U
0,0
2,5
5,0
7,5
10,0
12,5
15,0
Amostra 4
m
U
A

m
U
A

Minutos Minutos
m
U
A

m
U
A

Minutos Minutos

Quadro 6.16 Aplicao dos mtodos selecionados s amostras de medicamentos Amostras 1 a 3
(medicamentos contendo cetoprofeno): fase mvel = hexano:etanol 81,5:18,5 + CH
3
CO
2
NH
4
1,0 g/L;
F = 1,0 mL.min
-1
; T
c
= 12 C Amostra 4 (medicamento contendo fenoprofeno clcico diidratado):
fase mvel = hexano:2-propanol:cido actico 99:1:0,2; F = 0,7 mL.min
-1
; T
c
= 12 C.

265

7. DISCUSSO

7.1 QUALIFICAO DOS FRMACOS: ENSAIOS DE IDENTIFICAO

Para que as amostras dos frmacos pudessem ser empregadas no
desenvolvimento dos mtodos de separao, era necessrio, primeiramente,
qualific-las atravs da confirmao de suas identidades qumicas. Para tanto, foram
realizados ensaios de identificao selecionados com base nas exigncias da
farmacopia britnica para a correta identificao do cetoprofeno e do fenoprofeno
clcico.
Assim sendo, todos os ensaios previstos por essa farmacopia para a
identificao dos frmacos supracitados foram realizados, exceo da
cromatografia em camada delgada (teste D), que consta entre os ensaios de
identificao do cetoprofeno. Embora esse ensaio no tenha sido realizado, no
houve prejuzos identificao das amostras de cetoprofeno, pois, de acordo com a
farmacopia britnica, a cromatografia em camada delgada no obrigatria para
garantir a identidade do frmaco em questo. Na verdade, na monografia do
cetoprofeno, tal tcnica se apresenta como parte de uma alternativa
espectrometria de absoro no infravermelho, a qual pode ser empregada em
substituio a esta ltima apenas em casos especiais.
Alm disso, muito embora a escolha dos ensaios de identificao tenha se
dado com base nas exigncias da farmacopia britnica, mtodos equivalentes
descritos pela farmacopia americana foram empregados em alguns casos
especficos. Esse foi o caso do ensaio para a determinao da faixa de fuso das
Discusso

266

amostras de cetoprofeno, onde, em substituio ao mtodo descrito pela
farmacopia britnica, empregou-se aquele descrito pela farmacopia americana,
embora com pequenas modificaes. Tambm foi esse o caso do ensaio para a
identificao de clcio, exigido na monografia do fenoprofeno clcico, onde
novamente se adotou, por questes de praticidade, o mtodo equivalente descrito
pela farmacopia americana.
Em relao amostra de fenoprofeno clcico, alm dos demais ensaios
exigidos para sua identificao, foi realizada tambm a determinao do seu teor de
gua, com o propsito de confirmar que o frmaco se apresentava sob a forma
diidratada. Para essa finalidade, foram empregados dois mtodos distintos: o
mtodo de Karl Fisher (que o mtodo farmacopico) e a anlise termogravimtrica.
Os resultados dos ensaios de identificao adotados confirmaram a
identidade das amostras de cada frmaco.
A espectrometria de absoro no infravermelho evidenciou boa concordncia
entre os valores experimentais obtidos e aqueles descritos na literatura para os
nmeros de onda referentes s bandas principais, que so caractersticas dos
espectros de cada frmaco (tabela 6.1). No apenas as posies, mas tambm as
intensidades relativas das bandas de transmitncia dos espectros obtidos
experimentalmente foram comparadas quelas observadas nos espectros de
referncia, sendo possvel observar um elevado grau de correspondncia entre os
respectivos espectros (figuras 2.9, 2.11, 6.1, 6.2 e 6.3).
No tocante aos ensaios de identificao por espectrofotometria de absoro
no ultravioleta, segundo a farmacopia britnica, uma soluo de cetoprofeno,
preparada conforme descrito no subitem 5.2.1.2, deve apresentar um mximo de
absoro em 255 nm ( 2nm), quando examinada entre 230 e 350 nm. Alm disso, a
Discusso

267

absorvncia especfica no comprimento de onda de mxima absoro deve estar
compreendida entre 615 e 680. De acordo com a tabela 6.2, possvel verificar que
as amostras de cetoprofeno atenderam a ambas as especificaes.
Uma soluo de fenoprofeno clcico, por sua vez, quando preparada
conforme descrito no subitem 5.2.1.2 e analisada por espectrofotometria de
absoro no ultravioleta entre 230 e 350 nm, deve apresentar (ainda segundo a
farmacopia britnica) dois mximos de absoro: um em 272 e o outro em 278 nm,
alm de um ombro em 266 nm. Alm disso, os valores das absorvncias devem
estar prximos a 0,70 e a 0,65, nos mximos em 272 e em 278 nm,
respectivamente. De fato, a anlise do espectro de absoro no ultravioleta referente
amostra de fenoprofeno clcico diidratado revela claramente a presena de dois
mximos de absoro, bem como um ombro anterior a esses mximos (figura 6.6).
Tanto os mximos de absoro, como o ombro, ocorreram nos comprimentos de
onda mencionados pela farmacopia britnica. Adicionalmente, houve boa
concordncia entre os valores de absorvncia experimentais e aqueles descritos por
essa mesma farmacopia (tabela 6.3). Portanto, a amostra de fenoprofeno clcico
diidratado tambm atendeu s especificaes adotadas para o ensaio de
identificao por espectrofotometria de absoro no ultravioleta.
Essa mesma amostra apresentou, ainda, o comportamento caracterstico dos
sais de clcio quando submetida ao teste para a identificao desse metal. Alm
disso, a presena de clcio na amostra foi corroborada tambm pela anlise
termogravimtrica. Por meio dessa tcnica se pde observar que a decomposio
trmica da amostra, em presena de oxignio, conduziu a resduos compatveis com
a formao de xido de clcio, uma vez que a massa desses resduos se aproxima
daquela prevista por meio de clculo estequiomtrico (tabela 6.4, figuras 6.7 e 6.8).
Discusso

268

Ao mesmo tempo, as determinaes do teor de gua da amostra de
fenoprofeno clcico diidratado forneceram resultados que tambm esto de acordo
com as especificaes da farmacopia britnica, segundo a qual esse frmaco deve
conter entre 5,0 e 8,0% de gua. Alm disso, pde-se observar boa concordncia
entre os resultados obtidos pelo mtodo oficial e aqueles obtidos por
termogravimetria (tabela 6.6, figuras 6.9 e 6.10).
Por fim, e de volta s amostras de cetoprofeno, o ensaio para a determinao
da faixa de fuso dessas amostras tambm atestou a identidade das mesmas, visto
que essas se fundiram dentro da faixa de fuso especificada pela farmacopia
americana (compreendida entre 92 e 97 C, inclusive).
Com as amostras dos frmacos devidamente identificadas, pde-se ento dar
incio ao desenvolvimento dos mtodos de separao.


A estratgia para o desenvolvimento de um mtodo de separao para os
enantimeros do fenoprofeno teve incio com a realizao de alguns ensaios
preliminares, conforme descrito no subitem 5.2.2.4. Conforme j foi dito, esses
ensaios tiveram por objetivo definir o campo experimental que seria posteriormente
investigado por meio de um planejamento experimental fatorial fracionrio. Mais
especificamente, esses experimentos foram conduzidos para possibilitar a escolha
do modificador orgnico que seria utilizado como Solvente B, assim como para
determinar em que propores este seria empregado nas diversas fases mveis que
Discusso

269

Discusso
viriam a ser investigadas. Adicionalmente, alguns desses experimentos foram
realizados com o intuito de se definir os nveis em que o fator vazo da fase mvel
seria investigado no planejamento fatorial fracionrio. Para tanto, era necessrio
verificar se a coluna iria suportar, diante das fases mveis empregadas, a presso
gerada por uma vazo correspondente a 2,0 mL.min
-1
ou se, por outro lado, uma
vazo de 0,5 mL.min
-1
no resultaria em tempos de reteno inaceitveis (muito
longos).
Entre os modificadores orgnicos mais comumente empregados em CLAE em
fase reversa esto a acetonitrila, o metanol e o tetraidrofurano. Desses, apenas o
tetraidrofurano no teve sua seletividade investigada durante os ensaios
preliminares, devido incompatibilidade que apresenta com o material polimrico de
alguns componentes do cromatgrafo utilizado. A acetonitrila, por sua vez,
apresentou uma seletividade muito pobre ou mesmo nenhuma seletividade dentro
das condies experimentais empregadas (quadro 6.1 ensaios 6 e 7). Por outro
lado, o metanol apresentou uma seletividade promissora e, por essa razo, foi o
solvente escolhido para compor a fase mvel do mtodo em desenvolvimento
(quadro 6.1 ensaios 1 a 5). Para manter o tempo de reteno dos enantimeros
dentro de limites aceitveis, observou-se tambm que as porcentagens de metanol
empregadas nos prximos experimentos deveriam ser preferencialmente superiores
a 40% (vide quadro 6.1 ensaio 3).
Com relao vazo da fase mvel, observou-se que, a 2,0 mL.min
-1
, a
presso gerada no sistema era consideravelmente elevada. No entanto, como essa
presso estava ainda dentro dos limites suportados pela coluna, estabeleceu-se 2,0
mL.min
-1
como o nvel superior em que o fator vazo da fase mvel seria investigado
no planejamento fatorial fracionrio. Como nvel inferior, foi estabelecida a vazo de

270

______________________
1,0 mL.min
-1
, uma vez que uma vazo de 0.5 mL.min
-1
resultou em um aumento
desnecessrio do tempo de corrida, j que este no se traduziu em um aumento
expressivo da resoluo (quadro 6.1 ensaios 2 e 4).
Para todos os outros fatores, entretanto, o campo experimental investigado
durante o planejamento fatorial fracionrio pde ser definido a priori. Esse foi o caso,
por exemplo, para o fator temperatura da coluna. sabido que, em geral, quanto
menor a temperatura, maior a seletividade exibida pelas fases estacionrias
quirais
98
. Assim sendo, no havia razo para se definir uma temperatura
relativamente alta como nvel superior (acima da temperatura ambiente, por
exemplo). O nvel inferior, por sua vez, foi definido com base nas limitaes impostas
pelo forno empregado para controlar a temperatura da coluna, o qual incapaz de
manter temperaturas inferiores a 15 C abaixo da temperatura do ambiente onde se
encontra o cromatgrafo (T
F
T
A
- 15 C)*.
No tocante aos nveis estabelecidos para o fator pH do tampo, esses foram
definidos com base no pKa do fenoprofeno, o qual 4,5. Sendo o fenoprofeno um
frmaco cido e ionizvel, era importante investigar a seletividade da coluna Whelk-
O 1 frente s formas dissociada e no-dissociada do frmaco, bem como
estabelecer uma relao entre o estado de dissociao do frmaco e a sua reteno
pela coluna. Essa foi a razo pela qual os nveis para o fator pH do tampo foram
estabelecidos em 1 unidade a partir do pKa do frmaco; porque, nesses valores de
pH, o fenoprofeno encontrado predominantemente ionizado e no-ionizado (acima
de 90% em cada caso). Alm disso, esses nveis esto, claro, dentro dos limites de
pH suportados pela coluna Whelk-O 1, a qual pode ser utilizada numa faixa de pH
que se estende de 2,5 a 7,5.

*T
F
, temperatura do forno; T
A
, temperatura ambiente.

271

Os nveis adotados para o fator molaridade do tampo, por sua vez, foram
arbitrariamente fixados em 20 e 40 mM, porque esses nveis cobrem razoavelmente
a faixa de concentrao recomendada para as solues tampo empregadas em
CLAE (que de 10 a 50 mM).
Os dados obtidos atravs dos experimentos realizados de acordo com o
planejamento fatorial fracionrio (tabelas 6.7 e 6.8) permitiram o clculo das
estimativas dos efeitos de todos os 5 fatores sobre cada uma das 6 respostas
escolhidas (tabelas 6.9 a 6.14). Os valores das estimativas dos efeitos principais,
com seus respectivos intervalos de confiana, foram apresentados nas figuras 6.11 a
6.16. Contudo, em se tratando de um planejamento fatorial fracionrio, deve ser
lembrado que os efeitos principais so confundidos com efeitos de ordem mais alta
(interaes).
Planejamentos fatoriais completos no so normalmente empregados para
realizar a triagem de fatores devido ao grande nmero de experimentos envolvidos.
Em um planejamento fatorial completo, o nmero de experimentos (N = l
ln
)
corresponde a todas as possveis combinaes entre os fatores selecionados (n) e
seus nveis (l). Isso quer dizer que, para 5 fatores investigados em dois nveis, um
total de 32 experimentos seria necessrio. Por outro lado, em planejamentos
fatoriais fracionrios, o nmero de experimentos reduzido, uma vez que as
interaes so consideradas insignificantes. Infelizmente, isso nem sempre
corresponde realidade, especialmente em CLAE, onde no incomum que duas
ou mais variveis interajam entre si. Mesmo assim, a opo por um planejamento
fatorial fracionrio pode se revelar uma boa deciso, pois, com relativa freqncia,
um ou mais efeitos se apresentam estatisticamente insignificantes e, assim, alguns
fatores podem ser excludos de estudos posteriores.
Discusso

272

Esse foi o caso, por exemplo, do fator molaridade do tampo, se forem
consideradas apenas as respostas fator de separao entre os picos, resoluo
entre os picos e nmero mdio de pratos tericos (figuras 6.13 a 6.15). Alm disso,
se as interaes entre os fatores forem consideradas no-significativas, ento seria
possvel afirmar que quanto maior a molaridade do tampo, menores so o tempo e
o fator de reteno referentes ao segundo pico (figuras 6.11 e 6.12). Com base
nessas concluses, o fator molaridade do tampo foi excludo do conjunto de fatores
selecionados para o planejamento composto central e seu nvel foi fixado em 50 mM
para todos os experimentos posteriores. Essa deciso foi tomada porque, fixando a
molaridade do tampo em seu nvel mais alto (dentro da faixa de concentraes
recomendadas), esperava-se obter tempos de reteno menores sem que isso
acarretasse prejuzos para a resoluo entre os picos.
Contudo, o efeito do fator molaridade do tampo sobre a funo de resposta
cromatogrfica foi considerado significativo, assim como o efeito dos demais fatores
sobre essa mesma resposta (figura 6.16). Porm, como a molaridade do tampo no
afeta a resoluo entre os picos, e como seu efeito sobre o fator de reteno do
segundo enantimero relativamente pouco significativo, ento possvel que essa
concluso esteja equivocada. Provavelmente, o efeito atribudo molaridade do
tampo sobre a funo de resposta cromatogrfica causado, na verdade, por uma
das interaes que se confundem com esse efeito principal. De qualquer maneira, os
resultados apresentados na figura 6.16 no contriburam para a excluso de nenhum
dos fatores.
A temperatura da coluna, por sua vez, exerce um efeito significativo sobre
todas as respostas, exceo do nmero mdio de pratos tericos. Uma elevao
na temperatura da coluna conduz a uma diminuio da resoluo entre os picos
Discusso

273

(figura 6.14) assim como em todas as respostas relacionadas reteno dos
analitos (figuras 6.11 a 6.13). Essa diminuio da resoluo pode ser atribuda a
uma diminuio correspondente no fator de separao entre os picos (ou
seletividade). Embora j se soubesse antes de qualquer experimentao que um
aumento da temperatura da coluna geralmente contribui para a diminuio da
enantiosseletividade exibida pela coluna Whelk-O 1, era importante saber o quanto
este efeito seria significativo quando comparado aos possveis efeitos de outros
fatores sobre a enantiosseletividade. Entretanto, somente os fatores temperatura da
coluna e pH do tampo exercem efeitos significativos sobre o fator de separao
entre os picos. Alm disso, esses efeitos so contrrios um ao outro.
Como pode ser visto na figura 6.13, um aumento no pH do tampo conduz a
um aumento no fator de separao. Todavia, esse aumento no fator de separao
no se traduz, como esperado, em um aumento na resoluo entre os picos. Na
verdade, a resoluo diminui com o aumento do pH do tampo (figura 6.14). Esse
aparente paradoxo poderia ser explicado se o aumento do fator de separao viesse
acompanhado por uma diminuio da eficincia da coluna, atribuda ao alargamento
relativo dos picos. O alargamento dos picos a um valor de pH mais elevado pode
ocorrer porque amostras inicas interagem com os silanis presentes nas partculas
de slica da coluna, resultando em picos caudados. Todas as colunas constitudas
por partculas de slica contm silanis acessveis. Os efeitos desses silanis so
mais evidentes quando o pH da fase mvel superior a 3,5, porque nessa condio
h uma maior concentrao de silanis ionizados. No entanto, as interaes entre os
analitos e os silanis podem ser minimizadas empregando uma fase mvel de baixo
pH (2,0 < pH < 3,5), uma maior concentrao do tampo, ou escolhendo tampes
cujos ctions so fortemente atrados pelos silanis, como os ctions
4
NH
+
214
.
Discusso

274

Como, na verdade, os resultados demonstraram que o pH do tampo no tem efeito
significativo sobre o nmero mdio de pratos tericos a medida da eficincia da
coluna (figura 6.15), ento a diminuio da resoluo s pode ser atribuda a uma
diminuio do fator de reteno dos enantimeros relativamente superior ao
aumento do fator de separao (vide equao 7.1 abaixo). De fato, os resultados
demonstram que, pelo menos dentro do campo experimental investigado, variar o pH
do tampo a maneira mais efetiva de afetar o fator de reteno dos enantimeros
(figura 6.12).
A segunda maneira mais efetiva para promover mudanas no fator de
reteno dos enantimeros variar a porcentagem de metanol na fase mvel.
Realmente, a porcentagem de metanol na fase mvel possui um efeito significativo
sobre todas as respostas estudadas, exceo do fator de separao entre os picos
e do nmero mdio de pratos tericos. Quanto maior a porcentagem de metanol na
fase mvel, menor a resoluo entre os picos. O mesmo pode ser dito em relao ao
tempo e ao fator de reteno referentes ao segundo pico.
A resoluo entre dois picos pode ser expressa em termos de trs parmetros
cromatogrficos (k, e N), como definido pela bem conhecida equao 7.1:

( )
1
4 1
S
N k
R
k
=
+

(Eq. 7.1)

onde N o nmero de pratos da coluna, o fator de separao e k o fator de
reteno mdio entre dois picos adjacentes.

Pela anlise da equao acima se pode concluir que um aumento na
porcentagem de metanol na fase mvel diminui a resoluo por meio da reduo no
Discusso

275

fator de reteno mdio, uma vez que o nmero mdio de pratos e o fator de
separao no so significativamente afetados por esse aumento (figuras 6.12, 6.13
e 6.15).
Finalmente, o fator vazo da fase mvel, alm do efeito bvio que exerce
sobre o tempo (e sobre o fator) de reteno dos analitos, tambm afeta a resoluo
entre os picos e o nmero mdio de pratos tericos. Na verdade, esse foi o nico
fator a afetar o nmero mdio de pratos tericos (figura 6.15). Verifica-se que um
aumento na vazo da fase mvel reduz a eficincia da coluna, pois, de um modo
geral, h um alargamento dos picos na medida em que a vazo aumenta, conforme
explicado pela equao de van Deemter
215
. Por outro lado, a mudana na vazo da
fase mvel no afeta significativamente o fator de separao entre os picos (figura
6.13), uma vez que o tempo de reteno de cada enantimero afetado igualmente.
Alm disso, por diminuir ao mesmo tempo o nmero mdio de pratos tericos e o
fator de reteno mdio sem, contudo, afetar o fator de separao, um aumento na
vazo da fase mvel pode levar a uma diminuio significativa da resoluo entre os
picos (figura 6.14), conforme explicado pela equao 7.1. Levando tudo isso em
considerao, uma maior vazo da fase mvel parece no apresentar vantagens
sobre a vazo usual de 1,0 mL.min
-1
, uma vez que os tempos de reteno podem
ser diminudos por um aumento no pH do tampo sem comprometer a resoluo
entre os picos tanto quanto uma maior vazo da fase mvel o faria. Alm disso, a
vida til da coluna aumentada se ela no for submetida a presses mais elevadas.
Assim sendo, o fator vazo da fase mvel foi excludo do conjunto de fatores
selecionados para planejamento composto central e seu nvel foi fixado em 1,0
mL.min
-1
para todos os experimentos posteriores.
Discusso

276

Como conseqncia, os trs fatores restantes selecionados para o
planejamento composto central foram: porcentagem de metanol na fase mvel (v/v),
pH do tampo e temperatura da coluna. A princpio, para esse planejamento, apenas
uma varivel seria utilizada como resposta: a funo de resposta cromatogrfica
proposta por Bylund et al.
Em cromatografia, a avaliao da qualidade de uma separao muito
freqentemente baseada em vrios critrios. De fato, o resultado de um processo de
otimizao de um mtodo cromatogrfico depende muito do critrio de otimizao
selecionado. Vrias funes de resposta cromatogrfica j foram sugeridas para
auxiliar o analista no processo de tomada de deciso. Essas funes de resposta
cromatogrfica refletem normalmente um compromisso entre o tempo de corrida
cromatogrfica e a qualidade da separao, mas, infelizmente, ainda no foi
desenvolvida nenhuma funo de resposta geral que fosse capaz de descrever
adequadamente todas as separaes. Uma boa reviso de algumas das funes de
resposta cromatogrfica j propostas pode ser encontrada no artigo de Siouffi e
Phan-Tan-Luu
210
.
Neste trabalho, tentou-se usar uma funo de resposta cromatogrfica em
particular, proposta por Bylund et al.
209
, a qual foi especialmente desenvolvida para a
separao de enantimeros. Infelizmente, no foi possvel modelar satisfatoriamente
essa funo de resposta cromatogrfica ajustando os modelos propostos (equaes
5.4 e 5.5) aos dados apresentados nas tabelas 6.17 a 6.19. Por essa razo, decidiu-
se modelar diretamente as respostas resoluo entre os picos e tempo de reteno
referente ao segundo pico e, posteriormente, empregar a metodologia de otimizao
simultnea proposta por Derringer e Suich
212
. Dessa forma, seria possvel encontrar
Discusso

277

o melhor compromisso entre estas duas ltimas respostas sem que uma funo de
resposta cromatogrfica fosse necessria.
As estimativas dos parmetros dos modelos ajustados a cada uma das trs
respostas mencionadas acima so apresentadas na tabela 6.20. Pela anlise dos
dados dessa tabela se pode observar que, excluindo-se do modelo quadrtico
ajustado reposta resoluo entre os picos os termos relacionados a parmetros
no-significativos, obtm-se ento um modelo linear. Alm disso, e ainda
considerando a mesma resposta, interessante notar que o parmetro
correspondente ao efeito principal do fator pH do tampo foi considerado no-
significativo, diferentemente do que foi observado durante o planejamento fatorial
fracionrio. Com isso, pode-se concluir que, se o pH varia dentro de uma faixa mais
estreita, seu efeito sobre a resoluo desprezvel. Entretanto, uma pequena
variao no pH do tampo continua a afetar significativamente o tempo de reteno
dos enantimeros.
De fato, todos os termos considerados no-significativos ( = 0,05) foram
excludos de seus respectivos modelos. A qualidade do ajuste de cada novo modelo
(sem os termos no-significativos) foi avaliada pela anlise de suas varincias. Os
resultados so apresentados nas tabelas 6.21 a 6.25.
De acordo com os resultados apresentados nas tabelas 6.21 e 6.22, ambos
os modelos propostos para a funo de resposta cromatogrfica apresentaram
significativa falta de ajuste, muito embora a adio de termos quadrticos ao modelo
linear tenha resultado em um modelo bastante superior. Por essa razo, o uso da
funo de resposta cromatogrfica foi abandonado em favor da otimizao direta
das outras duas respostas. O modelo linear para a resposta tempo de reteno
referente ao segundo pico tambm foi beneficiado pela adio de alguns termos
Discusso

278

quadrticos, pois, enquanto esse modelo apresenta significativa falta de ajuste e
explica apenas 92,23% da variao observada, o modelo quadrtico bem ajustado
e explica 98,23% da mesma variao (tabelas 6.24 e 6.25). A resposta resoluo
entre os picos, por sua vez, bem descrita por um modelo linear, o qual capaz de
explicar 95,13% da variao observada e no apresenta falta de ajuste significativa
(tabela 6.23).
Para as respostas funo de resposta cromatogrfica e tempo de reteno
referente ao segundo pico, a superioridade dos modelos quadrticos pode ser
claramente observada comparando-se os resduos deixados por ambos os modelos
(linear e quadrtico) nos respectivos grficos de distribuio dos resduos (grficos
6.17, 6.18, 6.20 e 6.21).
Com relao aos modelos propostos para as respostas resoluo entre os
picos e tempo de reteno referente ao segundo pico, nenhuma evidncia foi
encontrada que possa sugerir que os resduos deixados por esses modelos no
sigam uma distribuio normal. Isso pode ser confirmado observando-se as figuras
6.22 a 6.25, mais particularmente os grficos de probabilidade normal dos resduos.
Esse fato importante, pois a normalidade evidenciada na distribuio dos resduos
torna legtima a anlise da varincia desses modelos.
A superfcie e o perfil de resposta gerados pelo modelo linear proposto para a
resposta resoluo entre os picos so apresentados nas figuras 6.26 e 6.27. As
figuras 6.28 a 6.30, por sua vez, apresentam as superfcies de resposta descritas
pelo modelo quadrtico proposto para a resposta tempo de reteno referente ao
segundo pico. Analisando essas figuras se pode perceber que a resoluo pode ser
melhorada diminuindo-se a porcentagem de metanol na fase mvel ou diminuindo-se
a temperatura. Todavia, definitivamente mais vantajoso diminuir a temperatura,
Discusso

279

uma vez que o aumento correspondente observado no tempo de reteno dos
enantimeros seria menor (considerando, claro, variaes equivalentes nos nveis
de ambos os fatores capazes de promover o mesmo aumento na resoluo entre os
picos). Alm disso, evidente que, como o pH do tampo no afeta a resoluo
(dentro do novo domnio experimental), seria mais vantajoso fix-lo em seu nvel
mais elevado (pH 4.74), de modo a obtermos tempos de reteno menores. De fato,
essas concluses esto de acordo com o que foi sugerido pela metodologia
proposta por Derringer e Suich, quando da otimizao simultnea das respostas
resoluo entre os picos e tempo de reteno referente ao segundo pico.
Os valores alcanados para a desejabilidade global e, em especial, para a
desejabilidade individual referente resoluo entre os picos ficaram aqum das
expectativas. No obstante, uma boa separao entre os enantimeros foi
alcanada. Essa separao, porm, no foi total; pelo menos, no dentro dos limites
impostos para o tempo de reteno dos enantimeros. Por outro lado, os ensaios
demonstraram que possvel alcanar uma separao em linha de base custa de
corridas cromatogrficas mais longas.


A estratgia adotada para o desenvolvimento de um mtodo de separao
para os enantimeros do fenoprofeno por CLAE em fase normal diferiu
completamente daquela adotada em fase reversa. Em fase reversa, devido ao
grande nmero de variveis inicialmente consideradas, preferiu-se adotar uma
Discusso

280

abordagem multivariada, enquanto que, em fase normal, a abordagem foi
exclusivamente univariada.
O primeiro passo no desenvolvimento do mtodo consistiu em selecionar um
solvente que apresentasse uma boa seletividade frente aos enantimeros do
fenoprofeno. Na CLAE em fase normal, as diferenas entre as seletividades exibidas
por diferentes solventes so governadas, em um primeiro momento, pela capacidade
de localizao desses solventes. Por essa razo, foram investigados solventes que
possuem e que no possuem essa capacidade. Entre os solventes com capacidade
de localizao, a seletividade pode ainda ser radicalmente diferente em virtude de
outras caractersticas do solvente como, por exemplo, seu carter bsico ou no, ou
ainda a presena de grupos doadores de prtons. Entre os solventes sem
capacidade de localizao investigados esto o diclorometano e o 1,2-dicloroetano.
Entre aqueles com capacidade de localizao, teve-se o cuidado de investigar
solventes com caractersticas distintas, como o acetato de etila (no-bsico), o
dioxano (bsico) e o 2-propanol (o qual possui grupo doador de prtons).
Os quadros 6.5 e 6.6 apresentam os cromatogramas obtidos durante a
investigao da seletividade desses solventes. Pela anlise desses cromatogramas,
pde-se observar que o nico solvente a apresentar total ausncia de seletividade
foi o dioxano (ensaio 7, 8 e 9), ao passo em que o grau de seletividade entre os
demais solventes foi bastante variado. O diclorometano e o 1,2-dicloroetano
apresentaram uma seletividade muito pequena, que dificilmente possibilitaria a
resoluo dos enantimeros em linha de base mesmo com a otimizao de outras
condies cromatogrficas. Entre ambos, o 1,2-dicloroetano apresentou a pior
seletividade, alm de resultar em uma maior reteno dos enantimeros. No ensaio
16, por exemplo, no foi observada a eluio dos enantimeros mesmo aps 30
Discusso

281

minutos de corrida. Os dois solventes mais promissores foram o acetato de etila e o
2-propanol, sendo que o ltimo apresentou uma seletividade ligeiramente superior.
Pde-se observar tambm que possvel alcanar uma resoluo bastante razovel
entre os enantimeros em uma fase mvel constituda apenas por hexano e cido
actico (ensaio 1), muito embora o tempo de corrida seja bastante insatisfatrio
(acima de 30 minutos).
No entanto, uma das observaes mais importantes obtidas pela anlise dos
cromatogramas apresentados nos quadros 6.5 e 6.6 diz respeito importncia da
soluo diluente utilizada para solubilizar a amostra. Pde-se observar que, quando
a polaridade dessa soluo era maior que a polaridade da fase mvel, havia uma
conseqente deteriorao no formato dos picos. Essa deteriorao pde ser
observada nos ensaios 2, 3, 6 e 12, e ela fica evidente se forem comparados os
ensaios 2 e 3 com os ensaios 13 e 14. Essa observao conduziu a uma mudana
na preparao da amostra, adotada a partir do ensaio 13. Com essa mudana, a
concentrao de etanol na soluo diluente final ficou limitada a 1% v/v.
Tendo o 2-propanol se mostrado o solvente mais promissor, decidiu-se ento
investigar a seletividade de outros alcois. A tabela 6.26 apresenta a anlise dos
cromatogramas obtidos durante essa investigao. Com base nos dados
apresentados nessa tabela, no foi possvel estabelecer uma relao entre a
seletividade exibida pelos diferentes alcois e o tamanho da cadeia carbnica dos
mesmos. O 2-propanol continuou sendo o solvente a exibir a melhor seletividade, ao
lado do 2-butanol. Entretanto, a resoluo entre os picos foi ligeiramente superior
com o emprego do 2-propanol, mas provvel que essa diferena no seja
significativa. Pde-se observar tambm que a altura dos picos foi consideravelmente
menor com o emprego do 1-butanol e do 2-butanol. Todavia, isso se deve
Discusso

282

provavelmente ao fato de terem sido empregados 1-butanol e 2-butanol de grau
analtico e no grau cromatogrfico, uma vez que a maior absortividade apresentada
pelos solventes de grau analtico (relacionada presena de impurezas) contribui
para a diminuio do sinal analtico gerado pela passagem do analito na clula do
detector. Assim, optou-se pelo 2-propanol como modificador orgnico, passando-se
em seguida otimizao de outras condies cromatogrficas.
A vazo da fase mvel foi a primeira condio cromatogrfica otimizada aps
a escolha do modificador orgnico. A avaliao dos cromatogramas obtidos durante
essa etapa de otimizao apresentada na tabela 6.27. Os dados apresentados
nessa tabela mostram que a resoluo entre os picos (R
s
) aumenta gradualmente
com a diminuio da vazo. No entanto, a porcentagem de aumento obtida sobre a
resoluo (A1) menor a cada decrscimo de 0,1 mL.min
-1
imposto vazo da fase
mvel, ao passo em que o aumento observado sobre o tempo de reteno referente
ao segundo pico (A2) se mantm mais ou menos constante. Dessa maneira, quando
a vazo atinge 0,6 mL.min
-1
, a razo A2/A1 aumenta significativamente, de tal modo
que no vantajoso adotar uma vazo para a fase mvel inferior a 0,7 mL.min
-1

(vide tabela 6.28 e figura 6.31). Com a diminuio da vazo da fase mvel de 1,0
para 0,7 mL.min
-1
, conseguiu-se um aumento de 5,77% sobre a resoluo. Em
contrapartida, o tempo de reteno referente ao segundo pico teve um aumento
superior a 50%, embora tenha se mantido ainda dentro de limites aceitveis.
Observou-se tambm um aumento da eficincia da coluna (superior a 8%) e uma
ligeira diminuio da assimetria dos picos. O fator de separao, entretanto,
permaneceu constante.
Posteriormente, decidiu-se otimizar a temperatura da coluna. A tabela 6.29
apresenta a avaliao dos cromatogramas obtidos nessa etapa de otimizao do
Discusso

283

mtodo. De acordo com os dados dessa tabela, pde-se concluir que o principal
efeito da diminuio da temperatura da coluna se faz notar sobre a resoluo. Com a
diminuio da temperatura da coluna de 24 para 12 C, observou-se um aumento da
resoluo (A1) aproximadamente igual 18%. Por outro lado, o aumento observado
sobre o tempo de reteno referente ao segundo pico (A2) foi de apenas 6,34%.
Alm disso, a razo A1/A2 aumenta progressivamente com a diminuio da
temperatura da coluna (vide tabela 6.30 e figura 6.32). Ao mesmo tempo, e
diferentemente do que foi observado durante a diminuio da vazo da fase mvel,
o fator de separao aumenta com a diminuio da temperatura da coluna, o que
explica, em parte, o aumento da resoluo entre os picos.
A ltima condio cromatogrfica a ser otimizada foi a quantidade de cido
actico empregada na fase mvel. A avaliao dos cromatogramas obtidos durante
essa etapa de otimizao apresentada na tabela 6.31. A interpretao dos dados
dessa tabela dificultada pelos resultados do ensaio 35, onde algumas respostas
(especialmente os tempos de reteno) apresentaram valores que contrariam a
tendncia observada nos ensaios anteriores. Contudo, o ensaio 35 foi repetido
algumas vezes e os resultados obtidos foram semelhantes entre as repeties. De
qualquer modo, se forem desconsiderados os resultados do ensaio 35, ento se
pode dizer que, com a diminuio da quantidade de cido actico empregada na
fase mvel, h um aumento do tempo de reteno dos enantimeros, acompanhado
de um aumento do fator de separao e da resoluo entre os picos. Contudo a
presena de cido actico na fase mvel fundamental, como mostra o ensaio 36
(quadro 6.10). Na ausncia de cido actico na fase mvel, os picos se apresentam
extremamente caudados e a resoluo entre eles fica seriamente prejudicada. Como
os resultados do ensaio 35 foram considerados atpicos, estabeleceu-se a fase
Discusso

284

mvel empregada no ensaio 34 como aquela que corresponde condio otimizada.
Isso porque, nesse ensaio, obteve-se a maior razo entre o aumento da resoluo e
o aumento do tempo de reteno referente ao segundo pico, mantendo-se o tempo
de corrida dentro de limites aceitveis (vide tabela 6.32 e figura 6.33).
Assim sendo, aps o desenvolvimento e a otimizao do mtodo de
separao, foi possvel alcanar a resoluo em linha de base dos enantimeros do
fenoprofeno em um tempo de corrida inferior a 20 minutos, empregando-se a CLAE
em fase normal.


A estratgia adotada para o desenvolvimento de um mtodo de separao
para os enantimeros do cetoprofeno por CLAE em fase reversa tambm foi
baseada em uma abordagem univariada. O primeiro passo no desenvolvimento do
mtodo consistiu em selecionar um solvente que apresentasse uma boa seletividade
frente aos enantimeros do cetoprofeno. Foram ento testados dois dos
modificadores orgnicos mais comumente usados em fase reversa, acetonitrila e
metanol, alm de dois outros alcois, etanol e 2-propanol. O primeiro modificador
orgnico testado foi o metanol (ensaio 1). No ensaio 2, a porcentagem de metanol
na fase mvel foi diminuda, com o intuito de ajustar o fator de reteno referente ao
segundo pico para dentro de um intervalo aceitvel (entre 3,0 e 5,0). Nos ensaios
posteriores (ensaios 3 a 5), a porcentagem adotada para os demais modificadores
orgnicos foi calculada com a ajuda de um nomgrafo, tendo por base a
Discusso

285

porcentagem de metanol empregada no ensaio 2. No entanto, mesmo com a ajuda
de um nomgrafo, os tempos de reteno obtidos variaram bastante entre os
ensaios 2 a 5. Entre os solventes testados, a acetonitrila apresentou a pior
seletividade. Etanol e 2-propanol foram os solventes mais promissores,
apresentando uma seletividade quase idntica entre si. Contudo, o etanol foi o
modificador orgnico escolhido, devido maior solubilidade do cetoprofeno nesse
solvente.
Em seguida, verificou-se a influncia do pH do tampo sobre a resoluo
entre os picos. Para tanto, utilizou-se dois tampes distintos: tampo formato de
amnio 25 mM pH 3,0 e tampo acetato de amnio 25 mM pH 5,5. Esses valores de
pH foram escolhidos de maneira a se trabalhar abaixo e acima do pKa do frmaco
(que 4,5). O emprego de um pH menos cido se mostrou mais promissor, em
virtude do maior fator de separao alcanado em pH 5,5. Por essa razo, adotou-se
o tampo acetato de amnio 25 mM pH 5,5 para todos os demais ensaios. Alm
disso, foi observada uma reduo dramtica no tempo de reteno dos
enantimeros quando este ltimo tampo foi empregado.
Por fim, decidiu-se diminuir a temperatura da coluna e a vazo da fase mvel
na tentativa de se alcanar uma resoluo satisfatria entre os enantimeros.
Todavia, embora a diminuio da temperatura da coluna tenha permitido um
pequeno aumento do fator de separao, a diminuio da vazo exerceu o efeito
oposto, o que no era esperado. De qualquer maneira, foi observado um aumento
da resoluo com a diminuio da vazo da fase mvel, muito embora esse
aumento no tenha sido expressivo. Adicionalmente, observou-se um aumento
significativo da assimetria dos picos.
Discusso

286

Os resultados obtidos durante a tentativa de desenvolvimento do mtodo
podem ser vistos na tabela 6.33 e nos quadros 6.11 e 6.12. Diante desses
resultados, concluiu-se que outras aes objetivando a otimizao do mtodo no
seriam muito promissoras, uma vez que a resoluo mxima obtida at ento estava
ainda longe de ser satisfatria. Assim sendo, o desenvolvimento de um mtodo de
separao para os enantimeros do cetoprofeno por CLAE em fase reversa foi
abandonado, na esperana de que a fase normal se mostrasse mais adequada
separao desses enantimeros.


Para o desenvolvimento de um mtodo de separao para os enantimeros
do cetoprofeno por CLAE em fase normal, optou-se novamente por uma abordagem
multivariada. Neste caso, a abordagem consistiu em otimizar a fase mvel
empregando-se um planejamento experimental do tipo planejamento de mistura,
conforme descrito no subitem 5.2.5.5. Dois dos componentes da fase mvel foram
escolhidos a priori, hexano e diclorometano. Esses solventes so comumente
empregados em fases mveis binrias, misturados a outros solventes mais polares,
como ter ter-butil metlico, acetato de etila, tetraidrofurano, 2-propanol, etc., embora
tambm possa ser empregada uma mistura binria entre ambos. Em CLAE em fase
normal, a reteno dos analitos diminui na medida em que a polaridade da fase
mvel aumenta. Como o hexano e o diclorometano possuem uma significativa
diferena de polaridade, optou-se por utilizar ambos em uma fase mvel ternria, de
Discusso

287

maneira que a reteno dos enantimeros pudesse ser controlada variando-se
apenas a proporo entre esses dois solventes. Um terceiro solvente, mais polar
(um lcool), seria ento adicionado fase mvel, de modo a proporcionar a
seletividade desejada. Alm disso, esse terceiro solvente forneceria, obviamente,
uma opo adicional para o controle da reteno dos enantimeros. Alm disso,
seria necessria a presena de um aditivo de fase mvel que minimizasse a
assimetria dos picos (ou, em outras palavras, a ocorrncia de picos caudados). Para
frmacos cidos, como o caso do cetoprofeno, o aditivo normalmente empregado
o cido actico ou o acetato de amnio.
Para que pudessem ser escolhidos o terceiro solvente e o aditivo de fase
mvel mais apropriado, foram realizados alguns experimentos preliminares. Nesses
experimentos, foram testados dois diferentes alcois, o 2-propanol e o etanol, alm
dos dois aditivos de fase mvel citados anteriormente. Devido sua baixa
solubilidade em 2-propanol, o acetato de amnio no foi empregado em conjunto
com esse solvente. Os cromatogramas obtidos nos ensaios preliminares so
apresentados no quadro 6.13. Pode-se perceber, pela anlise desses
cromatogramas, que as melhores separaes foram atingidas empregando-se o
acetato de amnio como aditivo de fase mvel, o que determinou a sua escolha e a
sua utilizao em todos os experimentos futuros. Conseqentemente, o etanol foi
escolhido para ser o terceiro solvente a compor as misturas investigadas no
planejamento de mistura. Os ensaios preliminares tambm ajudaram a estabelecer,
com base nos tempos de reteno obtidos, as propores mnima e mxima em que
esse solvente seria utilizado.
Para os ensaios previstos pelo planejamento de mistura, decidiu-se manter a
temperatura da coluna em 12 C, uma vez que j se sabia, a priori, que temperaturas
Discusso

288

inferiores favoreceriam a enantiosseletividade exibida pela coluna Whelk-O 1. Alm
disso, os mtodos desenvolvidos anteriormente haviam demonstrado ser verdadeira
essa relao entre a temperatura e a enantiosseletividade exibida pela coluna. A
varivel vazo da fase mvel, por sua vez, no foi otimizada, tendo sido fixada em
1,0 mL.min
-1
para todos os ensaios.
No tocante ao planejamento de mistura, pretendia-se, inicialmente, ajustar os
modelos matemticos propostos (equaes 5.19 a 5.21) a duas respostas apenas: a
resoluo entre os picos e o tempo de reteno referente ao segundo pico. Contudo,
como no foi possvel modelar satisfatoriamente esta ltima resposta, tentou-se
ento modelar a resposta logaritmo neperiano do fator de reteno referente ao
segundo pico.
As estimativas dos parmetros dos modelos ajustados a cada uma das trs
respostas mencionadas acima so apresentadas na tabela 6.36. Pela anlise dos
dados dessa tabela se pode observar que, para as respostas resoluo entre os
picos e logaritmo neperiano do fator de reteno referente ao segundo pico, a
adoo do modelo cbico especial no se justifica, uma vez que a estimativa do
parmetro
*
123
foi considerada no significativa ( = 0,05).
A qualidade do ajuste de cada um dos modelos obtidos foi avaliada pela
anlise de suas varincias. Os resultados so apresentados nas tabelas 6.37 a 6.42.
De acordo com os resultados apresentados na tabela 6.39, todos os modelos
propostos para a resposta tempo de reteno referente ao segundo pico
apresentaram significativa falta de ajuste, muito embora os modelos quadrtico e
cbico especial tenham se revelado bastante superiores em relao ao modelo
linear.
Discusso

289

Os modelos lineares propostos para as respostas resoluo entre os picos e
logaritmo neperiano do fator de reteno referente ao segundo pico tambm
apresentaram significativa falta de ajuste, diferentemente dos modelos quadrticos
propostos para essas mesmas respostas (tabelas 6.37, 6.38, 6.41 e 6.42). A
superioridade dos modelos quadrticos pode ser claramente observada
comparando-se os resduos deixados por esses modelos com os resduos deixados
pelos modelos lineares, os quais podem ser vistos nos respectivos grficos de
distribuio dos resduos (grficos 6.35, 6.36, 6.38 e 6.39). Alm disso, nenhuma
evidncia foi encontrada que possa sugerir que os resduos deixados pelos modelos
quadrticos no sigam uma distribuio normal. Isso pode ser confirmado atravs
das figuras 6.40 a 6.43, mais particularmente nos grficos de probabilidade normal
dos resduos.
A otimizao simultnea das respostas resoluo entre os picos e logaritmo
neperiano do fator de reteno referente ao segundo pico acabou por estabelecer
uma fase mvel binria para o mtodo, a qual no contm diclorometano. Os valores
alcanados para a desejabilidade global bem como para as desejabilidades
individuais ficaram muito aqum das expectativas, especialmente a desejabilidade
individual referente resoluo entre os picos. Para que a resoluo entre os picos
no fosse ainda mais comprometida, permitiu-se inclusive que o fator de reteno
referente ao segundo pico fosse superior a 5,0 (o fabricante da coluna recomenda
que este esteja entre 3,0 e 5,0). Mesmo assim, no foi possvel separar os
enantimeros em linha de base dentro dos limites impostos para o tempo de corrida.
De qualquer maneira, a resoluo obtida foi muito superior quela alcanada em
fase reversa.
Discusso

290

Nas condies otimizadas estabelecidas para o mtodo, e empregando a
coluna (S,S)-Whelk-O 1, pde-se observar que o (S)-(+)-cetoprofeno elui aps o (R)-
(-)-cetoprofeno, conforme demonstram os resultados da tabela 6.43. Contudo, como
a coluna Whelk-O 1 est disponvel em ambas as formas enantiomricas, uma
inverso da ordem de eluio pode ser facilmente obtida substituindo-se a coluna
utilizada pela (R,R)-Whelk-O 1.

7.6 APLICAO DOS MTODOS SELECIONADOS S AMOSTRAS DE MEDICAMENTOS

Boas separaes entre os enantimeros foram alcanadas ao se aplicar os
mtodos selecionados s amostras de medicamentos. Contudo, uma diferena
significativa foi observada com relao aos parmetros cromatogrficos resoluo
entre os picos e tempo de reteno referente ao segundo pico, quando comparados
os valores obtidos durante a otimizao dos mtodos com aqueles obtidos durante a
aplicao dos mtodos s amostras de medicamentos. No caso especfico do
mtodo desenvolvido para a separao dos enantimeros do cetoprofeno por CLAE
em fase normal, a resoluo alcanada durante a anlise dos medicamentos foi
aproximadamente 11% maior (em mdia) do que aquela prevista pelo modelo
matemtico proposto durante a otimizao do mtodo. Por outro lado, o tempo de
reteno obtido foi 19% superior (em mdia) quele previsto matematicamente. No
caso do mtodo desenvolvido para a separao dos enantimeros do fenoprofeno
por CLAE em fase normal, os resultados foram ainda mais desanimadores, muito
embora tenha sido possvel resolver os enantimeros em linha de base durante a
anlise do medicamento. A resoluo obtida foi aproximadamente 8% inferior quela
Discusso

291

Discusso
alcanada durante a otimizao do mtodo e o tempo de reteno praticamente
dobrou.
Infelizmente, um longo tempo se passou entre o desenvolvimento dos
mtodos e a aplicao destes s amostras de medicamentos. Nesse intervalo, a
coluna foi utilizada diversas vezes, com vrios solventes distintos, alternando
inclusive entre os modos normal e reverso. Assim, possvel que as diferenas
observadas possam ser atribudas a um provvel desgaste da coluna.
Por outro lado, possvel afirmar, com base na anlise de pureza dos picos
apresentada na tabela 6.44, que os mtodos se mostraram seletivos em relao s
amostras analisadas (um pico pode ser considerado livre de interferentes se os
valores calculados para a pureza de pico total e para a pureza de pico em trs
pontos se aproximam de 100,0 e de 1,0, respectivamente). Contudo, os mtodos
desenvolvidos no foram validados, uma vez que no foi possvel obter padres de
todos os enantimeros, os quais seriam necessrios validao completa dos
mtodos.

293

8. CONCLUSES

De acordo com os mtodos desenvolvidos e frente a ambos os frmacos,
cetoprofeno e fenoprofeno, a enantiosseletividade exibida pela coluna Whelk-O 1 em
fase normal se revelou superior quela exibida em fase reversa, o que determinou a
escolha dos mtodos baseados em fase normal.
Mesmo assim, foi possvel desenvolver, para os enantimeros do
fenoprofeno, um mtodo de separao satisfatrio por CLAE em fase reversa, o qual
apresentou tempos de reteno adequados e uma resoluo aceitvel, embora no
em linha de base. Contudo, seria possvel obter uma resoluo em linha de base
caso fossem adotados, durante a otimizao do mtodo, critrios menos exigentes
para a aceitao dos tempos de reteno observados. Para os enantimeros do
cetoprofeno, por outro lado, no foi possvel desenvolver um mtodo de separao
razovel por CLAE em fase reversa.
No entanto, empregando a CLAE em fase normal, foi possvel desenvolver
mtodos de separao satisfatrios para os enantimeros de ambos os frmacos.
Todavia, o mtodo de separao para os enantimeros do fenoprofeno se revelou
bastante superior, em termos de resoluo, quando comparado quele desenvolvido
para os enantimeros do cetoprofeno.
Portanto, diante dos resultados obtidos tanto em fase normal quanto em fase
reversa, pode-se afirmar que a enantiosseletividade exibida pela coluna Whelk-O 1
frente aos enantimeros do fenoprofeno maior que aquela exibida frente aos
enantimeros do cetoprofeno. Alm disso, pode-se afirmar tambm que a diminuio
da temperatura da coluna sempre favorece a enantiosseletividade, ao mesmo tempo
em que aumenta a reteno dos enantimeros.
Concluses

294

Concluses
Neste trabalho, mtodos univariados e multivariados foram aplicados com
sucesso no desenvolvimento dos mtodos de separao. Entretanto, embora a
abordagem multivariada permita uma maior compreenso do sistema cromatogrfico
em desenvolvimento, a esperada reduo no nmero de experimentos necessrios
para se chegar s condies otimizadas no foi observada.

295

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

1. DRAYER, D.E. The early history of stereochemistry. In: WAINER, I.W., ed.
Drug stereochemistry: analytical methods and pharmacology. 2.ed. New
York: Marcel Dekker, 1993. p.1-24. (Clinical pharmacology, v.18).

2. SOLOMONS, T.W.G. Estereoqumica: molculas quirais. In: ______. Qumica
orgnica. 6.ed. Rio de Janeiro: LTC, 1996. v.1, p.184-230.

3. MOSS, G.P. Basic terminology of stereochemistry (IUPAC Recommendations
1996). Pure and Applied Chemistry, v.68, n.12, p.2193-2222, 1996.

4. WAINER, I.W.; MARCOTE, A.A. Stereochemical terms and concepts: an
overview. In: WAINER, I.W., ed. Drug stereochemistry: analytical methods
and pharmacology. 2.ed. New York: Marcel Dekker, 1993. p.25-34. (Clinical
pharmacology, v.18).

5. VIEDMA, C. Enantiomeric crystallization from DL-aspartic and DL-glutamic
acids: implications for biomolecular chirality in the origin of life. Origins of Life
and Evolution of the Biosphere, v.31, n.6, p.501-509, 2001.

6. HE, Y.J.; QI, F.; QI, S.C. Effect of earths orbital chirality on elementary
particles and unification of chiral asymmetries in life on different levels.
Medical Hypotheses, v.54, n.5, p.783-785, 2000.

7. BAILEY, J. Chirality and the origin of life. Acta Astronautica, v.46, n.10,
p.627-631, 2000.

8. BRENNA, E.; FUGANTI, C.; SERRA, S. Enantioselective perception of chiral
odorants. Tetrahedron: Asymmetry, v.14, n.1, p.1-42, 2003.

9. ABOUL-ENEIN, H.Y.; BASHA, L.I.A Chirality and drug hazards. In: ABOUL-
ENEIN, H.Y.; WAINER, I.W., eds. The impact of stereochemistry on drug
development and use. New York: John Wiley, 1997. p.1-19. (Chemical
analysis, v.142).

10. OTT, R.J.; GIACOMINI, K.M. Stereoselective transport of drugs across
epithelia. In: WAINER, I.W., ed. Drug stereochemistry: analytical methods
and pharmacology. 2.ed. New York: Marcel Dekker, 1993. p.281-314. (Clinical

296

11. MASON, J.P.; HUTT, A.J. Stereochemical aspects of drug metabolism. In:
ABOUL-ENEIN, H.Y.; WAINER, I.W., eds. The impact of stereochemistry
on drug development and use. New York: John Wiley, 1997. p.45-105.
(Chemical analysis, v.142).

12. NOCTOR, T.A.G. Enantioselective binding of drugs to plasma proteins. In:
WAINER, I.W., ed. Drug stereochemistry: analytical methods and
pharmacology. 2.ed. New York: Marcel Dekker, 1993. p.337-364. (Clinical

13. ANSEL, H.C.; POPOVICH, N.G.; ALLEN Jr., L.V. Formas farmacuticas:
consideraes biofarmacuticas. In: ______. Farmacotcnica: formas
farmacuticas & sistemas de liberao de frmacos. 6.ed. So Paulo: Editorial
Premier, 2000. p.65-112.

14. KARIM, A.; MADHU, C.; COOK, C. Bioequivalency determination of racemic
drug formulations: is stereospecific assay essential? In: REDDY, I.K.;
MEHVAR, R., eds. Chirality in drug design and development. New York:
Marcel Dekker, 2004. p.393-418.

15. SRINIVAS, N.R. Role of stereoselective assays in bioequivalence studies of
racemic drugs: have we reached a consensus? Journal of Clinical
Pharmacology, v.44, n.2, p.115-119, 2004.

16. MIDHA, K.K.; MCKAY, G.; RAWSON, M.J.; HUBBARD, J.W. The impact of
stereoisomerism in bioequivalence studies. Journal of Pharmaceutical
Sciences, v.87, n.7, p.797-802, 1998.

17. KARIM, A. Enantioselective assays in comparative bioavailability studies of
racemic drug formulations: nice to know or need to know? Journal of Clinical

18. MEHVAR, R.; JAMALI, F. Bioequivalence of chiral drugs: stereospecific
versus non-stereospecific methods. Clinical Pharmacokinetics, v.33, n.2,
p.122-141, 1997.

19. EUROPEAN MEDICINES AGENCY. Committee for Medicinal Products for
Human Use. Investigation of Chiral Active Substances. 3CC29A. 1993.
Disponvel em: http://www.emea.europa.eu/pdfs/human/qwp/3cc29aen.pdf.
Acesso em: 11 mar. 2007.

297

20. EUROPEAN MEDICINES AGENCY. Committee for Medicinal Products for
Human Use. Note for Guidance on the Investigation of Bioavailability and
Bioequivalence. CPMP/EWP/QWP/1401/98. 2001. Disponvel em:
http://www.emea.europa.eu/pdfs/human/ewp/140198en.pdf. Acesso em: 11
mar. 2007.

21. UNITED STATES. Food and Drug Administration. Department of Health and
Human Services. Center for Drug Evaluation and Research. Guidance for
Industry on Bioavailability and Bioequivalence Studies for Orally
Administered Drug Products: General Considerations. Rockville: FDA,
2003. 23p.

22. GARCIA-ARIETA, A.; ABAD-SANTOS, F.; RODRIGUEZ-MARTINEZ, M.A.;
VARAS-POLO, Y.; NOVALBOS, J.; LAPARIDIS, N.; GALLEGO-SANDIN, S.;
ORFANIDIS, K.; TORRADO, J. An eutomer/distomer ratio near unity does not
justify non-enantiospecific assay methods in bioequivalence studies. Chirality,
v.17, n.8, p.470-475, 2005.

23. CROSSLEY, R. Chirality and aspects of drug development. In: ______.
Chirality and the biological activity of drugs. Boca Raton: CRC Press,
1995. p.161-187. (New directions in organic and biological chemistry).

24. ALVAREZ, C.; TORRADO, J.J.; CADORNIGA, R. Stereoselective drug
release from ketoprofen and ricobendazole matrix tablets. Chirality, v.11, n.8,
p.611-615, 1999.

25. SOLINS, M.A.; DE LA CRUZ, Y.; CALVO, B.; HERNANDEZ, R.M.; GASCON,
A.R.; GONI, I.; GURRUCHAGA, M.D.; PEDRAZ, J.L. Release of salbutamol
sulphate and ketoprofen enantiomers from matrices containing HPMC and
cellulose derivatives. Chirality, v.14, n.10, p.806-813, 2002.

26. SOLINS, M.A.; DE LA CRUZ, Y.; HERNANDEZ, R.M.; GASCON, A.R.;
CALVO, B.; PEDRAZ, J.L. Release of ketoprofen enantiomers from HPMC
K100M matrices-diffusion studies. International Journal of Pharmaceutics,
v.239, n.1/2, p.61-68, 2002.

27. VALLIAPPAN, K.; KANNAN, K.; MANAVALAN, R.; MURALIDHARAN, C.
Evaluation of stereoselective dissolution of racemic ketoprofen from
formulations containing chiral excipients. Indian Journal of Pharmaceutical
Sciences, v.65, n.3, p.253-259, 2003.

298

28. SRINIVAS, N.R.; BARBHAIYA, R.H.; MIDHA, K.K. Enantiomeric drug
development: issues, considerations, and regulatory requirements. Journal of
Pharmaceutical Sciences, v.90, n.9, p.1205-1215, 2001.

29. AGRANAT, I.; CANER, H.; CALDWELL, J. Putting chirality to work: the
strategy of chiral switches. Nature Reviews: Drug Discovery, v.1, n.10,
p.753-768, 2002.

30. STRONG, M. FDA policy and regulation of stereoisomers: paradigm shift and
the future of safer, more effective drugs. Food and Drug Law Journal, v.54,
n.3, p.463-487, 1999.

31. HUTT, A.J.; VALENTOV, J. The chiral switch: the development of single
enantiomer drugs from racemates. Acta Facultatis Pharmaceuticae
Universitatis Comenianae, v.50, p.7-23, 2003.

32. UNITED STATES. Food and Drug Administration. Department of Health and
Human Services. Center for Drug Evaluation and Research. FDA's Policy
Statement for the Development of New Stereoisomeric Drugs. 2003.
Disponvel em: http://www.fda.gov/cder/guidance/stereo.htm. Acesso em: 11
mar. 2007.

33. CANADA. Health Canada. Guidance for industry: stereochemical issues in
chiral drug development. 1998. Disponvel em: http://www.hc-sc.gc.ca/dhp-
mps/alt_formats/hpfb-dgpsa/pdf/prodpharma/stereo_e.pdf. Acesso em: 11
mar. 2007.

34. VLASSES, P.H.; ROTMENSCH, H.H.; SWANSON, B.N.; IRVIN, J.D.;
JOHNSON, C.L.; FERGUSON, R.K. Indacrinone: natriuretic and uricosuric
effects of various ratios of its enantiomers in healthy men. Pharmacotherapy,
v.4, n.5, p.272-277, 1984.

35. JAIN, A.K.; MICHAEL, R.; RYAN, J.R.; MCMAHON, F.G. Antihypertensive and
biochemical effects of indacrinone enantiomers. Pharmacotherapy, v.4, n.5,
p.278-283, 1984.

36. STINSON, S.C. Chiral pharmaceuticals. Chemical and Engineering News,
v.79, n.40, p.79-97, 2001.

299

37. SANTORO, M.I.R.M.; SINGH, A.K. Development and regulation of chiral drug
substances: an overview on worldwide pharmaceutical guidelines. Revista
Brasileira de Cincias Farmacuticas, v.37, n.3, p.259-268, 2001.

38. INSEL, P.A. Frmacos analgsico-antipirticos e antiinflamatrios e
medicamentos usados no tratamento da gota. In: HARDMAN, J.G.; LIMBIRD,
L.E.; MOLINOFF, P.B.; RUDDON, R.W., GILMAN, A.G., eds. Goodman &
Gilman: as bases farmacolgicas da teraputica. 9.ed. Mxico: McGraw-
Hill Interamericana, 1996. p.450-480.

39. EVANS, A.M. Pharmacodynamics and pharmacokinetics of the profens:
enantioselectivity, clinical implications, and special reference to S(+)-
ibuprofen. Journal of Clinical Pharmacology, v.36, suppl.12, p.7S-15S,
1996.

40. DEF 2004/2005: dicionrio de especialidades farmacuticas. 33.ed. Rio de
Janeiro: Publicaes Cientficas, 2004. p.291, p.663-664.

41. CARABAZA, A.; CABRE, F.; ROTLLAN, E.; GOMEZ, M.; GUTIERREZ, M.;
GARCIA, M.L.; MAULEN, D. Stereoselective inhibition of inducible
cyclooxygenase by chiral nonsteroidal antiinflammatory drugs. Journal of
Clinical Pharmacology, v.36, n.6, p.505-512, 1996.

42. BONEBERG, E.M.; ZOU, M.H.; ULRICH, V. Inhibition of cyclooxigenase-1 and
-2 by R(-)- and S(+)-ibuprofen. Journal of Clinical Pharmacology, v.36,
suppl.12, p.16S-19S, 1996.

43. BRUNE, K.; GEISSLINGER, G.; MENZEN-SOGLOWEK, S. Pure enantiomers
of 2-arylpropionic acids: tools in pain research and improved drugs in
rheumatology. Journal of Clinical Pharmacology, v.32, n.10, p.944-952,
1992.

44. WILLIAMS, K.M. Enantiomers in arthritic disorders. Pharmacology &
Therapeutics, v.46, n.2, p.273-295, 1990.

45. CALDWELL, J.; HUTT, A.J.; FOURNEL-GIGLEUX, S. The metabolic chiral
inversion and dispositional enantioselectivity of the 2-arylpropionic acids and
their biological consequences. Biochemical Pharmacology, v.37, n.1, p.105-
114, 1988.

300

46. MASCAGNI, P.; SABBATINI, V.; BIORDI, L.; MARTINOTTI, S.; ALLEGRETTI,
M.; MARULLO, A.; CASELLI, G.; BERTINI, R. R and S isomers of
nonsteroidal anti-inflammatory drugs differentially regulate cytokine
production. European Cytokine Network, v.11, n.2, p.185-192, 2000.

47. BERTINI, R.; CASELLI, G. Analgesic effect of ketoprofen is mainly associated
to its R-enantiomer: role of cytokine modulation. Analgesia, v.4, n.2, p.181-
186, 1999.

48. GHEZZI, P.; MELILLO, G.; MEAZZA, C.; SACCO, S.; PELLEGRINI, L.; ASTI,
C.; PORZIO, S.; MARULLO, A.; SABBATINI, V.; CASELLI, G.; BERTINI, R.
Differential contribution of R and S isomers in ketoprofen anti-inflammatory
activity: role of cytokine modulation. Journal of Pharmacology and
Experimental Therapeutics, v.287, n.3, p.969-974, 1998.

49. COOPER, S.A.; REYNOLDS, D.C.; REYNOLDS, B.; HERSH, E.V. Analgesic
efficacy and safety of (R)-ketoprofen in postoperative dental pain. Journal of
Clinical Pharmacology, v.38, suppl.2, p.11S-18S, 1998.

50. JERUSSI, T.P.; CAUBET, J.F.; MCCRAY, J.E.; HANDLEY, D.A. Clinical
endoscopic evaluation of the gastroduodenal tolerance to (R)-ketoprofen, (R)-
flurbiprofen, racemic ketoprofen, and paracetamol: a randomized, single-blind,
placebo-controlled trial. Journal of Clinical Pharmacology, v.38, suppl.2,
p.19S-24S, 1998.

51. OSSIPOV, M.H.; JERUSSI, T.P.; REN, K.; SUN, H.; PORRECA, F. Differential
effects of spinal (R)-ketoprofen and (S)-ketoprofen against signs of
neuropathic pain and tonic nociception: evidence for a novel mechanism of
action of (R)-ketoprofen against tactile allodynia. Pain, v.87, n.2, p.193-199,
2000.

52. JAMALI, F.; BROCKS, D.R. Clinical pharmacokinetics of ketoprofen and its
enantiomers. Clinical Pharmacokinetics, v.19, n.3, p.197-217, 1990.

53. FOSTER, R.T.; JAMALI, F.; RUSSELL, A.S.; ALBALLA, S.R.
Pharmacokinetics of ketoprofen enantiomers in healthy subjects following
single and multiple doses. Journal of Pharmaceutical Sciences, v.77, n.1,
p.70-73, 1988.

301

54. LAGRANGE, F.; PHOURCQ, F.; BANNWARTH, B.; LENG, J.J.; SAUX, M.C.
Passage of S-(+)- and R-(-)-ketoprofen across the human isolated perfused
placenta. Fundamental & Clinical Pharmacology, v.12, n.3, p.286-291,
1998.

55. SAKAI, T.; MARUYAMA, T.; SAKO, T.; AHMED, S.; ZUIDEMA, X.;
FUJIYAMA, C.S.; OTAGIRI, M. Stereoselective serum protein binding of
ketoprofen in liver diseases. Enantiomer, v.4, n.5, p.477-482, 1999.

56. BERTUCCI, C. Enantioselective inhibition of the binding of rac-profens to
human serum albumin induced by lithocholate. Chirality, v.13, n.7, p.372-378,
2001.

57. CHUANG, V.T.G.; OTAGIRI, M. Stereoselective binding of human serum
albumin. Chirality, v.18, n.3, p.159-166, 2006.

58. LAPICQUE, F.; MULLER, N.; PAYAN, E.; DUBOIS, N.; NETTER, P. Protein
binding and stereoselectivity of nonsteroidal anti-inflammatory drugs. Clinical
Pharmacokinetics, v.25, n.2, p.115-123, 1993.

59. ABERG, G.; CIOFALO, V.B.; PENDLETON, R.G.; RAY, G.; WEDDLE, D.
Inversion of (R)- to (S)-ketoprofen in eight animal species. Chirality, v.7, n.5,
p.383-387, 1995.

60. SAN MARTN, M.F.; SORACI, A.; FOGEL, F.; TAPIA, O.; ISLAS, S. Chiral
inversion of (R)-(-)-fenoprofen in guinea-pigs pretreated with clofibrate.
Veterinary Research Communications, v.26, n.4, p.323-332, 2002.

61. IGARZA, L.; SORACI, A.; AUZA, N.; ZEBALLOS, H. Chiral inversion of (R)-
ketoprofen: influence of age and differing physiological status in dairy cattle.
Veterinary Research Communications, v.26, n.1, p.29-37, 2002.

62. CASTRO, E.; SORACI, A.; FOGEL, F.; TAPIA, O. Chiral inversion of R(-)-
fenoprofen and ketoprofen enantiomers in cats. Journal of Veterinary
Pharmacology and Therapeutics, v.23, n.5, p.265-271, 2000.

63. RUDY, A.C.; LIU, Y.; BRATER, C.; HALL, S.D. Stereoselective
pharmacokinetics and inversion of (R)-ketoprofen in healthy volunteers.
Journal of Clinical Pharmacology, v.38, suppl.2, p.3S-10S, 1998.

302

64. GRUBB, N.G.; RUDY D.W.; BRATER, D.C.; HALL, S.D. Stereoselective
pharmacokinetics of ketoprofen and ketoprofen glucuronide in end-stage renal
disease: evidence for a 'futile cycle' of elimination. British Journal of Clinical

65. RUBIN, A.; KNADLER, M.P.; HO, P.P.K.; BECHTOL, L.D.; WOLEN, R.L.
Stereoselective inversion of (R)-fenoprofen to (S)-fenoprofen in humans.
Journal of Pharmaceutical Sciences, v.74, n.1, p.82-84, 1985.

66. EUROPEAN Pharmacopoeia. 5.ed. Strasbourg: Council of Europe, 2004. v.2,
p.1874.

67. UNITED STATES Pharmacopeia. 29.ed. Rockville: United States
Pharmacopeial Convention, 2005. p.1218.

68. CLARKE, E.G.C. Clarke's isolation and identification of drugs in
pharmaceutical body fluids and post-mortem material. 3.ed. London:
Pharmaceutical Press, 2004. p.1156.

69. LIVERSIDGE, G.G. Ketoprofen. Analytical Profiles of Drug Substances,
v.10, p.443-471, 1981.

70. NAKANISHI, K.; SOLOMON, P.H. Infrared absorption spectroscopy. 2.ed.
San Francisco: Holden-Day, 1977. p.26, 39.

71. BRITISH Pharmacopoeia 2005. London: Stationery Office, 2005. v.1, p.813.

72. UNITED STATES Pharmacopeia. 29.ed. Rockville: United States
Pharmacopeial Convention, 2005. p.892, 3207.

73. CLARKE, E.G.C. Clarke's isolation and identification of drugs in
pharmaceutical body fluids and post-mortem material. 3.ed. London:
Pharmaceutical Press, 2004. p.1027.

74. WARD, C.K.; SCHIRMER, R.E. Fenoprofen calcium. Analytical Profiles of
Drug Substances, v.6, p.161-182, 1977.

303

75. MAIER, N.M.; FRANCO, P.; LINDNER, W. Separation of enantiomers: needs,
challenges, perspectives. Journal of Chromatography, A, v.906, n.1/2, p.3-
33, 2001.

76. ANDERSSON, S.; ALLENMARK, S.G. Preparative chiral chromatographic
resolution of enantiomers in drug discovery. Journal of Biochemical and
Biophysical Methods, v.54, n.1-3, p.11-23, 2002.

77. TERFLOTH, G. Enantioseparations in super- and subcritical fluid
chromatography. Journal of Chromatography, A, v.906, n.1/2, p.301-307,
2001.

78. SCHURIG, V. Separation of enantiomers by gas chromatography. Journal of
Chromatography, A, v.906, n.1/2, p.275-299, 2001.

79. SCHULTE, M.; STRUBE, J. Preparative enantioseparation by simulated
moving bed chromatography. Journal of Chromatography, A, v.906, n.1/2,
p.399-416, 2001.

80. FOUCAULT, A.P. Enantioseparations in counter-current chromatography and
centrifugal partition chromatography. Journal of Chromatography, A, v.906,
n.1/2, p.365-378, 2001.

81. FRANCOTTE, E.R. Enantioselective chromatography as a powerful alternative
for the preparation of drug enantiomers. Journal of Chromatography, A,
v.906, n.1/2, p.379-397, 2001.

82. ZHANG, Y.; WU, D.R.; WANG-IVERSON, D.B.; TYMIAK, A.A.
Enantioselective chromatography in drug discovery. Drug Discovery Today,
v.10, n.8, p.571-577, 2005.

83. RIEKKOLA, M.-L.; JONSSON, J..; SMITH, R.M. Terminology for analytical
capillary electromigration techniques (IUPAC Recommendations 2003). Pure
and Applied Chemistry, v.76, n.2, p.443-451, 2004.

84. HA, P.T.T.; HOOGMARTENS, J.; VAN SCHEPDAEL, A. Recent advances in
pharmaceutical applications of chiral capillary electrophoresis. Journal of
Pharmaceutical and Biomedical Analysis, v.41, n.1, p.1-11, 2006.

304

85. LAMMERHOFER, M. Chiral separations by capillary electromigration
techniques in nonaqueous media. I. Enantioselective nonaqueous capillary
electrophoresis. Journal of Chromatography, A, v.1068, n.1, p.3-30, 2005.

86. LAMMERHOFER, M. Chiral separations by capillary electromigration
techniques in nonaqueous media. II. Enantioselective nonaqueous capillary
electrophoresis. Journal of Chromatography, A, v.1068, n.1, p.31-57, 2005.

87. OTSUKA, K.; TERABE, S. Enantiomer separation of drugs by micellar
electrokinetic chromatography using chiral surfactants. Journal of

88. WISTUBA, D.; SCHURIG, V. Enantiomer separation of chiral pharmaceuticals
by capillary electrochromatography. Journal of Chromatography, A, v.875,
n.1/2, p.255-276, 2000.

89. NISHI, H. Enantiomer separation of drugs by electrokinetic chromatography.
Journal of Chromatography, A, v.735, n.1/2, p.57-76, 1996.

90. BONATO, P.S.; JABOR, V.A.P. Anlise enantiosseletiva de frmacos:
contribuies da cromatografia lquida de alta eficincia e eletroforese capilar.
Qumica Nova, v.28, n.4, p.683-691, 2005.

91. HOLZGRABE, U.; BRINZ, D.; KOPEC, S.; WEBER, C.; BITAR, Y. Why not
using capillary electrophoresis in drug analysis? Electrophoresis, v.27, n.12,
p.2283-2292, 2006.

92. AGILENT TECHNOLOGIES. Guide to capillaries, reagents and supplies
for CE and CEC. 2002. Disponvel em:
http://www.chem.agilent.com/scripts/LiteraturePDF.asp?iWHID=29594. Aces-
so em: 26 abr. 2007.

93. ETTRE, L.S. Nomenclature for chromatography (IUPAC Recommendations

94. ABOUL-ENEIN, H.Y.; EL-AWADY, M.I.; HEARD, C.M.; NICHOLLS, P.J.
Application of thin-layer chromatography in enantiomeric chiral analysis: an
overview. Biomedical Chromatography, v.13, n.8, p.531-537, 1999.

305

95. KRASIKOV, V.D. Contemporary planar chromatography. Journal of
Analytical Chemistry, v.58, n.8, p.706-719, 2003. [Review].

96. WALL, P.E. Introduction and history. In: ______. Thin-layer
chromatography: a modern practical approach. Cambridge: Royal Society of
Chemistry, 2005. p.1-5. (RSC chromatography monographs).

97. POOLE, C.F. Planar chromatography at the turn of the century. Journal of

98. SNYDER, L.R.; KIRKLAND, J.J.; GLAJCH, J.L.; KERN, J.; KIRKLAND, K.
Chiral separations. In: SNYDER, L.R.; KIRKLAND, J.J.; GLAJCH, J.L.
Practical HPLC method development. 2.ed. New York: John Wiley, 1997.
p.537-615.

99. GAL, J. Indirect methods for the chromatographic resolution of drug
enantiomers. In: WAINER, I.W., ed. Drug stereochemistry: analytical
methods and pharmacology. 2.ed. New York: Marcel Dekker, 1993. p.65-106.
(Clinical pharmacology, v.18).

100. SRINIVAS, N.R. Evaluation of experimental strategies for the development of
chiral chromatographic methods based on diastereomer formation.
Biomedical Chromatography, v.18, n.4, p.207-233, 2004.

101. VADIM, A.D. Analytical chiral separation methods (IUPAC Recommendations

102. THOMPSON, R. A practical guide to HPLC enantioseparations for
pharmaceutical compounds. Journal of Liquid Chromatography & Related
Technologies, v.28, n.7/8, p.1215-1231, 2005.

103. WAINER, I.W.; DOYLE, T.D. Application of high-performance liquid
chromatographic chiral stationary phases to pharmaceutical analysis: direct
enantiomeric resolution of amide derivatives of 1-phenyl-2-aminopropane.
Journal of Chromatography, A, v.259, p.465-472, 1983.

104. REGIS TECHNOLOGIES. The Regis Pirkle-concept chiral HPLC column:
its nature, care, and use. Disponvel em:
http://www.registech.com/chiral/care_and_use.html. Acesso em: 13 maio
2007.

306

105. WAINER, I.W. HPLC chiral stationary phases for the stereochemical resolution
of enantiomeric compounds: the current state of the art. In: ______, ed. Drug
stereochemistry: analytical methods and pharmacology. 2.ed. New York:
Marcel Dekker, 1993. p.139-182. (Clinical pharmacology, v.18).

106. THUNBERG, L.; ANDERSSON, S.; ALLENMARK, S.; VESSMAN, J.
Preparative resolution of drug racemates to study the chiroptical properties of
their enantiomers. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,
v.27, n.3/4, p.431-439, 2002.

107. PURDIE, N.; SWALLOWS, K.A. Analytical applications of polarimetry, optical
rotatory dispersion, and circular dichroism. Analytical Chemistry, v.61, n.2,
p.77A-89A, 1989.

108. LINDER, S.W.; YANIK, G.W.; BOBBITT, D.R. Evaluation of laser-based
polarimetry for the determination of enantiomeric excess (ee) at the extremes
of the ee scale. Microchemical Journal, v.76, n.1/2, p.105-112, 2004.

109. BOBBITT, D.R.; LINDER, S.W. Recent advances in chiral detection for high
performance liquid chromatography. TrAC, Trends in Analytical Chemistry,
v.20, n.3, p.111-123, 2001.

110. PURDIE, N.; SWALLOWS, K.A. Circular dichroism I. Theory and practice.
TrAC, Trends in Analytical Chemistry, v.9, n.3, p.94-97, 1990.

111. ROTHCHILD, R. NMR methods for determination of enantiomeric excess.
Enantiomer, v.5, n.5, p.457-471, 2000.

112. TADEUSIAK, E.J.; CIESIELSKI, W.; OLEJNICZAK, S. The determination of
enantiomeric excess of valine by ODESSA solid-state NMR experiment.
Magnetic Resonance in Chemistry, v.44, n.10, p.905-908, 2006.

113. WENZEL, T.J.; WILCOX, J.D. Chiral reagents for the determination of
enantiomeric excess and absolute configuration using NMR spectroscopy.
Chirality, v.15, n.3, p.256-270, 2003.

114. LADANYI, L.; SZILAGYI, I.; HERMECZ, I. Thermoanalytic determination of the
enantiomeric purity of selegiline. Acta Pharmaceutica Hungarica, v.62, n.5,
p.231-236, 1992.

307

115. STEFAN, R.-I.; VAN STADEN, J.F.; ABOUL-ENEIN, H.Y. Molecular
recognition in chiral discrimination. Crystal Engineering, v.4, n.2/3, p.113-
118, 2001.

116. EL-HADY, D.A.; SELIEM, M.M.; GOTTI, R.; EL-MAALI, N.A. Novel
voltammetric method for enantioseparation of racemic methotrexate:
determination of its enantiomeric purity in some pharmaceuticals. Sensors
and Actuators: B, Chemical, v.113, n.2, p.978-988, 2006.

117. STADEN, R.I.S.V.; HOLO, L. Enantioselective, potentiometric membrane
electrodes based on cyclodextrins for the determination of l-histidine. Sensors
and Actuators: B, Chemical, v.120, n.2, p.399-402, 2007.

118. RINALDI, P.L. The determination of absolute configuration using nuclear
magnetic resonance techniques. Progress in Nuclear Magnetic Resonance
Spectroscopy, v.15, n.4, p.291-352, 1982.

119. POLAVARAPU, P.L. Renaissance in chiroptical spectroscopic methods for
molecular structure determination. Chemical Record, v.7, n.2, p.125-126,
2007.

120. STEPHENS, P.J.; DEVLIN, F.J.; CHEESEMAN, J.R.; FRISCH, M.J.;
BORTOLINI, O.; BESSE, P. Determination of absolute configuration using ab
initio calculation of optical rotation. Chirality, v.15, suppl., p.S57-64, 2003.

121. MCCANN, D.M.; STEPHENS, P.J. Determination of absolute configuration
using density functional theory calculations of optical rotation and electronic
circular dichroism: chiral alkenes. Journal of Organic Chemistry, v.71, n.16,
p.6074-6098, 2006.

122. KUPPENS, T.; BULTINCK, P.; LANGENAEKER, W. Determination of absolute
configuration via vibrational circular dichroism. Drug Discovery Today:
Technologies, v.1, n.3, p.269-275, 2004.

123. FREEDMAN, T.B.; CAO, X.; DUKOR, R.K.; NAFIE, L.A. Absolute
configuration determination of chiral molecules in the solution state using
vibrational circular dichroism. Chirality, v.15, n.9, p.743-758, 2003.

124. FLACK, H.D.; BERNARDINELLI, G. Absolute structure and absolute
configuration. Acta Crystallographica: Section A, v.55, Part 5, p.908-915,
1999.

308

125. ROUSSEL, C.; DEL RIO, A.; PIERROT-SANDERS, J.; PIRAS, P.;
VANTHUYNE, N. Chiral liquid chromatography contribution to the
determination of the absolute configuration of enantiomers. Journal of

126. DAVIES, N.M. Methods of analysis of chiral non-steroidal anti-inflammatory
drugs. Journal of Chromatography B: Biomedical Applications, v.691, n.2,
p.229-261, 1997.

127. MULLANGI, R.; YAO, M.; SRINIVAS, N.R. Resolution of enantiomers of
ketoprofen by HPLC: a review. Biomedical Chromatography, v.17, n.7,
p.423-434, 2003.

128. MCKAY, S.W.; MALLEN, D.N.B.; SHRUBSALL, P.R.; SWANN, B.P. Analysis
of Benoxaprofen and other -methylarylacetic acids using high-performance
liquid chromatography. Journal of Chromatography, A, v.170, n.2, p.482-
485, 1979.

129. SALLUSTIO, B.S.; ABAS, A.; HAYBALL, P.J.; PURDIE, Y.J.; MEFFIN, P.J.
Enantiospecific high-performance liquid chromatographic analysis of 2-
phenylpropionic acid, ketoprofen and fenoprofen. Journal of
Chromatography B: Biomedical Applications, v.374, n.2, p.329-337, 1986.

130. HAYBALL, P.J.; NATION, R.L.; BOCHNER, F.; LE LEU, R.K. Enantiospecific
analysis of ketoprofen in plasma by high-performance liquid chromatography.
Journal of Chromatography B: Biomedical Applications, v.570, n.2, p.446-
452, 1991.

131. THOMASON, M.J.; HUNG, Y.-F.; RHYS-WILLIAMS, W.; HANLON, G.W.;
LLOYD, A.W. Indirect enantiomeric separation of 2-arylpropionic acids and
structurally related compounds by reversed phase HPLC. Journal of

132. PANUS, P.C.; TOBER-MEYER, B.; FERSLEW, K.E. Tissue extraction and
high-performance liquid chromatographic determination of ketoprofen
enantiomers. Journal of Chromatography B: Biomedical Applications,
v.705, n.2, p.295-302, 1998.

133. ZHAO, H.; MU, Z.; LI, H.; QIU, Z. Determination of the optical purity of
ketoprofen by reversed-phase HPLC after derivatization with R-(+)-a-
methylbenzylamine. Xinan Shifan Daxue Xuebao, v.25, n.2, p.160-163,
2000.

309

134. ZHAO, H.; MU, Z.; LI, H.; QIU, S. Separation of enantiomeric ketoprofen by
pre-column chiral derivatization reversed-phase HPLC. Zhongguo Yao Xue
Za Zhi, v.35, n.3, p.194-196, 2000.

135. MU, Z.; LI, H.; QIU, Z. Separation of enantiomeric ketoprofen by pre-column
chiral derivatization RP-HPLC. Xinan Shifan Daxue Xuebao, v.27, n.1, p.69-
72, 2002.

136. BJRKMAN, S. Determination of the enantiomers of ketoprofen in blood
plasma by ion-pair extraction and high-performance liquid chromatography of
leucinamide derivatives. Journal of Chromatography B: Biomedical
Applications, v.414, n.2, p.465-471, 1987.

137. FOSTER, R.T.; JAMALI, F. High-performance liquid chromatographic assay of
ketoprofen enantiomers in human plasma and urine. Journal of
Chromatography B: Biomedical Applications, v.416, n.2, p.388-393, 1987.

138. MEHVAR, R.; JAMALI, F. Stereospecific high-performance liquid
chromatographic (HPLC) assay of fenoprofen enantiomers in plasma and
urine. Pharmaceutical Research, v.5, n.1, p.53-56, 1988.

139. VOLLAND, C.; SUN, H.; BENET, L.Z. Stereoselective analysis of fenoprofen
and its metabolites. Journal of Chromatography B: Biomedical
Appications, v.534, p.127-138, 1990.

140. PALYLYK, E.L.; JAMALI, F. Simultaneous determination of ketoprofen
enantiomers and probenecid in plasma and urine by high-performance liquid
chromatography. Journal of Chromatography B: Biomedical Applications,
v.568, n.1, p.187-196, 1991.

141. MEHVAR, R.; JAMALI, F.; PASUTTO, F.M. Liquid-chromatographic assay of
ibuprofen enantiomers in plasma. Clinical Chemistry, v.34, n.3, p.493-496,
1988.

142. LUAN, Y.; DU, Z.; ZHANG, D.; ZHAO, R.; HUANG, Z. Enantiospecific analysis
of ketoprofen by RP-HPLC with chiral precolumn derivatization. Yaowu Fenxi
Zazhi, v.21, n.4, p.281-283, 2001.

310

143. SANTA, T.; LUO, J.; LIM, C.K.; IMAI, K. Enantiomeric separation and
detection by high-performance liquid chromatography-mass spectrometry of 2-
arylpropionic acids derivatized with benzofurazan fluorescent reagents.

144. IWAKI, K.; BUNRIN, T.; KAMEDA, Y.; YAMAZAKI, M. Resolution and
sensitive detection of carboxylic acid enantiomers using fluorescent chiral
derivatization reagents by high-performance liquid chromatography. Journal
of Chromatography, A, v.662, n.1, p.87-93, 1994.

145. AL-KINDY, S.; SANTA, T.; FUKUSHIMA, T.; HOMMA, H.; IMAI, K. 1-(5-
dimethylamino-1-naphthalenesulphonyl)-(S)-3-aminopyrrolidine (DNS-Apy) as
a fluorescence chiral labelling reagent for carboxylic acid enantiomers.

146. WAINER, I.W.; DOYLE, T.D. Application of high-performance liquid
chromatographic chiral stationary phases to pharmaceutical analysis:
structural and conformational effects in the direct enantiomeric resolution of -
methylarylacetic acid antiinflammatory agents. Journal of Chromatography,
A, v.284, p.117-124, 1984.

147. CROWTHER, J.B.; COVEY, T.R.; DEWEY, E.A.; HENION, J.D. Liquid
chromatographic/mass spectrometric determination of optically active drugs.
Analytical Chemistry, v.56, n.14, p.2921-2926, 1984.

148. PIRKLE, W.H.; MCCUNE, J.E. Improved chiral stationary phase for the
separation of the enantiomers of chiral acids as their anilide derivatives.
Journal of Chromatography, A, v.471, p.271-281, 1989.

149. KAKODKAR, S.V.; ZIEF, M. Resolution of derivatized acids and amines on
JTB-X: A new urea bonded chiral stationary phase. Chirality, v.2, n.2, p.124-
127, 1990.

150. VAN OVERBEKE, A.; BAEYENS, W.; VAN DEN BOSSCHE, W.; DEWAELE,
C. Enantiomeric separation of amide derivatives of some 2-arylpropionic acids
by HPLC on a cellulose-based chiral stationary phase. Journal of

151. VAN OVERBEKE, A.; BAEYENS, W.; VAN DEN BOSSCHE, W.; DEWAELE,
C. Separation of 2-arylpropionic acids on a cellulose based chiral stationary
phase by RP-HPLC. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,
v.12, n.7, 901-909, 1994.

311

152. ABOUL-ENEIN, H.Y.; VAN OVERBEKE, A.; VANDER WEKEN, G.;
BAEYENS, W.; ODA, H.; DEPREZ, P.; DE KRUIF, A. HPLC on Chiralcel OJ-
R for enantiomer separation and analysis of ketoprofen, from horse plasma, as
the 9-aminophenanthrene derivative. Journal of Pharmacy and

153. FUKUSHIMA, T.; SANTA, T.; HOMMA, H.; AL-KINDY, S.M.; IMAI, K.
Enantiomeric separation and detection of 2-arylpropionic acids derivatized with
[(N,N-dimethylamino)sulfonyl]benzofurazan reagents on a modified cellulose
stationary phase by high-performance liquid chromatography. Analytical
Chemistry, v.69, n.9, p.1793-1799, 1997.

154. AMEYIBOR, E.; STEWART, J.T. Enantiomeric HPLC separation of selected
chiral drugs using native and derivatized -cyclodextrins as chiral mobile
phase additives. Journal of Liquid Chromatography & Related

155. AMEYIBOR, E.; STEWART, J.T. HPLC determination of ketoprofen
enantiomers in human serum using a nonporous octadecylsilane 1.5 m
column with hydroxypropyl -cyclodextrin as mobile phase additive. Journal
of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, v.17, n.1, p.83-88, 1998.

156. YE, X.; YU, X. Enantiomeric separation of ketoprofen by HPLC using
Chirobiotic V CSP and vancomycin as chiral mobile phase additives. Yaoxue
Xuebao, v.38, n.3, p.211-214, 2003.

157. GUO, Z.; WANG, H.; ZHANG, Y. Chiral separation of ketoprofen on an achiral
C8 column by HPLC using norvancomycin as chiral mobile phase additives.
Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, v.41, n.1, p.310-314,
2006.

158. ZHONG, Q.; HE, L.; BEESLEY, T.E.; TRAHANOVSKY, W.S.; SUN, P.;
WANG, C.; ARMSTRONG, D.W. Development of dinitrophenylated
cyclodextrin derivatives for enhanced enantiomeric separations by high-
performance liquid chromatography. Journal of Chromatography, A, v.1115,
n.1/2, p.19-45, 2006.

159. ARMSTRONG, D.W.; WARD, T.J.; ARMSTRONG, R.D.; BEESLEY, T.E.
Separation of drug stereoisomers by the formation of -cyclodextrin inclusion
complexes. Science, v.232, n.4754, p.1132-1135, 1986.

312

160. BEESON, M.D.; VIGH, G. Examination of the retention behavior of
underivatized profen enantiomers on cyclodextrin silica stationary phases.
Journal of Chromatography, A, v.634, n.2, p.197-204, 1993.

161. BOSKOV, Z.; CUNOV, E.; TESAOV, E. Comparison of vancomycin-
based stationary phases with different chiral selector coverage for
enantioselective separation of selected drugs in high-performance liquid
2005.

162. PHOURCQ, F.; JARRY, C.; BANNWARTH, B. Chiral resolution of
flurbiprofen and ketoprofen enantiomers by HPLC on a glycopeptide-type
column chiral stationary phase. Biomedical Chromatography, v.15, n.3,
p.217-222, 2001.

163. ANDERSSON, M.E.; ASLAN, D.; CLARKE, A.; ROERAADE, J.; HAGMAN, G.
Evaluation of generic chiral liquid chromatography screens for pharmaceutical
analysis. Journal of Chromatography, A, v.1005, n.1/2, p.83-101, 2003.

164. OKAMOTO, Y.; ABURATANI, R.; KAIDA, Y.; HATADA, K.; INOTSUME, N.;
NAKANO, M. Direct chromatographic separation of 2-arylpropionic acid
enantiomers using tris(3,5-dimethylphenylcarbamate)s of cellulose and
amylose as chiral stationary phases. Chirality, v.1, n.3, p.239-242, 1989.

165. CARR, R.A.; CAILL, G.; NGOC, A.H.; FOSTER, R.T. Stereospecific high-
performance liquid chromatographic assay of ketoprofen in human plasma and
urine. Journal of Chromatography B: Biomedical Applications, v.668, n.1,
p.175-181, 1995.

166. LOVLIN, R.; VAKILY, M.; JAMALI, F. Rapid, sensitive and direct chiral high-
performance liquid chromatographic method for ketoprofen enantiomers.
Journal of Chromatography B: Biomedical Applications, v.679, n.1/2,
p.196-198, 1996.

167. VAN OVERBEKE, A.; BAEYENS, W.; DEWAELE, C. Comparative study on
the enantiomeric separation of several non-steroidal anti-inflammatory drugs
on two cellulose-based chiral stationary phases. Journal of Liquid
Chromatography, v.18, n.12, p.2427-2443, 1995.

168. TANG, Y. Significance of mobile phase composition in enantioseparation of
chiral drugs by HPLC on a cellulose-based chiral stationary phase. Chirality,
v.8, n.1, p.136-142, 1996.

313

169. KANG, G.W.; KO, J.H.; CHEONG, W.J. Thermodynamic study of
enantioseparation of arylpropionic acids with a Chiralcel OJ-H stationary
phase. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies, v.28,
n.4, p.513-526, 2005.

170. PERRIN, C.; MATTHIJS, N.; MANGELINGS, D.; GRANIER-LOYAUX, C.;
MAFTOUH, M.; MASSART, D.L.; HEYDEN, Y.V. Screening approach for
chiral separation of pharmaceuticals part II. Reversed-phase liquid
2002.

171. MATTHIJS, N.; MAFTOUH, M.; HEYDEN, Y.V. Screening approach for chiral
separation of pharmaceuticals IV. Polar organic solvent chromatography.
Journal of Chromatography, A, v.1111, n.1, p.48-61, 2006.

172. VAN OVERBEKE, A.; BAEYENS, W.; ODA, H.; ABOUL-ENEIN, H.Y. Direct
enantiomeric HPLC separation of several 2-arylpropionic acids, barbituric
acids and benzodiazepines on chiralcel OJ-R chiral stationary phase.
Chromatographia, v.43, n.11-12, p.599-606, 1996.

173. ABOUL-ENEIN, H.Y. Chiral separation of some non-steroidal anti-
inflammatory drugs on tartardiamide DMB chiral stationary phase by HPLC.
Journal of Separation Science, v.26, n.6-7, p.521-524, 2003.

174. LIU, X.; WANG, J.; SHANG, Z.; YU, Y. Direct enantiomeric separation of non-
steroidal anti-inflammatory drugs by high performance liquid chromatography.
Fenxi Huaxue, v.29, n.9, p.993-996, 2001.

175. YOON, T.H.; KIM, I.H. Chiral separation of ketoprofen racemate by using
Chirex
3005 and Kromasil
CHI-II chiral column. Korean Journal of

Chemical Engineering, v.21, n.2, p.521-526, 2004.

176. HERMANSSON, J.; ERIKSSON, M. Direct liquid chromatographic resolution
of acidic drugs using a chiral
1
-acid glycoprotein column (Enantiopac
).
Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies, v.9, n.2/3,
p.621-639, 1986.

177. SCHILL, G.; WAINER, I.W.; BARKAN, S.A. Chiral separations of cationic and
anionic drugs on an
1
-acid glycoprotein-bonded stationary phase
(Enantiopac
). II. Influence of mobile phase additives and pH on chiral

resolution and retention. Journal of Chromatography, A, v.365, p.73-88,
1986.

314

178. MENZEL-SOGLOWEK, S.; GEISSLINGER, G.; BRUNE, K. Stereoselective
high-performance liquid chromatographic determination of ketoprofen,
ibuprofen and fenoprofen in plasma using a chiral
1
-acid glycoprotein column.
Journal of Chromatography B: Biomedical Applications, v.532, n.2, p.295-
303, 1990.

179. HERMANSSON, J.; HERMANSSON, I. Dynamic modification of the chiral
bonding properties of a Chiral-AGP column by organic and inorganic additives.
Journal of Chromatography, A, v.666, n.1/2, p.181-191, 1994.

180. MIWA, T.; MIYAKAWA, T.; KAYANO, M.; MIYAKE, Y. Application of an
ovomucoid-conjugated column for the optical resolution of some
pharmaceutically important compounds. Journal of Chromatography, A,
v.408, p.316-322, 1987.

181. ODA, Y.; ASAKAWA, N.; YOSHIDA, Y.; SATO, T. On-line determination and
resolution of the enantiomers of ketoprofen in plasma using coupled achiral-
chiral high-performance liquid chromatography. Journal of Pharmaceutical
and Biomedical Analysis, v.10, n.1, p.81-87, 1992.

182. MANO, N.; ODA, Y.; ASAKAWA, N.; YOSHIDA, Y.; SATO, T.; MIWA, T.
Studies of ovomucoid-, avidin-, conalbumin- and flavoprotein-conjugated chiral
stationary phases for separation of enantiomers by high-performance liquid
chromatography. Journal of Chromatography, A, v.687, n.2, p.223-232,
1994.

183. WANG, X.-J.; CAO, G.-F.; XU, S.-W. Enantiomeric separation of ketoprofen
on an ovomucoid column. Sepu, v.18, n.6, p.536-538, 2000.

184. ALLENMARK, S.; ANDERSSON, S. Optical resolution of some biologically
active compounds by chiral liquid chromatography on BSA-silica (Resolvosil)
columns. Chirality, v.1, n.2, p.154-160, 1989.

185. NOCTOR, T.A.G.; FELIX, G.; WAINER, I.W. Stereochemical resolution of
enantiomeric 2-aryl propionic acid non-steroidal anti-inflammatory drugs on a
human serum albumin based high-performance liquid chromatographic chiral
stationary phase. Chromatographia, v.31, n.1/2, p.55-59, 1991.

186. WANG, H.; ZOU, H.; LU, M.; LI, R.; ZHANG, Y. Enantiomeric separation of
drugs on human serum albumin column. Fenxi Huaxue, v.26, n.1, p.68-72,
1998.

315

187. BAEYENS, W.R.; VAN DER WEKEN, G.; HAUSTRAETE, J.; ABOUL-ENEIN,
H.Y.; CORVELEYN, S.; REMON, J.P.; GARCA-CAMPAA, A.M.; DEPREZ,
P. Application of the restricted-access precolumn packing material alkyl-diol
silica in a column-switching system for the determination of ketoprofen
enantiomers in horse plasma. Journal of Chromatography, A, v.871, n.1/2,
p.153-161, 2000.

188. MIWA, T.; MIYAKAWA, T.; MIYAKE, Y. Characteristics of an avidin-
conjugated column in direct liquid chromatographic resolution of racemic
compounds. Journal of Chromatography, A, v.457, p.227-233, 1988.

189. ODA, Y.; ASAKAWA, N.; ABE, S.; YOSHIDA, Y.; SATO T. Avidin protein-
conjugated column for direct injection analysis of drug enantiomers in plasma
by high-performance liquid chromatography. Journal of Chromatography B:
Biomedical Applications, v.572, n.1/2, p.133-141, 1991.

190. SMET, E.; STAELENS, L.; VANDER HEYDEN, Y.; BAEYENS, W.R.; ABOUL-
ENEIN, H.Y.; VAN DER WEKEN, G.; GARCA-CAMPAA, A.M. Optimization
of the chiral separation of some 2-arylpropionic acids on an avidin column by
modeling a combined response. Chirality, v.13, n.9, p.556-567, 2001.

191. MANO, N.; ODA, Y.; ASAKAWA, N.; YOSHIDA, Y.; SATO, T. Development of
a flavoprotein column for chiral separation by high-performance liquid
chromatography. Journal of Chromatography, A, v.623, n.2, p.221-228,
1992.

192. MARLE, I.; KARLSSON, A.; PETTERSSON, C. Separation of enantiomers
using -chymotrypsin-silica as a chiral stationary phase. Journal of
Chromatography, A, v.604, n.2, p.185-196, 1992.

193. HAGINAKA, J.; SEYAMA, C.; KANASUGI, N. The absence of chiral
recognition ability in ovomucoid: ovoglycoprotein-bonded HPLC stationary
phases for chiral recognition. Analytical Chemistry, v.67, n.15, p.2539-2547,
1995.

194. YAGI, M.; SHIBUKAWA, A.; NAKAGAWA, T. Direct injection analysis of
ketoprofen enantiomers in plasma using column-switching high-performance
liquid chromatography system. Chemical & Pharmaceutical Bulletin, v.38,
n.9, p.2513-2517, 1990.

316

195. I, N.; KITAHARA, H.; AOKI, F.; KISU, N. Direct separation of carboxylic acid
enantiomers by high-performance liquid chromatography with amide and urea
derivatives bonded to silica gel as chiral stationary phases. Journal of

196. BOISVERT, J.; CAILL, G., MCGILVERAY, I.J.; QURESHI, S.A.
Quantification of ketoprofen enantiomers in human plasma based on solid-
phase extraction and enantioselective column chromatography. Journal of
Chromatography B: Biomedical Applications, v.690, n.1/2, p.189-193,
1997.

197. EICHHOLD, T.H.; BAILEY, R.E.; TANGUAY, S.L.; HOKE, II, S.H.
Determination of (R)- and (S)-ketoprofen in human plasma by liquid
chromatography/tandem mass spectrometry following automated solid-phase
extraction in the 96-well format. Journal of Mass Spectrometry, v.35, n.4,
p.504-511, 2000.

198. PIRKLE, W.H.; WELCH, C.J.; LAMM, B. Design, synthesis, and evaluation of
an improved enantioselective naproxen selector. Journal of Organic
Chemistry, v.57, n.14, p.3854-3860, 1992.

199. PIRKLE, W.H.; WELCH, C.J. An improved chiral stationary phase for the
chromatographic separation of underivatized naproxen enantiomers. Journal
of Liquid Chromatography & Related Technologies, v.15, n.11, p.1947-
1955, 1992.

200. GRUBB, N.G.; RUDY, D.W.; HALL, S.D. Stereoselective high-performance
liquid chromatographic analysis of ketoprofen and its acyl glucuronides in
chronic renal insufficiency. Journal of Chromatography B: Biomedical
Applications, v.678, n.2, p.237-244, 1996.

201. AL KATHEERI, N.A.; WASFI, I.A.; LAMBERT, M.; SAEED, A.; KHAN, I.A.
Pharmacokinetics of ketoprofen enantiomers after intravenous administration
of racemate in camels: effect of gender. Journal of Veterinary
Pharmacology and Therapeutics, v.23, n.3, p.137-143, 2000.

202. BAEYENS, W.R.G.; VAN DER WEKEN, G.; ABOUL-ENEIN, H.Y.;
REYGAERTS, S.; SMET, E. Comparison of the enantiomeric separation of
some 2-arylpropionic acids on a novel Pirkle-concept stationary packing by
narrow-bore and conventional liquid chromatography. Biomedical
Chromatography, v.14, n.1, p.58-60, 2000.

317

203. LIANG, Y.; SONG, H.; FU, C.; ZHENG, W. Direct enantiomeric scale detection
of some non-steroidal anti-inflammatory drugs by high performance liquid
chromatography. Fenxi Huaxue, v.31, n.10, p.1253-1255, 2003.

204. CASTELLANI, L.; FLIEGER, M.; SINIBALDI, M. Enantiomer separation of 2-
arylpropionic acids on an ergot alkaloid-based stationary phase microbore
column application. Journal of Liquid Chromatography & Related

205. TERFLOTH, G.J.; PIRKLE, W.H.; LYNAM, K.G.; NICOLAS, E.C. Broadly
applicable polysiloxane-based chiral stationary phase for high-performance
liquid chromatography and supercritical fluid chromatography. Journal of

206. LEI, J.D.; TAN, T.W. Chiral separation of ketoprofen and thermodynamic study
in molecular imprinting. Acta Chimica Sinica, v.60, n.7, p.1279-1283, 2002.

207. JIANG, J.G.; REN, J.C.; XU, L.X.; WANG, H.Y. Separation of racemic
ketoprofen by molecularly imprinted polymer. Fenxi Shiyanshi, v.23, n.3,
p.56-58, 2004.

208. NETO, B.B.; SCARMINIO, I.S.; BRUNS, R.E. Quando as variveis so
muitas. In: ______. Como fazer experimentos: pesquisa e desenvolvimento
na cincia e na indstria. 2.ed. Campinas: UNICAMP, 2003. p.149-200.

209. BYLUND, D.; BERGENS, A.; JACOBSSON, S.P. Optimisation of
chromatographic separations by use of a chromatographic response function,
empirical modelling and multivariate analysis. Chromatographia, v.44, n.1/2,
p.74-80, 1997.

210. SIOUFFI, A.M.; PHAN-TAN-LUU, R. Optimization methods in chromatography
and capillary electrophoresis. Journal of Chromatography, A, v.892, n.1/2,
p.75-106, 2000.

211. NETO, B.B.; SCARMINIO, I.S.; BRUNS, R.E. Andando na superfcie de
resposta. In: ______. Como fazer experimentos: pesquisa e
desenvolvimento na cincia e na indstria. 2.ed. Campinas: UNICAMP, 2003.
p.251-300.

212. DERRINGER, G.; SUICH, R. Simultaneous optimization of several response
variables. Journal of Quality Technology, v.12, n.4, p.214-219, 1980.

318

213. NETO, B.B.; SCARMINIO, I.S.; BRUNS, R.E. Como modelar misturas. In:
______. Como fazer experimentos: pesquisa e desenvolvimento na cincia
e na indstria. 2.ed. Campinas: UNICAMP, 2003. p.301-347.

214. SNYDER, L.R.; KIRKLAND, J.J.; GLAJCH, J.L. Ionic samples: reversed-
phase, ion-pair and ion-exchange HPLC. In: ______. Practical HPLC Method
Development. 2.ed. New York: John Wiley, 1997. p.293-349.

215. VAN DEEMTER, J.J.; ZUIDERWEG, F.J.; KLINKENBERG, A. Longitudinal
diffusion and resistance to mass transfer as causes of nonideality in
chromatography. Chemical Engineering Science, v.5, n.6, p.271-289, 1956.

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Cpsula gelatinosa dura Referncia Eli Lilly do Brasil Ltda.

3005 and Kromasil

CHI-II chiral column. Korean Journal of

). II. Influence of mobile phase additives and pH on chiral

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