INSTITUT NATIONAL AGRONOMIQUE PARIS-GRIGNON COLE DOCTORALE ABIES

THSE
Pour obtenir le grade de DOCTEUR de lINSTITUT NATIONAL AGRONOMIQUE PARIS-GRIGNON

Pr !ent e "ar

Patricia MRIGOUT
Soutenue le #$ no%e&bre #''(

tude du mtabolisme de la plante en rponse lapport de diffrents fertilisants et adjuvants culturaux.

Influence des phytohormones sur le mtabolisme azot.

JURY
Alain OURR) Ni*olau! %on +IR,N S-l%ie RECOUS S-l%ain C.AILLOU /a%ier 0RIAND 1ran2oi!e DANIEL-3EDELE Rapporteur Rapporteur Examinateur Examinateur uteur industriel !irectrice de th"se

ABREVIATIONS
A
## ## #$# #!& #!&c #E #I# (I##. #1 #2 #& #R3 #R&m #RR #4 #4 #4& # 5 #cides #mins #spartate aminotransfrase #cide abscissi%ue #cide dsoxyribonucli%ue #cide dsoxyribonucli%ue complmentaire Extrait dal'ue riche en auxines (E) *+,-. #cide indole/0/acti%ue #r'inosuccinate lyase #mmonium transporter #mmonium nitrate #uxin response factor #cide ribonucli%ue messa'er #rabidopsis response re'ulator #mmonium sulfate #r'inosuccinate synthetase #spara'ine synthtase #dnosine triphosphate 6omplete #rabidopsis transcriptome microarray 6onvention industrielle de formation par la recherche 6o7c/1esaint 6ytosine triphosphate

H
<# <516 <i'h affinity transporter <i'h pression li%uid chromato'raphy #dnosine isopentenyltransfrase 1o9 affinity transporter 2embrane intrinsic protein #zote &icotinamide adnine dinuclotide &icotinamide adnine dinuclotide phosphate &itrite rductase &itrilase &itrate rductase &itrate transporter &itro'en use efficiency &itro'en upta>e efficiency &itro'en utilization efficiency

I
I5

L
1#

M
2I5

N
& &#!< &#!<5 &iR &I &R &R &=E &=pE &=tE

C
6# 2# 6I3RE 61 6 5

D
!8 !ry 9ei'ht #cide thyl"ne diamine ttraacti%ue Ethylene responsive factor Expressed se%uence ta' Extrait 3ood and a'riculture or'anization 3errdoxine 3resh 9ei'ht

O
:6 :rnithine carbamyl transfrase 5olymerase chain reaction 5oids frais 5oids sec Reverse transcription 4tarvation (carence en azote. I5 onoplast intrinsic protein =re

E
E! # ER3 E4 E)

P
56R 53 54

F
3#: 3d 38

R
R

S
4

G
;# ;6/24 ;!< ;:;# ;4 ;4 ; 5 #cide 'ibbrelli%ue ;as chromato'raphy/mass spectrometry ;lutamate deshydro'nase ;lutamate synthase ;lutamine synthtase ;ene se%uence ta' ;uanosine triphosphate

T U
=

AVANT-PROPOS
1es travaux dcrits dans ce manuscrit ont t raliss dans le cadre dune 6onvention Industrielle de 3ormation par la Recherche (6I3RE. associant trois partenaires autour du projet de recherche? (i. la socit $iotech2arine@ implante sur la cAte nord de la $reta'ne (5ontrieux@ 6Ates d#rmor.@ produit et commercialise des substances dori'ine al'ale ainsi %ue des en'rais azots chimi%uesB (ii. le laboratoire de &utrition #zote des 5lantes (&#5. lInstitut &ational de Recherche #'ronomi%ue (I&R#. de Cersailles@ oD les exprimentations ont t effectuesB (iii. et moi/mEme@ la doctorante.

EN CONS,QUENCE4 LES R,SULTATS PR,SENT,S DANS CE M,MOIRE SONT SOUMIS 5 CON1IDENTIALIT,6

INTRODUCTION
I. Azote & agriculture.
I.A. Le rle essentiel de lazote dans la fertilisation. =ne fertilisation ad%uate est un pralable pour la'riculture moderne afin de pouvoir satisfaire de forts rendements et une %ualit optimale des rcoltes. 1a 'rande majorit des lments minraux essentiels au dveloppement de la plante@ nest ncessaire %uen %uantits infimes@ %ui peuvent Etre fournies par la plupart des sols sans supplments. 6ependant %uel%ues lments clefs@ %ue sont le phosphore (5.@ le potassium (F.@ le soufre (4. et lGazote (&.@ sont fr%uemment en %uantits insuffisantes dans le sol pour permettre la croissance optimale des cultures. 2al'r son abondance@ lazote atmosphri%ue est inutilisable pour la plupart des plantes. 1es seules plantes capables dutiliser lazote de lair sont celles %ui dveloppent une symbiose avec des microor'anismes au sein des nodosits sur les racines des plantes. H la diffrence du phosphore et du potassium@ les plantes ont besoin dimportantes %uantits dazote@ lazote reprsentant 0 IJ de leur mati"re s"che. En outre lefficacit de la fertilisation azote sur le rendement des cultures a contribu au dveloppement dune a'riculture moderne de plus en plus 'ourmande en azote. En plus des char'es lourdes occasionnes par ce poste de dpenses@ lapport massif den'rais azots initi au milieu du si"cle dernier affecte le cycle naturel de lazote (3i'ure *.@ ce %ui nest pas sans cons%uence sur lenvironnement et la sant. I.B. Les conversions de lazote et le problme du nitrate. 1e nitrate (&:0/.@ lammonium (&<IK. et lure (6:(&<+.+. sont les formes den'rais azots les plus utilises. 1e nitrate constitue la source dazote majoritaire dans les sols (2arschner@ *LLM.. 1e nitrate est un ion char' n'ativement@ et ainsi@ il nest pas retenu par le complexe ar'ilo/humi%ue du sol@ %ui porte aussi une puissante char'e n'ative. r"s soluble@ le nitrate apport en excdent dans le sol@ est entraNn par lessiva'e et contribue la pollution des nappes phrati%ues (3i'ure *.. !es fortes concentrations de nitrates dans les cours deau entraNnent des

phnom"nes

deutrophisation@

se traduisant par un

important dveloppement de

microor'anismes et dal'ues@ perturbant les %uilibres colo'i%ues naturels. 1a dnitrification est un autre processus de pertes de lazote apport au sol (3i'ure *.. #insi les bactries du sol soumises des conditions danarobie convertissent le nitrate en azote 'azeux &+. 4ous certaines conditions (forte concentration en nitrate@ sol acide.@ les produits finaux de la dnitrification sont les oxydes nitri%ues (&+:.. 6es composs sont des 'az fort O effet de serre P et sont aussi destructeurs de la couche dozone@ provo%uant dimportants domma'es environnementaux. #ussi le nitrate fait/il lobjet de nombreux dbats et est remis en %uestion par les vives in%uitudes %uil fait naNtre %uant son effet nfaste sur lenvironnement et ses ris%ues de toxicit pour lhomme. #ussi limiter lexc"s de cet anion dans les sols et les v'taux est devenu lun des enjeux majeurs de la'riculture actuelle. 6ontrairement au nitrate@ lion ammonium est bien retenu par le sol 'rQce la char'e positive %uil porte. 6ependant une 'rande partie de lammonium apport au sol est rapidement convertie en nitrate par les microor'anismes du sol (nitrification@ 3i'ure *.. En outre@ les ions ammonium %ui pourraient Etre prsents par exemple juste apr"s fertilisation@ sont sujets aux pertes dans latmosph"re par le processus de volatilisation (3i'ure *.. 1ion ammonium est en %uilibre chimi%ue avec le 'az ammoniacal (&<0.@ et plus le sol est alcalin@ plus l%uilibre se dplace vers lammoniac@ et plus les pertes par volatilisation sont importantes. 1ure est lar'ement utilise en pulvrisation foliaire mais aussi incorpore dans les sols@ oD elle est toutefois rapidement hydrolyse. #ussi@ lhydrolyse de lure en ammonium par les urases du sol conduit des pertes dazote par volatilisation ammoniacale@ et des inhibiteurs durases sont couramment ajouts aux en'rais uri%ues afin de limiter ce phnom"ne.

II. Le mtabolisme de lazote chez les plantes.

!ans le sol@ nitrate et ammonium sont les deux principales formes dazote inor'ani%ue disponibles pour la plante (Raven et al.@ *LL+.. !ans les sols bien ars@ la nitrification est rapide? il en rsulte une faible concentration en ammonium@ et le nitrate est la principale source dazote disponible pour les plantes. !ans les sols dtremps ou acides@ lammonium saccumule (6ra9ford R 3orde@ +,,+.. 1es plantes non fixatrices de lazote atmosphri%ue absorbent et assimilent ces deux formes dazote anioni%ue (&:0/. et cationi%ue (&<IK.. 1absorption du nitrate et de lammonium est prise en char'e par des transporteurs au niveau M

de la racine (&R ? nitrate transporter et #2 ? ammonium transporter.. 1e nitrate est alors rduit en nitrite par la nitrate rductase (&R B E6 *.S.S.*.@ puis en ammonium par la nitrite rductase (&iRB E6 *.T.T.*. dans les cellules racinaires@ stoc> dans les vacuoles@ ou encore export vers le xyl"me pour rejoindre la partie feuille oD il sera rduit ou stoc>. 6ontrairement au nitrate@ lammonium est principalement assimil dans les racines. 1ammonium est alors incorpor dans les acides amins par la 'lutamine synthtase (;4B E6 S.0.*.+. et la 'lutamate synthase prsente sous les deux formes 3d et &#!< dpendantes (3d/ ;:;# B E6 *.I.T.* et &#!</;:;# B E6 *.I.*.*I.. 1ensemble de ces tapes de lassimilation de lazote est finement r'ul et intera'it avec dautres voies mtaboli%ues@ notamment celle du carbone (Frapp R ruon'@ +,,M..

II.A. Absorption de lazote minral nitrate et ammonium.

4elon le de'r de minralisation et de nitrification@ les concentrations en nitrate et ammonium dans les sols sont tr"s variables (%uel%ues micromolaire plusieurs millimolaire. (2arschner@ *LLM.. 1es plantes se sont adaptes et ont ainsi dvelopp des syst"mes spcifi%ues de transport de nitrate ou dammonium? un syst"me de transport haute affinit ou <# 4 pour <i'h #ffinity ransport 4ystem@ et un syst"me de transport basse affinit ou 1# 4 pour 1o9 #ffinity ransport 4ystem (6ra9ford R 3orde@ +,,+.. 5ar dfinition@ les transporteurs de type <# 4 interviennent dans le transport dazote prsent en faible concentration dans le milieu (U ,@M m2.@ et les transporteurs de type 1# 4 sont particuli"rement actifs pour de fortes concentrations externes (V ,@M m2.. 1es protines responsables de chacun de ces deux syst"mes de transport appartiennent une famille multi'ni%ue de transporteurs ( he #rabidopsis ;enome Initiative@ +,,,B von 8irn et al.@ +,,,B :rsel et al.@ +,,+.@ et sont finement r'ules en fonction de la source dazote disponible et du statut nutritionnel de la plante. 1es modalits du transport de lure chez les plantes sont beaucoup moins connues? elles seront dveloppes dans la %uatri"me partie de cette introduction (IC.6.0..

II.A.!. Absorption du nitrate.

1assimilation de lazote du sol impli%ue tout dabord le franchissement de la membrane plasmi%ue des cellules racinaires. !ans le cas du nitrate@ le potentiel n'atif de la membrane ainsi %ue le 'radient de concentration ne permettent pas@ en 'nral@ lentre passive du nitrate dans le cytoplasme@ et un syst"me de transport actif coupl une <KW# 5ase est donc ncessaire (;lass R 4iddi%i@ *LLM.. 1es transporteurs de nitrate sont cods par deux familles de '"nes? les '"nes NRT1 impli%us dans le transport faible affinit et les '"nes NRT2 responsables du transport haute affinit (3orde@ +,,,.. 6ette classification est toutefois simplifie car le '"ne #tNRT1.1 initialement identifi comme un transporteur de nitrate basse affinit ( say et al.@ *LL0.@ est 'alement impli%u dans le transport haute affinit (1iu et al.@ *LLLB 1iu et say@ +,,0.. 1e s%uenXa'e complet d#rabidopsis a rvl M+ '"nes NRT1 et T '"nes NRT2 (NRT2.1-7. ( he #rabidopsis ;enome Initiative@ +,,,.. 6hez #rabidopsis@ les premiers '"nes de la famille &R + ont t isols sur la base dune forte induction par le nitrate par rapport la 'lutamine (AtNRT2.1B 3illeur R !aniel/Cedele@ *LLL.@ ou par leur homolo'ie de s%uence avec le transport haute affinit pour le nitrate chez le champi'non Aspergillus nidulans CRNA (AtNRT2.1 et AtNRT2.2B Yhuo et al.@ *LLL.. #ctuellement sept '"nes appartenant la famille &R +@ AtNRT2.1 AtNRT2.7@ sont dcrits (:rsel et al.@ +,,+.. 1es transporteurs &R + d#rabidopsis sont principalement exprims dans la racine@ except le '"ne AtNRT2.7 %ui est prfrentiellement exprim dans les feuilles. !eux autres '"nes@ AtNRT2.3 et AtNRT2.5@ sont aussi exprims dans les parties ariennes. 1e '"ne AtNRT2.1 est le plus abondamment transcrit dans les racines (:rsel et al.@ +,,+.. 1es '"nes AtNRT1 constitue une famille de transporteur du nitrate beaucoup plus 'rande (M+ membres. %ue les '"nes #tNRT2. 1e premier '"ne de la famille@ AtNRT1.1@ a t isol 'rQce un mutant dinsertion rsistant au chlorate (chl1.@ analo'ue toxi%ue structural du nitrate ( say et al.@ *LL0.. 1es transporteurs AtNRT1.1@ AtNRT1.2 et AtNRT1.4 sont les seuls transporteurs de nitrate de la famille AtNRT1 Etre caractriss au niveau physiolo'i%ue et confirms comme tant des protines contribuant au 1# 4 ( say et al.@ *LL0B <uan' et al.@ *LLS@ *LLLB 6hiu et al.@ +,,I.. 1e '"ne AtNRT1.5 serait impli%u dans la scrtion du nitrate au niveau du xyl"me (6anivenc@ +,,M.. 1e transporteur AtNRT1.1 reste le plus tudi. Il est fortement exprim dans les jeunes or'anes en formation@ avec un possible rAle dans le dveloppement de la plante et en particulier dans celui des racines primaires et secondaires (;uo et al.@ +,,*.. 1absorption du nitrate par les plantes est un processus fortement r'ul tout dabord par la disponibilit en substrat@ mais aussi par le statut nutritionnel de la plante@ coordonn avec les T

fluctuations de son environnement physi%ue. En effet@ linflux haute affinit du nitrate est transitoirement au'ment lors%ue les plantes sont mises en prsence de nitrate (!aniel/Cedele et al.@ *LL-B 6ra9ford R ;lass@ *LL-.. 1e '"ne #t&R *.* est 'alement inductible par le nitrate@ et il est rprim lors dune priode de carence en nitrate (1ejay et al.@ *LLL.. 1expression des '"nes AtNRT2.1@ AtNRT2.4@ et AtNRT2.5 est tr"s fortement induite lors%ue les plantes sont cultives en conditions de nitrate limitant@ alors %ue lexpression des '"nes AtNRT2.6 et AtNRT2.7 semble beaucoup plus constitutive vis//vis du statut azot des plantes (:rsel et al.@ +,,+.. 1ammonium intera'it 'alement avec les syst"mes dabsorption du nitrate. # faible concentration@ lammonium a un effet inducteur rapide ($loom R 4u>rapanna@ *LL,.. 5ar contre@ concentration plus leve@ lammonium inhibe rapidement et rversiblement labsorption du nitrate (1ee R !re9@ *L-L.. 5lus 'nralement@ une r'ulation n'ative de type feedbac serait impose par les produits de lassimilation de lammonium comme les acides amins (2uller et al.@ *LLM.. 1e cycle jourWnuit constitue un autre niveau de r'ulation %ui permet de coordonner labsorption du nitrate avec la photosynth"se et le mtabolisme carbon. 1absorption nette du nitrate au'mente continuellement au cours de lclairement et dcroNt lobscurit (1ejay et al.@ *LLL.. 1es 'lucides@ produits de la photosynth"se@ seraient les acteurs de cette r'ulation de labsorption du nitrate (!elhon et al.@ *LLS.. 1addition de saccharose dans le milieu de culture au cours de la priode nocturne induit notamment les '"nes AtNRT1.1 et AtNRT2.1 (1ejay et al.@ *LLL@ +,,0..
II.A.". Absorption de lammonium.

1e transport actif de lammonium chez #rabidopsis est assur par un uniport dammonium volta'e dpendant@ pilot par la famille de transporteurs #t#2 (1ude9i' et al.@ +,,+.. 1a complmentation fonctionnelle dun mutant de levure dficient pour le transport de lammonium a permis didentifier le premier '"ne A!T1 de plante chez #rabidopsis? AtA!T1.1 (&innemann et al.@ *LLI.. !epuis@ lanalyse du s%uenXa'e complet du 'nome d#rabidopsis a rvl cin% autres s%uences homolo'ues (;azzarrini et al.@ *LLLB 4ohlen>amp et al.@ +,,,.. 1es '"nes AtA!T1.1 AtA!T1.5 sont fortement homolo'ues entre eux@ et forment la sous/famille #t#2 * des transporteurs dammonium. 1e '"ne AtA!T2 se rv"le plus proche des transporteurs dammonium des procaryotes %ue des transporteurs #2 * de plantes (1ude9i' et al.@ +,,*.. 6ontrairement aux membres de la famille #2 *@ le '"ne AtA!T2 est prfrentiellement exprim dans la partie arienne de la plante. 6ette

caractristi%ue laisse envisa'er un possible rAle de ce '"ne dans le recycla'e de lammonium issu du mtabolisme photorespiratoire (4ohlen>amp et al.@ +,,+.. 1e '"ne AtA!T1.1 est fortement exprim dans la racine@ su''rant une contribution majoritaire de ce '"ne dans la capacit totale dabsorption de lammonium par la racine (;azzarrini et al.@ *LLLB 1o%u R von 8irn@ +,,I.. En outre@ AtA!T1.1 est le transporteur %ui a le plus daffinit pour son substrat (1o%u R von 8irn@ +,,I.. .. AtA!T1.1 est aussi fortement induit par la diminution des ressources azotes du milieu. !e la mEme faXon@ le '"ne AtA!T1.3 est rapidement induit par la carence en azote alors %ue les '"nes AtA!T1.2 et AtA!T2.1 ne sont induits %uapr"s une lon'ue priode de carence (;azzarrini et al.@ *LLLB 4ohlen>amp et al.@ +,,,.. 1es mcanismes r'ulant le transport de lammonium par les #t#2 s en condition dazote limitant sont encore mal connus. 1absorption dammonium serait principalement r'ule par le statut azot r'nant localement autour de la racine@ la diffrence de la r'ulation par le statut azot de la plante enti"re dans le cas de labsorption du nitrate (;ansel et al.@ +,,*.. 1a 'lutamine exercerait aussi un rtro/contrAle n'atif sur la transcription du '"ne AtA!T1.1 (Ra9at et al.@ *LLL.. 1absorption dammonium par les racines varie aussi en fonction du rythme diurnal. #pr"s une au'mentation continuelle durant la priode lumineuse@ labsorption de lammonium diminue lobscurit (:urry et al.@ *LLSB ;azzarrini et al.@ *LLL.. 6es variations diurnales sont corrles avec le niveau dexpression des '"nes AtA!T1.2 et AtA!T1.3. #ussi@ ces '"nes seraient/ils plutAt impli%us dans labsorption dammonium au cours de la priode dclairement (;azzarrini et al.@ *LLL.. 1es photoassimilats seraient responsables de cette r'ulation au cours du cycle jourWnuit@ comme nous lavons dj mentionn dans le cas de labsorption du nitrate. 1ajout de saccharose en priode nocturne inhibe la baisse des taux de transcrits des '"nes AtA!T1.1@ AtA!T1.2 et AtA!T1.3@ et maintient ainsi un influx dammonium comparable celui mesur au cours de la priode lumineuse (1ejay et al.@ +,,0.. II.B. #duction du nitrate en ammonium.

1e nitrate mtaboli%uement actif disponible dans le cytosol doit ncessairement Etre rduit en ammonium pour Etre assimil. 1a rduction du nitrate est assure par laction successive de deux enzymes@ la nitrate (&R. et la nitrite (&iR. rductase. !ans le cytosol@ la &R catalyse la

saccharose

oxaloactate AAT glutamate

aspartate

asparagine

ASN 2-oxoglutarate glutamate

GOGAT NH4+ GDH 2-oxoglutarate glutamate GS glutamine 2-oxoglutarate NH4+ GDH

NO3NR

NO2NiR

NH4+

Figure 2. Voie dassimilation de lazote (daprs Coruzzi, 2003). GS, glutamine synthetase; GOGAT, glutamate synthase; AAT, aspartate aminotransferase; ASN, asparagine synthetase; GDH, glutamate deshydrogenase; NiR, nitrite reductase; NR, nitrate reductase.

rduction du nitrate en nitrite. oxi%ue@ le nitrite est immdiatement transfr dans les plastes oD il est pris en char'e par la &iR et rduit en ammonium (3i'ure +.. 1a &R est une enzyme soluble localise dans le cytosol@ %ui ncessite deux lectrons pour rduire le nitrate en nitrite. 1e pouvoir rducteur ncessaire la raction est apport par le &#!<. 6hez A. thaliana@ la &R est code par deux '"nes@ N"A1 et N"A2@ &I#+ assurant L,J de lactivit totale de la &R (6hen' et al.@ *L--B 6ra9ford et al.@ *L--B 8il>inson R 6ra9ford@ *LL*.. 1a &iR est localise dans le chloroplaste des feuilles et les plastes des racines (Fleinhofs R 8arner@ *LL,.@ et le pouvoir rducteur est assur par les ferrdoxines. 6hez #rabidopsis@ la &iR est code par le '"ne N"". 1ensemble de la voie de rduction du nitrate en ammonium est tr"s contrAl et sillustre par une forte r'ulation des enzymes cls rpondant la fois aux stimuli externes et au statut interne des plantes. !une part@ laccumulation du nitrite dans la cellule doit Etre empEche. Et dautre part@ les mtabolismes carbon et azot doivent Etre coordonns afin dassurer le maintien du pouvoir rducteur et la production des acides or'ani%ues@ accepteurs de lammonium pour la synth"se des acides amins. 1es deux tapes de la rduction du nitrate sont induites par le nitrate et rtro/contrAles par les composs azots rduits. En prsence dammonium ou en condition de nitrate limitant@ les niveaux dexpression des '"nes &I# et la %uantit de protine &R sont faibles (2eyer R 4titt@ +,,*.. Zuel%ues heures de rinduction par le nitrate suffisent au'menter le taux des transcrits des '"nes N"A (6ra9ford@ *LLM.. 1e rythme circadien r'ule 'alement lactivit de la &R et de la &iR. 1expression des '"nes N"A au'mente au cours des premi"res heures dillumination puis diminue en relation avec laccumulation de 'lutamine au cours de la journe (4titt et al.@ +,,+.. 1e '"ne N"" codant pour la &iR est r'ul de la mEme faXon %ue les '"nes N"A.

II.$. Incorporation de lammonium dans les acides amins.

1ammonium est indispensable car il constitue llment cl du passa'e entre lazote inor'ani%ue et lazote or'ani%ue et inversement. 1absorption de lammonium du sol par les racines (cf I.#.+.. et la rduction du nitrate par la &R et la &iR (cf II.$.. ne sont pas les seules sources dammonium pour la plante. 1e processus de photorespiration ainsi %ue le

*,

catabolisme de certains acides amins comme laspara'ine en particulier@ ou dautres composs riches en azote (urides par exemple.@ constituent 'alement un apport non n'li'eable. &anmoins@ %uelle %ue soit son ori'ine@ lammonium@ toxi%ue pour la plante@ doit Etre immdiatement rassimil. 1es trois enzymes 'lutamine synthtase (;4.@ 'lutamate synthase (;:;# .@ et 'lutamate dshydro'nase (;!<. sont les principaux acteurs des processus dassimilation de lammonium issu de labsorption racinaire ou [assimilation primaire et de sa rassimilation dans la plante (3i'ure +.. 1ammonium est incorpor dans les acides amins par laction combine de la ;4 # 5/ dpendante et de la ;:;# au cours du cycle ;4W;:;# . 1ion ammonium est incorpor au 'lutamate par la ;4 pour former la 'lutamine. 1e 'roupement amide de la 'lutamine est alors transfr l\/cto'lutarate par la ;:;# . !eux molcules de 'lutamate sont ainsi formes@ lune tant recycle pour la formation de 'lutamine@ lautre utilise pour la synth"se des acides amins (<irel R 1ea@ +,,*B 2iflin R <abash@ +,,+B 3i'ure +.. ;lutamine et 'lutamate sont les premi"res sources dazote rduit dans la cellule@ et peuvent alors Etre utiliss pour former aspartate et aspara'ine via les deux enzymes aspartate aminotransfrase (## . et aspara'ine synthtase (#4&. (3i'ure +.@ ainsi %ue les autres acides amins et molcules azotes. ;lutamine@ 'lutamate@ aspartate et aspara'ine@ assurent alors la translocation de lazote inor'ani%ue des or'anes source vers les or'anes puits (5eoples R ;ifford@ *LL0.. !eux isoformes de gluta&ine !-nt7 ta!e 8GS9 existent@ aux rAles et localisations diffrents. 1a ;4* cytoplasmi%ue est prsente principalement dans les racines et plus 'nralement les tissus non/photosynthti%ues. 1a ;4+ est majoritaire dans les tissus photosynthti%ues@ en particulier les feuilles jeunes@ et est localise dans le chloroplaste. 6ette distribution or'ane spcifi%ue su''"re un rAle prpondrant de la ;4+ dans lassimilation de lammonium issu de la rduction du nitrate dans les chloroplastes etWou dans la rassimilation de lammonium photorespiratoire. Zuant la ;4*@ elle interviendrait surtout pour lassimilation de lazote dans les racines (pour revue@ voir 6oruzzi@ +,,0.. 6hez #rabidopsis@ cin% '"nes codant pour la forme cytosoli%ue de la ;4 (#$N1.1 #$N1.5. et un seul '"ne codant pour la forme chloroplasti%ue (#$N2. ont t identifis. 1es '"nes #$N1.4 et #$N1.5 restent toutefois putatifs car lactivit des protines ;1&*.I et ;1&*.M na pas t dmontre. #$N1.4 et #$N1.5 seraient respectivement induits lors de la snescence foliaire (5ourtau et al.@ +,,S. et la 'ermination des 'raines. 1expression de #$N2 est uni%uement dtectable dans les feuilles vertes et #$N1.1@ #$N1.2@ #$N1.3 sont prfrentiellement exprims dans les racines et les

**

saccharose

oxaloactate AAT glutamate

aspartate

asparagine

ASN 2-oxoglutarate glutamate

GOGAT NH4+ GDH 2-oxoglutarate glutamate GS glutamine 2-oxoglutarate NH4+ GDH

NO3NR

NO2NiR

NH4+

Figure 2. Voie dassimilation de lazote (daprs Coruzzi, 2003). GS, glutamine synthetase; GOGAT, glutamate synthase; AAT, aspartate aminotransferase; ASN, asparagine synthetase; GDH, glutamate deshydrogenase; NiR, nitrite reductase; NR, nitrate reductase.

feuilles snescentes ($ernhard R 2atile@ *LLIB 5eterman R ;oodman@ *LL*.. 1es taux de transcrits de la ;4 sont r'uls par la lumi"re@ le carbone@ et les mtabolites azots (:liveira R 6oruzzi@ *LLL.. 1expression de la ;4 est en particulier induite par la lumi"re et le saccharose@ et rprime par des applications de 'lutamate ou 'lutamine. !eux types de gluta&ate !-nt7a!e 8GOGAT9 existent@ localises dans le chloroplaste@ %ui se distin'uent par le donneur dlectrons@ ferrdoxine (3d/;:;# . ou &#!< (&#!</ ;:;# . (<irel R 1ea@ +,,*.. 1a 3d/;:;# est prpondrante dans les feuilles est photosynthti%ues@ assurant LMJ de lactivit ;:;# @ alors %ue la &#!</;:;#

surtout active dans les tissus non photosynthti%ues comme les racines. 6es localisations tissulaires su''"rent un rAle prpondrant de la 3d/;:;# dans lassimilation primaire de lammonium alors %ue la &#!</;:;# serait plus spcifi%uement impli%ue dans les (#$%1 et #$%2. processus de rassimilation de lammonium photorespiratoire (pour revue@ voir 6oruzzi@ +,,0.. 6hez #rabidopsis@ deux '"nes codent pour la 3d/;:;# (6oschi'ano et al.@ *LL-.@ et un seul pour la &#!</;:;# ( #$T1.. #$%1 est exprim

majoritairement dans les feuilles et est r'ul par la lumi"re@ alors %ue #$%2 est dabord exprim dans les racines. #$T1 est constitutif@ faiblement exprim dans les feuilles mais fortement dans les racines (6oruzzi@ +,,0.. La gluta&ate d !7-drog na!e 8GD.9 est un enzyme %ui catalyse la conversion du 'lutamate en ammonium et \/cto'lutarate ainsi %ue la raction inverse@ cest//dire lamination de l\/cto'lutarate (3i'ure +. (#ubert et al.@ +,,*.. !eux formes majeures de ;!< ont t dcrites ? une forme &#!< dpendante dans les mitochondries et une forme &#!5< dpendante dans les chloroplastes (2elo/:liveira et al.@ *LLS.. #rabidopsis poss"de deux '"nes pour la ;!< ? #&'1 et #&'2. =n troisi"me '"ne putatif #&'3 a t rcemment identifi par homolo'ie de s%uence. #u niveau transcriptionnel@ les '"nes #&' sont r'uls n'ativement par les sucres et positivement par lammonium@ contrairement aux '"nes #(. 1enzyme ;!< est abondant dans les diffrents or'anes de la plante et son activit leve mais son rAle physiolo'i%ue reste encore tr"s dbattu (!ubois et al.@ +,,0.. 1e rAle majeur de la ;!< serait la dsamination du 'lutamate pour fournir ner'ie et s%uelettes carbons (2iflin R <abash@ +,,+B 2asclaux/!aubresse et al.@ +,,S.. La!"artate a&inotran!: ra!e 8AAT9@ enzyme phosphate/dpendant@ catalyse le transfert rversible dun 'roupe amin du 'lutamate vers loxaloactate pour former laspartate et l\/ cto'lutarate (3i'ure +.. 6in% '"nes codant diffrents isoenzymes ont t dcrits chez #rabidopsis@ A()1-5 (4chultz R 6oruzzi@ *LLMB 8il>ie et al.@ *LLM.. A()1 code pour *+

lenzyme mitochondrial ## *@ A()2 et A()4 codent pour des isoenzymes cytosoli%ues@ A()5 code pour lenzyme chloroplasti%ue ## 0@ et A()3 code pour un isoenzyme putatif du proxisome. ## + et ## 0 sont les formes majoritaires (6oruzzi@ +,,0.. ## + assure la synth"se des pools daspartate la lumi"re@ %ui sont utiliss pour la synth"se de laspara'ine lobscurit (6oruzzi@ +,,0.. ## + jouerait aussi un rAle important dans le transport de lazote jus%uau sili%ue (2iesa> R 6oruzzi@ +,,+.. La!"aragine !-nt7 ta!e 8ASN9 catalyse le transfert # 5/dpendant dun 'roupe amin de la 'lutamine vers une molcule daspartate pour former 'lutamate et aspara'ine (3i'ure +.. 2Eme si lammonium est un substrat potentiel@ la 'lutamine est le substrat privil'i de l#4& chez la majorit des plantes suprieures (4ieciecho9icz et al.@ *L--.. 1aspara'ine a t le premier acide amin dcouvert et@ compar la 'lutamine@ laspara'ine est relativement inerte et transporte plus dazote par carbone. #insi laspara'ine assure le stoc>a'e de lazote et le transport lon'ue distance de lazote par le phlo"me chez les plantes suprieures. rois '"nes codant pour l#4& ont t dcrits chez A. thaliana ? A(N1@ A(N2@ et A(N3. A(N1 est majoritairement exprim chez les jeunes plantules. 1expression de A(N3 est tr"s faible@ et A(N1 et A(N2 sont rcipro%uement r'uls par la lumi"re et les mtabolites. 6es diffrences dexpression su''"rent des rAles distincts pour ces trois '"nes (1am et al.@ *LL-.. 1a transcription du '"ne A(N1 est notamment induite chez les plantes cultives lobscurit@ et inhibe par la lumi"re. 6est exactement linverse pour A(N2. 1e niveau dexpression de A(N1 est tr"s finement corrl avec les taux daspara'ine libre (1am et al.@ *LLI@ *LL-@ +,,0.. A(N1 r'ulerait les taux daspara'ine libre synthtise chez #rabidopsis. 2tabolisme de lammonium et expression de A(N2 sont corrls@ su''rant un rAle important de A(N2 dans le mtabolisme de lammonium chez #rabidopsis (8on' et al.@ +,,I..

;lutamate et 'lutamine constituent les premi"res sources dazote rduit dans la cellule. 5ar transamination@ lazote est ensuite transfr dautres substrats carbons (acides \/ ctoni%ues. pour former de nouveaux acides amins (aspartate@ alanine@ 'lycine ].@ eux/ mEmes prcurseurs de tous les autres acides amins. 1es acides amins synthtiss peuvent aussitAt contribuer la biosynth"se des protines@ ou Etre transitoirement stoc>s dans les vacuoles@ ou transports vers dautres tissus.

*0

III. Azote% ure & agriculture.

1ure (6:(&<+.+. est un diamide dacide carboni%ue. 6est un compos cristallin blanc@ soluble dans leau@ avec un poids molculaire de S,@,S@ un point de fusion de *0+@T^6 et un contenu en azote de IS@SJ. 1ure est la forme den'rais azot la plus utilise dans le monde. Rpandue sur les champs par pulvrisation foliaire@ lure est aussi incorpore dans les sols@ seule ou en combinaison avec dautres en'rais azots.

III.A. Le procd de fabrication de lure.

1a prparation de lure repose sur la mthode dcouverte par $assarov en *-T, ($ellia@ *LSS.. 6ette mthode est base sur la dshydratation@ sous temprature et pression leves@ du carbamate dammonium@ obtenu par synth"se directe partir dammoniac et de dioxyde de carbone. !es amliorations successives du procd bas sur cette raction@ ont suivi et ont t utilises pour la premi"re fois des fins commerciales@ par I.;. 3arbenindustrie en #llema'ne@ en *L+,. 1a production dure lchelle industrielle nmer'ea %ue dans les annes *LM,@ et a ncessit des amliorations de %ualit et co_t de production. 1a fabrication industrielle de lure se droule en deux tapes sous une forte pression.

+&<0 K 6:+

&<+6::&<I
6arbamate dammonium carbamate

"

&<+6:&<+ K <+:
=re

1a premi"re raction est rapide@ exothermi%ue et totale (*I, +M, bar@ *-,^6.@ et conduit la formation de carbamate dammonium. 1a dcomposition thermi%ue du carbamate en ure est plus lente@ endothermi%ue et la conversion est de lordre de M, -,J. 1ure obtenue se prsente sous forme de solution a%ueuse dune concentration denviron T, -,J %ue lon transforme par vaporation sous vide de leau en une masse se prEtant au pompa'e (ure fondue.. 1a transformation suivante donne un en'rais 'ranul. Elle consiste soit en un prilla'e@ procd oD les 'outtelettes dure se solidifient dans un courant dair ascendant lors

*I

Consommation mondiale en Millions de tonnes

100 80 60 40 20 0 1970 1980 Ure 1990 Engrais Azots 2000

60 % dure par rapport aux fertilisants azots totaux 50 40 30 20 10 0 1970 1980 1990 2000

Figure 3. Evolution de la consommation mondiale des engrais azots et de lure (Donnes FAOSTAT, anne 2005 ).

de leur chute lintrieur de la tour de prilla'e@ soit en une 'ranulation de lure fondue sur des dis%ues rotatifs ou autres dispositifs refroidissement. III.B. &onnes conomi'ues.
III.B.!. (roduction.

1es principales r'ions productrices dure sont la Russie@ le 6anada et l#rabie 4aoudite. !autres producteurs du 2oyen/:rient sont aussi importants (Iran et Ira%@ du moins avant la 'uerre du ;olfe. (;libert et al.@ +,,S.. 1a production dure au 2oyen/:rient na cess de croNtre depuis les annes *L-,@ passant de + millions de tonnes par an en *L-, *, millions de tonnes par an en +,,,. En 6hine la production dure a tripl entre *L-L et *LLL. !epuis +,,,@ de nombreux pays d#mri%ue 1atine ont au'ment leur production de plus de +MJ (;libert et al.@ +,,S..

III.B.". $onsommation.

`us%ue dans les annes *LS,@ lure reprsentait seulement MJ de la consommation mondiale den'rais azots. 1es annes *L-, ont vu une acclration de lutilisation dure telle %ue lure reprsentait I,J des en'rais azots totaux au dbut des annes *LL,. #ujourdhui lure reprsente le fertilisant azot le plus utilis dans le monde (3i'ure 0.. 1a 6hine et lInde reprsentent environ la moiti de la consommation 'lobale@ et ont doubl leur consommation dure lors de la derni"re dcennie. 1es Etats/=nis et le 6anada reprsentent environ +,J du march 'lobal de lure (;libert et al.@ +,,S.. En 3rance la consommation dure reste tr"s faible (,@+ millions de tonnes en +,,, ce %ui reprsente ,@MJ de la consommation mondiale@ 3#:4 # +,,M.

III.$. )fficacit de lure en tant 'ue fertilisant azot. 1es proprits de lure en font un fertilisant azot de choix. 4a richesse en azote est intressante dun point de vue conomi%ue? de moindres %uantits sont utilises ce %ui permet de rduire les co_ts. 6est une molcule non polaire fortement soluble@ idale pour un usa'e *M

N atmosphrique (N2, N2O, NH3, NO3)

Pertes dN par le feuillage Fixation de N2

pertes N2O/N2 NO3

absorption NO3-, NH4+

immobilisation

rsidus

Micro-organismes
minralisation fixation de NH3

NH4

nitrification

URE-N
Eaux souterraines

Particules du sol
relargage

Figure 4. Dynamique de lure dans le sol (daprs Prasad, 1998).

dnitrification

Hommes Animaux
r sid us

Plante

volatilisation NH3

pluies acides

en pulvrisation foliaire@ de mEme %uen mlan'e avec dautres composs fertilisants@ pesticides ou herbicides. 1ure a t utilise pour la premi"re fois en tant %uen'rais azot en *L0M@ mais une certaine perplexit %uant son efficacit ne de rsultats anciens contradictoires@ subsiste dans lopinion a'ricole@ ce %ui a limit son utilisation jus%ue dans les annes *LS, (;ould et al.@ *L-S.. En effet@ lure est sujette diffrents mcanismes de pertes dazote@ comme la volatilisation ammoniacale@ le lessiva'e ou la dnitrification (3i'ure I.. 1ammoniac %ui mane de lure apporte au champ contribue aux pluies acides@ tandis %ue les nitrates produits dans le sol@ contribuent non seulement la contamination des eaux souterraines par lessiva'e@ mais aussi la destruction de la couche dozone@ par la formation doxyde nitri%ue selon le processus de dnitrification. 1accumulation de nitrite dans le sol suite lhydrolyse de lure peut aussi entraNner toxicit et pertes dazote. 1e biuret (dim"re de lure.@ en faible concentration dans lure@ est phytotoxi%ue sous certaines conditions. 6es diffrents probl"mes sont aujourdhui en majorit minimiss 'rQce aux nouvelles technolo'ies et volutions des procds de fertilisation.

III.$.!. (ertes dammoniac et to*icit de lammoniac.

1a volatilisation dammoniac est due la rapidit dhydrolyse de lure en ammoniac et dioxyde de carbone par les urases du sol. Il en rsulte une au'mentation du p<@ %ui@ combine la production dion ammonium@ conduit laccumulation dammoniac. 1es ions ammonium sont en %uilibre avec les 'az dammoniac en solution a%ueuse et@ p< alcalin@ la forme ammoniac libre est prdominante. 4i lammonium est relativement inoffensif@ lammoniac est tr"s toxi%ue et entraNne de srieux domma'es sur la 'ermination des 'raines et la croissance des plantules ($remner R Fro'meier@ *L-L.. En outre@ le p< alcalin coupl avec la forte concentration dions ammonium@ sont des conditions favorisant la volatilisation ammoniacale. 1es pertes dazote issu de lure par volatilisation ammoniacale dpendent de plusieurs facteurs? elles sont favorises dans les sols p< lev@ avec un faible pouvoir tampon@ et par les fortes tempratures. 1a volatilisation ammoniacale est le principal probl"me li lutilisation de lure en tant %ue fertilisant (6ourt et al.@ *LSI.. 1es recherches se sont donc attaches trouver une mthode efficace et conomi%ue afin de contrAler lvolution de lure en ammoniac. 1un des moyens consiste incorporer lure dans le sol. 6ependant@ cette prati%ue a'ricole se limite aux panda'es prcoces den'rais@ lors du semis par exemple. 1es particules dure peuvent aussi *S

Etre recouvertes de soufre %ui ralentit la dissolution du 'ranule dure (Rao@ *L-T.. &anmoins@ lapproche couramment utilise afin de remdier au probl"me de volatilisation ammoniacale@ consiste trouver des composs %ui inhibent lhydrolyse de lure. $eaucoup de composs ont t proposs comme des inhibiteurs durases potentiels. 1es hydroamates@ les composs soufrs htrocycli%ues@ les xanthates@ les %uinones et les phosphoroamides en sont %uel%ues exemples. 5lus rcemment@ Reddy R 4harma (+,,,. ont dmontr lefficacit des additifs chimi%ues comme le pyrite (3e4+.@ le chlorure de potassium (F6l. ou le sulfate de cuivre (6u4:I.. 6es additifs ont lavanta'e dEtre moins onreux %ue les inhibiteurs durases. Ils permettent aussi lenrichissement du sol en lments nutritifs essentiels %ue sont le soufre@ le fer@ le potassium@ le cuivre@ et le sulfate.

III.$.". Accumulation de nitrite.

1e p< alcalin et les fortes concentrations en ions ammonium suite lhydrolyse de lure inhibent loxydation du nitrite en nitrate par les bactries Nitr*bacter. 5ar contre@ les bactries Nitr*s*+*nas responsables de loxydation de lammonium en nitrite@ sont beaucoup moins sensibles aux sels dammonium en conditions alcalines. #insi@ les sols fertiliss avec les en'rais uri%ues ont tendance accumuler du nitrite@ toxi%ue pour la plante. 1accumulation de nitrite conduit aussi des pertes dazote 'azeux par dnitrification chimi%ue ainsi %u la contamination en nitrite des nappes prhati%ues. 1es inhibiteurs de nitrification associs avec lapplication dure sur les sols permettent de rduire considrablement laccumulation de nitrite@ et retardent 'alement la formation du nitrate. 6ependant lutilisation des inhibiteurs de nitrification peut 'alement amplifier le phnom"ne de pertes dazote uri%ue sous la forme dammoniac. #ussi est/il prfrable dajouter des inhibiteurs durase aux fertilisants uri%ues. En effet@ ceux/ci retardant considrablement lhydrolyse de lure@ limitent voire liminent laccumulation de nitrite dans les sols fertiliss avec de lure.

III.$.+. ,o*icit du Biuret.

1e biuret@ le dim"re de lure@ se forme lors de la dcomposition thermi%ue de lure au cours du prilla'e et de la 'ranulation de lure. 1e biuret interf"re avec la synth"se des protines

*T

chez les plantes (8ebster et al.@ *LMT.@ et ses effets phytotoxi%ues interviennent lors%uil reprsente au moins *J de lure. #ussi le biuret est/il un faux probl"me@ la plupart des fertilisants azots commercialiss en contenant moins de *J (;ould et al.@ *L-S..

III.$.-. Immobilisation de lazote de lure.

!"s lapport den'rais azot dans le sol@ une comptition sen'a'e entre les micro/or'anismes du sol et la culture pour la consommation de cet azote. 1a ror'anisation correspond au processus par le%uel les micro/or'anismes du sol assimilent lazote pour leurs propres besoins de renouvellement et de croissance. 1a ror'anisation est dautant plus importante %ue le sol a une forte activit biolo'i%ue. Elle ne doit pas Etre considre comme une perte pour le syst"me sol plante@ mais elle reprsente une immobilisation de len'rais dans le compartiment or'ani%ue du sol. 1ure nest pas sujette une ror'anisation spcifi%ue@ mais elle est plutAt immobilise via la raction biolo'i%ue entre forme ammoniacale et micro/or'anismes (Recous@ *L-TB 1e 4ouder R aureau@ *LLT..

III.$... /ertilisation foliaire dure.

1apport dazote aux cultures par pulvrisation foliaire sest dvelopp au cours des annes M,@ notamment parce %ue cette mthode apporte des avanta'es par rapport des strat'ies plus [classi%ues comme les apports dazote au sol. 1e faible indice de salinit de lure en fait la forme dazote privil'ie pour cette prati%ue a'ricole (la dessiccation des cellules par phnom"ne dosmose est rduite. (1aurent et al.@ *LL-.. 1a fourniture dure via le couvert v'tal permet de rduire les pertes dazote en'endres par le lessiva'e du nitrate lors dune application au sol. 1a pulvrisation dure reprsente 'alement une alternative efficace de nutrition azote@ afin de pallier les ventuelles difficults dabsorption par voie racinaire@ rencontres en cas de scheresse par exemple (;oodin' R !avies@ *LL+.. 6ependant des br_lures du feuilla'e apparaissent souvent suite la pulvrisation dure. 6es symptAmes de phytotoxicit sont dautant plus sv"res %ue la temprature est forte et lhumidit faible@ et %ue la solution dure pulvrise est concentre (8itte@ +,,*.. 6es ncroses ont dabord t attribues la formation de %uantits toxi%ues dammonium issu de lhydrolyse de lure par les urases des cellules foliaires (<insvar> et

*-

al.@ *LM0.. !es tudes plus rcentes montrent %ue les br_lures foliaires sont plutAt causes par laccumulation dure toxi%ue par elle/mEme (Fro'meier et al.@ *L-L.. !autres effets indsirables sont 'nrs par pulvrisation comme la phytotoxicit de lammoniac dissous issu de lhydrolyse de lure. En plus de ces symptAmes visuels de phytotoxicit@ la pulvrisation foliaire dure en'endre des interfrences avec le mtabolisme de la plante. #fin dassurer lassimilation de lure en acides amins@ la plante doit dpenser beaucoup dner'ie (S@M ' de 'lucose sont ncessaires pour convertir * ' dure.@ ce %ui aboutit des chutes de rendements (1aurent et al.@ *LL-.. 1action des urases foliaires 'n"re aussi des pertes dazote par volatilisation ammoniacale %ui nexc"dent pas 0,J@ et %ui sont encore bien moindres de faXon 'nrale (8itte@ +,,*.. outefois lessentiel des pertes par voie 'azeuse a lieu apr"s %ue lure a atteint le sol.

I0. 1re aspects biochimi'ues & molculaires.

I0.A. La dgradation de lure.

I0.A.!. 2istori'ue de la dcouverte de lure et de lurase.

1es dcouvertes de lure puis de lurase ont jou un rAle histori%ue dans lhistoire de la chimie or'ani%ue. 1isolement de lure issue de lurine humaine est attribu au chimiste franXais <illaire/2arine Rouelle en *TT0. En *-+-@ le chimiste allemand 3riedrich 8ahler synthtisa lure de mani"re un peu fortuite. En effet@ 8ahler traita du cyanate dar'ent avec une solution de chlorure dGammonium@ en esprant obtenir du cyanate dammonium. =ne nouvelle substance cristalline blanche a t obtenu@ %ui sest avre de mEme formule lmentaire (6<I:&+. %ue celle du cyanate dGammonium recherch. !Gautres proprits ont prouv %ue le produit obtenu ntait pas du cyanate dGammonium@ mais %uil tait identi%ue lGure contenue dans les urines animales. 1a premi"re molcule or'ani%ue@ lure@ venait dEtre cre@ partir de composs inor'ani%ues? la chimie or'ani%ue venait de naNtre. En *L+S@ `ames $atcheller 4umner prouva %ue les enzymes sont des protines en achevant la premi"re cristallisation dune enzyme@ lurase du haricot sabre (jac>bean@ Cana,alia

*L

ensif*r+is.. En *LTM@ !ixon et collaborateurs ont dcouvert %ue lurase contenait du nic>el (&i.@ lment indispensable son activit. #ujourdhui@ lurase est encore le seul enzyme connu pour contenir du nic>el chez les plantes suprieures.
I0.A.". &gradation non enz3mati'ue de lure.
O C H N H O H NH2 H H N C O

NH3

1ure est une molcule tr"s stable. 1a d'radation sop"re lentement en milieu a%ueux (la demi/vie de lure est de 0@S ans 0-^6 et pour un p< compris entre + et *+.. 1e processus de d'radation consiste en une limination conduisant la formation dacide cyani%ue et dammoniac.
I0.A.+. &gradation enz3mati'ue de lure.

O H2N C NH2 + H2O

urease
NH3 + H2N

O C OH

O H2N C OH + H2O NH3 + H2CO3

1a d'radation enzymati%ue de lure est *,*I fois plus rapide %ue la d'radation non enzymati%ue. 1enzyme urase (urea amidohydrolase@ E6 0.M.*.M. catalyse lhydrolyse de lure en ammoniac et carbamate@ %ui est alors spontanment hydrolys pour former une molcule dacide carboni%ue ainsi %uun seconde molcule dammoniac.

<+6:0 b <6:0/ K <K + &<0 K + <+: b + &<IK K + :</

+,

1acide carboni%ue se dissocie p< physiolo'i%ue@ et les molcules dammoniac s%uilibrent alors avec leau pour Etre protones. Il en rsulte une nette au'mentation du p<. I0.B. Les urases. !normes %uantits dure issues de la dtoxification des composs azots par lhomme et lanimal@ sont constamment rejetes naturellement dans lenvironnement. 1essor de la production et de lapplication des en'rais base dure constitue une autre voie principale dentre de lure dans lenvironnement. 6ependant@ lure ainsi 'nre est prise en char'e par dautres processus mtaboli%ues impli%uant lenzyme urase@ et na donc souvent %uune dure de vie tr"s courte. 1urase est un enzyme dpendant du nic>el@ rpandu chez la majorit des or'anismes. =ne activit urase est observe chez les procaryotes et beaucoup deucaryotes synthtisent lurase (nombreux microor'anismes@ des invertbrs@ les plantes.. 1enzyme le plus et le mieux tudi est une urase de plante@ celle du haricot sabre (jac> bean.. 1es urases microbiennes et les urases de plantes font lobjet dun 'rand intrEt en a'riculture@ depuis %ue les en'rais base dure occupent la premi"re place dans le monde. 1action des urases microbiennes est essentielle dans le sol pour la transformation des composs azots? *T 0,J de la population microbienne du sol prsentent une activit urolyti%ue. 1urase est tr"s stable et persiste mEme apr"s la mort des cellules v'tales et microbiennes. Elle est donc majoritairement prsente dans le sol comme un enzyme libre ou li aux particules collo7dales du sol.
I0.B.!. Les urases microbiennes.

1a caractrisation des urases microbiennes dun point de vue la fois physiolo'i%ue et molculaire a t particuli"rement bien dcrite dans deux revues de microbiolo'ie (2obley R <ausin'er@ *L-LB 2obley et al.@ *LLM.. &ous vo%uerons ici seulement %uel%ues aspects. 6hez les levures et bactries les urases sont cytoplasmi%ues. $ien %ue lure diffuse travers les membranes@ des syst"mes de transports actifs de lure ont t dcrits chez les levures@ al'ues et bactries. outes les urases ayant une activit urolyti%ue dpendante du nic>el@ le transport actif de nic>el est 'alement ncessaire pour la formation dune urase active. 1ure est alors hydrolyse en ammoniac et dioxyde de carbone@ ce %ui 'n"re une nette au'mentation du p< intracellulaire. 1e 'radient de proton ainsi form est utilis pour activer

+*

(UreABC)3

UreDGF

UreDGF UreE Ni2+ Ni2+ UreE Ni2+ Ni2+ UreDGF + GDP + Pi CO2 + GTP

(UreABC)3

Figure 5. Modle dactivation de lurase (daprs Hausinger et al., 2001).

une # 5ase <K dpendante@ et lammoniac est proton en ammonium. 1activit urolyti%ue des urases microbiennes est dpendante de la concentration en ure@ du niveau de lurase dans la cellule@ et des taux de transport de lure et de lammonium. 1es urases microbiennes sont des htropolym"res composs de deux ou trois sous units diffrentes@ \ (S, SS >!a.@ c (** **M >!a.@ et d (environ ** >!a.. 2al'r ces diffrences dans le nombre de sous units@ toutes les urases prsentent une forte similarit de s%uence@ ce %ui indi%ue %uelles sont des variantes de la mEme protine ancestrale. 1es '"nes des urases microbiennes sont or'aniss en cluster@ re'roupant des '"nes de structure et des '"nes accessoires. 1es trois sous units structurales \@ c@ et d des urases htropolym"ri%ues sont codes respectivement par trois '"nes conti'us@ ure6@ ure$@ et ure#. 1es s%uences des '"nes structuraux des urases prsentent de fortes homolo'ies et montrent des '"nes ancestraux communs. 6hacun de ces '"nes structuraux est ali'n de la mEme faXon@ de la plus petite sous unit la plus 'rande. Ils sont suivis par des '"nes accessoires ncessaires pour la synth"se du site catalyti%ue de lurase. =n minimum de sept '"nes est 'nralement ncessaire lexpression dune urase fonctionnelle. =re#@ =re$ et =re6 forment lapoenzyme inactive. 1es protines =re!@ =re3 et =re; sont ncessaires lincorporation du nic>el dans le site actif. =ne %uatri"me protine accessoire@ =reE@ facilite cette incorporation. 1a synth"se du centre actif de lurase est complexe et ncessite la prsence de nic>el@ de dioxyde de carbone@ et des protines accessoires@ ainsi %ue lhydrolyse du ; 5. 1a 3i'ure M illustre les diffrentes tapes cls du processus dactivation cellulaire de lurase. En absence de nic>el ou dune protine =re! fonctionnelle@ les cellules produisent lapourase (=re#$6.0@ structurellement identi%ue lholoprotine active exceptes labsence du nic>el et de la carbamylation (<ausin'er et al.@ +,,*.. 1apoprotine se lie alors avec un complexe prform compos des trois protines accessoires essentielles? =re!@ =re3@ et =re;. 1apourase pourrait aussi se lier successivement =re!@ puis =re3@ et enfin =re;. 1e complexe apourase =re!3; ainsi form constitue le complexe cl dans le processus dactivation de lurase. 1ensemble =re!3; est dissoci d"s lors %ue lapoenzyme est active. 5our cela@ la prsence de nic>el@ de bicarbonate@ de ; 5@ et de la protine =reE sont ncessaires. 1e bicarbonate est le donneur du dioxyde de carbone re%uis pour la carbamylation du rsidu lysine du site actif@ liant les deux ions nic>el. 1e nic>el semble Etre dlivr par la protine chaperone =reE. 1e nombre de nic>el li =reE est variable selon les diffrentes urases. 6ette variabilit est relier avec le nombre de rsidus histidine prsents dans la r'ion 6/terminale fixatrice de nic>el@ de la

++

protine =reE. 1ner'ie ncessaire lactivation de lurase in ,i,* provient du ; 5@ %ui se fixe sur un motif 5/loop de la protine =re;.
I0.B.". Les urases chez les plantes.

1a premi"re cristallisation de lurase est celle du haricot sabre (jac> bean@ Cana,alia ensif*r+is. et lactivation de lurase est encore aujourdhui la seule fonction du nic>el dmontre chez les plantes suprieures. 1urase est une enzyme ubi%uiste chez les plantes (8itte R 2edina/Escobar@ +,,*. et tr"s abondante dans la 'raine de nombreux membres de la famille des 1'umineuses et des 6ucurbitaces. 4a principale fonction est le recycla'e de lazote issu de lure. 1urase de haricot est la mieux caractrise du point de vue biochimi%ue@ alors %uau niveau 'nti%ue les informations proviennent essentiellement de ltude de lurase chez le soja (#l-cine +a... 1es urases des plantes ont t particuli"rement bien rensei'nes dans trois revues@ dont les informations %ui suivent sont majoritairement issues (5olacco R <olland@ *LL0@ *LLIB 4ir>o R $rodzi>@ +,,,.. 1a source de donnes complmentaires est prcise.
I0.B.".a (roprits biochimi'ues et ph3siologi'ues.

1es urases de plante sont des multim"res dune uni%ue sous unit denviron L, >!a (5olacco et al.@ *L-M.@ colinaire avec les trois peptides constituant les urases des bactries (2ulrooney R <ausin'er@ +,,0.. 6ha%ue sous/unit fixe deux ions nic>el@ sur une r'ion riche en rsidus histidine ( a>ishima et al.@ *L--.. 1affinit et la spcificit de lurase pour son substrat sont fortes. 1urase de haricot poss"de un Fm de +@L m2 et son activit spcifi%ue est de 0M,, emol dure d'rade par minute et par m' de protine. !es expriences de fractionnement cellulaire rv"lent une localisation cytoplasmi%ue de lurase. 1a protine nest pas 'lycosyle et ne contient pas de peptide si'nal (8itte@ +,,*.. =ne r'ulation de lurase par son substrat est vo%ue dans la littrature@ chez le riz (2atsumoto et al.@ *LSS.@ le haricot (2atsumoto et al.@ *LS-.@ et lor'e ( urley R 6hin'@ *L-SB 6hen R 6hin'@ *L--.. 6ependant@ 5olacco R <olland (*LL0. rfutent ltat inductible de lurase chez les plantes. 4elon ces auteurs@ lau'mentation de lactivit urasi%ue suite une exposition lure@ est plutAt 'nre par les urases de la population bactrienne retrouve chez les plantes.

+0

I0.B.".b Biologie molculaire.

1a richesse en protines du soja en fait la plante mod"le %uant ltude de lurase@ lurase tant le seul enzyme capable dassimiler lure chez les plantes. 1e soja produit deux urases diffrentes. 1urase ubi%uiste est homotrimri%ue et synthtise dans lensemble des tissus v'taux. 1urase embryonnaire existe sous la forme dhexam"res ou de trim"res et elle est spcifi%ue des 'raines matures et des racines des jeunes plantules. 1isoenzyme embryonnaire reprsente ,@+J ,@MJ des protines totales de la 'raine@ et son activit est respectivement *,, M,, fois plus importante %ue lurase ubi%uiste dans les embryons en dveloppement et les embryons matures. 6hacune des deux urases est code par un '"ne distinct? /u* code lurase spcifi%ue de lembryon et /uI lisoenzyme ubi%uiste ( oris>y et al.@ *LLI.. En revanche@ la pomme de terre@ la tomate@ plusieurs autres esp"ces de solanaces@ et aussi #rabidopsis@ ont un uni%ue '"ne ur0ase (8itte et al.@ +,,Mb.. 1a s%uence codante compl"te de lurase de la 'raine de Cana,alia ensif*r+is (jac>bean@ haricot sabre. a lon'temps t la seule disponible chez les plantes (Riddles et al.@ *LL*.. 1a s%uence 'nomi%ue du '"ne d#rabidopsis est dsormais disponible (# *;STMM,.. 1a s%uence nuclotidi%ue dun #!&c codant pour lurase foliaire chez le riz a t publie en +,,* dans les bases de donnes (1r-2a sati,a@ #$,TMITS.. 1es s%uences codantes pour les deux isourases du soja (#l-cine +a.. ont 'alement rcemment t ajoutes dans les bases de donnes (;oldraij et al.@ +,,0.. En +,,M@ 8itte et collaborateurs ont publi les s%uences de deux all"les du '"ne de lurase chez la pomme de terre (#`+TS-SI@ #`+TS-SM.. 1tude des mutants des '"nes /u* et /uI chez le soja a apport de nombreuses informations %uant aux rAles physiolo'i%ues de cha%ue isoenzyme (5olacco R <olland@ *LL0.. !ans les conditions utilises@ la perte de lurase embryonnaire nest pas associe un phnotype particulier? lisoenzyme spcifi%ue naurait donc pas de fonction physiolo'i%ue essentielle. 1urase ne jouerait pas de rAle dans la nutrition de lembryon@ puis%ue les cotyldons de soja ne 'n"rent pas dure in ,i,*. !e mEme@ alors %ue beaucoup dure est 'nre suite la 'ermination@ les mutants sans urase embryonnaire naccumulent pas plus dure %ue les sauva'es. #ussi lurase spcifi%ue de lembryon ninterviendrait pas dans lassimilation de lazote uri%ue@ mais aurait plutAt un rAle dans la dfense chimi%ue de la 'raine. =n mcanisme de dfense possible pourrait Etre la cration dun environnement hostile suite aux atta%ues de microbes ou insectes. 1a blessure de lembryon immature 'n"rerait la libration dar'inase par rupture des mitochondries. 1ure issue de laction de lar'inase sur limportant pool cytoplasmi%ue dar'inine (voir para'raphe IC.6.*..@ serait alors hydrolyse +I

par lurase entraNnant une forte hausse du p< accompa'ne par la production dammoniac toxi%ue. 1a perte de lurase ubi%uiste chez le soja entraNne lapparition de ncroses aux extrmits des feuilles ainsi %ue laccumulation dure dans les feuilles et les 'raines (4tebbins et al.@ *LL*.. !e mEme@ la suppression de toute activit urolyti%ue@ par ajout dinhibiteur durase ou par limination du nic>el@ conduit laccumulation dure chez les plantes de soja et blo%ue leur capacit utiliser lure comme source dazote. 1urase ubi%uiste est donc lori'ine du recycla'e de lure drive du mtabolisme de la plante@ et de lassimilation de lure exo'"ne. 6ependant@ ces mEmes plantes se dveloppent jus%u maturit et produisent de bons rendements en 'raines viables@ %ui 'erment normalement. 5ar contre@ le phenylphosphorodiamide (5!!.@ un inhibiteur durase@ blo%ue la 'ermination des 'raines chez #rabidopsis en prsence deau (Yonia et al.@ *LLM.. 6ette inhibition de la 'ermination peut Etre leve par lajout dune source externe dazote. 1urase semble donc avoir un rAle important pour la capture de lazote de lure lors de la mobilisation des rserves de la 'raine. 6es donnes runies su''"rent un rAle pivot de lurase dans la mobilisation de lazote des plantules.
I0.B.".c Activation de lurase et gnes accessoires.

4i les bases 'nti%ues de lactivation de lurase chez les microor'anismes sont relativement bien connues@ elle le sont beaucoup moins chez les plantes. Zuatre '"nes non lis contrAlent la synth"se des urases chez le soja. 1es '"nes structuraux /u* et /uI codent respectivement lisoenzyme spcifi%ue de lembryon et lisoenzyme ubi%uiste@ et les mutants correspondant naffectent %ue lune des deux urases. !eux autres '"nes@ /u+ et /u0@ dfinissent une deuxi"me classe pour la%uelle une seule mutation sur lun ou lautre de ces deux '"nes inhibe lactivit des deux urases@ la %uantit de protine produite restant toutefois leve. /u+ et /u0 sont analo'ues aux '"nes accessoires des bactries ncessaires la maturation de lurase@ et le phnoype des mutants mime celui dune absence totale de nic>el (accumulation dure@ perte dactivit urolyti%ue et ncroses foliaires.. /u+ et /u0 sont des '"nes accessoires impli%us dans lincorporation du nic>el dans le centre actif de cha%ue isoenzyme (5olacco et al.@ *LLL.. 3reyermuth R collaborateurs (+,,,. ont montr %ue le '"ne /u0 code pour une protine de 0+ >!a liant le nic>el@ et prsente de fortes homolo'ies avec les =re; bactriennes. En outre@ Eu0 est homolo'ue avec la protine =re; d#rabidopsis (3reyermuth et al.@ +,,,. et de +M

H+ URE

URE
diffusion

?
ATP H+

AtDUR3*

membrane plasmique AtTIPs**

UREASE CO2 + 2NH3 GS1

URE ?
URIDES ARGININE

AtTIPs

ure

?
ARGINASE

vacuole

mitochondrie
ornithine

Gln

plaste
arginine AL Arginosuccinate OCT AS
Aspartate + ATP

ornithine

glutamate semialdhyde
Pi

GOGAT
Carbamyl-P

?
CO2 + Gln +ATP

Glu GS2

Gln

citrulline acides amins

cytosol

Figure 6. Les sources dure chez les plantes. GS, glutamine synthtase; GOGAT, glutamate synthase; AL, arginosuccinate lyase; AS, arginosuccinate synthetase; OCT, ornithine carbamyl transfrase.

!edicag* truncatula (##SS,LL-.. 4a r'ion &/terminale est toutefois riche en histidine et aspartate@ et ainsi ressemble plus la r'ion 6/terminale de l=reE chez 3lebsiella aer*genes@ r'ion fixatrice du nic>el (1ee et al.@ *LL0.. 1es protines =re; du soja et d#rabidopsis poss"dent un domaine 5/loop de liaison des nuclotides@ %ui est aussi retrouv chez les =re; bactriennes. 1es mutants /u+ et /u0 se complmentent entre eux@ et une faible stimulation de lactivit urolyti%ue est observe in ,itr* suite au mlan'e des extraits proti%ues issus de ces deux mutants (5olacco et al.@ *LLL.. Eu0 intera'it avec le produit de /u+ pour lactivation de lurase in ,itr*@ mais aucune donne de s%uence nest encore disponible pour /u+. 1a r'ulation de la protine Eu0 est fonction du dveloppement et Eu0 saccumule dans les embryons en dveloppement. Eu0 %uivaut =re; et est directement impli%ue dans lactivation de lurase puis%ue des anticorps polyclonaux anti/=re; blo%uent cette activation in ,itr* (3reyermuth et al.@ +,,,.. !autres '"nes accessoires putatifs ont t identifis dans les ban%ues de donnes par comparaison avec les s%uences proti%ues microbiennes@ et les #!&c correspondants clons. 8itte et associs (+,,*. ont caractris la famille multiall"li%ue ure; chez la pomme de terre. 5lus rcemment@ $acanam9o R collaborateurs (+,,+. ont isol des ortholo'ues de ure! et ure3 chez le soja@ la tomate et #rabidopsis. #lors %ue les '"nes paralo'ues %re! et %re3 du soja semblaient Etre de possibles candidats pour /u+@ ces auteurs ont dmontr %ue /u+ ne codait ni pour =re! ni pour =re3. #ucun '"ne montrant une %uelcon%ue similarit avec ureE na t isol. En fait la protine =re; de plante pourrait avoir un rAle %uivalent la protine =reE des bactries (cf ci/dessus.. 5lus rcemment (+,,Mb.@ 8itte R associs ont identifi trois protines accessoires fondamentales pour lactivation de lurase chez #rabidopsis (#t+'0M,0M pour #t=re!@ #t*'+*-I, pour #t=re3 et #t+'0IIT, pour #t=re;.. I0.$. Les sources dure chez les plantes.
I0.$.!. Larginine.

1a principale route de production dure chez les plantes est la raction catalyse par lar'inase (1/#r' amidinohydrolase@ E6 0.M.0.*.. 1ar'inase d'rade lar'inine en ornithine et ure@ et intervient lors du cycle de lornithine@ 'alement appel le cycle de lure (3i'ure S.. 1ar'inine est un important constituant des protines et est le prcurseur pour la biosynth"se des polyamines@ molcules impli%ues dans la croissance@ le dveloppement et les

+S

allantone
allantonase

allantoate
Allantoate amidinohydrolase
CO(NH2)2

Allantoate amidohydrolase
CO2 + 2NH3

urase

CO2 + 2NH3

uridoglycolate
uridoglycolate amidohydrolase
CO2 + 2NH3

Uridoglycolate ure-lyase
CO(NH2)2

urase

CO2 + 2NH3

glyoxylate
Figure 7. Les voies de dgradation des urides chez les plantes (daprs Todd et Polacco, 2004).

rponses aux stress abioti%ues (2artin/ an'uy@ +,,*.. 1ar'inine reprsente en outre@ le compos majeur de transport et de stoc>a'e de lazote chez de nombreuses esp"ces v'tales. 1ure saccumule au cours de la 'ermination et du dveloppement des plantules@ conscutivement une au'mentation de lactivit de lar'inase lors de la mobilisation des rserves proti%ues de la 'raine (Yonia et al.@ *LLMB ;oldraij R 5olacco@ *LLL.. 1ure saccumule aussi dans les feuilles sources des plantes Q'es@ probablement 'nre par la d'radation des protines et de lar'inine pour la remobilisation de lazote dans les tissus en snescence (;erendfs et al.@ *LLL.. En revanche@ mal'r un lar'e pool dar'inine libre dans les embryons de soja en dveloppement (2icallef R 4help@ *L-L.@ ainsi %uune faible activit ar'inase in ,itr*@ lar'inase nest pas active in ,i,* ce stade de dveloppement (;oldraij R 5olacco@ *LLL.. #insi lactivation du cycle de lure est inexistante et permet aux embryons de conserver lar'inine@ principale rserve dazote utilise lors de la 'ermination du soja (;oldraij R 5olacco@ +,,,..
I0.$.". Les urides.

1es urides sont issus du catabolisme des purines. 6e sont des composs or'ani%ues structurellement proche de lure (2ugoz et al.@ +,,S.@ et tr"s riches en azote. 5armi eux@ lallanto7ne et lacide allanto7%ue@ son produit de d'radation. Ils jouent un rAle essentiel dans lassimilation@ le mtabolisme@ la mise en rserve et le transport de lazote chez les plantes (4chubert R $oland@ *LL,.. En outre@ les urides reprsentent la principale forme de transport de lazote atmosphri%ue fix par les bactries chez les plantes symbioti%ues urides (l'umineuses des r'ions tropicales comme le soja.. 6hez le soja par exemple (#l-cine +a..@ les urides reprsentent T, -,J (pWv. de lazote or'ani%ue circulant dans la s"ve du xyl"me (2c6lure R Israel@ *LTL..En revanche@ les l'umineuses des r'ions tempres (luzerne@ lupin@ pois. transportent leur azote des nodosits au reste de la plante@ essentiellement sous forme daspara'ine mais aussi de 'lutamine? elles sont %ualifies de l'umineuses amide. 1es urides doivent alors Etre convertis en mtabolites et lazote form@ assimil dautres molcules azotes. 1es possibles voies du catabolisme des urides chez les plantes sont dcrites sur la 3i'ure T. 1allanto7ne est d'rade en allantoate par lallanto7nase (E6 0.M.+.M. (han' R <an@ +,,I.. 1a d'radation de lallantoate peut alors Etre catalyse soit par lallantoate amidohydrolase (E6 0.M.0.L.@ soit par lallantoate amidinohydrolase (E6 0.M.0.I.. 6es deux enzymes produisent lurido'lycolate@ mtabolis en 'lyoxylate@ soit par +T

lurido'lycolate ure/lyase (E6 I.0.+.0.@ soit par lurido'lycolate amidohydrolase (E6 0.M.0.*L.. 6es activits diff"rent par la nature des composs azots %ui sont alors produits? lallantoate et lurido'lycolate amidohydrolases 'n"rent de lammonium@ alors %ue lallantoate amidinohydrolase et lurido'lycolate ure/lyase produisent de lure. 1es plantes sont effectivement capables de produire directement du dioxyde de carbone et de lammoniac@ issus de la d'radation des urides (5olacco R <olland@ *LL0.. 6ependant@ 4tebbins R 5olacco (*LLM. ont montr %ue les enzymes 'nratrices dammonium et dure fonctionnaient en parall"le chez le soja. 6hez #rabidopsis@ alors %ue lure 'nre est issue de lar'inine les trois premiers jours apr"s 'ermination@ la d'radation des urides contribue pour 0, I,J au pool dure (Yonia et al.@ *LLM.. Cadez R 4inclair (+,,,. ont mis en vidence %ue lallantoate est d'rad dans les feuilles de soja via lamidohydrolase ou lamidinohydrolase selon le type de cultivar. En outre la premi"re urido'lycolate ure/lyase a t purifie chez le pois chiche (2ugoz et al.@ +,,*..
I0.$.+. Absorption racinaire et foliaire.

:utre la biosynth"se dure au sein de la plante@ lure prleve dans le milieu extrieur constitue une autre source pour la plante. 1es feuilles et les racines constituent les deux voies dentre de lure dans la plante. 1ure est une molcule neutre. #insi@ elle pourrait franchir passivement la bicouche lipidi%ue de la membrane plasmi%ue (;alluci et al.@ *LT*.. 6ependant@ plusieurs expriences indpendantes ont apport la preuve physiolo'i%ue de lexistence de labsorption dure par les racines@ avant sa d'radation en dioxyde de carbone et ammonium. 1ors%ue lure est ajoute des plantes en culture hydroponi%ue@ lure se retrouve dans la s"ve xyl"mienne (<ine R 4prent@ *L--.@ ou encore saccumule dans les feuilles de plantes dficientes en nic>el (;erendfs et al.@ *LL-.. 1absorption dure par les racines dpendrait du statut azot initial de la plante ainsi %ue de la prsence de nitrate et dammonium ($radley et al.@ *L-L.. !e mEme@ la disponibilit en nic>el serait un facteur limitant pour labsorption de lure (;erendfs et al.@ *LL-.. 1application directe dure sur les feuilles entraNne une accumulation dure dans les feuilles ainsi %ue des ncroses leur extrmit apicale@ ncroses particuli"rement sv"res en prsence dun inhibiteur durase (Fro'meier et al.@ *L-L.. 1absorption dure via les feuilles est proportionnelle la concentration en ure de la solution pulvrise (Flein R 8einbaum@ *L-M.@ ou suit le taux de transpiration des feuilles@ ce %ui tmoi'ne dun processus diri' par les flux deau dans la plante (5alta et al.@ *LL*.. #insi@ labsorption dure par les racines rv"le des si'nes dun +-

contrAle par lazote et le nic>el@ alors %uau niveau foliaire@ le moteur de labsorption sav"re Etre un processus de diffusion. 2al'r ces preuves physiolo'i%ues dune absorption dure par les cellules v'tales racinaires et foliaires@ les mcanismes %ui r'issent le transport de lure sont peu connus dun point de vue molculaire. =n transporteur de lure haute affinit #t!=R0 a rcemment t clon et caractris chez #rabidopsis@ apportant pour la premi"re fois la preuve du transport actif dure chez les plantes (1iu et al.@ +,,0a.. #t!=R0 est constitu de *I domaines transmembranaires et lure est co/transporte avec des protons. #t!=R0 est exprim dans les feuilles et les racines@ et son expression est induite dans les racines carences en azote et pendant les trois premiers jours de la 'ermination (1iu et al.@ +,,0a.. 5ar une approche de complmentation htrolo'ue de mutant de transport de lure chez la levure@ 1iu et collaborateurs (+,,0b. ont isol chez #rabidopsis@ %uatre '"nes codant pour des protines intrins"%ues tonoplasti%ues ( I5.. 6ontrairement au transporteur haute affinit <KWure #t!=R0@ ces a%uaporines sont moins sensibles la concentration en ure et au p< environnant. 5areillement At&%R3@ trois de ces AtT")s sont induits dans les racines en carence azote et pendant les premiers jours de la 'ermination@ mais lexpression de ces '"nes reste constitutive dans les feuilles. 1a localisation subcellulaire de la protine de fusion ;35W#t I5s dans des protoplastes confirme ladressa'e de ces protines sur le tonoplaste mais aussi sur les autres endomembranes (vsicules de protoplastes clats.. =n adressa'e vers la membrane plasmi%ue nest toutefois pas exclure #ussi@ ces transporteurs compartiments cellulaires (1iu et al.@ +,,0b.. I0.&. Le devenir de lure dans la plante. Zuelle %ue soit son ori'ine endo'"ne ou exo'"ne@ lure nest pas utilisable par la plante avant dEtre prise en char'e par les urases %ui catalysent lhydrolyse de lure en dioxyde de carbone et ammonium. =ne incorporation directe de lure via le sens inverse du cycle de lornithine est aussi propose par certains auteurs ($eusichem R &eeteson@ *L-+.. !es flux dure existent entre les or'anes puits et source de la plante (;erendfs et al.@ *LLLB 8itte et al.@ +,,+.@ permettant ainsi la remobilisation prfrentielle de lazote uri%ue au niveau des or'anes en croissance. !e mEme les activits de lurase sont particuli"rement plus fortes dans les feuilles Q'es par rapport aux jeunes feuilles (8itte et al.@ +,,+.. 6oncernant I5 pourraient/ils jouer un rAle dans l%uilibration des concentrations en ure entre les diffrents

+L

saccharose

oxaloactate

aspartate

asparagine

AAT ASN glutamate 2-oxoglutarate glutamate GOGAT NH4+ GDH 2-oxoglutarate GS purines, ureides UREASE NO3
-

glutamate

glutamine

NO2 NR

NH4 NiR

2NH3 + CO2

UREA

arginine ARGINASE AL glutamate glutamate semialdehyde ornithine

fumarate

arginosuccinate

CO2 + glutamine + ATP

Carbamyl-P

OCT citrulline Pi

AS

Aspartate + ATP

Figure 8. Le devenir de lure chez les plantes. GS, glutamine synthtase; GOGAT, glutamate synthase; AAT, aspartate aminotransfrase; AL, arginosuccinate lyase; AS, arginosuccinate synthetase; ASN, asparagine synthtase; GDH, glutamate deshydrognase; NiR, nitrite rductase; NR, nitrate rductase; OCT, ornithine carbamyl transfrase.

lure issue de lar'inine@ un export de lure de la mitochondrie vers le cytosol doit oprer. En effet 5olacco R <olland (*LL0. ont vo%u une localisation intra/mitochondriale de lar'inase. 1tude des s%uences nuclotidi%ues de lar'inase d#rabidopsis (Frumpelman et al.@ *LLM. et de soja (;oldraij et al.@ *LL-. confirme cette hypoth"se? celles/ci prsentent une extrmit &/terminale riche en rsidus char's et hydroxyls@ formant un site potentiel dadressa'e vers la mitochondrie (4jalin' R ;lasser@ *LL-.. #ussi lutilisation de lure issue de laction de lar'inase (Yonia et al.@ *LLM.@ ncessite/t/elle le transport de lure hors de la mitochondrie@ les urases tant des enzymes cytoplasmi%ues (5olacco R <olland@ *LL0.. 4uite laction des urases@ lammonium ainsi form est incorpor dans les acides amins par laction combine de la 'lutamine synthtase (;4. et de la 'lutamate synthase (;:;# . (3i'ure -..

0. 4ubstances marines% azote & agriculture.

1es substances marines constituent une ressource naturelle et reprsentent un potentiel conomi%ue en plein essor dans les domaines a'ricole@ alimentaire@ pharmaceuti%ue@ cosmti%ue@ et industriel. En a'riculture@ lutilisation dal'ues marines pour amender les sols et fertiliser les cultures nest pas une prati%ue rcente (Cincent@ *L+I.. 6ependant lexploitation et la commercialisation de cette ressource marine naturelle et abondante restent principalement restreintes aux r'ions cAti"res@ le co_t des oprations de ramassa'e@ scha'e et transport tant lev par comparaison avec les en'rais chimi%ues traditionnels. =ne exception ce constat concerne les al'ues rou'es calcaires@ connues sous lappellation de mairl@ commercialises en #n'leterre et en 3rance pour lamendement des sols acides. #vec la mise sur le march des extraits dal'ues li%uides depuis les annes M,@ les traitements par voie foliaire ont permis un re'ain dintrEt pour les substances marines depuis les annes S,. !e nombreux effets a'ronomi%ues sont attribus aux extraits dal'ues? meilleure 'ermination des 'raines@ au'mentation du dveloppement racinaire et du rendement@ plus 'rande assimilation de lazote et du phosphore@ meilleure rsistance aux stress et aux maladies@ et amlioration de la conservation des fruits (#betz@ *L-,B 2ooney R van 4taden@ *L-SB `olivet et al.@ *LL*B Cer>leij@ *LL+.. 1es micronutriments et les phytohormones apports par les substances marines@ et en particulier les cyto>inines@ sont considrs comme les 'nrateurs de ces effets biolo'i%ues induits chez les plantes (2ooney R van 4taden@ *L-S..

0,

6ependant lutilisation des substances marines reste encore sujette bien des %uestionnements@ leurs mcanismes prcis daction restant inexpli%us jus%u prsent. V.A. )ntre milieu marin et monde vgtal5 Cin't/cin% mille esp"ces dal'ues sont recenses dans les mers et ocans@ %ui recouvrent les deux tiers de la surface de la terre. Elles reprsentent la pres%ue totalit de la flore marine@ et sont considres comme les premiers Etres vivants apparus il y a %uel%ues six cent millions dannes. 6es v'taux jouent un rAle fondamental dans l%uilibre de la biosph"re en produisant cha%ue anne plus du tiers de loxy'"ne de la plan"te@ et en constituant@ par le phytoplancton@ le premier maillon de la chaNne alimentaire. 1es al'ues sont classes parmi les 6rypto'ames et plus prcisment les hallophytes (plantes sans feuilles@ ni ti'es@ ni racines@ ni vaisseaux conducteurs.. 3eldmann (*LT-. a dfini lal'ue comme lensemble des v'taux eucaryotes@ photosynthti%ues par leurs plastes pourvus de chlorophylles associes des pi'ments varis@ se reproduisant par des spores et des 'am"tes forms dans des sporocytes et des 'amtocytes. :n distin'ue plusieurs 'roupes? les rhodophytes ou al'ues rou'es@ les chromophytes ou al'ues brunes la base de la plupart des en'rais a'ricoles et horticoles@ et les chlorophytes ou al'ues vertes. 1es al'ues marines se prsentent parmi les v'taux les plus productifs de la plan"te. 5our faire face labsence de racines@ ces v'taux marins ont d_ dvelopper des strat'ies de dveloppement et de nutrition particuli"rement performantes. 1eur in'niosit biochimi%ue les a ainsi amenes dvelopper diffrentes strat'ies dadaptation et de lutte tout fait exceptionnelles pour rsister et survivre aux diffrents stress abioti%ues (hydri%ue@ osmoti%ue@ thermi%ue@ ]. et bioti%ues (herbivores@ champi'nons@ ].. 6es strat'ies ont abouti la mise en place de tout un arsenal biolo'i%ue dune remar%uable efficacit. 1es al'ues ont ainsi une facult extraordinaire concentrer les principes actifs prsents dans lGeau de mer (jus%uG M,,,, fois.. #ussi ces phytonutriments naturels@ sont/ils exploits afin de renforcer la performance des v'taux terrestres et rpondre ainsi aux attentes en mati"re de productivit@ de %ualit et de respect de lenvironnement. 1es al'ues sont non seulement utilises comme en'rais pour la'riculture et lhorticulture@ mais sont dsormais prsentes dans la'roalimentaire@ la cosmti%ue@ la pharmacie@ le textile ou encore la chimie. 0.B. #colte% prparation et production des e*traits dalgues.

0*

Figure 9. Bateau gomonier louvrage.

Algues brunes

Plantes aquatiques diverses Algues rouges Algues vertes

Figure 10. Production aquacole mondiale par groupe d'algues. (Source FAO, 2002; R. Kaas, IFREMER).

Figure 11. Rpartition gographique de lalgoculture des algues brunes. La production mondiale des algues brunes est denviron 5 millions de tonnes. La Chine est le principal producteur avec 84,5% du total mondial (Source FAO, 2002; R. Kaas, IFREMER).

1a rcolte annuelle dal'ues fraNches en 3rance est denviron T,,,, tonnes@ dont les trois/ %uarts sont rcolts en $reta'ne (source 6EC#@ 6entre dGEtude et de Calorisation des #l'ues.. 1es al'ues fraNches sont rcoltes mcani%uement par des cueilleurs professionnels@ laide de bateau 'omonier (3i'ure L.@ ou manuellement par des plon'eurs sous/marins. En +,,,@ la production mondiale des al'ues et v'taux a%uati%ues atteint T@L millions de tonnes. 1es al'ues brunes sont de loin les plus reprsentes@ avec I@L millions de tonnes fraNches produites (3i'ure *,. (source 3#:@ +,,+B Ifremer.. !evant le 'ant chinois@ la production franXaise ne reprsente %uune infime part de la production mondiale dal'ues brunes (3i'ure **.. 1en'ouement des industriels pour les al'ues est cependant croissant@ et les techni%ues actuelles dapprovisionnement ne permettent pas de rpondre la demande dun march en plein essor. #insi est ne #lor@ une toute jeune socit (5aimpol@ ++. cratrice dune ferme a%uacole pour la culture dal'ues naturellement prsentes dans les eaux bretonnes afin de ne pas modifier lcosyst"me (dpEche #35 du ,*W,-W+,,S et site 9eb d#lor http?WW999.aleor.or'W.. 1a premi"re rcolte de IM, >' de >ombu@ une varit de laminaires brunes@ effectue fin juillet +,,S@ tait destine la socit de cosmti%ues $iotech2arine (5ontrieux@ 6Ates d#rmor.. 1es avanta'es des al'ues cultives par rapport aux al'ues sont une %ualit constante et plus calibre@ ainsi %uune meilleure traXabilit@ ce %ue recherchent les entreprises telles %ue $iotech2arine. 1es al'ues fraNchement rcoltes sont alors sches puis broyes. 1es mthodes utilises pour la prparation des extraits dal'ues sont varies. Elles font souvent lobjet dun dpAt de brevets et ne sont dcrites dans les publications %ue de mani"re sommaire et incompl"te. 1e process industriel %ui prend en compte les spcificits physi%ues et biochimi%ues des al'ues@ fait intervenir diffrentes technolo'ies dans le domaine de lextraction v'tale et de la purification. 1e matriel v'tal peut Etre soumis laction de diffrentes tempratures@ dun milieu alcalin@ ou de pressions varies. 1a nature des extraits commerciaux peut@ dans certains cas@ Etre tr"s diffrente de la composition ori'inelle des al'ues %ui ont servi leur prparation.

0.$. Les effets des e*traits dalgue. 1a littrature relative aux effets des extraits dal'ues marines sur la productivit des plantes cultives@ reporte fr%uemment des rsultats irr'uliers et contradictoires. 1a pertinence

0+

scientifi%ue des effets rpertoris nest pas toujours respecte@ de nombreux rapports manant des firmes productrices de substances marines visant dmontrer lefficacit commerciale de leurs produits mis sur le march. 6ependant nul ne peut nier les divers effets bnfi%ues des extraits dal'ues sur les cultures. 5lusieurs synth"ses biblio'raphi%ues dcrivent ces diffrents effets phytoactifs (#betz@ *L-,B 2ooney R van 4taden@ *L-SB `olivet et al.@ *LL*B Cer>leij@ *LL+..
0.$.!. 6ermination facilite des graines.

!e nombreux exemples damlioration de la 'ermination des 'raines par les extraits dal'ues ont t dcrits dans la littrature ($utton R &oyes@ *LSIB $hosle et al.@ *LTMB Rajesh9ari et al.@ *L-0B Cen>ataraman et al.@ *LL0B 2ohan et al.@ *LLIB El/4hee>h R El/4aied@ +,,,B 4ivasan>ari et al.@ +,,S.. 6es derniers rel"vent un pourcenta'e de 'ermination suprieur lors%ue des 'raines de 4igna sinensis sont semes sur un extrait dal'ues vertes ou brunes (respectivement L-J et *,,J.@ par rapport un semis sur de leau (-SJ.. 1e plus fort taux de 'ermination est observ pour des extraits concentrs +,J. 1a 'ermination est 'alement favorise lors%ue les 'raines sont dabord semes sur de leau pendant +I heures@ puis traites avec les extraits dal'ues@ comparativement un tmoin eau.
0.$.". Amlioration de la croissance% de labsorption minrale et du rendement des cultures.

1a croissance de plusieurs plantes cultives semble rpondre positivement lapplication dextraits dal'ues marines@ et ceci dautant mieux %ue les plantes sont stresses par une carence minrale (&elson R van 4taden@ *L-IaB $ec>ett R van 4taden@ *L-L. ou hydri%ue (2ooney R van 4taden@ *L-M.. 1a rponse de la plante lextrait dal'ue sobserve au niveau de son syst"me racinaire? une meilleure croissance des racines en'endre un syst"me racinaire plus vi'oureux. 1activit des racines est accrue et labsorption de diffrents lments minraux du sol comme lazote ($ec>ett R van 4taden@ *LL,a.@ le phosphore et le calcium (!e Cilliers et al.@ *L-0.@ le potassium ($ec>ett et van 4taden@ *L-L.@ le man'an"se ($lunden@ *LT+.@ le ma'nsium (4enn R Fin'man@ *LT-.@ le fer ($ooth@ *LSS.@ le zinc ($ec>ett R van 4taden@ *LL,b.@ sav"re plus importante. 6es modifications de larchitecture et de lactivit des racines@ se traduisent par une amlioration de la croissance de la plante toute enti"re. Il en

00

rsulte un accroissement du rendement des cultures. 6hez le bl@ lapport dun extrait (Felpa> SS.@ tant au niveau des racines %ue des feuilles@ entraNne une au'mentation du rendement en 'rains (&elson R van 4taden@ *L-Ib.? nombre et poids de chacun des 'rains par pi sont accrus (&elson R van 4taden@ *L-SB $ec>ett R van 4taden@ *L-L.. 6es effets sont observables uni%uement pour des conditions particuli"res de culture@ savoir une carence en potassium et en eau (2ooney R van 4taden@ *L-MB $ec>ett R van 4taden@ *L-L.. !es effets similaires ont t reports chez lor'e (3eatonby/4mith R van 4taden@ *L-T. et chez de nombreuses autres esp"ces v'tales (pour revue@ voir #betz@ *L-,B 2ooney R van 4taden@ *L-SB `olivet et al.@ *LL*B Cer>leij@ *LL+..
0.$.+. #sistance accrue des plantes au* stress et maladies.

1apport dextrait dal'ue conf"re aux plantes une plus forte rsistance au froid ($ooth@ *LSSB 4tephenson@ *LSSB 4enn R Fin'man@ *LT-. et la scheresse (2ooney R van 4taden@ *L-M.. Zuel%ues articles dcrivent une rsistance accrue des plantes aux maladies fon'i%ues en rponse la pulvrisation dextraits dal'ue ($ooth@ *LSSB 4tephenson@ *LSS.. 1es extraits dal'ues conf"rent 'alement une protection des plantes contre les atta%ues des insectes ($ooth@ *LSIB 4tephenson@ *LSS.. 1a fcondit de certains insectes seraient aussi rduite suite lapplication de ces extraits dal'ues ($ooth@ *LSSB 4tephenson@ *LSS.. 1infestation des racines par les nmatodes est aussi rduite en prsence dextraits dal'ue (3eatonby/4mith R van 4taden@ *L-0B 6rouch R van 4taden@ *LL0B 8u et al.@ *LLT.@ ces extraits jouant sur le taux de fcondit des nmatodes (8hapham et al.@ *LLIB 8u et al.@ *LL-.. 5lus rcemment@ lactivit licitrice dun extrait dal'ue verte a t dmontre chez !edicag* truncatula en utilisant une membrane macroarray (6luzet et al.@ +,,I.. #insi lexpression de nombreux '"nes de dfense est induite suite la pulvrisation de lextrait dal'ue. En accord avec ces effets sur lexpression des '"nes de dfense@ cet extrait en'endre une protection accrue des plantes contre les atta%ues patho'"nes (6luzet et al.@ +,,I..

0.$.-. 7eilleure 'ualit des produits rcolts.

!es pulvrisations foliaires rptes de substances marines sur des esp"ces fruiti"res ou maraNch"res avant la rcolte se traduisent par un affermissement des fruits ou des l'umes@

0I

%ui se conservent alors dautant mieux (4>elton R 4enn@ *LS-B 5ovolny@ *LSS@ *LSL@ *LT+@ *LTI@ *LTT.. 1a puret du jus de betterave sucre est notamment amliore par une diminution en potassium ($lunden et al.@ *LTI@ *LTL.. hvin et associs (*L-L. ont 'alement constat une au'mentation de la production de sucre chez la betterave en rponse un traitement al'al. 0.&. Approche molculaire des mcanismes daction des e*traits dalgues. 1es modalits daction des extraits industriels dal'ues marines sur les processus physiolo'i%ues@ biochimi%ues et molculaires des plantes ne sont pas encore clairement tablies. 1es al'ues marines contiennent de faibles concentrations en nutriments primaires comme lazote@ le phosphore et le potassium ($ooth@ *LSS.. Ils poss"dent tous les oli'olments ncessaires aux plantes mais aussi beaucoup dautres@ pouvant ainsi supprimer des carences en certains minraux (#it>en R 4enn@ *LSM.. 6ependant leurs teneurs dans les extraits sav"rent beaucoup trop faibles pour expli%uer totalement les rponses de croissance ($lunden@ *LTTB #betz@ *L-,.. 1occurrence de phnom"nes physicochimi%ues est une hypoth"se avance pour expli%uer les proprits phytoactives des extraits dal'ues@ mais les r'ulateurs de croissance apports par les al'ues semblent les principaux in'rdients responsables. !autres composs comme les lments/trace@ les bta7nes@ les polysaccharides@ induisent aussi des effets biolo'i%ues. 1e rAle des r'ulateurs de croissance a t su''r par le fait %ue les doses dextraits dal'ues appli%ues lhectare sont tr"s faibles@ ce %ui impli%ue %ue les in'rdients actifs doivent pouvoir a'ir tr"s faible concentration. 1es composs or'ani%ues connus pour induire de fortes rponses physiolo'i%ues tr"s faibles concentrations sont les phytohormones. #insi@ de nombreux r'ulateurs de croissance ont t identifis chez les al'ues ($rain et al.@ *LT0B #u'ier@ *LTSa@ bB Fin'man R 2oore@ *L-+B 2ooney R van 4taden@ *L-SB $radley@ *LL*B 6rouch R van 4taden@ *LL0B 4tir> et al.@ +,,0B jrda' et al.@ +,,I@ 5lettner et al.@ +,,M.. 1es hormones de croissance des al'ues sont@ pour lessentiel@ semblables celles des v'taux suprieurs.
0.&.!. Les c3to8inines.

6e sont les hormones %ui se retrouvent en plus forte proportion dans les tissus al'aux@ et aux%uelles est attribue la plupart des effets biolo'i%ues des extraits commerciaux. En

0M

comparant les effets obtenus avec la >intine et des extraits dal'ues commerciaux ayant une activit cyto>inine %uivalente@ $lunden (*LTT. a montr lexistence de similitudes entre les deux. #ussi@ le contenu en cyto>inines des extraits dal'ues et les effets bnfi%ues de ces extraits@ sont/ils troitement corrls. En utilisant la chromato'raphie li%uide haute performance@ 3eatonby/4mith R van 4taden (*L-I. ont identifi la cis- et la transribosylzatine@ la trans-zatine@ la dihydrozatine et la &S(k+/isopentnyladnosine.@ dans lextrait dal'ue Felpa>. !es cyto>inines ont aussi t mises en vidence dans lextrait commercial 4easol par chromota'raphie en phase 'azeuse couple un spectrom"tre de masse ( ay et al.@ *L-M.. 5armi celles/ci@ la trans-zatine et la trans-zatine riboside et leurs drivs dihydro@ ainsi %ue lisopentnyladnine et lisopentnyladnosine. 5lus tard (*L-T.@ ces mEmes auteurs ont identifi des cyto>inines/'lucosides dans le mEme extrait. 5armi les premi"res rponses des plantes aux cyto>inines@ impli%ues dans la r'ulation de leur croissance@ une induction de la synth"se proti%ue et de la division cellulaire (2iller@ *LS0B 5ozsar et al.@ *LST.@ une mobilisation des nutriments (1etham@ *LT-.@ un retard de snescence (4ha9 et al.@ *LSM.@ une inhibition de linfection fon'i%ue (!e>>er@ *LS0.@ ou encore une au'mentation du contenu en chlorophylle dans la feuille (2ourey/$rin'uier@ *L-S.@ une au'mentation de la masse fraNche et de la surface des feuilles (3eatonby/4mith R van 4taden@ *L-0.@ sont avancs. 6ependant@ la seule prsence des cyto>inines dans les extraits dal'ues marines@ nexpli%uerait pas lensemble de leurs effets bnfi%ues sur la plante (4anderson R `ameson@ *L-SB ay et al.@ *L-T.. En effet@ les prati%ues a'ricoles privil'ient lutilisation des extraits dal'ues en solutions tr"s dilues@ et mEme si lactivit cyto>inine est forte dans lextrait concentr@ celle/ci sav"re insuffisante pour affirmer %ue les cyto>inines soient les seuls composs responsables. !urand R collaborateurs (+,,0. ont dailleurs montr %ue leffet positif de lextrait dal'ue & 5R: ($iotech2arine. sur lactivit de la nitrate rductase ne pouvait sexpli%uer uni%uement par la prsence des cyto>inines contenues dans lextrait. En outre les activits cyto>inines de diffrents lots dun mEme extrait commercial peuvent prsenter de fortes variations. 6es fluctuations peuvent sexpli%uer notamment par des modifications de la composition des extraits dal'ues selon lpo%ue de lanne@ par les prati%ues dextraction et de conservation du matriel v'tal. #ussi est/il important de connaNtre les taux dactivit cyto>inine de chacun des extraits@ afin dassurer la reproductibilit des rsultats. 1a slection et lhomo'nisation de matriel brut sont ncessaires@ de mEme %ue le choix et le contrAle des techni%ues dextraction sont tr"s importants. 0S

0.&.". Les au*ines.

1a prsence des auxines dans les extraits commerciaux dal'ues marines a t lon'temps mise en doute. En effet@ lauxine est instable en milieu a%ueux@ et peut donc facilement Etre dtruite au cours de la rcolte ou lors de la prparation des extraits commerciaux. 1a prsence des auxines chez de nombreuses al'ues marines est pourtant clairement avre. En utilisant le test du coloptile davoine@ Can :verbee> (*LI,. a dcel la prsence dacide indole/0/acti%ue (#I#. dans une lar'e 'amme desp"ces dal'ues. !epuis@ les mthodes bases sur la chromato'raphie et la spectromtrie@ ont permis lidentification d#I# chez dautres al'ues (#be et al.@ *LT+B `acobs et al.@ *L-M.@ de mEme %ue dautres composs auxini%ues comme lacide phnyl/0/acti%ue (#be et al.@ *LT+B <art@ *L-+. et lacide hydroxyphnyl acti%ue (#be et al.@ *LTI.. $ernart R ;er9ic> (*LL,. ont dtect lindole/0/hydroxyactyle chez une al'ue rou'e par rsonance ma'nti%ue. 1es extraits dal'ues commerciaux ont alors t tests pour leur contenu en auxine. Fin'man R 2oore (*L-+. ont isol@ purifi et %uantifi de l#I# dans un extrait dAsc*ph-llu+ n*d*su+. 1a prsence d#I# a t confirme par chromato'raphie en phase 'azeuse couple un spectrom"tre de masse@ dans un autre extrait@ le 2axicrop (4anderson et al.@ *L-T.. 1es auxines@ et en particulier l#I#@ sont connues pour stimuler la croissance des racines adventives chez les plantes. #ussi@ le dveloppement dun syst"me racinaire vi'oureux chez la plante@ suite lapplication des extraits dal'ues@ a t lo'i%uement attribu aux auxines endo'"nes al'ales ($lunden R 8ild'oose@ *LTTB 3eatonby/4mith R van 4taden@ *L-0B &elson R van 4taden@ *L-I.. 6rouch R van 4taden (*LL*. ont 'alement mis en vidence une stimulation de la rhizo'n"se en prsence dun extrait concentr prpar partir dal'ues brunes. 6et effet promoteur a t attribu la prsence dindoles dans lextrait (6rouch et al.@ *LL+..

0.&.+. Les gibbrellines.

$ien %ue la prsence des 'ibbrellines chez les al'ues soit bien documente (6rouch R van 4taden@ *LL0 et rfrences.@ elle nest pas clairement tablie dans les extraits dal'ues

0T

commerciaux. 1es 'ibbrellines sont des molcules fra'iles@ peu reprsentes@ et dont lactivit serait limite dans le temps. #ussi@ alors %ue 8illiams et collaborateurs (*LTI. ont dtect une faible activit 'ibbrelline dans trois extraits commerciaux fraNchement prpars@ le taux dacide 'ibrelli%ue devient n'li'eable apr"s une conservation de %uatre mois temprature ambiante. Il en rsulte %ue les 'ibbrellines ne peuvent expli%uer les effets physiolo'i%ues observs aux doses oD les extraits sont utiliss en a'riculture. 6ependant@ les 'ibbrellines@ en syner'ie avec les cyto>inines@ pourraient intervenir dans lamlioration de la 'ermination constate apr"s lutilisation des extraits dal'ues (6rouch R van 4taden@ *LL0..
0.&.-. Lacide abscissi'ue.

1a prsence dacide abscissi%ue dans un extrait commercial a t confirme par chromato'raphie en phase 'azeuse et spectrom"trie de masse ($oyer R !ou'herty@ *L--.. <irsch R collaborateurs (*L-L. ont ensuite montr %ue lacide abscissi%ue est universellement rpandu chez les al'ues. outefois son rAle reste dterminer.
0.&... Lth3lne.

Il y a peu dtudes sur lthyl"ne chez les al'ues. 1a production dthyl"ne a t mise en vidence chez plusieurs esp"ces dal'ues (Canden !riessche et al.@ *L--B 5lettner et al.@ +,,M.. 1acide/*aminocyclopropane/*/carboxyli%ue@ molcule prcurseur de lthyl"ne@ a t identifie dans un extrait commercial dal'ues brunes (&elson R van 4taden@ *L-M.. outefois@ la prsence dthyl"ne dans les extraits commerciaux dal'ues marines reste dmontrer.
0.&.9. Les bta:nes.

1es bta7nes sont des composs de type ammonium %uaternaire %ui prsentent une activit cyto>inine/li>e (8heeler@ *LT0.. 1eur participation aux proprits phytoactives des extraits dal'ues marines a t envisa'e du fait %ue les extraits contiennent de nombreux composs %ui rpondent positivement certains tests cyto>ini%ues ($lunden et al.@ *L-I.. 5lusieurs bta7nes ont dailleurs t isoles partir de nombreuses esp"ces dal'ues brunes utilises pour la prparation des extraits dal'ues commerciaux ($lunden et al.@ *L-M.. !iffrents

0-

extraits commerciaux ont alors t tests pour leur contenu en bta7nes ($lunden et al.@ *L-S.. ;lycine bta7ne@ acide d/aminobutyri%ue bta7ne@ acide l/aminovalri%ue bta7ne ont alors pu Etre identifis et %uantifis. 8hapham et collaborateurs (*LL0. ont montr %ue les bta7nes prsentes dans les extraits dal'ues entraNnaient une au'mentation des taux de chlorophylle dans les plantes traites par rapport aux contrAles non traites. !es rsultats similaires sont dcrits par $lunden R collaborateurs (*LLT.. 6es auteurs su''"rent un ralentissement de la d'radation de la chlorophylle plutAt %uune au'mentation du taux de chlorophylle. 1es bta7nes joueraient 'alement un rAle dans la rsistance des plantes au 'el ($lunden et al.@ *L-I.@ ainsi %ue dans la protection des plantes contre linvasion des nmatodes ($lunden et al.@ *LLT..
0.&.;. Les autres composs.

1es extraits commerciaux se caractrisent par la prsence de nombreux composs %ui sont 'nralement spcifi%ues aux esp"ces dal'ues utilises. 5armi ceux/ci@ nous pouvons citer des oli'osaccharides et des polysaccharides (laminaranes@ carra'hnanes].@ des sucres@ des polyols (mannitol.@ des acides amins@ des protines@ des drivs phnoli%ues@ lipides@ pi'ments@ vitamines] 1a paroi cellulaire des al'ues marines est riche en divers oli'o et polysaccharides (Floare' R Zuatrano@ *L--.@ et certains stimuleraient les syst"mes de dfense et de rsistance des plantes (`oubert et al.@ *LL-.. #insi@ la laminarine et les carra'hnanes semblent Etre impli%us dans le dclenchement des rponses de dfense par la plante (6ardinale et al.@ +,,,B 2ercier et al.@ +,,*B Flarzyns>i et al.@ +,,,@ +,,0B #ziz et al.@ +,,0B 2enard et al.@ +,,I.. 1a laminarine induit non seulement les rponses prcoces de dfense (alcalinisation du milieu extracellulaire@ production de proxyde dhydro'"ne.@ mais aussi les rponses tardives (induction de la phenylalanine ammoniac lyase et de la lipoxy'"nase.. 1a liminarine induit en outre la synth"se de phytoalexines@ lexpression de plusieurs familles de 5atho'enesis/Related (5R. protines@ ainsi %ue laccumulation de lacide jasmoni%ue (Flarzyns>i et al.@ +,,,.. 6ependant aucune raction hypersensible na t dtecte. 1es carra'hnanes induisent lexpression de '"nes de dfense ainsi %ue les voies de si'nalisation mdies par lthyl"ne@ lacide jasmoni%ue et lacide salicyli%ue (2ercier et al.@ +,,*.. 1activit de ces polysaccharrides serait lie leur de'r de sulfatation? plus leur contenu en sulfate est important et plus la molcule est active (2ercier et al.@ +,,*B 2enard et al.@ +,,I.. 1induction de diffrents '"nes de dfense a 'alement t mise en vidence chez le tabac@ 0L

'rQce la premi"re tude transcriptomi%ue sur lactivit licitrice dun extrait dal'ue verte (6luzet et al.@ +,,I.. 5armi eux@ les '"nes impli%us dans la biosynth"se des phytoalexines@ des 5R protines et des protines de la paroi cellulaire sont surexprims suite au traitement avec lextrait dal'ue. 5lusieurs '"nes du mtabolisme primaire rpondent aussi lextrait dal'ue. 5armi ceux/ci@ les enzymes cls du mtabolisme de lazote comme la nitrite rductase sont induits@ de mEme %ue la citrate rductase impli%ue dans le mtabolisme des carbohydrates. 1e mannitol a t identifi comme lun des composants actifs de l:ptine@ un extrait de lal'ue cAti"re Asc*ph-llu+ n*d*su+@ commercialis par la socit ;oimar (Flarzyns>i et al.@ +,,M.. 1e biostimulant :ptine au'mente la %uantit dazote absorb par une culture de bl@ ainsi %ue le transfert de lazote des feuilles et des ti'es vers le 'rain. 1a %ualit de la rcolte est alors optimise tout en favorisant le rendement@ lextrait dal'ue au'mentant la teneur en protines des 'rains (`oubert et al.@ +,,+.. !es recherches ont alors t entreprises afin de dterminer la (ou les. mati"re(s. active(s. contenue(s. dans cet extrait (Flarzyns>i et al.@ +,,M.. 5armi les molcules prsentes dans lextrait@ le mannitol serait un photoassimilat activateur de la nitrate rductase. 1e mannitol induirait 'alement une plus forte accumulation de chlorophylle dans les tissus. =n autre extrait dal'ue (& 5R:@ $iotech2arine. a aussi rvl une activit inductrice sur lactivit de la nitrate rductase (!urand et al.@ +,,0.. 6ertains extraits dal'ues montrent des proprits antioxydantes@ et a'issent en syner'ie avec la vitamine E (1e utour@ *LL,.. 1e utour a alors identifi la chlorophylle a comme le principal compos actif des extraits (1e utour et al.@ *LL-.. 0.). 4ubstances marines% ph3tohormones et azote. 1azote est essentiel la croissance et au dveloppement des plantes@ et@ en ce sens@ lazote est facteur nutritionnel important. 1es plantes ont aussi la capacit de senser leur statut azot interne et externe@ et de sadapter aux variations des conditions azotes en modifiant lexpression des '"nes@ les activits enzymati%ues et les contenus en mtabolites (4titt et al.@ +,,+.. 6ette capacit orchestrer ces chan'ements de disponibilit en azote@ ncessite un rseau de si'nalisation efficace et int'r. 1azote devient alors un facteur de si'nalisation. 1e nitrate est la premi"re molcule si'nal en activant lexpression des '"nes lis lassimilation de lazote (8an' et al.@ +,,,.. !e nouvelles molcules si'nal intervenant dans la propa'ation des si'naux azots sont aujourdhui proposes. 5armi celles/ci les cyto>inines et les auxines

I,

semblent jouer un rAle central de communication de la disponibilit en azote entre les racines et les feuilles (8alch/1iu et al.@ +,,M.. 6ertains extraits al'aux sont riches en auxines ou en cyto>inines. #ussi peut/on supposer une interaction entre ces phytohormones dori'ine marine et lint'ration des si'naux azots par la plante. 1es cyto>inines sont impli%ues dans de nombreux processus dveloppementaux comme la division cellulaire@ la formation et la r'nration des or'anes@ la dominance apicale@ le dveloppement vasculaire la mobilit des nutriments@ et la snescence (2o>@ *LLI.. 1es cyto>inines interviendraient dans la propa'ation du statut azot des racines vers les feuilles via le xyl"me ( a>ei et al.@ +,,*@ +,,+.. &itrate et biosynth"se des cyto>inines sont troitement relis. En effet lexpression de deux adnosine isopentnyltransfrases phosphate (premier enzyme de la voie de biosynth"se des cyto>inines@ I5 .@ est module par la disponibilit en azote (2iya9a>i et al.@ +,,IB a>ey et al.@ +,,I.. At")T3 est rapidement induite par le nitrate alors %ue At")T5 rpond aussi bien un traitement prolon' de nitrate ou dammonium. 4uite une priode de carence en azote@ la fourniture de nitrate induit aussi lexpression de certains '"nes de type #RR (#rabidopsis Response Re'ulators.@ %ui interviennent dans la rponse aux cyto>inines ( ani'uchi et al.@ *LL-B !#'ostino et al.@ +,,,.. 1es cyto>inines pourraient aussi a'ir comme mdiateurs systmi%ues dans le sens inverse@ cest//dire des feuilles vers les racines. 1es cyto>inines issues des feuilles et transportes vers les racines via le phlo"me@ pourraient ainsi jouer un rAle int'rateur@ en r'ulant labsorption du nitrate en rponse aux variations du statut azot de la partie arienne (8alch/1iu et al.@ +,,M.. 1es auxines de la partie arienne sont importantes pour lmer'ence des racines latrales chez des plantules d#rabidopsis ($halerao et al.@ +,,+.. 1es auxines reprsentent donc de bons candidats pour mdier le si'nal systmi%ue permettant linhibition du dveloppement des racines latrales en rponse une accumulation de nitrate dans les feuilles (3orde@ +,,+.. 6ette accumulation de nitrate dans les feuilles pourrait inhiber la biosynth"se des auxines ou leur char'ement dans le phlo"me@ entraNnant ainsi un contenu en auxines trop faible pour favoriser la formation des primordia des racines latrales (3orde@ +,,+.. 1initiation des racines latrales est fortement inhibe chez des plantes cultives sur un milieu contenant une forte dose de carbone par rapport lazote@ et cette inhibition semble dpendre de la r'ulation du transport dauxines (2alamy R Ryan@ +,,*.. 1e transporteur #t&R *.* est aussi r'ul par les auxines dans les feuilles et les racines (;uo et al.@ +,,+..

I*

1es extraits dal'ues marines semblent donc prsenter des proprits intressantes %ui pourraient Etre exploites plus 'rande chelle en a'riculture et horticulture. 6e sont 'nralement des mlan'es complexes de plusieurs al'ues@ dont la nature varie@ pour une mEme al'ue selon le mode de prparation@ et aussi@ pour un mEme produit commercial selon le lot considr (%ualit de lal'ue@ date de rcolte@ ].. #ussi@ les firmes commerciales doivent elles assurer la standardisation de leurs lots dextraits marins@ caractriser la (ou les. biomolcule(s. responsable(s.@ et dterminer son (leur. mode daction@ afin denvisa'er le dveloppement de ces extraits marins sur le march.

0I. $onte*te% ob<ectifs & stratgies de travail.

1a socit $iotech2arine@ implante sur la cAte nord de la $reta'ne (5ontrieux@ 6Ates d#rmor.@ proximit de larchipel de $rhat@ et %ui produit et commercialise des substances dori'ine al'ale ainsi %ue des en'rais azots chimi%ues@ est confronte ces exi'ences. #insi@ $iotech2arine a contact lI&R# de Cersailles@ et collabore depuis *LLT avec le laboratoire de la &utrition #zote des 5lantes. 1e projet initial consistait dcrypter les modalits daction des substances marines lori'ine de leurs effets sur le mtabolisme azot de la plante. #u pralable@ il sa'issait de valider ces effets stimulateurs sur la nutrition azote des plantes@ notamment par des mesures dactivit de la nitrate rductase@ avant didentifier la (ou les. molcule(s. responsable(s. et comprendre son (leur. mcanisme daction (!urand et al.@ +,,*.. #u fil des ans@ un autre aspect sest ajout ce projet@ $iotech2arine partant du constat %ue les en'rais base dure sont peu utiliss en 3rance la diffrence du reste du monde. 2a th"se finance par une convention 6I3RE (6onvention Industrielle de 3ormation par la REcherche. traite de ce double aspect. 1analyse biblio'raphi%ue fait apparaNtre %ue les connaissances sur les effets dun apport dure sur la physiolo'ie et le mtabolisme des plantes restent finalement tr"s incompl"tes. !autre part@ les cin% annes dtudes menes par &athalie !urand nont pas permis didentifier la (ou les. molcule(s. active(s. des extraits fournis par la socit $iotech2arine. 1objectif de cette tude est de mieux apprhender leffet des diffrentes formes azotes sur le mtabolisme des plantes@ et ainsi de situer plus clairement lintrEt des fertilisants azots uri%ues vis//vis du nitrate et de lammonium. 1e second volet de cette tude porte sur la nature et la comprhension des interactions entre mtabolisme azot et bio/stimulants apports par la pulvrisation de substances marines. #

I+

plus lon' terme@ le but de ce projet est damliorer la fertilisation azote tout en satisfaisant aux exi'ences de rendement des cultures et au souci de protection de lenvironnement. 1es plantes de 'randes cultures telles %ue le ma7s et le bl ont t nos premiers matriels dtude. &ous avons ensuite utilis la plante mod"le Arabid*psis thaliana pour analyser plus finement les rponses et notamment pour accder aux '"nes. 2a th"se se dcoupe en deux 'rands volets %ui seront respectivement dtaills dans les parties I et II de ce mmoire. 1a premi"re partie porte sur ltude de limpact de lure sur la croissance et le mtabolisme azot de la plante@ mais aussi sur les syst"mes de transport dazote@ nitrate@ ammonium et ure. 6es tudes physiolo'i%ues ont t compltes par une analyse transcriptomi%ue dans le but didentifier des '"nes cibles rpondant lure. !ans la deuxi"me partie@ nous avons test lefficacit de la pulvrisation foliaire dun extrait dal'ue fourni par notre partenaire industriel sur la croissance et les param"tres lis au mtabolisme azot de la plante. &ous lavons vu prcdemment@ les connaissances actuelles sur les modalits daction des substances al'ales sont assez limites. #fin de mieux comprendre les voies de si'nalisation de ces substances@ nous avons par ailleurs choisi une tude transcriptomi%ue. 6ette approche systmati%ue nous permet ainsi de navoir aucun a pri*ri sur le type de rsultats obtenus@ et douvrir au maximum les champs dinvesti'ation sur ce sujet afin de rechercher de nouvelles cibles au cmur du mtabolisme du v'tal.

I0

CHAPITRE I

Efficacit d ti!i"ati#$ d% ! &% 'a& !%" c&a!%"(

I. 7ise au point dun s3stme de culture avec lure.

1e laboratoire de la &utrition #zote des 5lantes (&#5. a ac%uis une 'rande renomme au niveau national et international de par son savoir/faire dans le domaine de la nutrition nitri%ue et ammoniacale des plantes. #u cours des annes T,@ les solutions nutritives %uilibres appeles solutions 6o7c/1esaint du nom de leurs auteurs (6o7c and 1esaint@ *LTM. ont t mises au point au laboratoire pour une utilisation en culture hydroponi%ue. 5ar contre@ lure ntait pas une source dazote tudie au &#5. &otre premier travail@ dterminant pour la suite du projet@ a donc consist en la mise au point de techni%ues culturales prcises sur milieu contenant de lure@ afin dtudier les cons%uences de lalimentation azote sous forme ure sur la croissance des plantes@ par comparaison avec une alimentation sous forme ammonium ou nitrate. &ous avons choisi la culture en hydroponie car cest un syst"me oD la nutrition minrale est parfaitement contrAle. En outre@ nous avions ainsi facilement acc"s aux racines. &ous avons initi cette tude avec le ma7s et le bl@ plantes de 'randes cultures ayant un intrEt a'ronomi%ue majeur. &ous avons ensuite utilis la plante mod"le Arabid*psis thaliana pour des analyses plus fines@ et notamment pour pouvoir tudier les '"nes impli%us dans lassimilation de lure (3i'ure *+.. &otre choix pour une concentration de + m2 dazote dans lensemble des solutions nutritives se base sur des travaux antrieurs@ dans le but dviter toute toxicit ammoniacale pour les plantes (6haillou et al.@ *LL*.. 1a composition des diffrentes solutions utilises pour la culture en hydroponie est dtaille dans les ableaux * et +. &ous devions aussi nous assurer %ue les formes dazote apportes nvoluaient pas au cours du temps dans le milieu de culture hydroponi%ue. 5our cela nous renouvelions les solutions de culture tous les deux jours. En outre@ plusieurs contrAles taient effectus %uotidiennement? (i. suivi (p<m"tre lectroni%ue. et rajustement du p< afin dviter une acidification de la II

Tableau 1. Composition des solutions pour la culture hydroponique du mas et du bl. Coc-Lesaint KH2PO4 KNO3 K2SO4 MgSO4(7H2O) CaCl2 NH4NO3 (NH4)2SO4 CO(NH2)2 Oligolments* Fer-DTPA 0,9 mM 1,4 mM 0,8 mM 0,65 mM 2,35 mM 0,3 mM 0,1 mL L-1 22 g L-1 NH4NO3 0,9 mM 1,5 mM 0,65 mM 2,35 mM 1 mM 0,1 mL L-1 22 g L-1 (NH4)2SO4 0,9 mM 1,5 mM 0,65 mM 2,35 mM 1 mM 0,1 mL L-1 22 g L-1 CO(NH2)2 0,9 mM 1,5 mM 0,65 mM 2,35 mM 1 mM 0,1 mL L-1 22 g L-1

* 23 M B; 9 M Mn; 0.3 M Mo; 0.95 M Cu; et 3.5 M Zn. Tableau 2. Composition des solutions pour la culture hydroponique dArabidopsis. NH4NO3 K2SO4 MgSO4 KH2PO4 CaCl2 NH4NO3 (NH4)2SO4 CO(NH2)2 Oligolments* Fer Sequestrne 2,5 mM 1 mM 1 mM 2,2 mM 1 mM 1 mL L-1 10 mg L-1 NH4NO3 + CO(NH2)2 2,5 mM 1 mM 1 mM 2,2 mM 0,5 mM 0,5 mM 1 mL L-1 10 mg L-1 CO(NH2)2 2,5 mM 1 mM 1 mM 2,2 mM 1 mM 1 mL L-1 10 mg L-1 (NH4)2SO4 2,5 mM 1 mM 1 mM 2,2 mM 1 mM 1 mL L-1 10 mg L-1
Carence

2,5 mM 1 mM 1 mM 2,2 mM 1 mM 10 mg L-1

* 23 M B; 9 M Mn; 0.3 M Mo; 0.95 M Cu; et 3.5 M Zn.

solution ammoniacaleB (ii. prsence de nitrate pour vrifier %uil ny avait pas eu nitrification dans les solutions ammoniacale et uri%ue (bandelettes Zuantofixn.B (iii. prsence dammonium pour vrifier %ue lure navait pas t hydrolyse (>it #%ua%uant &<IK 2erc>.. &ous avons ainsi pu obtenir des conditions de culture nous permettant lutilisation de lure comme seule source dazote@ %uel %ue soit le matriel dtude v'tal. 6es conditions de culture sont discutes plus avant dans les deux articles %ui suivent.

II. Article ! = 1rea use efficienc3 of h3droponicall3 gro>n maize and >heat plants =
Arti*le !ou&i! ; Journal of Plant Nutrition et a**e"t "our "ubli*ation !ou! r !er%e de &odi:i*ation!6 6et article rassemble les rponses physiolo'i%ues et mtaboli%ues de deux plantes de 'randes cultures (ma7s et bl.@ une alimentation azote sous forme ure@ par comparaison avec une nutrition sous formes ammonium nitrate ou ammonium sulfate. #lors %ue lure entraNne une croissance moindre par rapport aux autres sources azotes testes@ le dveloppement des racines est favoris par rapport celui des parties ariennes. !autre part@ lazote apport sous forme ure est faiblement absorb par les plantes. Enfin@ ma7s et bl rpondent diffremment lure en terme de croissance et de mtabolisme azot.

IM

120

A
100 Hauteur du mas (cm)

URE

AN

AS

CL b

a a

80

60

40

20

B
40 Hauteur du bl (cm)

30

20

10

0 Longueur de la partie racinaire du bl (cm)

C
90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 T0 T0 + 7 jours T0 + 14 jours T0 + 21 jours

Figure 13. Evolution de la hauteur du mas et du bl. T0 reprsente le dbut du traitement azot sous la forme ure, AN, AS, ou CL. Les valeurs sont des moyennes de 6 rptitions. Les diffrentes lettres correspondent aux groupes significativement diffrents P<0,05.

III. #sultats complmentaires obtenus au cours de la culture en h3droponie.

&ous reprendrons ici les mEmes abrviations %ue celles utilises dans larticle *? #& pour ammonium nitrateB #4 pour ammonium sulfateB et 61 pour 6o7c/1esaint. III.A. )volution de la hauteur des plantes. 1a lon'ueur des parties ariennes des plantules de ma7s et de bl a t mesure cha%ue prl"vement hebdomadaire@ du collet la pointe des feuilles tires. 6es mesures ont t compltes par celles de la lon'ueur des racines chez le bl (3i'ure *0#@ $@ 6.. 1es mesures de la lon'ueur des parties arienne et racinaire cha%ue prl"vement montrent une croissance homo'"ne %uel%ue soit la source dazote et lesp"ce v'tale considre (3i'ure *0#@ $@ 6.. 1volution de la taille des plantes de ma7s corrobore sa cinti%ue de croissance (3i'ure *0# et 3i'ure *# de l#rticle *.. 6hez le ma7s@ des br_lures apparaissent au niveau de la courbure des plus 'randes feuilles des plantes ayant eu un apport en #& et en #4 %uel%ues jours avant le deuxi"me prl"vement. 6es symptAmes semblent tmoi'ner dune toxicit de la nutrition ammoniacale. 1a surface des br_lures est plus importante chez les plantes cultives sur #4 %ue sur #&. :n observe 'alement de tr"s l'"res br_lures pour les plantes tmoin 61 (la solution fournit un tr"s l'er apport en ammonium.. #ucun symptAme nest dtect sur les plantes poussant sur ureB leurs feuilles sont toutefois dune couleur plus jaune %ue celles des plantes soumises aux autres traitements. 6e jaunissement pourrait traduire un symptAme de snescence reli une d'radation partielle de la chlorophylle en rponse une limitation en azote pour ces plantes sur ure (!iaz et al.@ +,,S.. =n dosa'e de la chlorophylle dans la partie arienne des plantes pourrait confirmer cette hypoth"se. 6hez le bl@ la hauteur de la partie arienne volue peu au cours des +* jours de culture. 5ar contre@ lallon'ement des racines est beaucoup plus important indpendamment de la source azote. 1ampleur de cet allon'ement racinaire semble plus prononc pour les plantules de bl alimentes avec de lure (3i'ure *06.. #ucune diffrence visuelle %uant laspect des plantes nest constater@ contrairement ce %ue lon a observ chez le ma7s. &ous avons aussi compt le nombre de talles cha%ue prl"vement@ et lvolution du nombre de talles rv"le les mEmes diffrences %ue celles de la courbe de croissance@ en fonction de la source dazote prsente dans la solution nutritive (#rticle *.. IS

QNa chez le mas (mmol/plante)

30 QNa chez le bl (mmol/plante) a 25 b 20 15 10 5 0 0 7 14 Jours aprs le dbut du traitement azot URE AN 21 b a c

30 25 20 b 15 10 5 0 0 7 14 Jours aprs le dbut du traitement azot CL 21 c a

AS

Figure 14. Quantit dazote absorbe par le mas et le bl au cours des trois semaines de traitement azot, sous forme ure, ammonium nitrate, et ammonium sulfate. La quantit dazote absorbe (QNa) est calcule pour la plante entire et les valeurs sont des moyennes de 6 rptitions. Les diffrentes lettres correspondent aux groupes significativement diffrents P<0,05.

III.B. ?uantit dazote prlev par les plantes. En partant des valeurs de la teneur en azote total mesure dans la plante@ nous avons calcul pour cha%ue prl"vement@ la %uantit totale dazote prlev par la plante (3i'ure *I.. 5our cela@ la concentration en azote total (emol '/* poids sec. a t multiplie par le poids sec de la plante enti"re en '. #u cours des +* jours de culture les valeurs de %uantit dazote total prlev pour chacun des 0 traitements #&@ #4 et ure sont semblables pour le ma7s et le bl. #lors %ue la %uantit dazote apport pour cha%ue traitement est identi%ue@ la %uantit dazote total absorb par les plantes nourries avec de lure reste faible au cours du temps par rapport aux trois autres conditions azotes (3i'ure *I.. 1azote apport sous forme de la molcule ure semble donc plus difficilement absorb pour les plantes %ue les ions nitrate ou ammonium. &otons %ue@ dans tous les cas@ la %uantit de lazote absorb au cours des sept derniers jours de culture est la plus forte. 1es plantes sont alors en pleine croissance et la demande en azote devient plus importante.

I0. 1tilisation de lure par le bl en conditions proches du champ.

!ans nos conditions de culture hydroponi%ue@ lazote apport na pas subi de transformations et les plantes ont donc t directement au contact de llment azot ajout en ltat. &ous avons ainsi pu montrer %ue labsorption de lazote sous forme dure est faible. 1ors%ue lure est apporte au champ@ les racines des plantes sont simultanment exposes trois sources dazote? ure@ ammonium et nitrate. 1a prsence dure se limite une br"ve priode du fait de la rapidit de son hydrolyse par les urases du sol. 1es principales sources dazote pour les plantes sont donc lammonium et le nitrate. #fin de tenir compte des transformations des formes azotes %ui existent dans les conditions naturelles@ nous nous sommes rapprochs des conditions a'riculturales en ralisant une culture de bl en pots@ sur sol non fertilis en azote minral. En outre@ avec lutilisation des isotopes stables (ure@ ammonitrate@ ammosulfate mar%us lazote
*M

&.@ nous pensions obtenir %uel%ues lments de rponse

%uant la cinti%ue dabsorption de lure par rapport aux autres sources azotes@ mais aussi sur la nature de la forme dazote absorb en conditions naturelles.

IT

Tableau 3. Proprits pdologiques du sol utilis pour la culture de bl en pots. Granulomtrie (g kg-1) Argile Limon fin Limon grossier Sable fin Sable grossier 169 181 406 216 28 C organique 14,5 (g kg-1) N organique 0,87 Calcaire 2 pH eau 7,5

Tableau 4. Solution de fertilisation de fond pour la culture de bl en pots. KH2PO4 K2PO4H Ca(H2PO4)2(1H2O) MgSO4(7H2O) Oligolments* Fer Sequestrne 2,56 mM 0,85 mM 2,525 mM 3,5 mM 9,2 mL. L-1 0,9 g.L-1

* 23 M B; 9 M Mn; 0.3 M Mo; 0.95 M Cu; et 3.5 M Zn.

Figure 15. Culture du bl en pots. Les plantes sont ges de 26 jours.

I0.A. 7ise en place du dispositif e*primental de culture. #fin de mener bien nos exprimentations@ nous recherchions un sol au p< neutre@ et avec un reli%uat dazote minral faible. 1e sol utilis pour ces exprimentations provient de la parcelle 1a 6a'e sur les terres de Cersailles@ sans fertilisation minrale depuis cin% ans. 1e sol a t prlev au printemps dans lhorizon ,/0, cm@ sch lair libre en serre@ puis tamis. 1e reli%uat moyen dazote du sol a t mesur? il atteint *I >' ha /*@ ce %ui correspond un reli%uat faible pour les a'ronomes (5atric> 4aulas@ #'ronomie@ I&R# Cersailles/;ri'non.. 4a nature et sa composition sont aussi dtailles dans le ableau 0. 1es premiers tests de 'ermination sur ce sol nont pas t concluants@ le sol tant beaucoup trop ar'ileux. 3inalement le plus judicieux sest avr Etre lutilisation dun substrat compos de ce sol et de sable de fontainebleau inerte (M,WM,.. 6ent pots de un litre ont t prpars lidenti%ue? au fond@ une couche dar'ile expans pour le draina'e@ surmonte du mlan'e sol et sable. 6ha%ue pot a reXu une fumure de fond apport en solution (+M, m1B ableau I.. &ous avons cultiv 0 plantes de bl (cv. 6ourtot. par pot. 1es pots ont t installs en serre non climatise@ et larrosa'e a t effectu avec de leau dminralise par sub/irri'ation d"s %ue le sol sasschait. `us%uau talla'e du bl@ les plantes ont utilis uni%uement lazote du sol pour leur croissance. &ous avons 'alement arros par sub/irri'ation deux pots avec une solution nutritive compl"te 6o7c/1esaint (6o7c R 1esaint@ *LT*.@ ces pots constituant des tmoins de croissance optimale. &ous avons effectu deux essais au cours de deux ts successifs (3i'ure *M..
I0.A.!. )ssai !.

=n mois apr"s le semis@ les plantes taient au stade talla'e. 1es *,, pots ont alors t spars en deux lots de M, pots. =n premier apport dazote a t effectu sur les *M, plantes dun lot de M, pots@ 0+ jours apr"s le semis@ et sous 0 formes? ure@ ammonium nitrate et ammonium sulfate@ mar%us lazote *M. &ous avons ainsi fertilis ces plantes avec *,, m1 de solution azote par pot laide dune serin'ue@ cha%ue solution apportant ,@,M ' de *M& enrichi MJ. 1a mEme %uantit dazote *I& a t apporte au deuxi"me lot de M, pots sous la forme dune solution de F&:0. 6es pots ont alors t cultivs encore +, jours jus%u montaison@ oD un deuxi"me apport dazote sous la forme *M&@ identi%ue celui effectu sur le premier lot de pots@ a t ralis. 6eux/ci ont donc reXu ,@* ' dazote au total par pot (,@,M ' de *I& K ,@,M '

I-

de *M&.@ ce %ui correspond environ la %uantit normalement pandue en a'riculture sur une culture de bl. =n@ 0 et - jours suivant cha%ue apport de
*M

&@ *+ plantes (I pots. ont t

rcoltes par traitement azot. 1e choix des diffrentes dates de prl"vement a t motiv par la vitesse avec la%uelle lure volue vers lammonium par hydrolyse. !es tudes antrieures ont montr %ue 0, S,J de lure est hydrolyse au cours de la premi"re journe dans diffrents sols en tuve +-^6. 1hydrolyse est totale au bout de I jours (4oubies et al.@ *LMM.. #insi nous pensions pouvoir comparer la cinti%ue dabsorption de lure celle des autres formes azotes@ et ainsi obtenir des indications %uant la forme dure absorbe@ molculaire ou d'rade. H cha%ue prl"vement@ parties arienne et racinaire ont alors t spares@ peses@ puis con'eles dans lazote li%uide. 1e matriel v'tal rcolt a t lyophilis@ pes et rduit en poudre afin de raliser les dosa'es de lazote total et du *M&@ du nitrate et des acides amins.

I0.A.". )ssai ".

6e deuxi"me essai a t ralis un an apr"s le premier. &ous avons respect un schma de culture identi%ue au premier essai@ notamment les dates du semis et des apports dazote. 1es rsultats du premier essai (cf IC.$.. nous ont conduit modifier %uel%ues points du protocole de culture pour ce deuxi"me essai? ils sont prciss ci/apr"s. =n seul apport de *M& a t ralis au stade montaison@ lensemble des pots ayant reXu une solution de F&:0 au stade talla'e. 5ar rapport au premier essai@ I traitements supplmentaires azots ont t effectus? ure K urase (4i'man. K nic>el (le nic>el est le cofacteur de lenzyme urase.B ure K #'rotain (I26 #;RI6:n@ inhibiteur durase.B ammonitrate K urase K nic>elB et ammonitrate K #'rotain@ ces deux derniers traitements servant de contrAles. 4uivant les indications des fournisseurs@ nous avons apports *,, units denzyme par pot telles %ue lure apporte soit totalement hydrolyse en 0, min@ et l#'rotain a t utilis une concentration finale de *, e1 1/*. 1e nic>el a t ajout ,@I e2 (;erendfs et al.@ *LL-..

IL

I0.A.+. (rotocole des dosages.

I0.A.+.a Les anal3ses !.@ et le dosage de lazote total.

1a composition isotopi%ue de cha%ue chantillon est dtermine par une analyse par spectromtrie de masse. M T m' de poudre de mati"re s"che v'tale sont pess dans une nacelle dtain@ br_ls@ et lazote 'azeux form est dos (combustion !umas.. 5our lessai *@ les analyses *M& ont t effectues avec lautoanalyseur dazote Roboprep 6& coupl un spectrom"tre de masse racermass (Europa 4cientific.. 5our lessai +@ les analyses *M& ont t effectues avec lautoanalyseur E# EuroCector 4.5.#. et le spectrom"tre de masse Isoprime (;C Instruments.. 6es analyses *M& ont t prises en char'e par 5ascal illard@ au 1aboratoire de $iochimie et 5hysiolo'ie 2olculaire des 5lantes@ dans l#telier des Isotopes 4tables@ lI&R# de 2ontpellier. En sortie analyti%ue@ nous obtenons la fois la composition en azote total de lchantillon (J &t.@ et labondance isotopi%ue du 'az (#J Echantillon.. 1a %uantit de *M& provenant de labsorption pendant le mar%ua'e@ prsente dans les feuilles la rcolte@ se dfinit comme suit (!elens et al.@ *LLT.? Z*M&a feuilles o #J exc"s feuilles x Z &t feuilles #J Echantillon o p*M& W (*I& K *M&.q x *,, #J exc"s o #J Echantillon r #J moin 1exc"s isotopi%ue (#J exc"s. reprsente la teneur ou abondance en isotope lourd entre lchantillon trait et lchantillon tmoin.
I0.A.+.b Le dosage du nitrate et des acides amins totau*.

1e dosa'e du nitrate ainsi %ue celui des acides amins totaux ont dj t dcrits (1oudet et al.@ +,,0..

M,

Poids sec de la partie arienne du bl (g)

0,5

A
0,4 0,3 0,2

1,2

0,8

0,4 0,1 0 J0 J8 J1 J3 Jours aprs le dbut du traitement azot URE AN 0 J0 J1 J3 J8 Jours aprs le dbut du second traitement azot AS

Poids sec de la partie arienne du bl (g)

2,2

C
a 1,8 a 1,4 b b 1 b a

0,6

J0

J1

J3

J8

Jours aprs le dbut du traitement azot URE URE+Agrotain URE+Urase+NiCl2

Figure 16. Evolution de la biomasse sche de la partie arienne du bl. Les plantes sont cultives en pots placs en serre, et deux essais sont raliss au cours de deux ts successifs. Lors de lessai 1, un apport dazote 15N est effectu sur un premier lot de plantes, 32 jours aprs le semis sous la forme ure, ammonium nitrate (AN) et ammonium sulfate (AS) (A). Le mme jour, un deuxime lot de plantes est fertilis avec la mme quantit dazote sous forme KNO3. 20 jours aprs, ce deuxime lot de plantes reoit un apport de 15N identique celui effectu sur le premier lot de plantes (B). Pour lessai 2, un apport dazote sous forme KNO3 est effectu 29 jours aprs le semis. Lapport de 15N est effectu 48 jours aprs semis sous la forme ure, additionn ou pas dAgrotain, un inhibiteur durase, ou durase et de son cofacteur le nickel (C). Les valeurs sont respectivement des moyennes de 12 et de 3 rptitions pour lessai 1 et 2. Les diffrentes lettres correspondent aux groupes significativement diffrents P<0,05.

I0.A.-. Anal3se statisti'ue.

1ensemble de nos donnes a t soumis une analyse de variance (#&:C#. sur )14tat/5ro T.M (#ddinsoft.. 1e test de &e9man/Feuls au seuil \ o MJ a t ralis pour comparer les traitements.
IV.B. Rsultats et discussion.

2al'r nos soins@ la rcolte des racines a t difficile et nous avons perdu beaucoup de matriel. 1es rsultats %ue nous avons obtenus sont de ce fait errons@ et nous avons choisi de ne pas les mentionner dans ce mmoire. 1es rsultats %ui suivent concernent donc uni%uement la partie arienne. !autre part@ nous prsenterons ici uni%uement les rsultats obtenus au cours de lessai * car ceux de lessai + sont 'lobalement similaires pour les traitements ure@ ammonium nitrate (#&. et ammonium sulfate (#4.. 5our contre@ les rsultats de lessai + obtenus avec les 0 traitements contenant de lure seront prsents. I0.B.!. $roissance et statut azot initial des plantes avant les apports
dazote.

6omme nous lavons vu dans le para'raphe prcdent (cf IC.#..@ les plantes ont t spares en deux lots@ cha%ue lot ayant reXu des apports dazote diffrents. 5our lun des lots@ un seul apport dazote sous les trois formes =@ #& et #4 mar%us lazote *M@ a t effectu 0+ jours apr"s le semis. 1autre lot a reXu@ la mEme date@ la mEme %uantit dazote mais sous forme F*I&:0. Cin't jours apr"s@ un deuxi"me apport dazote a t effectu sur ces mEmes plantes sous les trois formes =@ #& et #4 mar%us lazote *M. 1analyse de la croissance (3i'ure *S. et du statut azot (3i'ures *T +,. de lensemble de ces plantes au jour zro (`,@ date des apports dazote. nous a permis dtablir une caractrisation assez fine de [ltat mtaboli%ue des plantes juste avant les apports de *M&. 5our le premier lot de plantes ayant reXu un seul apport dazote@ la teneur moyenne en azote total est de IJ `, (3i'ure *T#. (elle slevait TJ chez des bls Q's dune vin'taine de jours et cultivs en hydroponie sur + m2 &<I&:0@ #rticle*.. 1a teneur en nitrate est de *,, emol '/* de poids sec (3i'ure *L#. (contre -,, emol de nitrates '/* de poids sec chez le bl en hydroponie@ #rticle *.@ et seulement des traces dacides amins sont retrouves dans les

M*

A
Teneur en azote total dans la partie arienne du bl (%) 5

a b b b b

B
4

4 3 3

J0

J1 J3 Jours aprs le dbut du traitement azot URE 3,6

J8

J0

J8 Jours aprs le dbut du second traitement azot AS

J1

J3

AN

C
Teneur en azote total dans la partie arienne du bl (%) 3,2 a 2,8 b

2,4

J0

J1

J3

J8

Jours aprs le dbut du traitement azot URE URE+Agrotain URE+Urase+NiCl2

Figure 17. Evolution de la teneur en azote total dans la partie arienne du bl. Les conditions de culture sont les mmes que pour la Figure 16. Les diffrentes lettres correspondent aux groupes significativement diffrents P<0,05.

feuilles du premier lot de plantes@ nayant pas encore reXu dazote (3i'ure +,#.. outes ces donnes traduisent une certaine limitation en azote@ ce %ui est en accord avec les observations compares entre ces plantes et les tmoins de croissance optimale. En Effet@ les deux pots tmoins 6o7c/1esaint prsentaient des plantules plus ['rasses `,@ avec un limbe plus tal par rapport aux bls irri'us avec de leau. 1es bls tant dficients en azote@ lapport de *M& a donc t efficace. outefois la prsence dazote et de nitrate dans la partie arienne des plantes nayant encore reXu aucune fertilisation azote impli%ue %ue les plantes ont utilis lazote issu de la minralisation naturelle de lazote or'ani%ue du sol pour assurer leur croissance jus%u ce stade. 5our le deuxi"me lot de plantes pralablement fertilis avec du F&:0 avant lapport de *M& (`,.@ seulement +@TJ dazote total sont prsents dans les feuilles (3i'ure *T$.. 6ependant@ une semaine apr"s lapport de *M& aux plantes du premier lot (3i'ure *T#.@ le pourcenta'e moyen dazote total est proche de MJ. #u cours des douze jours sparant les points `(premier lot. et `, (deuxi"me lot.@ la croissance des plantes est forte (3i'ure *S#@ $.@ ce %ui entraNne cette dilution de lazote `,. 1e contenu en nitrate confirme ltat de carence des plantes puis%ue tr"s peu de nitrates sont mesurs `, chez ce deuxi"me lot de plantes (3i'ure *L$.. #ussi notre apport de F&:0 a seulement servi au maintien de la croissance des plantes. En revanche nous retrouvons des acides amins@ issus de lassimilation du nitrate apport +, jours avant (3i'ure +,$.. #insi ces plantes semblent avoir puis leurs rserves en azote pour la production dacides amins et de protines@ et ainsi poursuivre leur croissance (3i'ure *S$.. &otons %ue les rsultats de lessai + (3i'ures *S6@ *T6@ *-6@ *L6 et +,6. concernant lensemble des param"tres mesurs pour le traitement ure sont 'lobalement semblables ceux de lessai * (3i'ures *S$@ *T$@ *-$@ *L$ et +,$.. 6es observations consolident notre tude. I0.B.". Absorption et assimilation de lure par les plantes. #ucune diffrence de croissance du bl na pu Etre mesure entre les 0 nutritions azotes ure@ #& et #4 reXues au cours de la culture (3i'ure *S#@ $.. #u cours de lessai + (3i'ure *S6.@ lajout d#'rotain semble entraNner une baisse de croissance si'nificative par rapport lure (`our -.. &ous avons vrifi sur le traitement contrAle #& %ue l#'rotain@ inhibiteur de lhydrolyse de lure@ ntait pas phytotoxi%ue. #insi la forme [ure non d'rade serait dfavorable la croissance@ comme nos rsultats en culture hydroponi%ue le montrent. 1ajout M+

Q15Na dans la partie arienne du bl (g)

500

800

A
400 300 400 200 600

a 100 0 J1 J3 J8 Jours aprs le dbut du traitement azot URE 500 AN 200

a b

J1 J3 J8 Jours aprs le dbut du second traitement azot AS

Q15Na dans la partie arienne du bl (g)

C
400 300 200 100 0

J1

J3 Jours aprs le dbut du traitement azot URE+Agrotain

J8

URE

URE+Urase+NiCl2

Figure 18. Evolution de la quantit de 15N absorb pendant le marquage et prsent dans la partie arienne du bl. Les conditions de culture sont les mmes que pour la Figure 16. Les diffrentes lettres correspondent aux groupes significativement diffrents P<0,05.

durase lure permet une meilleure croissance compare lure seule au bout de 0 jours de traitement. 1a forme [ure hydrolyse@ donc un mlan'e dammonium et de nitrate@ serait ainsi plus favorable la croissance du bl par rapport lure. &anmoins@ ce rsultat est en contradiction avec ceux des essais * et + concernant les diffrentes formes azotes #&@ #4 et ure (3i'ure *S$.. &ous lavons vu@ la culture du bl en hydroponie avec de lure comme seule source dazote@ entraNne une baisse rapide de la teneur en azote total dans lensemble de la plante (#rticle *@ 3i'ures 06@ !.. 1a teneur en azote total au'mente ici durant les 0 jours %ui suivent le premier apport dure (3i'ure *T#.. !ans les deux essais@ elle chute une semaine apr"s le second apport@ indpendamment de la source dazote@ sans doute cause de la forte demande en azote cette priode (3i'ure *T$.. 1a teneur en azote est un param"tre difficilement exploitable car il int"'re deux variables@ la %uantit dazote absorb et la biomasse accumule. #insi@ au cours de lessai +@ la teneur en azote du traitement ure K #'rotain ne chute pas entre les jours 0 et - contrairement aux deux autres traitements (3i'ure *T6.@ mais la croissance du bl sur ure K #'rotain est aussi plus faible par rapport aux autres traitements (3i'ure *S6.. &ous avons %uantifi lentre dazote dans la plante au cours du temps en utilisant le traceur
*M

&@ isotope stable de lazote prsent naturellement dans lenvironnement sous forme de

traces. 5our cela@ nous avons calcul cha%ue prl"vement la %uantit de *M& prsente dans la partie feuille (le calcul est dtaill dans le para'raphe IC.#.0..@ provenant de labsorption pendant le mar%ua'e (3i'ure *-.. !ans nos conditions de culture sur sol@ labsorption dazote uri%ue se rv"le aussi efficace %ue celle des formes ammoniacale et nitri%ue@ et ceci d"s le jour %ui suit lapport (3i'ure *-#@ $.. #insi@ au cours de lessai *@ S,J de lazote apport sous forme ure est retrouv dans les parties ariennes - jours apr"s le second apport (3i'ure *-$.. 2ais sous %uelle forme cet azote issu de lure est/il absorb par les plantess =re@ ammonium@ nitrate@ ou un mlan'e de plusieurs formess 1essai * ne nous permet pas de rpondre cette %uestion. 6est pour%uoi nous avons mis en place un deuxi"me essai oD nous nous sommes proposs de blo%uer lhydrolyse de lure 'rQce un inhibiteur durase (#'rotain.@ ou au contraire@ dacclrer cette hydrolyse en prsence durase et de son cofacteur le nic>el. 6ependant@ compte tenu des rsultats obtenus et illustrs sur la 3i'ure *-6@ nous ne pouvons rien conclure %uant la forme sous la%uelle lazote uri%ue apport est absorb par le bl. 1es %uantits de (3i'ure *-6..
*M

& prsentes dans les parties ariennes sont en effet

identi%ues %uel %ue soit le traitement au huiti"me jour@ mais aussi le jour %ui suit le traitement

M0

Teneur en nitrate dans la partie arienne du bl (mol g-1 poids sec)

400

160

A
300 a 120

B
b a 80 b b 40 c b

200

100

J0

J1 J3 J8 Jours aprs le dbut du traitement azot URE AN

J0 J1 J8 J3 Jours aprs le dbut du second traitement azot AS

Teneur en nitrate dans la partie arienne du bl (mol g-1 poids sec)

120

C
100 80 60 40 20 0 J0 J1 J3 J8

Jours aprs le dbut du traitement azot URE URE+Agrotain URE+Urase+NiCl2

Figure 19. Evolution de la concentration en nitrate dans la partie arienne du bl. Les conditions de culture sont les mmes que pour la Figure 16. Les diffrentes lettres correspondent aux groupes significativement diffrents P<0,05.

&anmoins@ lanalyse de la concentration en nitrate dans les feuilles de bl nous permet de formuler une rponse partielle cette %uestion. En effet les feuilles des bls senrichissent en nitrate au cours des 0 jours %ui suivent lapport d#&@ mais aussi d#4 et dure (3i'ure *L#@ $.. #insi@ nous pouvons penser %ue ces nitrates sont issus de lhydrolyse de lure. &ous avons observ le contraire en hydroponie@ oD la prsence dure et d#4 entraNne une brus%ue chute des nitrates dans la plante (#rticle *@ 3i'ure I6@ !.. 6ependant@ dans nos conditions de culture sur sol@ le processus de nitrification est actif et pourrait expli%uer les %uantits de nitrates non n'li'eables@ mesures dans les plantes alimentes avec #4 et ure. &otons %ue la concentration en nitrates des plantes traites avec l#& reste ici assez nettement suprieure celle des deux autres traitements aux jours * et 0@ ce %ui conforte notre interprtation (3i'ure *L#@ $.. 6ependant@ la prsence durase dans le sol semble fortement limiter laccumulation de nitrate dans les feuilles du bl nourri avec de lure (3i'ure *L6.. 1e bloca'e de lhydrolyse de lure par l#'rotain semble rduire de la mEme faXon laccumulation du nitrate (3i'ure *L6.. &ous retrouvons ainsi une situation comparable celle de la culture en hydroponie. Indpendamment des en'rais@ une autre source de nitrate provient de la minralisation de lazote or'ani%ue prsent dans le sol ( ableau 0.. &anmoins@ il semble %ue cette seule source ne puisse expli%uer les au'mentations de nitrate observes suite aux apports den'rais. =n tmoin exempt den'rais aurait t ncessaire pour %uantifier lapport du sol par minralisation. 6oncernant la concentration en acides amins totaux@ les plantes ayant pouss en prsence dure sont les plus riches durant les 0 jours suivant les apports dazote (3i'ure +,#@ $.. 1a mtabolisation de lazote uri%ue serait donc particuli"rement efficace chez le bl@ par rapport au nitrate ou lammonium. &ous retrouvons ici le mEme comportement dj relev en culture hydroponi%ue (#rticle *@ +,6.. &os rsultats le montrent? la mthodolo'ie
*M

ableau +.. 1a prsence durase dans le sol semble

favoriser cette accumulation. Zuant linhibiteur durase aucun effet nest observ (3i'ure

& adopte nous a permis de comparer les

absorptions dure@ d#& et d#4@ mais elle est peu adapte pour discriminer entre les formes dazote (nitri%ue@ ammoniacale@ ou uri%ue. absorbes dans nos conditions de culture sur sol. 1azote de lure est/il absorb sous forme ure ou sous les formes rduites ammonium etWou nitrates

MI

Teneur en acides amins dans la partie arienne du bl (mmol g-1 poids sec)

0,4

A
0,8 0,6 0,4 0,2 0 J0

a 0,3 b b b b a b a 0,1 a 0,2

B
a a b b

c J1 J3 J8 0 J0 J1 J3 J8

Jours aprs le dbut du traitement azot URE Teneur en acides amins dans la partie ariennee du bl (mmol g-1 poids sec) 0,3 AN

Jours aprs le dbut du second traitement azot AS

C
a 0,2 b

b 0,1

J0

J1 J3 Jours aprs le dbut du traitement azot URE+Agrotain

J8

URE

URE+Urase+NiCl2

Figure 20. Evolution de la concentration en acides amins totaux dans la partie arienne du bl. Les conditions de culture sont les mmes que pour la Figure 16. Les diffrentes lettres correspondent aux groupes significativement diffrents P<0,05.

0. 1tilisation de lure par les crales conclusions & perspectives.

&ous avons choisi deux syst"mes de culture afin dtudier lefficacit dutilisation de lure par les crales. !ans un syst"me dhydroponie@ le contrAle des conditions de culture est assez fin@ et les racines sont accessibles. !ans un syst"me de culture sur sol %ui se rapproche plus des conditions a'ronomi%ues@ la maNtrise des conditions exprimentales est beaucoup plus difficile@ et les racines sont difficilement rcupres. 1es rsultats obtenus en culture hydroponi%ue sont dj discuts dans l#rticle *. &ous rajouterons ici seulement %uel%ues aspects. 0.A. 1re et architecture racinaire. &ous lavons vu en hydroponie@ contrairement une nutrition ammoniaco/nitri%ue ou ammoniacale@ la croissance des racines est favorise aux dpends de celle de la partie feuille chez les plantes alimentes avec de lure. &ous lavons mesur chez le bl@ cette plus forte croissance se traduit pas une plus 'rande lon'ueur de la racine principale expose lure. &ous avons 'alement pu observer un chevelu racinaire plus dense pour les racines plon'es dans la solution uri%ue@ par comparaison aux autres traitements. 2Eme si ce phnotype racinaire est caractristi%ue dun dficit dazote@ nous ne pouvons pas exclure %ue ce soit une rponse spcifi%ue des racines@ au contact avec la molcule dure (#rticle *.. 0.B. Absorption et assimilation de lure. 6est le principal rsultat de notre tude en hydroponie? dans nos conditions de culture@ ma7s et bl sont capables dabsorber lure sous sa forme non d'rade@ et dutiliser lazote uri%ue pour assurer leur croissance. 6ette utilisation est diffrente selon %ue ce soit du ma7s ou du bl. outefois@ labsorption de lure est faible sous sa forme molculaire@ facteur limitant la croissance des plantes@ et lure sav"re donc une source dazote moins efficace en terme de rendement@ %ue les sources plus traditionnelles comme lammonium nitrate ou lammonium sulfate (#rticle *.. Il nous a t beaucoup plus difficile dvaluer lefficacit de lure par rapport ces autres sources dazote@ lors%uelle est apporte sur sol. !ans nos essais de culture sur pots@ la croissance des bls est toutefois homo'"ne %uelle %ue soit la source dazote ure@ ammonium MM

nitrate ou ammonium sulfate. 4i lon sattache essayer de relier efficacit dutilisation de lure et formes dazote absorb (ure@ nitrate@ ammonium.@ beaucoup de %uestions restent sans rponse. Il semble clair %ue lhydrolyse de lure a dbut au cours du premier jour de traitement@ compte tenu des tudes antrieures (4oubies et al.@ *LMMB Recous@ *L-T.. !ans cette hypoth"se@ lazote se prsenterait sous les deux formes ure et ammonium. 1a nitrification tant plus lente %ue lhydrolyse de lure (4oubies et al.@ *LMM.@ il est peu probable %uelle ait dmarr d"s le premier jour suivant lapport dure. :r@ au cours de cette premi"re journe en prsence dure mar%ue@ labsorption de *M& est aussi efficace %ue les formes ammoniaco/nitri%ue et ammoniacale (3i'ure *-#.@ voire suprieure la forme ammoniacale (3i'ure *-$.. 1a forme ammoniacale pourrait Etre majoritaire et donc compenserait la faible absorption de lure %ue nous avons constate en hydroponie. 6est probable mais nous ne pouvons rien affirmer@ faute de maNtriser suffisamment les conditions exprimentales. En particulier nous navons pas test lefficacit de linhibiteur durase #'rotain@ ni celle de lurase. 6e type dtude en sol aurait ncessit davanta'e de contrAles notamment au niveau des bilans de 15&. #insi nous navons pas %uantifi les pertes dazote %ui ont pu se produire au cours de nos essais. 1e lessiva'e du nitrate a probablement t limit par larrosa'e des pots par sub/irri'ation. 2ais les pertes par volatilisation de la forme ammoniacale ont certainement t non n'li'eables puis%ue nous avons apport les en'rais sous forme li%uide et une temprature en serre leve. &os rsultats montrent %ue les feuilles du bl trait avec de lure senrichissent en nitrates. Zuelle est lori'ine de ce nitrate dans la plante alimente avec de lures (i. Cient/il directement de la minralisation de lazote or'ani%ue du sols (ii. 1ure apporte au sol est/ elle hydrolyse en ammonium par les urases@ puis nitrifie@ nitrates alors absorbs par la plantes 1a prsence durase dans le sol semble fortement limiter laccumulation de nitrate dans les feuilles du bl nourri avec de lure (3i'ure *L6.. 1hypoth"se (ii. serait donc carter@ mais les trop 'randes variations de nos rsultats ne nous permettent pas de conclure. Zuoi%uil en soit@ lazote uri%ue sav"re bien utilis par les plants de bl cultivs en pots@ tout comme nous lavions vu en culture hydroponi%ue. #fin dapporter de nouveaux lments de rponses nos %uestions lissue de ces deux essais de culture sur sol@ nous avons essay de doser lure dans nos chantillons de bl par chromato'raphie chan'euse dions@ mais lanalyse na pas abouti notamment en raison de la faiblesse du contenu en ure dans nos chantillons. !e mEme il nous a t impossible de suivre le devenir de llment *M& par chromato'raphie 'azeuse couple un spectrom"tre de masse@ lenrichissement en *M& de MJ tant trop insuffisant. MS

;rQce nos exprimentations sur deux plantes de 'randes cultures@ et sur deux syst"mes de culture@ nous ont permis de mesurer les avanta'es mais aussi les limites de chacune des deux esp"ces crali"res ma7s et bl@ ainsi %ue celles des syst"mes de culture en hydroponie et sur sol. #fin de nous permettre daller plus avant dans ltude de lutilisation de lure par le v'tal@ ainsi %ue dans ltude de ses mcanismes r'ulateurs@ notre matriel dtude sera dsormais Arabid*psis thaliana.

MT

CHAPITRE II

Eff%t d% ! &% " & !% t&a$"'#&t & !% )ta*#!i")% d% !a+#t% c,%+ A&a*id#'"i" t,a!ia$a(

I. Introduction.
5our faire suite notre tude sur crales@ et afin danalyser plus finement les diffrentes adaptations du mtabolisme de la plante %ue nous avons pu mettre en vidence en rponse une fourniture dure@ nous avons choisi de poursuivre notre travail sur une autre esp"ce v'tale@ Arabid*psis thaliana. !ans un premier temps@ nous avons cherch caractriser lensemble des rponses physiolo'i%ues de la plante un apport dure. 1e choix des diffrents milieux de culture utiliss se fonde sur les diffrents aspects %ue nous voulions traiter. =ne solution nutritive contenant de lammonium nitrate (#&. a constitu notre milieu de rfrence. &ous y avons ajout de lure (#&K=. dans le but de pouvoir valuer les effets de la prsence dure sur lutilisation par la plante des autres formes dazote@ %ue sont le nitrate et lammonium. =n milieu nutritif compos exclusivement dure (=. comme source dazote nous a permis de caractriser les rponses de la plante %ui sont spcifi%ues lure. &ous avons vu %ue le ma7s et le bl prsentent des si'nes de carence azote suite un apport dure (#rticle *.. #ussi avons/nous test un milieu nutritif sans aucune source dazote (4.@ afin dvaluer la svrit de la carence en azote 'nre par lure. Enfin@ pour %ue lazote de lure soit utilis par la plante (voir introduction.@ lure doit Etre hydrolyse. 1azote uri%ue est alors converti en ammonium@ et ainsi est/il l'itime de se demander si une nutrition avec de lure ne serait pas %uivalente une nutrition ammoniacale. #fin dapporter des lments de rponse cette %uestion@ nous avons choisi de tester un milieu contenant uni%uement de lammonium (#4.. 1a 3i'ure +* synthtise de faXon schmati%ue le plan exprimental suivi lors de nos exprimentations (voir aussi #rticle +.. ;rQce des mesures dinflux avec lisotope 15& dont le principe est dcrit sur la 3i'ure ++@ nous souhaitions apporter une preuve physi%ue dun M-

flux dure via les racines de la plante. &ous avons 'alement mesur leffet de laddition dure dautres sources azotes sur linflux de nitrate@ dammonium ou dure@ et ceci en fonction des diffrents statuts azots de la plante (#&@ #&K=@ = ou 4.. En outre@ ces analyses physiolo'i%ues ont t compltes par des mesures sur des param"tres lis au mtabolisme azot comme le contenu en nitrate ou en acides amins libres au niveau foliaire et racinaire. 1e travail sest alors poursuivi un niveau molculaire par une analyse de la rponse de la plante au niveau de lexpression 'ni%ue. ;rQce une tude transcriptomi%ue@ nous avons identifi les '"nes dont lexpression est module en rponse diffrents traitements azots contenant ou non de lure.

II. Article " = (h3siological and transcriptomic aspects of urea upta8e and assimilation in Arabidopsis plants =
Arti*le "r "ar "our <tre !ou&i! ; Plant Physiology6 6et article rassemble les rsultats obtenus au cours de notre tude sur limpact de lure chez des plantes d#rabidopsis cultive en hydroponie. 1es deux aspects physiolo'i%ue et transcriptomi%ue sont traits.

ML

III. #sultats complmentaires.

&ous reprendrons ici les mEmes abrviations %ue celles utilises dans l#rticle +? #& pour ammonium nitrateB #&K= pour ammonium nitrate K ureB = pour ureB 4 pour le milieu sans azoteB et #4 pour ammonium sulfate. III.A. Anal3se ph3siologi'ue de la rponse A lure chez Arabidopsis. 1#rticle + dcrivant la pres%ue totalit des rsultats %ue nous avons obtenus au cours de lanalyse physiolo'i%ue de la rponse lure@ nous ajouterons ici seulement %uel%ues complments et illustrations 'raphi%ues non reprsentes dans larticle.
III.A.1. Ure et architecture racinaire.

&ous lavons vu chez le ma7s et chez le bl@ une nutrition exclusivement uri%ue conduit une stimulation du dveloppement racinaire aux dpends des parties ariennes (6hapitre I.. &ous retrouvons cette mEme particularit dveloppementale des racines chez #rabidopsis (#rticle +.. 2Eme si cette induction du dveloppement des racines semble reli un dficit en azote@ nous ne pouvons pas exclure %ue ce soit une rponse spcifi%ue des racines au contact de la molcule dure (#rticle *.. =n tel phnotype racinaire avait dj t observ dans le laboratoire@ sur une culture in ,itr* d#rabidopsis en milieu semi/li%uide contenant de lure. #ussi@ dans le but de mieux comprendre comment a'it la source azote ure sur le dveloppement de lappareil racinaire@ nous avons mis en place un dispositif de culture in ,itr* d#rabidopsis cotype 6olumbia sur des boNtes places en position verticale dans une chambre de culture en jours lon's (*-^6@ S,J dhumidit et photopriode Th/+0h.. #pr"s de nombreux tests de milieux de 'ermination et de culture@ il semble %ue la source azote na pas dinfluence visible sur la 'ermination des plantules. 1e dispositif exprimental le plus simple a donc t une 'ermination directe des 'raines sur les diffrentes sources azotes ammonium nitrate@ ammonium sulfate et ure@ avec deux concentrations en azote M et *, m2. 1e principal probl"me %ue nous avons rencontr avec ce syst"me de culture en position verticale a t celui de lhtro'nit de croissance des plantules sur une mEme boNte@ mais aussi dune exprimentation lautre. !e plus le meilleur dveloppement de la partie arienne sur ammonium nitrate par rapport lure@ a rendu difficile une comparaison de lappareil S,

0,8

a a 5 b 4 3 2 a a a b b c 1 0 Rapport feuilles/racines c d a b b

Poids frais en g

0,6 b 0,4

0,2

0 RACINES AN AN+U FEUILLES U AS S

Figure 23. Distribution de le masse frache entre les racines et les feuilles des plantes aprs une semaine de culture sur diffrentes sources azotes. Les plantes dArabidopsis ont t cultives pendant 35 jours en hydroponie sur un milieu contenant 0,5 mM NH4NO3. Les plantes ont alors t transfres sur diffrents milieux contenant 1 mM NH4NO3 (AN), 0,5 mM NH4NO3+0,5 mM CO(NH2)2 (AN+U), 1 mM CO(NH2)2 (U), 1 mM (NH4)2SO4 (AS), ou ne contenant pas dazote (S). Elles sont rcoltes 42 jours, une semaine aprs le transfert. Les valeurs sont des moyennes de 8 rptitions. Les diffrentes lettres correspondent aux groupes significativement diffrents P<0,05.
NO3- en mol g-1 MF racinaire NO3- en mol g-1 MF foliaire 60 A 50 40 30 20 10 0 4 MF g-1 3 2 1 0 RACINES FEUILLES AN AN+U U AS C 160 120 80 40 0 MF 2 1,5 1 0,5 0 RACINES S FEUILLES D B

Figure 24. Contenu en nitrate (A, B), en ammonium (C) et en ure (D) dans les racines et les feuilles des plantes aprs une semaine de culture sur diffrentes sources azotes. Les conditions de culture sont les mmes que pour la Figure 23. Les valeurs sont des moyennes de 3 rptitions.

CO(NH2)2 en mol

NH4 en mol

g-1

racinaire. 6ependant des points intressants ont t observs au cours de ces exprimentations? (i. les plantules se dveloppent bien sur ure ? elles sont bien vertes@ plus trapues et avec un ptiole plus court %ue les plantules cultives sur ammonium nitrateB (ii. de nombreux poils absorbants apparaissent sur toute la lon'ueur de la racine principale et des racines secondaires au contact avec lureB (iii. les racines secondaires sont plus lon'ues chez les plantes cultives sur ure par rapport celles alimentes avec lammonium nitrateB (iv. au contact de lure@ les racines secondaires et tertiaires se dveloppent de faXon importante pour former un rseau branchu au niveau de la partie suprieure de lappareil racinaire. !epuis ces premiers essais prliminaires de cultures in ,itr* en boNtes verticales@ des amliorations du syst"me de culture ont t dveloppes. 1e syst"me de culture est dsormais bien maNtris et donne des rsultats beaucoup plus homo'"nes. Il serait donc intressant de reprendre cette tude %uant leffet de lure sur larchitecture racinaire@ en utilisant ce nouveau syst"me de culture en boNtes verticales.
III.A.2. Nutritions urique et ammoniacale.

!evant labsence de rptitions exprimentales@ nous avons fait le choix de ne pas publier les donnes obtenues avec une nutrition exclusivement ammoniacale (#4.. outefois les rsultats %ue nous avons obtenus nous ont paru si'nificatifs dans la mesure oD@ notamment@ lanalyse des param"tres azots sur les plantes alimentes avec les autres milieux azots (#&@ #&K=@ = et 4.@ est comparable avec nos exprimentations antrieures. 6es rsultats sont illustrs sur les 3i'ures +0 +M. 1e dveloppement v'tal des plantes cultives sur = et #4 est assez proche (3i'ure +0.. outefois des symptAmes de toxicit ammoniacale comme un jaunissement au niveau de la rosette des plantes@ sont apparus au cours de la culture sur #4@ alors %uils sont inexistants chez les plantes alimentes avec lure. En outre@ la croissance des racines plon'es dans la solution ammoniacale est moindre par rapport celle des racines au contact avec lure@ alors %ue la croissance de lappareil foliaire est similaire (3i'ure +0.. 6eci su''"re %ue cette particularit phnotypi%ue du dveloppement racinaire en prsence dure soit une rponse spcifi%ue la molcule dure (voir para'raphe prcdent.. 1es donnes illustres sur la 3i'ure +I rv"lent un statut azot similaire entre des plantes cultives sur = ou sur #4. 6ependant lanalyse du contenu en ammonium dans les plantes ne nous permet pas de confondre nutritions ammoniacale et uri%ue. En effet@ si le contenu en ammonium est identi%ue dans les racines entre les traitements = et #4@ lammonium saccumule beaucoup plus dans les feuilles des plantes cultives sur #4 (3i'ure +I6.. !e faXon plus surprenante@ S*

Acides amins totaux en mol g-1 MF

50 40 30 20 10 0 RACINES FEUILLES

Acides amins en mol g-1 MF racinaire Acides amins en mol g-1 MF foliaire

14 12 10 8 6 4 2 0 12 10 8 6 4 2 0 ALA ARG ASN ASP GABA GLN GLU GLY SER

AN

AN+U

AS

Figure 25. Contenu en acides amins dans les racines et les feuilles des plantes aprs une semaine de culture sur diffrentes sources azotes. Les conditions de culture sont les mmes que pour la Figure 23. Les valeurs sont des moyennes de 3 rptitions.

les racines au contact d#4 prsentent la plus forte concentration en ure. 6ela su''"re %ue la prsence dammonium induirait la voie de biosynth"se de lure dans la cellule racinaire. &ous retrouvons ici une forte accumulation des acides amins dans les plantes cultives sur #4 (3i'ure +M.@ caractristi%ue de la nutrition ammoniacale (1o%u R von 8irn@ +,,I.. 1a 'lutamine est le compos amin majeur accumul la fois dans les racines et dans les feuilles. 1e contenu en alanine contribue 'alement cette forte accumulation dans les racines. !ans les feuilles@ la srine@ le 'lutamate et laspara'ine sont aussi bien reprsents (3i'ure +M.. 6et enrichissement en acides amins est li la rapidit dassimilation de lammonium absorb@ sans la%uelle laccumulation des ions &<IK pourrait atteindre des niveaux toxi%ues pour la plante. 1es acides amins saccumulent 'alement chez les plantes alimentes avec de lure@ mais dans une moindre mesure par rapport celles places sur ammonium@ en particulier au niveau de la partie arienne. 6e sont aussi les mEmes acides amins %ui sont lori'ine de cette accumulation (#rticle +..
III.A.3. Complments aux anal ses par !C"#$.

1es analyses par spectromtrie de masse couple une chromato'raphie 'azeuse (;6/24. nous ont permis non seulement de suivre lincorporation du 15&:3, 15&<4 et CO(15NH2)2 dans les diffrents acides amins (Article 2, Figure 4), mais aussi dans lammonium. 1a 3i'ure +S illustre les mesures des %uantits en 15&<4+ retrouves dans les racines des plantes suite un influx de M minutes de nitrate@ dammonium ou dure enrichis en 15&. 4ans aucune surprise@ seulement dinfimes %uantits de inversement linflux de
15 15

&<4+ sont dceles apr"s un influx de

15

15

&:3, et

&<4 est suivi par un enrichissement important en

&<4+. 6et

enrichissement est diffrent selon le statut azot de la plante au moment oD linflux est effectu. 4i la prsence pralable dure dans le milieu de culture favorise l'"rement cet enrichissement@ les racines des plantes carences en azote sont elles tr"s riches en 15&<4+. 6es rsultats sont en accord avec les mesures dinflux (#rticle +@ 3i'ure 0.. 1es informations les plus intressantes de cette analyse du contenu en 15&<4+ sont celles obtenues suite un influx de 6:(15&<2.2. !e lammonium enrichi en *M& est retrouv dans les racines suite linflux de 6:(15&<2.2, mEme si les %uantits mesures restent tr"s infrieures celles %ui suivent un influx de 15&<4+. Lhydrolyse de lure 15& est la seule origine possible de cet ammonium 15&. 4oit (i. une partie de lure contenue dans la solution de mar%ua'e t hydrolyse en *M&/ ammonium au cours de notre exprience dinflux@ ammonium alors absorb par les racinesB soit (ii. le 15&<4+ provient de lhydrolyse in planta par les urases des cellules racinaires@ de S+

mol 15NH4+ g-1 MF racinaire

0 6 mM 15NO3 AN 10 mM 15NH4 10 mM CO(15NH2)2 AN+U U S

Figure 26. Contenu en 15NH4+ dans les racines des plantes aprs un influx de 5 minutes de nitrate, dammonium ou dure enrichis au 15N. Les plantes dArabidopsis ont t cultives pendant 35 jours en hydroponie sur un milieu contenant 0,5 mM NH4NO3. Les plantes ont alors t transfres sur diffrents milieux contenant 1 mM NH4NO3 (AN), 0,5 mM NH4NO3+0,5 mM CO(NH2)2 (AN+U), 1 mM CO(NH2)2 (U), 1 mM (NH4)2SO4 (AS), ou ne contenant pas dazote (S). Les influx ont t raliss au 42ime jour de culture, une semaine aprs le transfert. Les valeurs sont des moyennes de 3 rptitions.
Enrichissement foliaire des acides amins (% 15N) 8 CO(15NH2)2 6

0
lu ln (2 N ) G ln (5 N ) ly ab a ln G lu Pr o Th r la Se r re a U G sn sp G A A A G G Py ro G V al

AN

AN+U

Figure 27. Suivi de lincorporation du 15N dans les acides amins des feuilles des plantes aprs un influx de 5 minutes dure 10 mM enrichie au 15N. Les conditions de culture sont les mmes que pour la Figure 26. Linflux dure a t ralis au 42ime jour de culture, une semaine aprs le transfert. Les valeurs sont des moyennes de 3 rptitions.

lure absorbe. &anmoins@ le contenu en

15

&<4+ dans les racines vgtales nest pas

significativement diffrent selon la source dazote apporte, bien que linflux dure soit induit dans les racines pralablement alimentes avec de lure (Article 2, Figure 3). Si lammonium
15

& mesur dans ces racines provenait de lhydrolyse, alors nous nous

attendrions en retrouver davantage par rapport aux racines soumises aux autres rgimes azots. Ce nest pas le cas, aussi pouvons-nous supposer que les faibles quantits dammonium 15N mesures dans les racines des plantes suite un influx dure, sont issues dune hydrolyse partielle de lure dans la solution de marquage. Toutefois, une hydrolyse de lure semble peu probable puisque nos mesures dinflux ont t effectues en conditions striles dans une chambre de culture 21C, et lexprimentation de marquage sest droule sur cinq minutes. Dans lArticle 2, nous avons vu que lammonium issu de lhydrolyse de lure dans la racine, tait rapidement mtabolis pour former les acides amins. Le 15&<4+ mesur dans les racines suite linflux dure pourrait donc aussi correspondre lammonium urique encore non mtabolis ou alors mis en rserve dans la vacuole. 1allocation vers les feuilles dune partie de lure absorbe avant son hydrolyse par les urases des cellules racinaires@ est lune des caractristi%ues du transport et de lassimilation de lure dans la plante ensei'ne par nos exprimentations (#rticle +.. 1a 3i'ure +T apporte la preuve directe de cette redistribution de lure des racines vers les feuilles en lespace de seulement cin% minutes. En effet@ %uel%ue soit le traitement azot appli%u aux plantes une semaine avant linflux (#&@ #&K=@ = ou 4.@ nous retrouvons de lure enrichie en *M& dans la partie arienne de la plante suite un influx dure radiomar%ue pendant M minutes. III.B. Anal3se gnomi'ue globale de la rponse A lure chez Arabidopsis. &ous lavons vu@ les analyses physiolo'i%ues en rponse diffrentes combinaisons dun r'ime azot mixte #&W= (*,,W,B M,WM,B ,W*,,.@ ont permis de mettre en vidence des adaptations du mtabolisme v'tal aux diffrentes sources dazote. #fin dobtenir une plus lar'e caractrisation des effets de lure@ mais aussi dans le but dexpliciter plus finement les rponses de la plante@ nous avons orient notre tude vers lchelle molculaire 'rQce une analyse de lexpression 'ni%ue. 1analyse du transcriptome 'rande chelle est aujourdhui rendue tr"s accessible 'rQce la techni%ue des puces #!& ou microarrays. 6elles/ci sont utilises pour identifier et %uantifier la sur/ ou sous/expression dun ensemble de '"nes dans une situation biolo'i%ue donne. 1analyse dune masse suffisante de donnes dexpriences

S0

Figure 28. Principe dune puce ADN. Cette technique repose sur lhybridation molculaire, selon un schma inverse de celui du Northern blot. Des ADNc de squences connues sont fixs sur un support solide. Le mlange complexe dARN tester est rverse transcrit, amplifi et marqu par deux fluorochromes diffrents. Le matriel marqu est alors hybrid sur la puce. Les donnes sont lues au scanner, chaque signal est normalis puis analys statistiquement afin de dterminer les gnes diffrentiellement exprims.

Figure 29. La puce CATMA. La puce CATMA contient 24576 GSTs rparties en 3 mtablocs, chacun composs de 64 blocs de 144 spots, un spot correspondant un gne.

sur puces peut permettre didentifier des familles et des rseaux fonctionnels de '"nes mis en jeu sous leffet du stimulus tudi. &ous avons ainsi identifi laide de la puce
6# 2#

(6omplete #rabidopsis ranscriptome 2icro#rray. dveloppe par nos coll"'ues de l=nit de Recherche en ;nomi%ue C'tale Evry (http?WW999.catma.or'W.@ les '"nes dont lexpression est module par le statut nutritionnel de la plante. 6ette lame de verre contient des sondes correspondant aux +M,,, '"nes d#rabidopsis annots au cours du s%uenXa'e complet du 'nome ( he #rabidopsis ;enome Initiative@ +,,,.. #vant dapporter %uel%ues complments l#rticle + %uant la description des profils dexpression 'nrs par notre analyse transcriptome@ nous dtaillerons ici %uel%ues points du 'rand principe dune analyse par biopuce et plus particuli"rement par puce 6#
III.B.!. La puce
2#.

6# 2#

1e principe de base des puces #!& est lhybridation molculaire d#R&s ou d#!&s pralablement mar%us (cibles.@ avec des #!& complmentaires de s%uence connue (sonde.@ fixs sur un support solide. 1a miniaturisation des techni%ues de dpAt des #!&s permet ltude de centaines de milliers d#!& de s%uences diffrentes en une seule fois. 6oncernant la puce
6# 2#@

les #!&s dposs sont des sondes '"nes spcifi%ues appeles

;4 s (;ene 4e%uence

a's.@ 'nres pour chacun des +M,,, '"nes d#rabidopsis. 1es

;4 s sont des fra'ments 'nomi%ues amplifis par 56R dune taille de *M, M,, paires de base@ obtenus partir de s%uences 'nomi%ues sur des r'ions transcrites@ slectionnes pour leur unicit dans le 'nome. 1a %ualit de toutes les ;4 s est vrifie par lectrophor"se sur un 'el da'arose@ avant %ue celles/ci soient dposes mcani%uement sur une lame de verre 'rQce un robot (3i'ure +-.. 1a puce
6# 2#

contient +IMTS ;4 s rparties en 0 mtablocs@

chacun composs de SI blocs de *II spots@ un spot correspondant un '"ne (3i'ure +L.. #vant de procder lhybridation sur la puce@ les #R&s des deux chantillons comparer sont extraits@ rverse transcrits@ amplifis puis mar%us par deux fluorochromes diffrents (6yM@ rou'eB et 6y0@ vert.. 1e matriel mar%u est alors hybrid sur la puce
6# 2#@

et la

%uantification des si'naux vert et rou'e permet dvaluer lexpression diffrentielle de cha%ue '"ne dun chantillon par rapport lautre. =ne rptition techni%ue consiste inverser les fluorochromes (dye/s9ap. attachs chacun des deux chantillons (#llemeersch et al.@ +,,M. (3i'ure +-.. 1es donnes obtenues sont normalises puis soumises une analyse statisti%ue afin de dterminer les '"nes diffrentiellement exprims.

SI

RACINES

AN+U

AN

FEUILLES

Figure 30. Comparaisons ralises avec la puce CATMA, dans le but dvaluer limpact de la fourniture dure sur lexpression gnique. Les ARNs racinaire et foliaire ont t extraits de plantules dArabidopsis de 42 jours. Les plantes sont cultives en hydroponie pendant 35 jours sur une solution nutritive contenant 0,5 mM de NH4NO3. Les plantes sont alors transfres sur diffrents milieux contenant 2 mM dazote, apport sous les formes ammonium nitrate (AN), ammonium nitrate et ure (AN+U), et ure (U). Les flches reprsentent les conditions compares sur une mme lame.

Figure 31. Tableau de prsentation des rsultats de lanalyse transcriptomique. Pour chaque rptition biologique (exp1 et exp2), seule la comparaison ure (U) vs ammonium nitrate (AN) au niveau des racines est reprsente. Les moyennes des exp1 et exp2 sont indiques dans les colonnes repet. Seulement un nombre trs restreint de gnes est galement illustr.

5our la ralisation de notre tude transcriptome cherchant valuer leffet de lure sur lexpression 'ni%ue@ nous avons choisi de comparer trois nutritions azotes@ apportant chacune + m2 dazote. 1e milieu ammonium nitrate (#&. a constitu notre rfrence. Il a t compar une solution contenant uni%uement de lure (=.@ et un mlan'e dammonium nitrate (#&. et dure (=. ajouts dans les mEmes proportions. !e plus nous avons utilis lensemble du matriel v'tal notre disposition@ spar en racines et feuilles@ et nous avons ralis une rptition biolo'i%ue (rptition exprimentale. (#rticle +.. <uit comparaisons ont t effectues (3i'ure 0,.. 1es rsultats danalyses diffrentielles sont prsents sous forme de tableau comportant pour cha%ue '"ne et pour cha%ue comparaison le lo'+ des intensits moyennes (rou'e et verte.@ le ratio moyen des lo'+ des intensits (rou'eWvert.@ et la p/value (mesure statisti%ue de la diffrence dexpression.. =n code couleur permet de visualiser facilement lchelle des valeurs pour cha%ue colonne du tableau. #insi@ une couleur rou'e est attribue aux '"nes induitsB les '"nes rprims sont indi%us en vert (3i'ure 0*..
III.B.". Interprtation de nos donnes de transcriptome.

&ous avons choisi lapproche transcriptomi%ue dans le but dlucider les rseaux de r'ulation emprunts par la plante pour int'rer lassimilation de lure avec les autres voies mtaboli%ues cellulaires@ et ainsi mettre en place les adaptations mtaboli%ues et physiolo'i%ues %ue nous avons pu mesures prcdemment (#rticle +B 6hapitre II@ para'raphe III.#... 1analyse 'nomi%ue de la rponse nutritionnelle chez #rabidopsis@ nous a permis de dresser un catalo'ue des '"nes spcifi%uement r'uls par lure. 1a liste exhaustive des '"nes dont la transcription est module en prsence dure@ est dtaille dans l#rticle +. 1es rsultats prsents ici seront identi%ues ceux dcrits dans cet article@ mais nous avons toutefois choisi des illustrations 'raphi%ues diffrentes@ dans le but davoir une autre vue densemble des profils dexpression 'ni%ue 'nrs en rponse lure. 5ar ailleurs@ nous prsentons ainsi %uel%ues/unes des applications offertes par loutil des donnes 'nomi%ues. 1es analyses de transcriptome haut dbit 'n"rent un norme set de donnes. #ussi lexploitation de cette masse dinformations est/elle limite par notre capacit les interprter. 6es donnes doivent Etre hirarchises mais aussi replaces dans un contexte biolo'i%ue dj connu. !es outils bioinformati%ues adapts et puissants sont alors indispensables pour [faire parler lensemble des donnes exprimentales. 1eur SM
2#52#&

pour interprter

Processus biologiques induits dans les racines U vs AN

Processus biologiques rprims dans les racines U vs AN

Acides amins 5% Stress 7% Transport 11%

Hormone 6%

Transport 7% Protine 7%

ARN 14%

Protine 7% ARN 12% Processus biologiques rprims dans les feuilles U vs AN Paroi cellulaire 6%

Processus biologiques induits dans les feuilles U vs AN Mtabolisme COH majeur 4%

Acides amins 9%

Hormone 9%

Mtabolisme secondaire 6% Hormone 4% Protine 13% ARN 11% PS glycolysis OPP cell wall amino acid metabolism secondary metabolism tetrapyrrole synthesis polyamine metabolism C1-metabolism DNA cell not assigned Stress 3% Transport 7% Signalisation 5% ARN 14%

Stress 5%

Protine 8%

14% metabolism major CHO 5% fermentation 8% TCA/org. transformation lipid metabolism S-assimilation hormone metabolism stress nucleotide metabolism misc protein development

minor CHO metabolism gluconeogenese/ glyoxylate cycle mito e- transport/ATP synthesis N-metabolism metal handling Co-factor and vitamine metabolism redox.regulation Biodegradation of Xenobiotics RNA signalling transport

Figure 32. Distribution en classes fonctionnelles des gnes racinaires et foliaires diffrentiellement exprims entre des plantes cultives en prsence dure (U), et des plantes cultives en prsence dammonium nitrate (AN) . Les ARNs racinaires et foliaires ont t extraits de plantules dArabidopsis de 42 jours. Les plantes sont cultives en hydroponie pendant 35 jours sur une solution nutritive contenant 0,5 mM de NH4NO3. Les plantes sont alors transfres sur deux milieux contenant 2 mM dazote, apport sous les formes ammonium nitrate (AN), ou ure (U). Classification MAPMAN (Thimm et al., 2004); P-value<0,05.

dveloppement a connu un formidable essor parall"lement aux avances technolo'i%ues des approches transcriptomi%ues. 5lusieurs lo'iciels sont aujourdhui disponibles. 5our notre tude nous avons choisi le lo'iciel
2#52#& 2#52#&

( himm

et

al.@

+,,IB

7tt"=>>gabi6r?"d6de>"ro@e*t!>Ma"Man>..

permet le classement des donnes

'nomi%ues dans des cat'ories fonctionnelles hirarchi%ues. 1es 3i'ures 0+ et 00 illustrent sous forme de dia'rammes circulaires cette rpartition en classes fonctionnelles des '"nes diffrentiellement exprims au cours de notre tude. 6e mEme classement est prsent dans les ableaux III et CI@ complmentaires l#rticle +. 1es classes fonctionnelles les plus reprsentes selon les comparaisons sont ici facilement visualises. 6ha%ue '"ne est ainsi assi'n une fonction biolo'i%ue d"s lors %ue celle/ci soit connue dans les bases de donnes publi%ues. =n autre module du lo'iciel
2#52#&

combine ces donnes

fonctionnelles@ pour replacer cha%ue '"ne au cmur des processus biolo'i%ues dans les%uels il intervient. 3inalement la masse de donnes 'nomi%ues se traduit par une reprsentation symboli%ue des voies mtaboli%ues et autres processus biolo'i%ues@ oD cha%ue '"ne mis en jeu sous leffet du stimulus tudi est reprsent par un petit carr. 1es '"nes impli%us dans un processus particulier sont ainsi 'roups dans lGespace@ et des orientations biolo'i%ues particuli"res sont facilement mises en vidence@ alors %uelles seraient moins apparentes sur une liste de '"nes individuels. 1es dia'rammes prsents sur les 3i'ures 0I 0L sont %uel%ues unes des interprtations 'raphi%ues de la compilation de nos donnes par le lo'iciel
2#52#&.

1a visualisation

'raphi%ue des '"nes %ui rpondent lure montre clairement une plus forte modification des niveaux de transcription lors%ue lure est la seule source dazote disponible pour la plante@ par rapport un mlan'e ure et #& (3i'ures 0I 0L #@ et $.. 1es chan'ements de lexpression 'ni%ue sont aussi plus importants au niveau racinaire %ue foliaire (3i'ures 0I@ 0M@ 0S@ et 3i'ures 0T@ 0-@ 0L.. Il apparaNt clairement %ue le passa'e dune forme azote #& vers lure@ en'endre chez le v'tal@ de profondes variations dans lexpression des '"nes assi'ns des processus mtaboli%ues tr"s varis (3i'ures 0I et 0T.. 1a forte proportion des '"nes rpondant lure@ impli%us dans la transcription et le mtabolisme proti%ue dj relev dans l#rticle +@ se retrouve ici (3i'ures 0M et 0-.. 1a dominance de la couleur bleu indi%ue %ue ces '"nes sont majoritairement induits (3i'ure 0M#.. !ans les racines@ les processus de r'ulation mdis par les cyto>inines et lacide jasmoni%ue sont rprims alors %ue la r'ulation par les auxines et lthyl"ne est plutAt induite. 5armi les '"nes cibles diffrentiellement exprims@ les '"nes de biosynth"se des cyto>inines At")T3 et At")T5 sont SS

Processus biologiques induits dans les racines AN+U vs AN

Processus biologiques rprims dans les racines AN+U vs AN Paroi cellulaire 8% Lipide 6%

Hormone 3% Stress 3%

ARN 11% Protine 5% Signalisation 6% Transport 9% Dveloppement 5% Protine 10% ARN 21% Dveloppement 4%

Processus biologiques induits dans les feuilles AN+U vs AN Lipide 3% Acides amins 3% Mtabolisme secondaire 8% Hormone 6% Stress 9% Protine 10% ARN 5% PS glycolysis OPP cell wall amino acid metabolism secondary metabolism tetrapyrrole synthesis polyamine metabolism C1-metabolism DNA cell not assigned 14% metabolism major CHO 5% fermentation 8% TCA/org. transformation lipid metabolism S-assimilation hormone metabolism stress nucleotide metabolism misc protein development

Processus biologiques rprims dans les feuilles AN+U vs AN Photosynthse 8% Mtabolisme COH majeur 8% Paroi cellulaire 8% Acides amins 5% ARN 18% Hormone 8%

Transport 8% Dveloppement 5% Protine 10%

Transport 6%

Dveloppement 3%

minor CHO metabolism gluconeogenese/ glyoxylate cycle mito e- transport/ATP synthesis N-metabolism metal handling Co-factor and vitamine metabolism redox.regulation Biodegradation of Xenobiotics RNA signalling transport

Figure 33. Distribution en classes fonctionnelles des gnes racinaires et foliaires diffrentiellement exprims entre des plantes cultives en prsence dammonium nitrate et dure (AN+U), et des plantes cultives en prsence dammonium nitrate (AN) . Les ARNs racinaires et foliaires ont t extraits de plantules dArabidopsis de 42 jours. Les plantes sont cultives en hydroponie pendant 35 jours sur une solution nutritive contenant 0,5 mM de NH4NO3. Les plantes sont alors transfres sur deux milieux contenant 2 mM dazote, apport sous les formes ammonium nitrate (AN), ou ure (U). Classification MAPMAN (Thimm et al., 2004); P-value<0,05.

A. U vs AN

B. AN+U vs AN

Figure 34. Vue densemble des gnes racinaires lis au mtabolisme. Les ARNs ont t extraits sur des racines dArabidopsis de 42 jours. Les plantes sont cultives en hydroponie pendant 35 jours sur une solution nutritive contenant 0,5 mM de NH4NO3. Les plantes sont alors transfres sur deux milieux contenant 2 mM dazote, apport sous les formes ammonium nitrate (AN), ou ure (U). Un carr reprsente un gne. Le carr est bleu si le gne est induit, et rouge sil est rprim en prsence dure. Classification MAPMAN (Thimm et al., 2004); P-value<0,05.

A. U vs AN

AtIPT5

AtIPT3

B. AN+U vs AN

Figure 35. Vue densemble des gnes racinaires lis aux processus de rgulation. Les ARNs ont t extraits sur des racines dArabidopsis de 42 jours. Les plantes sont cultives en hydroponie pendant 35 jours sur une solution nutritive contenant 0,5 mM de NH4NO3. Les plantes sont alors transfres sur deux milieux contenant 2 mM dazote, apport sous les formes ammonium nitrate (AN), ou ure (U). Un carr reprsente un gne. Le carr est bleu si le gne est induit, et rouge sil est rprim en prsence dure. Classification MAPMAN (Thimm et al., 2004); P-value<0,05.

A. U vs AN

AtNrt2.5 AtNrt1.1 AtDUR3 AtAMTs

B. AN+U vs AN

Figure 36. Vue densemble des gnes racinaires lis aux processus de transport. Les ARNs ont t extraits sur des racines dArabidopsis de 42 jours. Les plantes sont cultives en hydroponie pendant 35 jours sur une solution nutritive contenant 0,5 mM de NH4NO3. Les plantes sont alors transfres sur deux milieux contenant 2 mM dazote, apport sous les formes ammonium nitrate (AN), ou ure (U). Un carr reprsente un gne. Le carr est bleu si le gne est induit, et rouge sil est rprim en prsence dure. Classification MAPMAN (Thimm et al., 2004); P-value<0,05.

A. U vs AN

B. AN+U vs AN

Figure 37. Vue densemble des gnes foliaires lis au mtabolisme. Les ARNs ont t extraits sur des rosettes dArabidopsis de 42 jours. Les plantes sont cultives en hydroponie pendant 35 jours sur une solution nutritive contenant 0,5 mM de NH4NO3. Les plantes sont alors transfres sur deux milieux contenant 2 mM dazote, apport sous les formes ammonium nitrate (AN), ou ure (U). Un carr reprsente un gne. Le carr est bleu si le gne est induit, et rouge sil est rprim en prsence dure. Classification MAPMAN (Thimm et al., 2004); P-value<0,05.

A. U vs AN

B. AN+U vs AN

Figure 38. Vue densemble des gnes foliaires lis aux processus de rgulation. Les ARNs ont t extraits sur des rosettes dArabidopsis de 42 jours. Les plantes sont cultives en hydroponie pendant 35 jours sur une solution nutritive contenant 0,5 mM de NH4NO3. Les plantes sont alors transfres sur deux milieux contenant 2 mM dazote, apport sous les formes ammonium nitrate (AN), ou ure (U). Un carr reprsente un gne. Le carr est bleu si le gne est induit, et rouge sil est rprim en prsence dure. Classification MAPMAN (Thimm et al., 2004); P-value<0,05.

A. U vs AN

B. AN+U vs AN

Figure 39. Vue densemble des gnes foliaires lis aux processus de transport. Les ARNs ont t extraits sur des rosettes dArabidopsis de 42 jours. Les plantes sont cultives en hydroponie pendant 35 jours sur une solution nutritive contenant 0,5 mM de NH4NO3. Les plantes sont alors transfres sur deux milieux contenant 2 mM dazote, apport sous les formes ammonium nitrate (AN), ou ure (U). Un carr reprsente un gne. Le carr est bleu si le gne est induit, et rouge sil est rprim en prsence dure. Classification MAPMAN (Thimm et al., 2004); P-value<0,05.

rprims dans les racines des plantes cultives sur ure (3i'ure 0M#.. !iffrents '"nes de type #RR rpondent aussi n'ativement lure. H linverse@ les '"nes N"T2 (nitrilase. et C5)6371@ '"nes de la voie de biosynth"se des auxines (8ood9ard R $artel@ +,,M.@ sont induits dans les feuilles en prsence dure. !ans le cas du '"ne codant pour la nitrilase +@ cette induction semble spcifi%ue lure (#rticle +@ ableau III.. !ans les feuilles@ la diffrence est moins nette et les '"nes de si'nalisation par les auxines semblent autant induits %ue rprims (3i'ure 0-#.. &ous pouvons donc envisa'er %ue ces variations dans le niveau dexpression des '"nes lis aux phytohormones@ soient une explication la stimulation du dveloppement racinaire des plantes sur ure (#rticle +.. En effet les cyto>inines et les auxines ont des rAles anta'onistes dans le dveloppement racinaire. 1es auxines stimulent la formation des racines latrales et adventives@ alors %ue les cyto>inines inhibent la formation des racines et inversent leffet des auxines (#loni et al.@ +,,S.. 1thyl"ne est un autre si'nal hormonal impli%u dans la formation des racines latrales (#loni et al.@ +,,S.. Il est difficile de savoir si cette si'nalisation hormonale particuli"re est une rponse lure elle/mEme@ ou si elle traduit un chan'ement du statut azot interne de la plante sous une alimentation uri%ue@ cest//dire la baisse des ressources en azote (#rticle +.. 6oncernant les processus lis au transport@ le transport de lammonium est induit@ de mEme %ue celui des acides amins et des cations divalents. # linverse@ les a%uaporines et le transport du sulfate sont inhibs (3i'ure 0S#.. &ous retrouvons linduction du '"ne AtNrt2.58 ainsi %ue la rpression du '"ne AtNrt1.18 codant respectivement pour un transporteur haute et faible affinit du nitrate (3i'ure 0S#..

I0. 1tilisation de lure par Arabidopsis conclusions & perspectives.

out comme le ma7s et le bl (6hapitre I.@ #rabidopsis est capable dabsorber lure sous sa forme molculaire@ et dutiliser lazote uri%ue pour assurer sa croissance. 6hez les crales@ lure reprsente la source dazote la moins efficace en terme de rendement par rapport lammonium sulfate et surtout lammonium nitrate (#rticle *@ 6hapitre I.. 4i une nutrition exclusivement sous forme dure est aussi moins efficace par rapport une nutrition mixte de nitrate et ammonium chez #rabidopsis@ lure est@ en revanche@ aussi efficace %uune nutrition ammoniacale en terme de croissance (6hapitre II@ 5ara'raphe III... 1es plantes alimentes avec de lure comme seule source dazote prsentent aussi des symptAmes caractristi%ues dune limitation en azote. 6e man%ue dazote nest pas 'nr par

ST

une incapacit des plantes assimiler lazote issu de lure@ mais il naNt plutAt conscutivement une moindre efficacit dabsorption de lure par les racines@ par rapport au nitrate ou lammonium. En effet@ lure absorbe est rapidement hydrolyse par les urases des cellules racinaires@ et lammonium produit est alors assimil via le cycle ;4/ ;:;# pour former 'lutamine et autres acides amins ncessaires la croissance de la plante. =ne faible partie de lure absorbe semble Etre toutefois@ vhicule vers les parties ariennes par les vaisseaux du xyl"me (3i'ure +T.. &ous avons 'alement pu mesurer leffet de laddition dure dautres sources azotes sur linflux de nitrate@ dammonium ou dure. 1e transport dure semble positivement r'ul par son substrat@ lure@ et inhib par la prsence dammonium nitrate. En outre la prsence dure dans le milieu semble inhiber le transport du nitrate@ alors %ue le transport dammonium semble inductible par la prsence dure (#rticle +.. 1ori'inalit de notre tude tient notre analyse du transcriptome d#rabidopsis en rponse une addition dure. &ous avons ainsi pu relier nos rsultats physiolo'i%ues et la modulation de lexpression 'ni%ue en rponse lure chez #rabidopsis (#rticle +.. &ous avons ainsi obtenu un set de '"nes cibles %ui rpondent spcifi%uement lure. 1ensemble de nos rsultats de transcriptome devra toutefois Etre valid@ par exemple par la confirmation de lexpression diffrentielle de %uel%ues '"nes en R /56R %uantitative. 5rfrentiellement nous choisirons comme matriel v'tal des plantes issues dune culture indpendante celles utilises pour notre analyse 'nomi%ue 'lobale. &otre tude transcriptome ainsi valide@ nos efforts porteront alors sur la comprhension des mcanismes mis en jeu par ces '"nes cibles en rponse lure.

S-

CONCLUSION GENERALE

Efficacit d ti!i"ati#$ d% ! &% 'a& !%" -.ta /(

&otre travail sest attach mieux comprendre les mcanismes mis en jeu par la plante en rponse une addition dazote sous la forme ure. &ous avons tout dabord mis en place une vaste tude sur diffrents param"tres mtaboli%ues@ afin de caractriser [ltat physiolo'i%ue de la plante soumise une nutrition uri%ue. 6es expriences nous ont permis de mettre en vidence des adaptations du mtabolisme v'tal en rponse lure. 5lantes de 'randes cultures (ma7s et bl.@ et #rabidopsis@ rv"lent des [tats physiolo'i%ues 'lobalement identi%ues. 6es analyses physiolo'i%ues ont t compltes au niveau molculaire par une analyse de lexpression 'ni%ue chez #rabidopsis laide des puces 6#
2#.

En cela@ ce travail

constitue ( notre connaissance.@ la premi"re tude transcriptomi%ue en rponse lure.

I. Labsorption de lure & le problme de son h3drol3se.

1tude de labsorption de lure impli%ue un strict contrAle de son processus dhydrolyse. &ous avons ainsi multipli les prcautions afin dempEcher lhydrolyse de lure dans nos conditions de culture. &ous avons tout dabord fait le choix dun syst"me de culture en hydroponie@ dans le%uel les param"tres de la nutrition minrale sont parfaitement contrAls. &ous avons aussi renouvel les solutions nutritives tous les deux jours dans le cas du ma7s et du bl@ et %uotidiennement pour #rabidopsis. Enfin@ au cours de nos cultures sur crales@ nous avons suivi lvolution de la solution uri%ue par des contrAles r'uliers de p<@ contenus en ure@ ammonium et nitrate. 2al'r tout@ nous ne pouvons pas affirmer %uune petite partie de lure apporte na pas t hydrolyse dans nos conditions de culture en hydroponie (#rticles * et +.. 4il y a effectivement eu une hydrolyse partielle de lure@ le phnom"ne reste nanmoins tr"s faible dans nos conditions de culture. &ous avons aussi obtenu des rsultats assez puissants@ notamment 'rQce lutilisation dure mar%ue lazote *M et aux mesures dinflux dure@ pour pouvoir affirmer %ue lure est effectivement absorbe par les racines des plantes sous sa forme molculaire@ et ceci aussi bien chez le ma7s et le bl %ue chez #rabidopsis. SL

II. Absorption & Assimilation de lure.

2a7s@ bl et #rabidopsis sont non seulement capables dabsorber lure sous sa forme molculaire@ mais aussi dassimiler lazote issu de lure afin dassurer leur croissance. 1ure reste toutefois une source dazote moins efficace@ en terme de rendement@ %uune solution mixte de nitrate et dammonium@ mais aussi efficace par rapport une nutrition ammoniacale@ du moins pour #rabidopsis. 6ette plus faible efficacit dutilisation dure par les plantes semble davanta'e due une plus faible efficacit dabsorption de lure@ plutAt %u une plus faible assimilation de lazote issu de lure@ par rapport au nitrate et lammonium. En effet@ la nutrition uri%ue est associe une forte au'mentation des %uantits de 'lutamine dans la plante. 1ammonium issu de lhydrolyse de lure par les urases des cellules racinaires@ est alors incorpor aux diffrents acides amins via le cycle ;4/;:;# @ de la mEme faXon %ue lammonium absorb@ issu de la photorespiration@ ou de la rduction du nitrate (#rticle +.. &ous avons apport la preuve physi%ue dun transport dure travers les racines des plantes@ mais %uen est/il des modalits du transport de lure au niveau molculaires 1%uipe de &icolaus von 8irn a identifi un transporteur haute affinit de lure chez #rabidopsis@ #t!=R0 (1iu et al.@ +,,0a.@ ainsi %ue %uatre protines tonoplasti%ues (#t I5s. assurant le transport facilit de lure (1iu et al.@ +,,0b.. &otre tude du transcriptome montre %ue lexpression du '"ne At&%R3 est fortement induite dans les racines des plantes alimentes avec de lure par rapport celles au contact dammonium nitrate. &ous avons aussi montr %ue linflux dure dans les racines est positivement r'ul par la prsence pralable dure dans le milieu de culture (#rticle +.. #insi@ nous pouvons supposer %ue le transport dure %ue lon a mis en vidence se fait@ du moins en partie@ via la protine #t!=R0. 6ependant il peut exister dautres syst"mes de transport de lure. #lors %ue 1iu et collaborateurs ont montr une surexpression du '"ne At&%R3 au cours de la carence azote (1iu et al.@ +,,0a.@ nous navons pas mesur dau'mentation de linflux dure chez nos plantes carences (#rticle +.. 6ela su''"re lexistence dun autre niveau de r'ulation du transport dure par #t!=R0@ en aval de la transcription. 1e niveau dexpression daucun des %uatre transcrits #t I5s nest modifi en rponse lure dans notre analyse transcriptome. 5ar contre la transcription de deux a%uaporines #t+'+L-T, et #t+'0I0L, est spcifi%uement induite par lure (#rticle +.. 1e transport dure via les a%uaporines a dj t montr par syst"me dexpression

T,

htrolo'ues dans les ovocytes de xnopes (Ec>ert et al.@ *LLLB ;erbeau et al.@ *LLL.. &ous pouvons donc penser %ue ces deux a%uaporines soient aussi des transporteurs potentiels dure. !es tudes complmentaires comme ltude dexpression de ces '"nes par R /56R %uantitative ou lanalyse de mutants@ sont envisa'er pour obtenir de nouvelles informations %uant la fonction de ces '"nes et leur ventuelle implication dans le transport de lure.

III. Lure facteur nutritionnel rgulateur du transport de lazote.

1ure a un rAle nutritionnel en tant %ue tel en permettant la croissance v'tale lors%uelle constitue la seule source dazote disponible pour la plante. 1a prsence dure r'ule 'alement les syst"mes de transport ddis aux trois formes azotes@ nitrate@ ammonium et ure. 1ure semble directement impli%ue dans la r'ulation de son propre transport. 1au'mentation de linflux dure dans les racines des plantes pralablement alimentes avec lure comme seule source dazote le prouve. En revanche cette au'mentation sav"re Etre contrebalance par lajout dammonium nitrate dans la solution nutritive. 1a prsence dammonium nitrate semble donc inhiber le transport dure (#rticle +.. 6ette observation est en accord avec notre analyse transcriptome %ui montre %ue le '"ne At&%R3 est fortement induit dans les racines en prsence dure. 1ors%ue lon ajoute de lammonium nitrate@ le '"ne reste induit dans les racines@ mais cette induction est fortement rduite dans lune de nos rptitions biolo'i%ues (pour lautre rptition@ le '"ne est aussi induit mais la )value est suprieure ,@,M.. Zuant aux syst"mes de transport du nitrate et de lammonium@ nos rsultats montrent %uils sont aussi r'uls par la prsence dure. #lors %ue linflux de nitrate est rduit suite une priode de culture des plantes sur une solution nutritive contenant uni%uement de lure@ compare une solution mixte dure et dammonium nitrate@ linflux dammonium est %uant lui stimul (#rticle +.. 4i ces observations sont parfaitement confirmes au niveau molculaire dans le cas du transport de lammonium@ les rponses concernant le pattern dexpression des '"nes de transport du nitrate sont plus contrastes. En effet@ notre analyse 'nomi%ue rv"le une au'mentation du niveau dexpression des transcrits de trois transporteurs dammonium en rponse la seule prsence dure ( AtA!T1.38 AtA!T1.1 et AtA!T29. Zuant au nitrate@ si la prsence dure stimule lexpression des '"nes AtNRT2.5 et AtNRT2.4@ elle diminue le niveau de transcription du '"ne AtNRT1.1. 1e '"ne AtNRT2.1@ le plus abondamment transcrit dans les racines et majoritaire dans linflux du

T*

nitrate haute affinit (:rsel et al.@ +,,+.@ nest pas diffrentiellement exprim en rponse lure. !es tudes complmentaires seront ncessaires afin de comprendre les modalits des mcanismes de r'ulation par lure du transport du nitrate@ mais aussi de lammonium et de lure.

I0. Lure molcule signal B

:utre son rAle nutritionnel@ lure semble Etre impli%ue dans le dveloppement de la racine. En effet ma7s@ bl@ et #rabidopsis prsentent tous le mEme phnotype racinaire en rponse la prsence dure@ savoir un dveloppement accru de la racine (#rticles * et +.. !ans ltat actuel de nos diffrentes exprimentations@ il nous est difficile de savoir si cest un effet propre la molcule ure@ ou si ce phnom"ne traduit plus une rponse la limitation en azote. outefois@ nous pouvons penser %ue lure jouerait bien un rAle de molcule si'nal dans la mise en place de larchitecture racinaire. 2Eme si ce ne sont %ue des tudes prliminaires %uil faudra toffer@ nos cultures in ,itr* en boNtes verticales semblent montrer un effet local de lure sur le dveloppement racinaire (voir 6hapitre II@ 5ara'raphe III.#.*... &os analyses transcriptome montrent 'alement une corrlation troite entre apport dure et expression de diffrents '"nes lis la si'nalisation et la synth"se des hormones auxine et cyto>inine@ faisant plus penser un effet systmi%ue de lure (voir 6hapitre II@ 5ara'raphe III.$.+... &otre travail apporte donc de relles avances dans la comprhension des mcanismes dabsorption et dassimilation de lure chez les plantes. !e nombreuses %uestions restent cependant sans rponses lissue de ce travail@ ce %ui ouvre un vaste champ dinvesti'ations pour de futures recherches. 3orts de ces connaissances@ nous pourrons ainsi amliorer lefficacit dabsorption et dassimilation de lure chez les plantes@ et rhabiliter lure en tant %ue fertilisant azot@ dans un souci dune a'riculture durable@ moins co_teuse et plus respectueuse de lenvironnement.

T+

CHAPITRE I

Et d%" *i#c,i)i0 %" & ',1"i#!#.i0 %"(

I. &escriptif des e*traits marins.

rois extraits dal'ues marines ont t utiliss au cours de notre tude. 1es al'ues ont t rcoltes sur l#rchipel de $rhat (cAte nord bretonne@ 3rance. et prpares selon les process de fabrication de notre partenaire industriel@ la socit $iotech2arine@ une filiale du 'roupe Roullier base 5ontrieux (6Ates d#rmor@ ++.. 6hacun des trois extraits a t choisi pour sa composition chimi%ue particuli"re. I.A. )*trait !!!9. 6est un extrait dal'ues vertes (%l,a spp.. obtenu selon une mthode dextraction a%ueuse chaud. Il est essentiellement compos de polysaccharides@ et en particulier dacides uroni%ues et de sucres neutres %ui reprsentent respectivement *T et I0J des sucres totaux. 1activit licitrice de cet extrait a t caractrise@ pour la premi"re fois@ 'rQce une tude du transcriptome par macroarray chez !edicag* Truncatula (6luzet et al.@ +,,I.. 1expression de nombreux '"nes de dfense est induite suite la pulvrisation de lextrait dal'ue@ et cet extrait 'n"re aussi une protection accrue des plantes contre les atta%ues patho'"nes (6luzet et al.@ +,,I.. I.B. )*trait !"CD. 6et extrait a t obtenu par une hydrolyse a%ueuse en milieu alcalin dal'ues brunes. 6est un extrait auxini%ue@ dsi'n ainsi du fait de sa richesse en auxines estimes I+SL e' 1/*.

T0

I.$. )*trait @AE!.D. 6et extrait a t prpar partir dal'ues brunes selon une extraction a%ueuse en milieu acide et chaud. Il est riche en cyto>inines (MS,, n' 1/*..

II. )ffets des e*traits dalgues sur la croissance & le statut azot de la plante.
II.A. 7ise au point du dispositif e*primental de culture. &ous avons choisi la culture en hydroponie d#rabidopsis afin de tester leffet des extraits dal'ues sur les param"tres azots de la plante. 1es extraits dal'ues ont t apports aux plantes@ soit par pulvrisation foliaire@ soit ils ont t directement ajouts la solution nutritive. !es 'raines d#rabidopsis ont t semes puis cultives en conditions contrAles sur une solution nutritive contenant * m2 de &<4&:3 (Article 3). Le milieu de culture a t renouvel tous les deux jours. Aprs 35 jours de culture, les plantules ont t spares en deux lots. Des pulvrisations dextraits dalgue ont t ralises sur les feuilles des plantes de lun des lots (Article 3). Les trois extraits dalgue ont t tests, chacun deux concentrations diffrentes suivant les recommandations de BiotechMarine: 10 et 1% pour les extraits 1116 et NA9158; 1% et 1 pour lextrait 1208. 6ertaines plantes ont t pulvrises avec de leau@ et dautres nont subi aucune pulvrisation@ en terme de contrAles. #fin de faciliter labsorption@ un a'ent mouillant (4il9et. a t ajout aux solutions de pulvrisation une concentration finale de ,@,*J. 5our le second lot@ les diffrents extraits dal'ue ont t ajouts directement dans la solution nutritive une concentration de 1 (v, v). 1a solution nutritive a t renouvele tous les deux jours@ et lensemble des plantes a t rcolt au I+ i"me jour de culture. Racines et feuilles ont t spars@ pess@ puis con'els dans lazote li%uide afin dEtre analyss. 1es contenus en azote total@ en nitrate et en acides amins ont t mesurs afin de caractriser le statut azot des plantes selon le traitement impos. =ne seconde exprimentation ralise dans les mEmes conditions@ sest attache faire une tude cinti%ue de leffet des substances marines sur la croissance@ les param"tres azots et lexpression des '"nes chez #rabidopsis. 1es plantes ont t rcoltes une heure@ puis un@

TI

A 200 Poids frais racinaire en mg a 150 100 50 0 B Poids frais racinaire en mg Poids frais foliaire en mg 200 160 120 80 40
1/1 00e 1/1 00e 1/1 00e e H 2O np ulv ri s 1/1 0e 1/1 0e

a Poids frais foliaire en mg 600 b

400

c d

200

a b b b b b b b

600 400 200 0

e 1/1 000

No

EXT 1116

EXT NA9158

EXT 1208

NH4NO3

Figure 40. Distribution de le masse frache entre les racines et les feuilles des plantes aprs lapport des extrais dalgues directement dans la solution (A) ou par pulvrisation foliaire (B). Les plantes dArabidopsis ont t cultives pendant 35 jours en hydroponie sur un milieu contenant 1 mM NH4NO3. Les plantes ont alors t spares en 2 lots, puis 3 extraits dalgues ont t ajouts la solution nutritive (1), ou pulvriss sur les feuilles diffrentes concentrations. Les plantes sont rcoltes 42 jours, une semaine aprs lapport dalgues. Les valeurs sont des moyennes de 8 rptitions. Les diffrentes lettres correspondent aux groupes significativement diffrents P<0,05.

No

2O np ulv ri s

1/1 00e

1/1 00e

1/1 000

1/1 00e

1/1 0e

1/1 0e

trois et sept jours apr"s pulvrisation des extraits ***S (*,J.@ L*M- (*,J. et *+,- (*t.. Enfin@ nous avons rpt cette derni"re culture mais en la simplifiant. 4eul lextrait *+,- a t pulvris@ avec deux points de cinti%ue@ une heure et sept jours. 1es param"tres azots nont pas t mesurs lors de cette exprimentation. II.B. )ffets des e*traits dalgues sur la croissance et les paramtres azots des plantes. 1es plantes rpondent diffremment aux extraits dal'ues selon %uils soient ajouts directement dans la solution nutritive ou pulvriss sur la rosette (3i'ure I,.. 1ors%ue les extraits sont directement dilus dans le milieu de culture@ leffet sur la croissance des plantes est 'lobalement n'atif sauf pour lextrait &#L*M- (3i'ure I,#.. 1es plantes cultives sur lextrait *+,- taient extrEmement chtives (pourrissement de la racine.. 1a concentration utilise tait certainement trop forte pour cet extrait. En revanche@ %uel %ue soit le type dextrait et sa concentration@ peu de diffrences de croissance sont apparues entre les contrAles et les plantes pulvrises avec les extraits dal'ues. 6ependant lextrait *+,- utilis *t a conduit un effet de croissance positif sur lensemble de la plante et plus particuli"rement sur la racine (3i'ure I,$.. &ous navons toutefois observ aucune diffrence %uant laspect des racines entre ces plantes traites avec lextrait *+,- et les plantes tmoins. 6ompte tenu de la faible croissance des plantes nourries avec les extraits dal'ues apports en solution@ nous avons choisi deffectuer les analyses uni%uement sur les plantes soumises la pulvrisation des extrais dal'ues. #ucune diffrence du contenu en azote total nest apparue suite la pulvrisation des extraits ***S et *+,- (lazote total na pas t mesur pour la pulvrisation de lextrait &#L*M-. (3i'ure I*#.. !e mEme@ les concentrations en nitrate et en acides amins totaux ont peu vari suite aux pulvrisations (3i'ure I*$@ 6.. 1a pulvrisation avec lextrait ***S *J a toutefois entraNn une l'"re au'mentation de la concentration en nitrate dans les racines. 1ensemble de ces rsultats a t confirm lors de notre deuxime exprimentation (Figure 42A, B, et C).

TM

A N total en mmol g-1 MS racinaire 5 4,5 4 3,5 3 1/10e 1/100e 1/100e 1/1000e H2O Non pulvris N total en mmol g-1 MS foliaire 5,5

4,5

4 1/10e 1/100e 1/100e 1/1000e H2O

Non pulvris

B NO3- en mol g-1 MF racinaire NO3- en mol g-1 MF foliaire 160 120 80 40
1/1 00e 1/1 00e 1/1 00e e 1/1 000 e

40

20

1/1 00e

1/1 00e

1/1 00e

H 2O np ulv ri s

No

Acides amins en mol g-1 MF racinaire

20 15 10 5 0
1/1 0e

Acides amins en mol g-1 MF foliaire

20 15 10 5 0
1/1 0e

1/1 00e

1/1 00e

1/1 00e

H 2O np ulv ri s

1/1 00e

1/1 00e

1/1 00e

1/1 0e

No 1/1 0e 1/1 000 H

1/1 000

No

EXT 1116

EXT NA9158

EXT 1208

NH4NO3

Figure 41. Contenu en azote total (A), en nitrate (B) et en acides amins (C) dans les racines et les feuilles des plantes aprs la pulvrisation foliaire des extraits dalgues. Les plantes dArabidopsis ont t cultives pendant 35 jours en hydroponie sur un milieu contenant 1 mM NH4NO3. 3 extraits dalgue ont alors t pulvriss sur les feuilles des plantes diffrentes concentrations. Les plantes sont rcoltes 42 jours, une semaine aprs lapport dalgues. Les valeurs sont des moyennes de 5 rptitions.

No

np ulv

ri s

2O

2O np ulv ri s

0
1/1 0e

1/1 0e

1/1 0e

1/1 000

1/1 0e

II.$. $onclusions. 1absence deffets constats des extraits dal'ues sur la croissance et les param"tres azots de la plante a t un rsultat dcevant. 1extrait *+,- a toutefois retenu notre attention. 1apport de cet extrait par pulvrisation foliaire a montr un effet positif sur la croissance des plantes@ et en particulier au niveau de la racine. 6ette rponse phnotypi%ue de la plante nest certes pas si'nificative@ mais elle pourrait facilement sexpli%uer par la composition chimi%ue de lextrait al'al. 6elui/ci se caractrise par sa richesse en auxines@ phytohormones impli%ues dans linitiation des racines latrales chez #rabidopsis (6asimiro et al.@ +,,0.. 1e dveloppement des racines latrales est un dterminant majeur de larchitecture racinaire. Elles assurent non seulement lancra'e de la racine dans le sol@ mais elles contribuent aussi lefficacit dutilisation de leau par la plante de mEme %uelles facilitent lextraction des lments nutritifs du sol. 1architecture racinaire dtermine la surface dchan'e entre la racine et le sol@ et lutilisation de lextrait dal'ue *+,- sur les cultures montre ainsi toute son importance a'ronomi%ue. outefois@ cet effet de lextrait *+,- sur le dveloppement racinaire doit Etre confirm et demande davanta'e dtudes notamment en syst"me de boNtes verticales. Il serait aussi intressant de tester leffet de cet extrait dal'ue sur des plantes carences en azote@ dans lespoir dobtenir une rponse plus prononce. !urand et collaborateurs ont ainsi pu montrer %ue la stimulation de lactivit nitrate rductase est accrue lors%ue lextrait & 5R: est apport sur des plantes cultives en conditions limitantes de nitrate (!urand et al.@ +,,0..

TS

Poids frais racinaire en mg

Poids frais racinaire en mg

150 100 50 0 T0 T 1H T 1J T 3J T 7J

600 400 200 0 T0 T 1H T 1J T 3J T 7J

NO3- en mol g-1 MF racinaire

NO3- en mol g-1 MF foliaire

50 40 30 20 10 0 T0 T 1H T 1J T 3J T 7J

120

80

40

T0

T 1H

T 1J

T 3J

T 7J

Acides amins en mol g-1 MF racinaire

25 20 15 10 5 0 T0 T 1H T 1J T 3J T 7J

Acides amins en mol g-1 MF foliaire

40 30 20 10 0

T0

T 1H

T 1J

T 3J

T 7J

EXT 1116

EXT NA9158

EXT 1208

H2O

Figure 42. Distribution de la masse frache (A) et contenu en nitrate (B) et en acides amins (C) dans les racines et les feuilles des plantes aprs la pulvrisation foliaire des extraits dalgues. Les plantes dArabidopsis ont t cultives pendant 35 jours en hydroponie sur un milieu contenant 1 mM NH4NO3. Les extraits dalgues 1116, NA9158 et 1208 ont alors t pulvriss sur les feuilles, respectivement une concentration de 10%, 10% et 1. Les plantes sont rcoltes 42 jours, une semaine aprs lapport dalgues. Les valeurs sont des moyennes de 3 rptitions.

CHAPITRE II

Et d%" t&a$"c&i't#)i0 %"(

2Eme si notre tude physiolo'i%ue sur les effets dune pulvrisation foliaire de trois extraits dal'ues sur la croissance et le mtabolisme v'tal@ na pas rvl des effets forts@ les substances marines sont reconnues pour leur intrEt a'ronomi%ue. 6ependant les voies de si'nalisation des substances al'ales sont encore tr"s obscures. 1utilisation des nouveaux outils de biolo'ie molculaires comme les puces #!&@ est apparue comme la meilleure approche afin daborder ce probl"me. 1e caract"re systmi%ue de lapproche transcriptome nous permet ainsi douvrir au maximum les champs dinvesti'ation sur les modalits daction des substances marines. !ans le but didentifier les '"nes dont lexpression est module en rponse la pulvrisation foliaire de substances marines@ nous avons utilis deux types de puces #!&. &ous avons@ dune part@ rassembl sur une membrane macroarray des sondes correspondant aux '"nes clefs des mtabolismes azot et carbon. !autre part@ afin dlar'ir les donnes de transcriptome@ nous avons utilis la puce
6# 2#

(voir 5artie I.. 4eul lextrait al'al ayant

montr un effet positif sur la croissance des plantes a t tudi au niveau molculaire@ savoir lextrait *+,-. Il sera dsi'n par labrviation #E (Extrait #uxini%ue. dans la suite du manuscrit.

I. 7ise au point dun filtre macroarra3.

1es membranes sont@ parmi les trois types essentiels de puces (membranes@ lames de verre@ et 'enechips (#ffimtrix..@ les outils les plus accessibles dans la plupart des laboratoires de biolo'ie molculaire. &ous avons choisi de construire notre propre membrane ddie aux '"nes clefs des mtabolisme azot et carbon@ afin dtudier les ventuelles interactions entre la transcription de ces '"nes et la prsence dextraits dal'ues.

TT

Tableau 5. Gnes spotts sur la membrane macroarray.

1 A 14-3-3-like Ca2+ dep protein kinase APS reductase pyruvate kinase MAP2K5alpha ICDH nicotianamine synthase IDH1 2 sulfite reductase 3 Fd-GOGAT microbody NAD-dep malate dehydrogenase RING zinc finger prot beta fructosidase 4 NaCl-inducible Ca2+ binding prot homologue gne induit par nitrate ATHB12 MADS-box transcription factor AGL18 4 putative hexose transporter MSS1 5 ADP-GPP 6 GLU2 7 PEPC1 Unknown Prot contains 2 kelch motifs Na+/H+ exchanging protein serine acetyltransferase UDP-GPP delta tonoplast protein glutamine-dep ASN1 rgulation aluminium/auxine 8 Putative protein/hypothetical protein GASA2 9 ARR6 salt-stress induced gamma TIP GAI phosphogluconate deshydrogenase NOI (gne induit par le nitrate) Lipase CLC-a Monooxygenase 2 MO2 10 anhydrase carbonique 11 chalcone synthase 12 Nrt2.4

pyruvate kinase

leucine zipper HBP-1B-like transporteur sucre

ICDH

PR proteine

Fd-Nitrite Reductase

Nrt2.5

C D E F G H

IDH2 AMP-binding protein serine acetyltransferase 2 mitochondrial citrate synthase CAB Protein 4 precursor homolog lectine

UDP-GPP PIP3 anhydrase carbonique histidine decarboxylase NR1 P2

NADH-GOGAT PEPC

beta-1,3 glucanase HXK2

noduline GASA3 proline oxidase Arginosuccinate synthase leucine-rich repeat protein isocitrate lyase

G6P deshydrogenase SUC1 GST ABRE (bZIP) transporteur phosphate SAG29

Nrt1.1 GS1 AMT1 N2R15 Nrt2.1 Nrt2.3

Nrt2.6 Nrt2.7 GS2 AtHVA22blike protein Tmoin + Apt Tmoin pKS

Cyclopropane fatty ferredoxin-NADP acyl Phospholipide Reductase synthase GDH2 pyrroline carboxylate reductase T5r ketol-acid reductoisomerase transketolase DEF PEPC3 GDH2

I.A. Le choi* des gnes.

1a liste des LS '"nes %ue nous avons choisi de dposer sur le filtre a t dfinie par lensemble des membres du laboratoire. &ous avons fait appel chacun dentre eux afin %uils rpertorient les principaux '"nes du mtabolisme azot et carbon %uils souhaiteraient voir apparaNtre sur la membrane. &ous avons runi lensemble de leurs propositions@ fait un tri et slectionn LS '"nes. 6eux/ci sont lists dans le ableau M@ en fonction de leur position sur le filtre. I.B. La prparation du filtre A mo3enne densit. 5our la ralisation de notre projet puce #!&@ nous avons utilis une ban%ue de clones c!&# d#rabidopsis (+T pla%ues de 0-I puits contenant L-TT E4 s et S,,, '"nes. fournis par l=nit de Recherche en ;nomi%ue C'tale dEvry (collaboration avec 5ierre <ilson.. 1ensemble des +T pla%ues de 0-I puits a t dupli%u afin davoir une rpli%ue de secours en cas de probl"me. 5our cela@ toutes les colonies ont t repi%ues manuellement une une laide de cAnes pour pipette striles dans du milieu +/h contenant de lampicilline (*M, e' m1/*. et *,J de 'lycrol@ raison de M, e1 de milieu de culture par puits. 1es colonies repi%ues sont alors incubes une nuit 0T^6 puis conserves r -,^6. =ne autre tape du travail de prparation a consist faire une recherche informati%ue afin dassi'ner une E4 (Expressed 4e%uence a'. chacun des '"nes choisis pour fi'urer sur le filtre. 1es s%uences des LS '"nes candidats proviennent des bases de donnes publi%ues. 6es s%uences ont t utilises pour rechercher les E4 s correspondantes 'rQce au pro'ramme $1#4 & (#ltschul et al.@ *LLT. contre les bases de donnes E4 chez Arabid*psis thaliana@ disponibles au &6$I (http?WW999.ncbi.nlm.nih.'ovW$1#4 W.. !es recherches #IR complmentaires dE4 s correspondantes aux '"nes dintrEt ont t effectues sur (http?WW999.arabidopsis.or'Windex.jsp.. &ous avons ensuite recherch les E4 s correspondantes dans le fichier dcrivant lensemble des colonies bactriennes rassembles en pla%ues 0-I puits (=R;C@ Evry.. 1a position des clones dintrEt ayant t identifie sur lensemble des +T pla%ues de 0-I puits@ ceux/ci ont t repi%us sur une pla%ue LS puits@ incubs une nuit 0T^6 et conservs r -,^6. 1es produits de 56R correspondant aux #!&c ont t amplifis partir dune culture bactrienne 'rQce aux amorces universelles 2*0 sens et reverse (LI^6 M min@ puis LI^6 0,

T-

sec@ MM^6 IM sec@ T+^6 +@0, min pour I, cycles@ et un dernier cycle T+^6 *M min.@ puis purifis sur filtres 2icroconn/56R. 6ha%ue produit de 56R a t examin sur un 'el da'arose et valid uni%uement si une seule bande claire et de taille attendue tait observe. 1e dpAt sur 'el nous a aussi permis une estimation de la concentration du produit de 56R. 1ensemble des LS clones a t s%uenc par la socit Euro'entec@ le s%uenXa'e ayant t amorc du cAt 0 par loli'onuclotide reverse 2*0. 1a %ualit des s%uences a t confirme par lestimation du nombre total de nuclotides indtermins infrieur ,@*J. 1es s%uences ont alors t analyses et compares aux E4 s 'rQce au pro'ramme $estfit sur le lo'iciel du ;6; (;enetics 6omputers ;roup@ 8isconsin@ =4#. mais aussi en utilisant le pro'ramme $1#4 & (http?WW999.ncbi.nlm.nih.'ovW$1#4 W.. I.$. Le spotting. 1a concentration des produits de 56R purifis a t ajuste autour de *,, n' e1/*@ puis ceux/ ci ont t rassembls dans une pla%ue LS puits en attendant le dpAt sur membrane. 1es #!&c ont t dposs sur des membranes de nylon <ybond 2/&K - ) *+ cm (#mersham. puis fixs aux =C. 1e dpAt a t ralis par un robot Z$ot (;enetix. en collaboration avec 3ranXois 5iumi sur le site du 6R$ ;#!IE (6entre de Ressources $iolo'i%ues ;nomi%ue des #nimaux !omesti%ues et dGIntrEt Economi%ue. localis sur le site de `ouy en `osas. 5our cha%ue clone@ le dpAt a t dupli%u afin dapporter un lment de contrAle supplmentaire au moment de lanalyse des rsultats dhybridation. 1a %ualit du dpAt a t vrifie par le 6R$ en utilisant comme sonde un pool dune dizaine de produits de 56R choisis parmi ceux dposs sur la membrane. 6ette dmarche contrAle %ualit a permis de vrifier le schma de dpAt@ la prsence dun si'nal pour cha%ue spot dpos@ la forme et laspect des spots ainsi %ue la reproductibilit des dpAts. 6ent copies de ce filtre thmati%ue ['"nes du mtabolisme azot et carbon ont ainsi vu le jour@ ce nombre important se justifiant par la ncessit de reproduire au maximum les expriences@ mais aussi pour une utilisation plus 'nrale du filtre par lensemble des membres du laboratoire. I.&. Les h3bridations diffrentielles. 1es profils compars sont obtenus par hybridation avec des sondes complexes synthtises partir d#R&s prleves sur des plantes traites ou non. 1es %uantits d#R&s servant de TL

A. H2O 1H

B. AE 1H

C. H2O 7J

D. AE 7J

Tmoin positif Apt: gne constitutif chez Arabidopsis Figure 43. Rvlation de la membrane macroarray au PhosphorImager. Les plantes sont cultives en hydroponie pendant 35 jours sur une solution nutritive contenant 1 mM de NH4NO3. Les rosettes des plantes sont alors pulvrises avec un extrait dalgue (AE) ou de leau. Les plantes sont rcoltes une heure (1H) et sept jours (7J) aprs le spray. Les ARNs totaux sont extraits de la partie arienne des plantes, rverse transcrits et marqus au 33P, puis hybrids sur la membrane pendant une nuit. Une paire de points reprsente un gne, chaque gne tant spott en doublon.

matrice pour synthtiser les #!&c mar%us au \/d6 500 sont importantes (M, e'. et ncessitent M, e6i de radiolment. #ussi ces expriences demandent/elles beaucoup de matriel et nous avons t contraints de travailler uni%uement sur du matriel foliaire. 1e protocole suivi a t le suivant. out dabord les #R&s issus de la partie feuille ont t extraits soit au phnol chaud@ soit au trizol@ ce %ui nous permettait davoir un bon rendement dextraction avec des #R&s de %ualit. 1es sondes ont t prpares par reverse transcription@ en prsence dun \/005 d6 5 et de M, e' d#R&s totaux. 1incorporation des radionuclotides a t vrifi sur un compteur radioactivit (8allac@ type *I*,@ 5er>in/ Elmer.. 4uite la prhybridation des membranes (I h.@ celles/ci ont t hybrides avec la sonde une nuit I+^6 dans un tampon 6hurch (6hurch R ;ilbert@ *L-I.. 5uis les membranes sont laves comme il a dj t dcrit par !ivol et collaborateurs (+,,M.. 1es filtres ont t exposs sur cran au minimum *S h et les si'naux radioactifs de cha%ue hybridation sont lus et retranscrits en ima'e par un 5hosphorIma'er 31# M,,, (3uji.. 1es intensits des si'naux dhybridation ont t %uantifies en utilisant le lo'iciel 2ulti ;au'e C+.+ (3uji.. =ne 'rille prdfinie de LS spots permet le calcul des intensits de cha%ue spot par rapport au tmoin positif@ ainsi %ue la comparaison de ces intensits entre deux membranes. I.). Les rsultats. !evant lextrEme variabilit des rsultats dhybridation@ nous ne dvelopperons pas cette partie. outefois la 3i'ure I0 illustre le type de rsultats %ue lon a pu obtenir avec la membrane macroarray. 6omme nous le voyons sur cette fi'ure@ lexploitation des filtres na pas t limite ni par la %ualit@ ni par la reproductibilit du dpAt. 1es principales difficults aux%uelles nous avons t confrontes ont plutAt concern la normalisation de nos donnes dhybridation@ tape clef de lanalyse dima'e. En effet pour pouvoir comparer les rsultats dhybridation entre eux@ il faut saffranchir des diffrences de dpAt entre les membranes@ mais 'alement des diffrences de mar%ua'e des diverses sondes complexes. 1e si'nal dhybridation nest pas strictement %uantitatif puis%ue les %uantits d#!& dposes nont pas t compl"tement homo'nises (concentration moyenne de *,, n' e1/*.. :r@ %uantit d#!& dpose et si'nal dhybridation ne sont pas toujours relis linairement (!esprez et al.@ *LL-.. 6est le cas lors%ue de faibles %uantits d#!& sont dposes (limite de sensibilit de dtection.@ ou lors%ue ces %uantits sont trop importantes (limite de saturation du si'nal.. #insi est/il impossible de rapporter le si'nal dhybridation la %uantit dpose pour la

-,

normalisation des si'naux. !e plus le lo'iciel danalyse dima'e 2ulti ;au'e C+.+ (3uji. ntait pas un outil assez puissant pour la normalisation de nos ima'es. Enfin une analyse statisti%ue de variance aurait t ncessaire afin de dterminer les '"nes dont la dr'ulation tait si'nificative. &ous avons donc choisi dabandonner ces analyses de transcriptome chelle rduite@ pour passer lanalyse compl"te du 'nome d#rabidopsis 'rQce la puce microarray dal'ues brunes riche en auxines@ sont dcrites dans l#rticle 0 ci/apr"s.
6# 2#.

6es

analyses du transcriptome d#rabidopsis en rponse une pulvrisation foliaire dun extrait

II. Article + = 6ene e*pression profiling of Arabidopsis thaliana in response to an au*in=rich bro>n algae e*tract =
6et article dcrit la premi"re tude ( notre connaissance. du transcriptome d#rabidopsis en rponse la pulvrisation foliaire dun extrait dal'ues brunes riche en auxines. &ous avons ainsi identifi toute une batterie de '"nes impli%us dans la transduction de diffrents si'naux hormonaux au cmur de la plante@ ainsi %ue dans la mise en place des mcanismes de dfense chez la plante.

-*

Tableau 6. Liste des gnes diffrentiellement exprims dans les parties ariennes d'Arabidopsis une heure et sept jours aprs pulvrisation foliaire de l'extrait d'algue. Sont indiqus: les numros CATMA et AGI de chaque gne. La fonction assigne chaque gne a t dsigne selon le "TIGR Arabidopsis gene index" (Release 5, January 2004). Un ratio positif indique que le gne est sur-exprim en rponse l'extrait d'algue (cases rouges); un ratio ngatif indique que le gne est sous-exprim en rponse l'extrait d'algue (cases vertes). Les P-values ont t corriges selon Bonferroni. Les gnes sont considrs comme diffrentiellement exprim pour une P-value < 0,05. FEUILLE 1 heure CATMA Number At Number CATMA1A18400 CATMA1A26550 CATMA2A21020 CATMA2A24855 CATMA3A01430 CATMA3A50440 CATMA4A01260 AT1G19380 AT1G28370 AT2G22500 AT2G26530 AT3G02480 AT3G57450 AT4G01080 Putative Gene ID expressed protein ERF domain protein 11 (ERF11) mitochondrial substrate carrier family protein expressed protein ABA-responsive protein-related expressed protein expressed protein 2-dehydro-3-deoxyphosphoheptonate aldolase 1 / 3-deoxy-D-arabinoheptulosonate 7-phosphate synthase 1 / DAHP synthetase 1 (DHS1) expressed protein expressed protein beta-amylase, putative (BMY3) / 1,4-alpha-D-glucan maltohydrolase, putative ChaC-like family protein male sterility MS5 family protein FEUILLE 7 jours P-Value2 2,72E-9 1,65E-7 0,00E+0 6,99E-3 5,39E-9 1,39E-2 6,99E-4 1,13E-4 5,99E-9 3,38E-3 0,00E+0 1,79E-2 1,91E-10

log2 ratio1 P-Value1 log2 ratio2 1,06 2,46E-7 -1,27 0,75 3,68E-2 -1,18 0,76 3,29E-2 -1,48 1,01 2,89E-6 -0,88 -0,75 4,19E-2 -1,26 0,88 4,44E-4 -0,86 1,33 0,00E+0 0,95 1,02 1,43 0,81 -1,39 0,84 1,05 1,35E-6 0,00E+0 4,64E-3 0,00E+0 1,87E-3 4,12E-7 1,00 -1,25 -0,90 -1,56 -0,85 -1,33

CATMA4A41393 AT4G39980 CATMA5A02320 CATMA5A15740 CATMA5A17020 CATMA5A23890 CATMA5A44770 AT5G03210 AT5G17460 AT5G18670 AT5G26220 AT5G48850

Tableau 7. Liste des gnes diffrentiellement exprims dans les racines d'Arabidopsis une heure et sept jours aprs pulvrisation foliaire de l'extrait d'algue. Sont indiqus: les numros CATMA et AGI de chaque gne. La fonction assigne chaque gne a t dsigne selon le "TIGR Arabidopsis gene index" (Release 5, January 2004). Un ratio positif indique que le gne est sur-exprim en rponse l'extrait d'algue (cases rouges); un ratio ngatif indique que le gne est sous-exprim en rponse l'extrait d'algue (cases vertes). Les P-values ont t corriges selon Bonferroni. Les gnes sont considrs comme diffrentiellement exprim pour une P-value < 0,05. CATMA Number At Number CATMA1A06190 CATMA1A17310 CATMA1A25965 CATMA1A26690 CATMA1A31210 CATMA1A33350 CATMA1A70060 CATMA2A21360 CATMA2A24855 CATMA2A38220 CATMA2A43300 CATMA3A08930 CATMA3A09980 CATMA3A22775 CATMA3A23245 CATMA3A43940 CATMA3A54340 CATMA4A13560 CATMA4A29280 CATMA4A38060 CATMA5A39860 CATMA5A43205 CATMA5A44770 CATMA5A47120 CATMA5A50340 CATMA5A57200 AT1G07135 AT1G18300 AT1G27730 AT1G28480 AT1G32920 AT1G35210 AT1G80840 AT2G22880 AT2G26530 AT2G40000 AT2G44840 AT3G10040 AT3G10930 AT3G22840 AT3G23250 AT3G50930 AT3G61190 AT4E13260 AT4G27652 AT4G36500 AT5G44110 AT5G47220 AT5G48850 AT5G51190 AT5G54490 AT5G61600 Putative Gene ID RACINE 1 heure RACINE 7 jours P-Value2 0,00E+0 0,00E+0 0,00E+0 1,92E-4 0,00E+0 0,00E+0 1,36E-5 2,00E-2 0,00E+0 0,00E+0 1,80E-10 0,00E+0 0,00E+0 4,82E-2 0,00E+0 1,01E-7 0,00E+0 8,43E-11 8,43E-11 2,76E-4 2,57E-2 2,49E-6 4,08E-2 0,00E+0 9,85E-6 0,00E+0

log2 ratio1 P-Value1 log2 ratio2 glycine-rich protein 0,84 3,59E-4 -2,09 MutT/nudix family protein 0,77 6,44E-3 -2,43 zinc finger (C2H2 type) family protein (ZAT10) / salt-tolerance zinc finger protein (STZ) 1,02 1,76E-7 -2,17 glutaredoxin family protein 0,80 1,58E-3 -1,32 expressed protein 0,76 6,82E-3 -2,07 expressed protein 0,82 8,91E-4 -2,06 WRKY family transcription factor 0,71 4,40E-2 -1,42 VQ motif-containing protein 0,90 3,00E-5 -1,13 expressed protein 1,19 2,80E-11 -2,17 expressed protein 0,93 1,11E-5 -2,83 ethylene-responsive element-binding protein, putative 1,08 1,07E-8 -1,78 expressed protein 1,08 8,31E-9 -2,20 expressed protein 1,03 1,16E-7 -2,15 chlorophyll A-B binding family protein / early light-induced protein (ELIP) -0,80 2,24E-3 1,09 myb family transcription factor (MYB15) 1,58 0,00E+0 -2,56 AAA-type ATPase family protein 1,09 4,84E-9 -1,58 BON1-associated protein 1 (BAP1) 0,90 3,07E-5 -2,31 eugene prediction 0,77 6,24E-3 -1,80 expressed protein 1,14 4,71E-10 -1,80 expressed protein 0,85 3,28E-4 -1,30 ABC transporter family protein -1,03 9,04E-8 1,12 ethylene-responsive element-binding factor 2 (ERF2) 0,71 4,33E-2 -1,48 male sterility MS5 family protein -1,41 0,00E+0 1,09 AP2 domain-containing transcription factor, putative 1,08 1,09E-8 -2,25 calcium-binding EF-hand protein, putative 0,79 3,00E-3 -1,43 ethylene-responsive element-binding family protein 0,96 2,64E-6 -2,68

III. #sultats complmentaires A lanal3se gnomi'ue globale en rponse A lapplication foliaire de le*trait dalgues chez Arabidopsis.
!ans l#rticle 0@ nous avons tabli la liste des '"nes diffrentiellement exprims la fois dans les racines et dans la partie feuille@ une heure et sept jours apr"s avoir pulvris les rosettes d#rabidopsis avec un extrait dal'ue riche en auxines (#E. concentr *t. &ous avons aussi cherch identifier les '"nes dont la transcription est module par lapport de #E aux temps * heure et T jours@ et ceci dans chacun des deux or'anes de la plante@ racines ou feuilles. 6es '"nes sont lists dans les ableaux S et T. reize et +S '"nes sont diffrentiellement exprims respectivement dans les parties arienne et racinaire. Except 0 '"nes foliaires %ui rpondent de la mEme faXon@ la fois aux points * heure et T jours ( ableau S.@ les '"nes induits * heure sont rprims T jours et inversement@ %uel%ue soit lor'ane v'tal considr ( ableaux S et T.. 5armi ces 0 '"nes@ + sont induits une heure et T jours apr"s le traitement al'al. 1un code pour une protine inconnue (# I;,*,-,.@ le '"ne &'(1 code pour une 0/deoxy/!/arabinoheptulosonate/T/phosphate synthase@ une enzyme %ui catalyse la premi"re raction de la biosynth"se des acides amins aromati%ues (Feith et al.@ *LL*.. 6hez les plantes@ les acides amins aromati%ues sont les prcurseurs de mtabolites secondaires varis@ parmi les%uels les li'nines@ les anthocyanes@ les auxines@ ou les phytoalexines (Feith et al.@ *LL*.. 6es composs interviennent dans de nombreux processus comme le contrAle de la croissance (auxines.@ le maintien de la plante et le contrAle des flux deau (li'nines.@ ou encore la rsistance aux atta%ues extrieures (phytoalexines.. 1e '"ne &'(1 est induit en rponse une blessure physi%ue@ lacide jasmoni%ue (2c6onn et al.@ *LLT.@ ou une atta%ue patho'"ne (Feith et al.@ *LL*.. 1e profil dexpression du '"ne &'(1 rvl par notre analyse transcriptome est ainsi en accord avec lorientation de la rponse v'tale l#E vers les processus de dfense %ue nous avons mise en vidence dans l#rticle 0. &ous retrouvons aussi dans ces ableaux S et T@ diffrents facteurs de rponse lthyl"ne (ER3. (#rticle 0.. 1a reprsentation visuelle de nos donnes de transcriptome laide du lo'iciel
2#52#&

nous

am"ne aux mEmes conclusions (3i'ures II et IM.? de nombreux '"nes lis aux processus de si'nalisation sont activs en rponse la pulvrisation foliaire de lextrait dal'ue. 1a rponse rapide de la plante (* heure. fait intervenir lactivation de nombreux '"nes lis la si'nalisation par les hormones (auxine@ thyl"ne@ acide jasmoni%ue.@ ainsi %uau stress (3i'ures II# et IM#.. 6elle/ci disparaNt T jours@ et les voies de si'nalisation hormonale et de -+

A. Profil dexpression 1 heure aprs la pulvrisation de lextrait dalgue.

B. Profil dexpression 7 jours aprs la pulvrisation de lextrait dalgue.

Figure 44. Vue densemble de la rgulation par lextrait dalgues des gnes lis aux processus de signalisation dans la feuille. Les ARNs ont t extraits sur des rosettes dArabidopsis de 35 et 42 jours. Les plantes sont cultives en hydroponie pendant 35 jours sur une solution nutritive contenant 1 mM de NH4NO3. Lextrait dalgues (AE) a alors t pulvris sur les feuilles une concentration de 1. Une partie des plantes est rcolte 1 heure aprs le traitement algal (A., diagrammes de gauche), lautre 7 jours aprs (B., diagrammes de droite). Un carr reprsente un gne. Le carr est bleu si le gne est induit, et rouge sil est rprim en rponse lAE. Classification MAPMAN (Thimm et al., 2004); P-value<0,05.

rponse au stress sont plutAt rprimes@ comme en tmoi'ne la prpondrance de la couleur rou'e sur les 3i'ures II$ et IM$. &otre comparaison entre une plante pulvrise avec lextrait dal'ue et avec de leau@ nous permet de dire %ue cet arsenal de ractions de dfense mis en place par la plante en rponse la pulvrisation de lextrait dal'ues est spcifi%ue lextrait dal'ue lui/mEme@ et nest pas d_ un stress inhrent la techni%ue de pulvrisation.

-0

A. Profil dexpression 1 heure aprs la pulvrisation de lextrait dalgue.

B. Profil dexpression 7 jours aprs la pulvrisation de lextrait dalgue.

Figure 45. Vue densemble de la rgulation par lextrait dalgues des gnes lis aux processus de signalisation dans la racine. Les ARNs ont t extraits sur des racines dArabidopsis de 35 et 42 jours. Les plantes sont cultives en hydroponie pendant 35 jours sur une solution nutritive contenant 1 mM de NH4NO3. Lextrait dalgues (AE) a alors t pulvris sur les feuilles une concentration de 1. Une partie des plantes est rcolte 1 heure aprs le traitement algal (A., diagrammes de gauche), lautre 7 jours aprs (B., diagrammes de droite). Un carr reprsente un gne. Le carr est bleu si le gne est induit, et rouge sil est rprim en rponse lAE. Classification MAPMAN (Thimm et al., 2004); P-value<0,05.

CONCLUSION GENERALE

Et d% d% !%ff%t d $ %/t&ait da!. % &ic,% %$ a /i$% c,%+ A&a*id#'"i" 2 a"'%ct" ',1"i#!#.i0 %" %t )#!c !ai&%"(
&otre travail sest attach mieux comprendre les mcanismes mis en jeu par #rabidopsis en rponse la pulvrisation foliaire dextraits dal'ues marines. &ous avons tout dabord tudi les rponses de la plante en terme de dveloppement@ mais aussi les rponses mtaboli%ues et en particulier celles lies lazote. &ous avons alors ax notre travail sur les effets de la fertilisation foliaire avec un extrait dal'ue particuli"rement riche en auxine (#E.. 5our cela nous avons entrepris la caractrisation des rponses de la plante au niveau molculaire par une approche 'lobale du transcriptome d#rabidopsis. 6es expriences nous ont permis de mettre en vidence une rponse rapide de la plante lapplication de l#E@ oriente vers les mcanismes de dfense et la si'nalisation hormonale. &ous avons test les effets de la pulvrisation foliaire@ ainsi %ue dun apport direct dans la solution de culture de trois extraits dal'ues@ mais aucun phnotype particulier na t observ chez les plantes traites par rapport aux plantes non traites. !e mEme les mesures des diffrents param"tres azots dfinissant le statut azot de la plante nont pas rvl de diffrences. !evant ces absences de rponses physiolo'i%ues@ il nous fallait une mthode pour accder aux rseaux de r'ulation les plus fins@ au cmur de la cellule v'tale. 1analyse de lexpression des '"nes en rponse la pulvrisation de l#E laide des puces #!& nous a sembl lapproche la plus approprie. 6ette approche systmati%ue nous a ainsi permis de navoir aucun a priori sur le type de rsultats obtenus@ et douvrir au maximum les champs dinvesti'ation sur les applications des substances marines. &otre analyse du transcriptome d#rabidopsis nous a permis didentifier les '"nes cibles de lextrait dal'ue au cmur de la cellule v'tale. 1es auxines apportes par lextrait dal'ue sont vraisemblablement impli%ues dans les mcanismes de dfense et dadaptation mobiliss par la plante. 6ependant

-I

dautres phytohormones al'ales semblent aussi participer ces effets. Reste dsormais poursuivre les recherches afin de@ non seulement@ mieux comprendre le mode daction des auxines@ mais aussi identifier les autres molcules al'ales biolo'i%uement actives.

-M

CONCLUSIONS & PERSPECTIVES

U&%3 " *"ta$c%" )a&i$%"3 a+#t% & a.&ic !t &%(

&ous lavons dj vo%u? lure est une source dazote peu exploite par les a'riculteurs franXais. =n apport dure sur les cultures est effectivement moins efficace %ue la fertilisation plus traditionnelle avec du nitrate et de lammonium. 6ependant nous pouvons esprer %ue ce travail am"ne reconsidrer lure comme une source dazote attractive@ et en particulier pour une utilisation combine avec lammonium nitrate. En effet@ nous avons montr %ue dans ce cas@ la croissance des plantes tait comparable avec celle des plantes ayant reXu un apport dammonium nitrate. En outre la prsence dure permet une rduction de la teneur en nitrate dans la plante. &otre analyse transcriptomi%ue a aussi mis en vidence des adaptations du mtabolisme v'tal intressantes@ et en particulier concernant le mtabolisme des acides amins@ et donc la %ualit nutritive de la plante. #insi@ dans un souci dune a'riculture durable@ moins onreuse et respectueuse de lenvironnement@ lure pourrait avoir toute sa place. 1es al'ues sont une autre ressource naturelle de phyto/nutriments@ 'alement peu exploite en a'riculture@ notamment faute de connaissances sur leurs modalits daction sur la plante. 1tude de lefficacit de ces substances marines sur les cultures bnficie aujourdhui des derni"res avances technolo'i%ues comme la 'nomi%ue. 1es potentialits des nouvelles technolo'ies dtude des '"nes permettent desprer lidentification de nouvelles cibles au cmur du mtabolisme du v'tal. 6est dans cet objectif %ue nous avons entrepris une analyse 'lobale du transcriptome d#rabidopsis en rponse la pulvrisation dun extrait dal'ues brunes. 1e travail doit se poursuivre non seulement afin de mieux comprendre le rseau de si'nalisation mis en place par la plante en rponse lextrait dal'ue tudi@ mais aussi pour identifier les autres molcules biolo'i%uement actives contenues dans lextrait marin. &ous envisa'eons aussi de comparer les rponses de la plante aux substances marines avec celles obtenues avec des hormones synthti%ues (auxine@ cyto>inine@ ].. &ous pourrions ainsi identifier les molcules responsables des effets des substances marines.

-S

# lissue de cette valuation biolo'i%ue@ les molcules les plus prometteuses@ candidates aux nouvelles 'nrations de produits destins lamlioration de la nutrition et de la sant v'tales@ pourront %uitter le laboratoire pour tester leur efficacit au champ@ sur les 'randes cultures (comme les crales@ les prota'ineux.@ la vi'ne@ les cultures fruiti"res@ les cultures fourra'"res@ maraNch"res et horticoles@ et les cultures tropicales. 6es phyto/nutriments naturels@ fort de leur exprience du monde marin@ pourront renforcer la performance des v'taux terrestres et rpondre ainsi aux attentes en mati"re de productivit@ de %ualit et de respect de lenvironnement. Enfin@ lors%ue nos connaissances sur lutilisation de lure par les plantes ainsi %ue sur les modalits daction des substances marines seront mieux tablies@ nous pourrons envisa'er ltude des interactions entre les diffrentes sources dazote (ure@ nitrate et ammonium. et les phytohormones marines. 1es rponses de la plante soumise une nutrition sous forme ure@ nitrate ou ammonium seront analyses suite lajout de diffrentes substances marines@ soit au niveau de la feuille@ soit au niveau de la racine.

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Abe .4 U*7i-a&a M4 Sato R (*LT+. Isolation and identification of native auxins in marine al'ae. #'ric $iol 6hem $(? ++ML/++S, Abe .4 U*7i-a&a M4 Sato R (*LTI. Isolation of phenyl acetic acid and its p/hydroxy derivative as auxin/li>e substances from =ndaria pinnatifida. #'r $iol 6hem $A? -LT/-LAbet? P (*L-,. 4ea9eed extracts? have they a place in #ustralian a'riculture or horticultures ` #ust Inst #'ric 4ci B(? +0/+L AitCen D04 Sern TL (*LSM. 4ea9eed products as a fertilizer and soil conditioner for horticultural crops. $ot 2ar A? *II/*IAloni R4 Aloni E4 Lang7an! M4 Ullri*7 CI (+,,S. Role of cyto>inin and auxin in shapin' root architecture? re'ulatin' vascular differentiation@ lateral root initiation@ root apical dominance and root 'ravitropism. #nn $ot EF(M.? --0/-L0 Alt!*7ul S14 Madden TL4 S*7a::er AA4 G7ang D4 G7ang G4 Miller +4 Li"&an DD (*LLT. ;apped $1#4 and 54I/$1#4 ? a ne9 'eneration of protein database search pro'rams. &ucleic #cids Res #H(*T.? 00-L/00I,+ Aubert S4 0lign- R4 Dou*e R4 Gout E4 Rat*li::e RG4 Robert! DI (+,,*. 6ontribution of 'lutamate dehydro'enase to mitochondrial 'lutamate metabolism studied by (*0.6 and (0*.5 nuclear ma'netic resonance. ` Exp $ot H#(0MI.? 0T/IM Augier . (*LTSa. 1es hormones des al'ues. Etat actuel des connaissances I. Recherche et tentative didentification des auxines. $ot 2ar JE? *+T/*I0 Augier . (*LTSb. 1es hormones des al'ues. Etat actuel des connaissances II. Recherche et tentatives didentification des 'ibbbrellines@ des cyto>inines et diverses autres substances de nature hormonale. $ot 2ar JE? +IM/+MI A?i? A4 Poin!!ot 04 Daire /4 Adrian M4 0e?ier A4 La&bert 04 Doubert DM4 Pugin A (+,,0. 1aminarin elicits defence responses in 'rapevine and induces protection a'ainst $otrytis cinerea and 5lasmopara viticola. 2ol. 5lant 2icrobe In J(? ***-/**+0a*ana&Ko M4 +itte CP4 Lubber! M+4 Pola**o DC (+,,+. #ctivation of the urease of 4chizosaccharomyces pombe by the =re3 accessory protein from soybean. 2ol ;enet ;enomics #(A? M+M/M0I 0e*Cett RP4 %an Staden D (*L-L. he effect of sea9eed concentrate on the 'ro9th and yield of potassium stressed 9heat. 5lant 4oil JJ(? +L/0S 0e*Cett RP4 %an Staden D (*LL,a. he effect of sea9eed concentrate on the yield of nutrient stressed 9heat. $ot 2ar $$? *IT/*M+ 0e*Cett RP4 %an Staden D (*LL,b. he effect of sea9eed concentrate on the upta>e of foliar applied 6u@ 2n and Yn by tomato seedlin's. 4 #fric ` $ot H(? 0-L/0L+ 0enini S4 R-"nieK!C- +R4 +il!on IS4 CiurliS4 Mangani S (+,,*. 4tucture/based rationalization of urease inhibition by phosphate? novel insi'hts into the enzyme mechanism. ` $iol Inor' 6hem (? TT-/TL, 0ernart M4 GerKi*C +. (*LL,. 0(hydroxyacetyl.indole@ a plant 'ro9th re'ulator from the :re'on red al'a )ri*nitis lance*lata. 5hytocemistry #E? 0SLT/0SL0ern7ard +R64 Matile P (*LLI. !ifferential expression of 'lutamine synthetase 'enes durin' the senescence of Arabid*psis thaliania rosette leaves. 5lant science EA(*.? T/*I 0eu!i*7e& ML %an4 Neete!on DD (*L-+. =rea nutrition of youn' maize and su'ar/beet plants 9ith emphasis on ionic balance and vascular transport of nitro'enous compounds. &eth ` #'ric 4ci 0,? 0*T/00,.$hosle &$@ =nta9ala #;@ !har'al>ar CF (*LTM. Effect of sea9eed extract on the 'ro9th of )hase*lus ,ulgaris 1.. Indian `. 2ar. 4ci. B? +,-/+*, 07alerao RP4 EClL: D4 L@ung I4 Mar*7ant A4 0ennett M4 Sandberg G (+,,+.. 4hoot/derived auxin is essential for early lateral root emer'ence in #rabidopsis seedlin's. 5lant ` #E? 0+Sr 00+ 0loo& AD4 SuCra"anna SS (*LL,. Effects of exposure to ammonium and transplant shoc> upon the induction of nitrate absorption. 5lant 5hysiol EB? -M/L,

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0lunden G (*LT+. he effect of a%ueous sea9eed extract as a fertilizer additive. In )r*c. 7th "nternati*nal (ea:eed (-+p*siu+. =niversity of o>yo 5ress@ M-I/M-L 0lunden G (*LTT. 6yto>inin activity of sea9eed extracts. &# : 6onf. 4er. I? 00T/0II 0lunden G4 Cri""! AL4 Gordon SM4 Ma!on TG4 Turner C. (*L-S. he characterisation and %uantitative estimation of betaines in commercial sea9eed extracts. $ot 2ar #E? *MM/*S, 0lunden G4 Gordon SM4 S&it7 0E4 1let*7er RL (*L-M. Zuaternary ammonium compounds in species of the fucaceace (5haeophyceace. from $ritain. $r 5hycol ` #'? *,M/*,0lunden G4 DerCin! T4 Liu )+ (*LLT. Enhanced leaf chlorophyll levels in plants treated 9ith sea9eed extract. ` #ppl 5hycol A? M0M/MI0 0lunden G4 Roger! DD4 0arKell CD (*L-I. $iolo'ically active compounds from the $ritish marine al'ae. In Natural )r*ducts and &rug &e,el*p+ent Alfred 7en2*n (-+p*siu+ #'? *TL/ *L,. Edited by Fro's'aard/1arser 65@ $ro''er 4@ 6hristensen 4@ Fofod <@ 2un>s'aard@ 6openha'en 0lunden G4 +ildgoo!e P0 (*LTT. he effects of a%ueous sea9eed extract and >inetin on potato yield. ` 4ci 3ood #'ri #A? *+*/*+M 0lunden G4 +ildgoo!e P04 Ni*7ol!on 1E (*LTI. he effects of a%ueous sea9eed extract on su'ar beet. In )r*c. 6th "nternati*nal (ea:eed (-+p*siu+@ $an'or@ &orth 8ales@ SST/ST+ 0lunden G4 +ildgoo!e P04 Ni*7ol!on 1E (*LTL. he effects of a%ueous sea9eed extract on su'ar beet. $ot 2ar ##? M0L/MI* 0oot7 CO (*LSI. 4ea9eed has possibilities apart from its fertiliser use. he ;ro9er (#? II+/II0 0oot7 E (*LSS. 4ome properties of sea9eed manures. In )r*c. 5th "nternati*nal (ea:eed (-+p*siu+. 5er'amon 5ress@ 1ondon@ 0IL/0MT 0o-er GL4 Doug7ert- SS (*L--. Identification of abscisic acid in the sea9eed Asc*ph-llu+ n*d*su+. 5hytochemistry #F? *M+*/*M++ 0radle- DP4 Morgan MA4 OToole P (*L-L. =pta>e and apparent utilization of urea and ammonium nitrate in 9heat seedlin's. 3ert Res #'? I*/IL 0radle- PM (*LL*. 5lant hormones do have a role in controllin' 'ro9th and development of al'ae. ` phycol #F? 0*T/0+* 0rain IR4 C7alo"in MC4 Turner TD4 0lunden G4 +ildgoo!e P0 (*LT0. 6yto>inin activity of commercial a%ueous sea9eed extract. 5lant 4ci 1ett J? +I*/+IM 0re&ner DM (*LLM. Recent research on problems in the use of urea as a nitro'en fertilizer. 3ert Res B#? 0+*/0+L 0re&ner DM4 Iro&eier MD (*L-L. Evidence that the adverse effect of urea fertilizer on seed 'ermination in soil is due to ammonia formed throu'h hydrolysis of urea by soil urease. 5roc &atl #cad 4ci A(? -*-M/-*-0utton E14 No-e! C1 (*LSI. Effect of a sea9eed extract upon emer'ence and survival of seedlin's of creepin' red fescue. #'ron ` H(? III/IIM Cani%en* G (+,,M. Implication des '"nes 5 R dArabid*psis thaliana dans le transport de nitrate. h"se@ =niversit de 2ontpellier II Cardinale 14 DonaC C4 LioterinC +4 Nie7au! I4 0oller T4 .irt . (+,,,. !ifferential activation of four specific 2#5F path9ays by distinct elicitors. ` $iol 6hem #FH? 0ST0I/ 0STI, Ca!i&iro I4 0ee*C&an T4 Gra7a& N4 07alerao R4 G7ang .4 Ca!ero P4 Sandberg G4 0ennett MD (+,,0. !issectin' #rabidopsis lateral root development. rends 5lant 4ci A(I.? *SM/*T* C7aillou S4 3e!!e- DI4 Morot-Gaudr- D14 Ra"er CD4 .enr- LT4 0outin DP (*LL*. Expression of characteristics of ammonium nutrition as affected by p< of the root medium. ` Exp $ot B#? *-L/*LS

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C7ang G4 I*7ar D4 .au!inger RP (+,,I. 6hemical cross/lin>in' and mass spectrometric identification of sites of interaction for =re!@ =re3 and urease. ` $iol 6hem #FE(*M.? *M0,M/ *M0*I C7en )G4 C7ing TM (*L--. Induction of barley leaf urease. 5lant 5hysiol A(? LI*/LIM C7eng CL4 A*edo GN4 DeKdne- D4 Good&an .M4 ConCling MA (*LL*. !ifferential expression of t9o Arabid*psis nitrate reductase 'enes. 5lant 5hysiol E(? +TM/+TL C7eng CL4 DeKdne- D4 Na& .G4 den 0oer 0G4 Good&an .M (*L--. # ne9 locus (&I#*. in Arabid*psis thaliana encodin' nitrate reductase. E2$: ` F? 00,L/00*I C7iu CC4 Lin CS4 .!ia AP4 Su RC4 Lin .L4 T!a- )1 (+,,I. 2utation of a nitrate transporter@ #t&R *?I@ results in a reduced petiole nitrate content and altered leaf development. 5lant 6ell 5hysiol BH(L.? **0L/**IC7ur*7 GM4 Gilbert + (*L-I. ;enomic se%uencin'. 5roc &atl #cad 4ci AJ(T.? *LL*/*LLM Clu?et S4 Torregro!a C4 Da*Muet C4 La:itte C4 1ournier D4 Mer*ier L4 Sala&agne S4 0riand /4 E!Muerr -Tuga- MT4 Du&a! 0 (+,,I. ;ene expression profilin' and protection of !edicag* truncatula a'ainst a fun'al infection in response to an elicitor from 'reen al'ae %l,a spp. 5lant 6ell Environ #F? L*T/L+CoN* )4 Le!aint C (*LT*. 6omment assurer une bonne nutrition en eau et en ions minraux en horticulture. <orticulture 3ranXaise A? **r*I CoN* )4 Le!aint C (*LTM. 1a nutrition minrale et en eau des plantes en horticulture avance. 1e !ocument echni%ue de la 465# #$? */++ Coru??i GM (+,,0. 5rimary &/assimilation into #mino #cids in Arabid*psis. In The Arabid*psis 7** . Edited by 2eyero9itz E@ 4omerville 6@ #merican 4ociety of 5lant $iolo'ists@ Roc>ville@ 2!@ $J(*.? */*T Co!*7igano IT4 Melo-Oli%eira R4 Li& D4 Coru??i GM (*LL-. Arabid*psis 'ls mutants and distinct 3d/;:;# 'enes. Implications for photorespiration and primary nitro'en assimilation. 5lant 6ell J'(M.? TI*/M+ Court MN4 Ste"7en RC4 +aid DS (*LSI. oxicity as a. cause of the inefficiency of urea as a fertilizer. ` 4oil 4ci JH? I+/ICraK:ord NM4 1orde 0G (+,,+. 2olecular and !evelopmental $iolo'y of Inor'anic &itro'en &utrition. In The Arabid*psis 7** . Edited by 2eyero9itz E@ 4omerville 6@ #merican 4ociety of 5lant $iolo'ists@ Roc>ville@ 2!@ doiW*,.**LLWtab.,,**@ *r+M CraK:ord NM4 Gla!! ADM (*LL-. 2olecular and physiolo'ical aspects of nitrate upta>e in plants. rends in 5lant science $? 0-L/0LM CraK:ord NM4 S&it7 M4 0elli!!i&o D4 Da%i! R+ (*L--. 4e%uence and nitrate re'ulation of the Arabid*psis thaliana mR&# encodin' nitrate reductase@ a metalloflavoprotein 9ith three functional domains. 5roc &atl #cad 4ci AH? M,,S/M,*, Crou*7 ID4 S&it7 MT4 %an Staden D4 LeKi! MD4 .oad G3 (*LL+. Identification of auxins in a commercial sea9eed concentrate. ` 5lant 5hysiol J$A? ML,/MLI Crou*7 ID4 %an Staden D (*LL*. Evidence for rootin' factors in a sea9eed concentrate prepared from /c l*nia +a.i+a. ` 5lant 5hysiol J$F? 0*L/0++ Crou*7 ID4 %an Staden D (*LL0. Effect of sea9eed concentrate from /c l*nia +a.i+a (osbec>. 5apenfuss on !el*id*g-ne inc*gnita infection on tomato. ` #ppl 5hycol H? 0T/I0 Crou*7 ID4 %an Staden D (*LL0. Evidence for the presence of plant 'ro9th re'ulators in commercial sea9eed products. 5lant ;ro9th Re'ul J$? +*/+L CroK:ord N (*LLM. &itrate? nutrient and si'nal for plant 'ro9th. 5lant 6ell T? -ML/-SDOAgo!tino I04 Deruere D4 Iieber DD (+,,,. 6haracterization of the response of the #rabidopsis response re'ulator 'ene family to cyto>inin. 5lant 5hysiol J#B(I.? *T,S/*T*T Daniel-3edele 14 1illeur S4 Cabo*7e M (*LL-. &itrate transport? a >ey step in nitrate assimilation. 6urr. :pin. 5lant $iol J? +0M/+0L

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De 3illier! D4 Iot?e +AG4 Doubert M (*L-0. Effect of sea9eed foliar spray on fruit %uality and mineral nutrition. !ecid 3ruit ;ro9 $$? LT/*,* DeCCer D (*LS0. Effect of cyto>inin on po9dery milde9. &ature JEF? *,+T/*,+Del en! E4 Morot-Gaudr- D14 Martin 14 T7oreuP A Q Go@on A (*LLT. 2thodolo'ie *M&. In Assi+ilati*n de l;a2*te che2 les plantes +SM/+-,. Editions I&R#@ 2ieux comprendre Del7on P4 Go@on A4 Tillard P4 Pa!!a&a L (*LLS. !iurnal re'ulation of &:0/ upta>e in soybean plants. I. !ependence on current photosynthesis and su'ar availability to the roots. ` Exp $ot BF? -L0/L,, De!"re? T4 A&!ele& D4 Cabo*7e M4 .o:te . (*LL-. !ifferential 'ene expression in #rabidopsis monitored usin' c!&# arrays. 5lant ` JB(M.? SI0/SM+ Dia? C4 Saliba-Colo&bani 34 Loudet O4 0elluo&o P4 Moreau L4 Daniel-3edele 14 MorotGaudr- D14 Ma!*lauP-Daubre!!e C (+,,S. 1eaf yello9in' and anthocyanin accumulation are t9o 'enetically independent strate'ies in response to nitro'en limitation in #rabidopsis thaliana. 5lant 6ell 5hysiol BF(*.?TI/-0 Di%ol 14 3ilaine 14 T7ibi%illier! S4 A&!ele& D4 PalauMui DC4 Iu!iaC C4 Dinant S (+,,M. 4ystemic response to aphid infestation by 2yzus persicae in the phloem of #pium 'raveolens. 5lant 2ol $iol HF(I.? M*T/MI, DiPon NE4 Ga??olaC4 0laCel- RL Gerner 0 (*LTM. `ac>/bean urease (E.6. 0.M.*.M.0.. # metalloenzyme. # simple biolo'ical role for nic>el. ` #m 6hem 4oc EF? I*0*/I*00 Duboi! 14 Ter*e-La:orgue T4 Gon?ale?-Moro M04 E!ta%illo DM4 SangKan R4 Gallai! A4 .irel 0 (+,,0. ;lutamate dehydro'enase in plants? is there a ne9 story for an old enzymes 5lant 5hysiol $iochem BJ? MSM/MTS Durand N4 0riand /4 Me-er C (+,,0. he effect of marine bioactive substances (& 5R:. and endo'enous cyto>inins on nitrate reductase activity in Arabid*psis thaliana. 5hysiol 5lantarum JJE? I-L/IL0 E*Cert M4 0iela A4 Sie:rit? 14 Ialden7o:: R (*LLL. &e9 aspects of plant a%uaporin re'ulation and specificity. ` Exp $ot H'? *MI*r*MIM El-S7eeC7 MM4 El-Saied AA1 (+,,,. Effect of crude sea9eed extracts on seed 'ermination@ seedlin' 'ro9th and some metabolic processes of 4icia faba 1.. 6ytobios J'J? +0/+M 1AO +,,M. 3#:4 # !atabase 6ollection (http?WWfaostat.fao.or'W.. 3ood and #'riculture :r'anization of the =nited &ations@ Rome@ Italy 1eatonb--S&it7 0C4 %an Staden D (*L-0. he effect of sea9eed concentrate on the 'ro9th of tomato plant in nematode/infested soil. 4cienta <ortic #'? *0T/*IS 1eatonb--S&it7 0C4 %an Staden D (*L-0. he effect of sea9eed concentrate and fertilize on the 'ro9th of 7eta ,ulgaris. Y 5flanzenphysiol JJ#? *MM/*S+ 1eatonb--S&it7 0C4 %an Staden D (*L-I. Identification and seasonal variation of endo'enous cyto>inins in /c l*nia +a.i+a (osbec>. 5apenf. $ot 2ar #F? M+T/M0* 1eatonb--S&it7 0C4 %an Staden D (*L-T. Effects of sea9eed concentrate on 'rain yield in barley. 4outh #fric ` $ot H$? *+M/*+1eld&ann D (*LT-. 5rcis de botani%ue ome I C'taux Infrieurs. Edited by 2asson@ 5aris 1illeur S4 Daniel-3edele 1 (*LLL. Expression analysis of a hi'h/affinity nitrate transporter isolated from Arabid*psis thaliana by differential display. 5lanta #'F? IS*/ISL 1orde 0G (+,,,. &itrate transporters in plants? structure@ function and re'ulation. $iochim $iophys #cta JB(H? +*L/+0M 1orde 0G (+,,+. 1ocal and lon'/ran'e si'nalin' path9ays re'ulatin' plant responses to nitrate. #nnu Rev 5lant $iol H$? +,0/++I 1re-er&ut7 SI4 0a*ana&Ko M4 Pola**o DC (+,,,. he soybean /u3 'ene encodes a &i/ bindin' protein necessary for urease activity. 5lant ` #J(*.? M0/S,

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Galangau 14 Daniel-3edele 14 MoureauP T4 Le-de*Cer MT4 Cabo*7e M (*L--. Expression of leaf nitrate reductase 'enes from potato and tobacco in relation to li'ht/dar> re'imes and nitrate supply. 5lant 5hysiol AA? 0-0/0-Gallu*i E4 Mi*elli C4 Li""e C (*LT*. &on/electrolyte permeability across thin lipid membranes. #rch Int 5hysiol $iochem FE? --*r--T Gan!el /4 Muno! S4 Tillard P4 Go@on A (+,,*. !ifferential re'ulation of the &:0/ and &<IK transporter 'enes #t&R +.* and #t#mt*.* in Arabid*psis? relation 9ith lon'/distance and local controls by & status of the plant. 5lant ` #(? *I0/*MM Ga??arrini S4 Le@a- L4 Go@on A4 Ninne&ann O4 1ro&&er +04 %on +ir n N (*LLL. hree functional transporters for constitutive@ diurnally re'ulated@ and starvation/induced upta>e of ammonium in Arabid*psis roots. 5lant 6ell JJ? L0T/LIGerbeau P4 Gu*lu D4 Ri"o*7e P4 Maurel C (*LLL. #%uaporin &t/ I5a can account for the hi'h permeability of tobacco cell vacuolar membrane to small neutral solutes. 5lant ` JA? MTTrM-T GerendR! D4 Pola**o DC4 1re-er&ut7 SI4 Sattel&a*7er 0 (*LLL. 4i'nificance of nic>el for plant 'ro9th and metabolism. `. 5lant &utr. 4oil 4ci J(#? +I*/+MS GerendR! D4 G7u G4 Sttel&a*7er 0 (*LL-. Influence of nitro'en and &i supply on nitro'en metabolism and urease activity in rice (1r-2a sati,a 1... ` Exp $ot BE(0+S.? *MIM/*MMI Gla!! ADM4 SiddiMi M) (*LLM. &itro'en absorption by plants roots. In Nitr*gen Nutriti*n "n 'igher )lants. Edited by <.4.4rivastava and R.5.4in'h.@ #ssociated 5ub.6o. &e9 !elhi.@ +*/ MS Glibert PM4 .arri!!on D4 .eil C4 Sei?inger S (+,,S. escalatin' 9orld9ide use of urea r a 'lobal chan'e contributin' to coastal eutrophication. $io'eochemistry FF? II*/IS0 Goldrai@ A4 0ea&er LD4 Pola**o DC (+,,0. Interallelic complementation at the ubi%uitous urease codin' locus of soybean. 5lant 5hysiol J$#? *-,*/*-*, Goldrai@ A4 Coello P4 Pola**o DC (*LL-. &ucleotide se%uence of a c!&# encodin' a soybean seedlin's axes ar'inase (accession n^ #3,0MST*.(5;R L-/,*S.. 5lant 5hysiol JJ(? -ST Goldrai@ A4 Pola**o DC (*LLL. #r'inase is inoperative in developin' soybean embryos. 5lant 5hysiol JJE? +LL/0,0 Goldrai@ A4 Pola**o DC (+,,,. #r'inine de'radation by ar'inase in mitochondria of soybean seedlin' cotyledons. 5lanta #J'? SM+/SMGooding MD4 Da%ie! +P (*LL+. 3oliar urea fertilization of cereals? a revie9. 3ert Res $#? +,L/ +++ Gould +D4 .agedorn C4 M*Cread- GL (*L-S. =rea transformations and fertilizer efficiency in soil. #dv. in #'ronomy B'? +,L/+0Guo 1Q4 +ang R4 C7en M4 CraK:ord NM (+,,*. he #rabidopsis dual/affinity nitrate transporter 'ene #t&R *.* (6<1*. is activated and functions in nascent or'an development durin' ve'etative and reproductive 'ro9th. 5lant 6ell J$ *TS*/*TTT Guo 1Q4 +ang R4 CraK:ord NM (+,,+. he #rabidopsis dual/affinity nitrate transporter 'ene #t&R *.* (6<1*. is re'ulated by auxin in both shoots and roots. ` Exp $ot H$(0T,.? -0M/ -II .art LC (*L-+. #uxins as plant 'ro9th re'ulators in the marine al'a )elag*ph-cusp*rra (1eman. (etchell (5haeophyta 6aminales.. 5h! hesis@ =niversity of 4outhern 6alifornia@ 1os #n'eles .au!inger RP4 Col"a! GD4 Soriano A (+,,*. =reaseB a paradi'm for protein/assisted metallocenter assembly. #42 &e9s (F(+.? T-/-I .ine DC4 S"ent DI (*L--. ;ro9th of )hase*lus ,ulgaris on various nitro'en sources? the impotance of urease. ` Exp $ot $E? *M,M/*M*+ .in!%arC ON4 +ittKer S.4 TuCe- .0 (*LM0. he 2etabolism of 3oliar/#pplied =rea. I. Relative Rates of 6*I:+ 5roduction by 6ertain Ce'etable 5lants reated 9ith 1abeled =rea. 5lant 5hysiol #A(*.? T,rTS

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.irel 04 Lea PD (+,,*. #mmonia assimilation. In )lant Nitr*gen. Edited by 1ea 5`@ 2orot/ ;audry `3? 4prin'er@ TL/LL .ir!*7 R+4 .artung +4 Gi&&ler . (*L-L. #bscisic acid content of #l'ae under stress. $ot #cta J(#? 0+S/00I .o:: T4 Truong .N4 Cabo*7e M (*LLI. he use of mutants and trans'enic plants to study nitrate assimilation. 5lant 6ell Environ JF? I-L/M,S .uang NC4 C7iang CS4 CraK:ord NM4 T!a- )1 (*LLS. C'$1 encodes a component of the lo9/affinity nitrate upta>e system in Arabid*psis and sho9s cell type/specific expression in roots. 5lant 6ell A? +*-0/+*L* .uang NC4 Liu I.4 Lo .D4 T!a- )1 (*LLL. 6lonin' and functional characterization of an Arabid*psis nitrate transporter 'ene that encodes a constitutive component of lo9/affinity upta>e. 5lant 6ell JJ? *0-*/*0L+ Da*ob! +P4 1alCen!tein I4 .a&ilton R. (*L-M. &ature and amount of auxin in al'ae? I## from extracts of Culerpa paspal*ides (4iphonales.. 5l 5hysiol FA? -II/-IDoli%et E4 Langlai!-Deannin I4 Morot-Gaudr- D1 (*LL*. 1es extraits dal'ues marines? proprits phytoactives et intrEt a'ronomi%ue. #nne $iolo'i%ue? *,L/*+S Doubert DM4 M r- A4 . r- P (+,,+. 6omment lextrait dal'ue u;#Tv stimule la nutrition azote des bls. 5hytoma HH#? +,/++ Doubert DM4 )%in DC4 0ar*7ietto T4 Serg DM4 Ple!!e 0 Ilar?-n!Ci O4 Io"" M4 1ritig 04 Iloareg 0 (*LL-. # c/*@0 'lucan@ specific to a marine al'a@ stimulates plant defense reactions and induces broad ran'e resistance a'ainst patho'ens. In The 1<<6 7right*n C*nference= )ests and &iseases@ II*/IIIeit7 04 Dong /N4 Au!ubel 1M4 1inC GR (*LL*. !ifferential induction of 0/deoxy/!/ arabino/heptulosonate T/phosphate synthase 'enes in #rabidopsis thaliana by 9oundin' and patho'enic attac>. 5roc &atl #cad 4ci AA? --+*r--+M Iing&an AR4 Moore D (*L-+. Isolation@ purification and %uantitation of several 'ro9th re'ulatin' substances in Asc*ph-llu+ n*d*su+ (5haeophyta.. $ot 2ar #H? *IL/*M0 Ilar?-n!C- O4 De!*a&"! 34 Ple!!e 04 )%in DC4 Iloareg 04 1ritig 0 (+,,0. 4ulfated fucan oli'osaccharides elicit defense responses in tobacco and local and systemic resistance a'ainst tobacco mosaic virus. 2ol. 5lant 2icrobe In J((+.? **M/*++ Ilar?-n!C- O4 E!nault D4 Eu?en M4 Doubert DM (+,,M. 2canismes daction de lextrait dal'ue ;#T. 5hytoma HAH? I+/II Ilar?-n!C- O4 Ple!!e 04 Doubert DM4 )%in DC4 Io"" M4 Iloareg 04 1ritig 0 (+,,,. 1inear c/*@0 'lucans are elicitors of defense responses in tobacco. 5lant 5hysiol J#B? *,+T/*,0T Ilein I4 +einbau& SA (*L-M. 3oliar application of urea to almond and olive? leaf retention and >inetics of upta>e. ` 5lant &utr A? **T/*+L Ilein7o:! A4 +arner RL (*LL,. #dvances in nitrate assimilation. In The bi*che+istr- *f plants. Edited by 2iflin $`@ 1ea 5`? #cademic 5ress@ J(? -L/*+, Iloareg 04 Quatrano RS (*L--. 4tructure of the cell 9alls of marine al'ae and ecophysiolo'ical functions of the matrix polysaccharides. :ceano'r 2ar $iol #nnu Rev #(? +ML/0*M Ira"" A4 Truog .N (+,,M. Re'ulation of 6W& interaction in model plant species. `ournal of 6rop Improvement JH(+.? *+T/*T0 Irog&eier MD4 M*Cart- G+4 0re&ner DM (*L-L. 5hytotoxicity of foliar/applied urea. 5roc &atl #cad 4ci A(? -*-L/-*L* Iru&"el&an PM4 1re-er&ut7 SI4 Cannon D14 1inC GR4 Pola**o DC (*LLM. &ucleotide se%uence of Arabid*psis thaliana ar'inase expressed in yeast (accession n^ =*M,*L.. 5lant 5hysiol J'F? *ITL/*I-,

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La& .M4 Co!*7igano IT4 Oli%eira IC4 Melooli%eira R4 Coru??i GM (*LLS. he molecular 'enetics of nitro'en assimilation into amino acids in hi'her plants. #nnu Rev 5lant $iol BF? MSL/ML0 La& .M4 .!ie7 M.4 Coru??i G (*LL-. Reciprocal re'ulation of distinct aspara'ine synthetase 'enes by li'ht and metabolites in Arabid*psis thaliana. 5lant ` J(? 0IM/0M0 La& .M4 Peng SS4 Coru??i GM (*LLI. 2etabolic re'ulation of the 'ene encodin' 'lutamine/ dependent aspara'ine synthetase in #rabidopsis thaliana. 5lant 5hysiol J'(? *0IT/*0MT La& .M4 +ong P4 C7an .I4 )a& IM4 C7en L4 C7oK CM4 Coru??i GM (+,,0. :verexpression of the #4&* 'ene enhances nitro'en status in seeds of Arabid*psis. 5lant 5hysiol J$#(+.? L+S/0M Laurent 14 0out7ier A4 0onne:o- M (*LL-. 5ulvrisation foliaire dazote sur bl. =ne techni%ue %ui doit encore faire ses preuves. 5erspect #'ric #$B? *T/++ Le Souder C4 Taureau DC (*LLT. En'rais azots. 1eur devenir dans le sol. 5erspect #'ric ##J? SI/SS Le Tutour 0 (*LL,. #ntioxidative activities of al'al extracts@ syner'istic effect 9ith vitamin E. 5hytochemistry #E? 0TML/0TSM Le Tutour 04 0en!li&ane 14 Gouleau MP4 Gou-gou DP4 Saadan 04 Que&eneur 1 (*LL-. #ntioxydant and pro/oxydant activities of the bro9n al'ae@ $a+inaria digitata@ 'i+anthalia el*ngata@ >ucus ,esicul*sus@ >ucus serratus and Asc*ph-llu+ n*d*su+. ` #ppl 5hycol J'? *+*/*+L Lee M.4 Mulroone- S04 .au!inger RP (*LL,. 5urification@ characterization@ and in vivo reconstitution of 3lebsiella aer*genes urease apoenzyme. ` $acteriol JF#(-.? II+T/II0* Lee M.4 PanCrat? .S4 +ang S4 S*ott RA4 1innegan MG4 Do7n!on MI4 I""olito DA4 C7ri!tian!on D+4 .au!inger RP (*LL0. 5urification and characterization of 3lebsiella aer*genes =reE protein? a nic>el bindin' protein that functions in urease metallocenter assembly. 5rotein 4ci #? *,I+r*,M+ Lee R04 DreK MC (*L-L. Rapid@ reversible inhibition of nitrate influx in barley by ammonium. ` Exp $ot B'? TI*/TM+ Le@a- L4 Gan!el /4 Cere?o M4 Tillard P4 MSller C4 Ira"" A4 %on +ir n N4 Daniel-3edele 14 Go@on A (+,,0. Re'ulation of root ion transporters by photosynthesis? functional importance and relation 9ith hexo>inase. 5lant 6ell JH? ++*-/++0+ Le@a- L4 Tillard P4 Le"etit M4 Oli%e 14 1illeur S4 Daniel-3edele 14 Go@on A (*LLL. 2olecular and functional re'ulation of t9o &:0/ upta>e systems by &/ and 6/status of Arabid*psis plants. 5lant ` JA? M,L/M*L Let7a& DS (*LT-. 6yto>inins. In )h-t*h*r+*nes and related C*+p*unds= a c*+prehensi,e Treatise ". Edited by 1etham !4@ ;ood9in 5$@ <i''ins `@ ElsevierW<olland@ #msterdam@ +,M/+M* Liu I.4 .uang C)4 T!a- )1 (*LLL. 6<1* is a dual/affinity nitrate transporter of Arabid*psis involved in multiple phases of nitrate upta>e. 5lant 6ell JJ? -SM/-TI Liu I.4 T!a- )1 (+,,0. 49itchin' bet9een the t9o action modes of the dual/ affinity nitrate transporter 6<1* by phosphorylation. E2$: ` ##? *,,M/*,*0. Liu L.4 LudeKig U4 1ro&&er +04 %on +ir n N (+,,0a. #t!=R0 encodes a ne9 type of hi'h/affinity ureaW<K symporter in #rabidopsis. 5lant 6ell JH? TL,/-,, Liu L.4 LudeKig U4 Ga!!ert 04 1ro&&er +04 %on +ir n N (+,,0b. =rea transport by nitro'en/re'ulated tonoplast intrinsic proteins in #rabidopsis. 5lant 5hysiol *00? *++,/*++LoMu 4 D4 %on +ir n N (+,,I. Re'ulatory levels for the transport of ammonium in plant roots. ` Exp $ot HH? *+L0/*0,M Loudet O4 C7aillou S4 Merigout P4 Talbote* D4 Daniel-3edele 1 (+,,0. Zuantitative rait 1oci #nalysis of &itro'en =se Efficiency in #rabidopsis. 5lant 5hysiol J$J? 0IM/0M-

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LudeKig U4 %on +ir n N4 1ro&&er +0 (+,,+. =niport of &<IK by the root hair plasma membrane ammonium transporter 1e#2 *B*. ` $iol 6hem #FF? *0MI-/*0MMM LudeKig U4 %on +ir n N4 Rent!*7 D4 1ro&&er +0 (+,,*. Rhesus factors and ammonium? a function in effluxs ;enome $iol #? revie9s *,*,.*/*,*,/M Mala&- DE4 R-an IS (+,,*. Environmental re'ulation of lateral root initiation in #rabidopsis. 5lant 5hysiol J#F(0.?-LL/L,L Mar!*7ner M (*LLM. 2ineral &utrition in <i'her 5lants. + ed. 1ondon? #cademic 5ress Martin-Tangu- D (+,,*. 2etabolism and function of polyamines in plants? recent development (ne9 approaches.. 5lant ;ro9th Re'ul $B? *0M/*IMa!*lauP-Daubre!!e C4 Rei!dor:-Cren M4 Pageau I4 Lelandai! M4 Grand@ean O4 Ironenberger D4 3aladier M.4 1eraud M4 Douglet T4 Su?uCi A (+,,S. ;lutamine synthetase/'lutamate synthase path9ay and 'lutamate dehydro'enase play distinct roles in the sin>/source nitro'en cycle in tobacco. 5lant 5hysiol JB'? III/IMS Mat!u&o&to .4 .a!egaKa )4 Ioba-a!7i M4 TaCa7a!7i E (*LS-. Inducible formation of urease in Cana,alia ensif*r+is. 5hysiol.5lantarum #J? -T+/--* Mat!u&o&to .4 )a!uda I4 Ioba-a!7i M4 TaCa7a!7i E (*LSS. he inducible formation of urease in rice plants. 4oil 4ci 5lant &utr J#? +0L/+II M*Clure PR4 I!rael D+ (*LTL. ransport of &itro'en in the )ylem of 4oybean 5lants. 5lant 5hysiol (B? I**/I*S M*Conn M4 Creel&an RA4 0ell E4 Mullet DE4 0roK!e D (*LLT. `asmonate is essential for insect defense in #rabidopsis. 5roc &atl #cad 4ci EB(*,.? MIT0/MITT Melo-Oli%eira R4 Oli%eira IC4 Coru??i GM (*LLS. #rabidopsis mutant analysis and 'ene re'ulation define a nonredundant role for 'lutamate dehydro'enase in nitro'en assimilation. 5roc &atl #cad 4ci E$(*,.? IT*-/IT+0 Menard R4 Alban S4 de Ru::ra- P4 Da&oi! 14 1ran? G4 1ritig 04 )%in DC4 Iau::&ann S (+,,I. c/*@0 'lucan sulfate@ but not c/*@0 'lucan@ induces the salicylic acid si'nallin' path9ay in tobacco and #rabidopsis. he 5lant 6ell J(? 0,+,/0,0+ Mer*ier L4 La:itte C 0orderie! G4 0riand /4 E!Muerr -Tuga- MT4 1ournier D (+,,*. he al'al polysaccharide carra'eenans can act as an elicitor of plant defense. &e9 5hytol JBE? I0/ M* Me-er C4 Stitt M (+,,*. &itrate reduction and si'nallin'. In )lant nitr*gen. Edited by 1ea 5`@ 2orot/;audry `3@ $erlin@ 4prin'er/Cerla'@ S*rTMi*alle: 0D4 S7el" 0D (*L-L. #r'inine metabolism in developin' soybean cotyledons. I. Relationship to nitro'en nutrition. 5lant 5hysiol E'? S+I/S0, Mie!aC 0.4 Coru??i GM (+,,+. 2olecular and physiolo'ical analysis of Arabid*psis mutants defective in cytosolic or chloroplastic aspartate aminotransferase. 5lant 5hysiol J#E? SM,/SS, Mi:lin 0D4 .aba!7 DG (+,,+. he role of 'lutamine synthetase and 'lutamate dehydro'enase in nitro'en assimilation and possibilities for improvement in the nitro'en utilization of crops. ` Exp $ot H$? LTL/L-T Miller CO (*LS0. Finetin and >inetin/li>e compounds. In !*dern !eth*ds *f )lant Anal-sis (? *LI/+,+. Edited by 1ins>ens <3@ racy 2C@ 4prin'er/Cerla'@ $erlin Mi-aKaCi I4 Mat!u&oto-Iitano M4 IaCi&oto T (+,,I. Expression of cyto>inin biosynthetic isopentenyltransferase 'enes in #rabidopsis? tissue specificity and re'ulation by auxin@ cyto>inin@ and nitrate. 5lant ` $F(*.? *+-/0Moble- .LT4 .au!inger RP (*L-L. 2icrobial ureases? si'nificance@ re'ulation@ and molecular characterization. 2icrobiol Revie9s H$(*.? -M/*,Moble- .LT4 I!land MD4 .au!inger RP (*LLM. 2olecular biolo'y of microbial ureases. 2icrobiol Revie9s HE(0.? IM*/I-,

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Mo7an 3R4 3enCatara&an I4 Muruge!Kari R4 Mut7u!a&- S (*LLI. Effect of crude and commercial sea9eed extract on seed 'ermination and seedlin' 'ro9th in Ca?anus ca?an 1.. 5hy>os $$? IT/M* MoC MC (*LLI. 6yto>inins and plant development? an overvie9. In C-t* inins= che+istr-8 acti,it- and functi*n *MM/*SS. Edited by 2o> !84@ 2o> 26@ 6R6 5ress@ $oca Raton@ 3lorida Moone- PA4 %an Staden D (*L-M. Effect of sea9eed concentrate on the 'ro9th of 9heat under conditions of 9ater stress. 4outh #fric. ` 4ci AJ? S0+/S00 Moone- PA4 %an Staden D (*L-S. #l'ae and cyto>inins. ` 5lant 5hysiol #F? 0*T/0+* Moure--0ringuier A (*L-S. Recherche des modalits daction de la prparation al'ale ;#*I sur les plantes suprieures. h"se de doctorat@ =ER Rennes I Muller 04 Tillard P4 Touraine 0 (*LLM. &itrate fluxes in soybean seedlin' roots and their response to amino acids? #n approach usin' &/*M. 5lant 6ell Environ JE? *+ST/*+TL Mulroone- S04 .au!inger RP (+,,0. &ic>el upta>e and utilization by microor'anisms. 3E24 2icrobiol Revie9s #F? +0L/+S* MuTo? A4 Piedra! P4 Aguilar M4 Pineda M (+,,*. =rea is a product of ureido'lycolate de'radation in chic>pea. 5urification and characterization of the ureido'lycolate urea/lyase. 5lant 5hysiol J#H? -+-/-0I MuTo? A4 Ra!o MD4 Pineda M4 Piedra! P (+,,S. !e'radation of ureido'lycolate in 3rench bean (5haseolus vul'aris. is catalysed by a ubi%uitous ureido'lycolate urea/lyase. 5lanta ##B(*.? *TM/*-I Nel!on +R4 %an Staden D (*L-Ia. he effect of sea9eed concentrate on 'ro9th of nutrient/ stressed@ 'reenhouse cucumbers. <ortscience JE? -*/-+ Nel!on +R4 %an Staden D (*L-Ib. he effect of sea9eed concentrate on 9heat culms. ` 5lant 5hysiol JJH? I00/I0T Nel!on +R4 %an Staden D (*L-M. */aminocycloprpane/*/carboxylic acid in sea9eed concentrate. $ot 2ar #A? I*M/I*Nel!on +R4 %an Staden D (*L-S. Effect of sea9eed concentrate on the 'ro9th of 9heat. 4outh #fric ` 4ci A#? *LL/+,, Ninne&ann O4 DauniauP DC4 1ro&&er +0 (*LLI. Identification of a hi'h affinity &<IK transporter from plants. E2$: ` J$?0ISI/0IT* Oli%eira IC4 Coru??i GM (*LLL. 6arbon and amino acids reciprocally modulate the expression of 'lutamine synthetase in Arabid*psis. 5lant 5hysiol J#J(*.? 0,*/*, UrdLg 34 StirC +A4 %an Staden D4 No%RC O4 Strnad M (+,,I. Endo'enous cyto>inins in three 'enera of microal'ae from the chlorophyta. ` 5hycol B'? --/LM Or!el M4 Ira"" A4 Daniel-3edele 1 (+,,+. #nalysis of the &R + nitrate transport family in Arabid*psis. 4tructure and 'ene expression. 5lant 5hysiol J#E(+.? --S/-LS Ourr- A4 Ma*du:: D.4 Prud7o&&e MP4 0ou*aud D (*LLS. !iurnal variation in the simultaneous upta>e and sin> allocation of &<IK and &:0/ by 1olium perenne in flo9in' solution culture. ` Exp $ot BF? *-M0/*-S0 Palta DA4 1iller- IR4 Mat7eK! EL4 Turner NC (*LL*. 1eaf feedin' of (*M&. urea for labellin' 9heat 9ith nitro'en. #ust. ` 5lant 5hysiol JA? S+T/S0S Peo"le! M04 Gi::ord RM (*LL0. 1on' distance transport of carbon and nitro'en from sources to sin>s in hi'her plants. In )lant )h-si*l*g-8 7i*che+istr- and !*lecular 7i*l*g-. Edited by ! !ennis ! @ urpin !<. &e9 hor>@ I0I/IT Peter&an TI4 Good&an .M (*LL*. he 'lutamine synthetase 'ene family of Arabid*psis thaliana? li'ht/re'ulation and differential expression in leaves@ roots and seeds. 2ol ;en ;enet #$'(*/+.? *IM/MI

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Plettner I4 SteinCe M4 Malin G (+,,M. Ethene (ethylene. production in the marine macroal'a %l,a (Enteromorpha. intestinalis 1. (6hlorophyta@ =lvophyceace.? effect of li'ht/stress and co/production 9ith dimethylsulphide. 5lant 6ell Environ #A? **0S/**IM Pola**o DC4 1re-er&ut7 SI4 GerendR! D4 Cian?o SR (*LLL. 4oybean 'enes involved in nic>el insertion into urease. ` Exp $ot H'(00S.? **IL/**MS Pola**o DC4 .olland MA (*LL0. Roles of urease in plant cells. Int rev cyt JBH? SM/*,0 Pola**o DC4 .olland MA (*LLI. ;enetic control of plant ureases. In #enetic /ngineering. Edited by 4etlo9 `F? 5lenum 5ress@ &e9/hor>@ J(? 00/IPourtau N4 Denning! R4 Pel?er E4 Palla! D4 +ingler A (+,,S. Effect of su'ar/induced senescence on 'ene expression and implications for the re'ulation of senescence in Arabid*psis. 5lanta ##B(0.? MMS/SPouteau S4 C7erel I4 3au*7eret .4 Cabo*7e M (*L-L. &itrate reductase mR&# re'ulation in Nic*tiana plu+baginif*lia nitrate reductase/deficient mutants. 5lant 6ell J? ****/**+, Po%oln- M (*LSS. Investi'ation of the effectiveness on an extract of sea/9eeds on the yield and %uality of cucumbers for pic>lin' I. 5art. Rostlinna Cyroba J#? 00M/0I, Po%oln- M (*LSL. he influence of sea/9eeds extracts on the storability of apples. Rostlinna Cyroba JH? MIM/MMI Po%oln- M (*LT+. he effect of the sea9eed on ripenin' and stora'e capacity of peaches and apricots. Rostlinna Cyroba JA? T,0/T*, Po%oln- M (*LTI. he effect of the steepin' of peat/cellulose flo9erpots (`iffy/pots. in extracts of sea9eeds on the %uality of tomato seedlin's. In )r*c. 6th "nternati*nal (ea:eed (-+p*siu+@ $an'or@ &orth 8ales@ T0,/T00 Po%oln- M (*LTT. Effects of sea9eed extract on the yield@ ripenin' and shelf life of tomatoes. ` 5hycol J$@ suppl. MM Po?!ar 0l4 El .a&&ad- M4 Iiral- G (*LST. 6yto>inin effect of benzaldenine? increase of nucleic acid and protein synthesis in bean leaves. &ature #JB? +T0/+TI Pra!ad R (*LL-. 3ertilizer urea@ food security@ health and the environment. 6urr 4ci FH(T.? STT/ S-0 Ra@e!7Kari M4 LaC!7&anan II4 C7itra AS (*L-0. Effect of sea9eed on tomato. 5roc. :f &ational 4eminar on the 5roduction echnolo'y of omato and 6hillies@ &#=@ 6oimbatore@ -T/-L Rao DLN (*L-T. 4lo9 release urea fertilizers/effect on flood 9ater chemistry@ ammonia volatilization and rice 'ro9th in al>ali soil. 3ert Res J$? +,L/++* Ra%en DA4 +ollenKeber 04 .andle- LL (*LL+. # comparison of ammonium and nitrate as nitro'en sources for photolithotrophs. &e9 5hytolo'ist J#J? *L/0+ RaKat SR4 Sili& SN4 Iron?u*Cer .D4 SiddiMi M)4 Gla!! AD (*LLL. #t#2 * 'ene expression and &<IK upta>e in roots of Arabid*psis thaliana? evidence for re'ulation by root 'lutamine levels. 5lant ` JE? *I0/*M+ Re*ou! S (*L-T. 1es mcanismes de transformation de lazote dans le sol. 5erspectives #'ricoles JJH? *,,/*,M Redd- DD4 S7ar&a IL (+,,,. Effect of amendin' urea fertilizer 9ith chemical additives on ammonia volatilization loss and nitro'en/use efficiency. $iol 3ertil 4oils $#? +I/+T Riddle! P+4 +7an 34 0laCele- RL4 Gerner 0 (*LL*. 6lonin' and se%uencin' of a jac> bean urease encodin' c!&#. ;ene J'A= +SM/+SSander!on ID4 Da&e!on PE (*L-S. he cyto>inins in a li%uid sea9eed extract? could they be the active in'redientss In 5th "nternati*nal (-+p*siu+ *n #r*:th Regulat*rs in >ruit )r*ducti*n ".. Edited by 1uc>9ill 16. #cta <ortic JFE? **0/**S Sander!on ID4 Da&e!on PE4 GabCieKi*C DA (*L-T. #uxin in a sea9eed extractB identification and %uantification of indole/0/acetic acid by 'as chromato'raphy/mass spectrometry. ` 5lant 5hysiol J#E? 0S0/0ST

LT

S*7legel AD4 Nel!on D+4 So&&er! LE (*L-T. =se of urease inhibitors and urea fertilizers on 9inter 9heat. 3ert Res JJ? LT/*** S*7ubert IR4 0oland MD (*LL,. he ureides. In The 7i*che+istr- *f )lants J(? *LT/+-0. Edited by 2iflin $`@ 1ea 5`@ #cademic 5ress@ 4an !ie'o S*7ult? CD4 Coru??i GM (*LLM. he aspartate aminotransferase 'ene family of #rabidopsis encodes isoenzymes localized to three distinct subcellular compartments. 5lant ` F(*.? S*/TM Senn TL4 Iing&an AR (*LT-. 4ea9eed research in crop production. Econ. #dmin. =4 !ept. of 6ommerce@ 8ashin'ton !6@ */+M S7aK M4 07atta*7ar-a PI4 Qui*C +A (*LSM. 6hlorophyll@ protein and nucleic acid levels in detached@ senescin' 9heat leaves. 6an ` $ot B$?T0L/TIS Sie*ie*7oKi*? IA4 Do- I+4 Ireland RD (*L--. he metabolism of aspara'ine in plants. 5hytochemistry #F? SS0/ST* SirCo A4 0rod?iC R (+,,,. 5lant ureases? roles and re'ulation. #cta $iochim 5ol BF(I. **-L/ **LM Si%a!anCari S4 3enCate!alu 34 Anant7ara@ M4 C7andra!eCaran M (+,,S. Effect of sea9eed extracts on the 'ro9th and biochemical constituents of Ci'na sinensis. $ioresour echnol EF(*I.? *TIM/*TM* S@Lling S4 Gla!er E (*LL-. 2itochondrial tar'etin' peptides in plants. rends 5lant 4ci $? *0S/ *I, SCelton 0D4 Sern TL (*LS-. Effect of se9eed sprays on %uality and shelf/life of peaches. In )r*c. 6th "nternati*nal (ea:eed (-+p*siu+@ 4antia'o de 6ompostela@ 4pain@ T0*/T0M So7lenCa&" C4 S7elden M4 .oKitt S4 Ud%ardi M (+,,,. 6haracterization of #rabidopsis #t#2 +@ a novel ammonium transporter in plants. 3E$4 1ett B(F? +T0/+TSo7lenCa&" C4 +ood CC4 RoebG+4 Ud%ardi M (+,,+. 6haracterization of #rabidopsis #t#2 +@ a hi'h/affinity ammonium transporter of the plasma membrane. 5lant 5hysiol J$'? *T--/*TLS Soubie! L4 Gadet R4 Lenain M (*LMM. Recherches sur lvolution de lure dans les sols et sur son utilisation comme en'rais azot. #nn #'ron LLT/*,00 Stebbin! N4 .olland MA4 Cian?io SR4 Pola**o DC (*LL*. ;enetics tests of the roles of the roles of the embryonic ureases of soybean. 5lant 5hysiol EF? *,,I/*,*, Stenbbin! NE4 Pola**o DC (*LLM. =rease is not essential for ureide de'radation in soybean. 5lant 5hysiol J'E? *SL/*TM Ste"7en!on +M (*LSS. he effect of hydrolysed sea9eed on certain plant pests and diseases. In )r*c. 5th "nternati*nal (ea:eed (-+psiu+ H? I,M/I*M@ <alifax@ 6anada StirC +A4 No%RC O4 Strnad M4 %an Staden D (+,,0. 6yto>inins in macroal'ae. 5lant ;ro9th Re'ul BJ? *0/+I Stitt M4 Muller C4 Matt P4 Gibon )4 Carillo P4 Mor*uende R4 S*7eible +R4 Ira"" A (+,,+. 4teps to9ards an inte'rated vie9 of nitro'en metabolism. ` Exp $ot H$(0T,.? LML/T, Su&ner D0 (*L+S. he isolation and cristallization of the enzyme urease. ` $iol 6hem (E? I0M/ II* TaCei I4 SaCaCibara .4 Tanigu*7i M4 Sugi-a&a T (+,,*. &itro'en/dependent accumulation of cyto>inins in root and the translocation to leaf? implication of cyto>inin species that induces 'ene expression of maize response re'ulator. 5lant 6ell 5hysiol B#(*.? -M/L0 TaCei I4 TaCa7a!7i T4 Sugi-a&a T4 )a&a-a T4 SaCaCibara . (+,,+. 2ultiple routes communicatin' nitro'en availability from roots to shoots? a si'nal transduction path9ay mediated by cyto>inin. ` Exp $ot H$(0T,.? LT*/LTT TaCei I4 Ueda N4 AoCi I4 Iuro&ori T4 .ira-a&a T4 S7ino?aCi I4 )a&a-a T4 SaCaCibara . (+,,I. #tI5 0 is a >ey determinant of nitrate/dependent cyto>inin biosynthesis in #rabidopsis. 5lant 6ell 5hysiol BH(-.? *,M0/*,S+

L-

TaCi!7i&a I4 Suga T4 Ma&i-a G (*L--. he structure of jac> bean uresase. he complete amino acid se%uence@ limited proteolysis and reactive cysteine residues. Eur ` $iochem JFH? *M*/*SM Tanigu*7i M4 Iiba T4 SaCaCibara .4 Uegu*7i C4 Mi?uno T4 Sugi-a&a T (*LL-. Expression of #rabidopsis response re'ulator homolo's is induced by cyto>inins and nitrate. 3E$4 1ett B#E(0.? +ML/+S+ Ta- SA04 Ma*Leod DI4 Palni LMS4 Let7a& DS (*L-M. !etection of cyto>inins in a sea9eed extract. 5hytochemistry #B? +S**/+S*I Ta- SA04 Palni LMS4 Ma*Leod DI (*L-T. Identification of cyto>inins 'lucosides in a sea9eed extract. `. 5lant ;ro9th Re'ul H? *00/*0T7e Arabido"!i! Geno&e Initiati%e (+,,,. #nalysis of the 'enome se%uence of the flo9erin' plant Arabid*psis thaliana. &ature B'A (S-*I.? TLS/-*M T7i&& O4 0la!ing O4 Gibon )4 Nagel A4 Me-er S4 Iruger P4 Selbig D4 Muller LA4 R7ee S)4 Stitt M (+,,I. 2#52#&? a user/driven tool to display 'enomics data sets onto dia'rams of metabolic path9ays and other biolo'ical processes. 5lant ` $F? L*I/0L Todd CD4 Pola**o DC (+,,I. 4oybean cultivars [8illiams -+ and [2aple #rro9 produce both urea and ammonia durin' ureide de'radation. ` Exp $ot HH(0L-.? -ST/-TT Tori!C- RS4 Gri::in DD4 )eno:!C- RL4 Pola**o DC (*LLI. # sin'le 'ene (/u4. encodes the tissue/ubi%uitous urease of soybean. 2ol ;en ;enet #B#? I,I/I*I T!a- )14 S*7roeder DI4 1eld&ann IA4 CraK:ord NM (*LL0. he herbicide sensitivity 'ene C'$1 of Arabid*psis encodes a nitrate/inducible nitrate transporter. 6ell. F#? T,M/T*0 Turle- R.4 C7ing TM (*L-S. 5hysiolo'ical responses of barley leaves to foliar applied urea/ ammonium 6rop sci #((M.? L-T/LL0 3ade? 34 Sin*lair TR (+,,,. =reide de'radation path9ays in intact soybean leaves. ` Exp $ot HJ(0IL.? *IML/*ISM 3an O%erbeeC D (*LI,. #uxin in marine al'ae. 5l 5hysiol 1ancaster JH? +L*/+LL 3anden Drie!!*7e T4 Ie%er! C4 Collet M4 Ga!"ar T (*L--. Acetabularia +editerranea and ethyleneB production in relation 9ith development@ circadian rhythms in emission@ and response to external application. ` 5lant 5hysiol J$$? S0M/S0L 3enCatara&an I4 Mo7an 3R4 Muruge!Kari R4 Mut7u!a&- M (*LL0. Effect of crude and commercial sea9eed extract on seed 'ermination and seedlin' 'ro9th in 'reen 'ram and blac> 'ram. 4ea9eed Res =tiln J(? +0/+3erClei@ 1N (*LL+. 4ea9eed extracts in a'riculture and horticulture? a revie9. $iol #'ric <ort A? 0,L/0+I 3in*ent 3 (*L+I. 1es #l'ues marines et leurs emplois a'ricoles@ alimentaires@ industriels. Edouard 2enez@ Zuimper@ 3rance@ +,S p 3on +ir n N4 Ga??arrini S4 Go@on A4 1ro&&er +0 (+,,,. he molecular physiolo'y of ammonium upta>e and retrieval. 6urr :pin 5lant $iol $ (0.? +MI/+S* +al*7-Liu P4 1illeur S4 Gan )4 1orde 0G (+,,M. 4i'nalin' mechanisms inte'ratin' root and shoot responses to chan'es in the nitro'en supply. 5hotosynth Res A$(+.? +0L/+M, +ang R4 Guegler I4 La0rie ST4 CraK:ord NM (+,,,. ;enomic analysis of a nutrient response in #rabidopsis reveals diverse expression patterns and novel metabolic and potential re'ulatory 'enes that are induced by nitrate. 5lant 6ell J#? *IL*r*M*, +eb!ter GC4 0erner RA4 Gan!a AN (*LMT. he effect of biuret on protein synthesis in plants. 5lant 5hysiol S,/S* +7a"7a& CA4 0lunden G4 DerCin! T4 .anCin! SD (*LL0. 4i'nificance of betaines in the increased chlorophyll content of plants treated 9ith sea9eed extract. ` #ppl 5hycol H? +0*/ +0I

LL

+7a"&an C4 DenCin! T4 0lunden G4 .anCin! SD (*LLI. he role of sea9eed extracts@ Asc*ph-llu+ n*d*su+@ in the reduction in fecundity of !el*id*g-ne ?a,anica. 3undam #ppl &ematol JF? *-*/*-0 +7eeler A+ (*LT0. Endo'enous 'ro9th substances. Rep Rothamsted exp 4tn Part I? *,*/*,+ +ilCie SE4 Ro"er DM4 S&it7 AG4 +arren MD (*LLM. Isolation@ characterisation and expression of a c!&# clone encodin' plastid aspartate aminotransferase from Arabid*psis thaliana. 5lant 2ol $iol #F(S.? *++T/00 +ilCin!on DQ4 CraK:ord NM (*LL*. Identification of the Arabid*psis C'$3 'ene as the nitrate reductase structural 'ene N"A2. 5lant 6ell $?IS*/IT* +illia&! DG4 0rain IR4 0lunden G4 +ildgoo!e P04 DeKer! I (*LTI. 5lant 'ro9th re'ulatory substances in commercial sea9eed extracts. In )r*c. 6th "nternati*nal (ea:eed (-+p*siu+@ $an'or@ &orth 8ales@ TS,/TS0 +itte CP (+,,*. 2odifyin' nitro'en use efficiency? molecular manipulation of urea metabolism in leaves of (*lanu+ tuber*su+. 5h! thesis. 4cottish 6rop Research Institute@ =niversity of !undee@ !undee@ =F +itte CP4 I!idore E4 Tiller SA4 da%ie! .34 Ta-lor MA (+,,*. 3unctional characterization of urease accessory protein ; (ure;. from potato. 5lant 2ol $iol BH? *SL/*TL +itte CP4 Medina-E!*obar N (+,,*. In/'el detection of urease 9ith nitroblue tetrazolium and %uantification of the enzyme from different crop plants usin' the indophenol reaction. #nal $iochem #E'? *,+/*,T +itte CP4 Ro!!o MG4 Ro&ei! T (+,,Mb. Identification of three urease accessory proteins that are re%uired for urease activation in #rabidopsis. 5lant 5hysiol J$E? **MM/**S+ +itte CP4 Tiler SA4 Ta-lor MA4 Da%ie! .3 (+,,+. 1eaf urea metabolism in potato. =rease activity profile and patterns of recovery and distribution of *M& after foliar urea application in 9ild/type and urease/antisense trans'enics. 5lant 5hysiol J#A? **+L/**0S +itte CP4 Tiller S4 I!idore E Da%ie! .34 Ta-lor MA (+,,Ma. #nalysis of t9o alleles of the urease 'ene from potato polymorphisms@ expression and extensive alternative splicin' of the correspondin' mR&#. ` Exp $ot H((I,L.? L*/LL +ong .I4 C7an .I4 Coru??i GM4 La& .M (+,,I. 6orrelation of #4&+ 'ene expression 9ith ammonium metabolism in Arabid*psis. 5lant 5hysiol J$B(*.? 00+/+oodKard A+4 0artel 0 (+,,M. #uxin? re'ulation@ action@ and interaction. #nn $ot EH(M.? T,T/T0M +u )4 DenCin! T4 0lunden G4 %on Mende N4 .anCin! SD (*LL-. 4uppression of fecundity of the root/>not nematode@ !el*id*g-ne ?a,anica@ in monoxenic cultures of Arabid*psis thaliana treated 9ith an al>aline extract of Asc*ph-llu+ n*d*su+. ` #ppl 5hycol J'? L*/LI +u )4 DenCin! T4 0lunden G4 +7a"&an C4 .anCin! SD (*LLT. he role of betaines in al>aline extracts of Asc*ph-llu+ n*d*su+ in the reduction of !el*id*g-ne ?a,anica and !. inc*gnita infestations of tomato plants. 3undam #ppl &ematol #'? LL/*,+ )ang D4 .an I. (+,,I. 3unctional characterization of allantoinase 'enes from #rabidopsis and nonureide/type le'ume blac> locust. 5lant 5hysiol J$B? *,0L/*,IL )%in DC4 C7abot R4 Sa%ar- P (*L-L. 1es al'ues en a'riculture. Influence sur les plantes cultives et approche molculaire des mcanismes daction. 5erspect #'ric J$B? TI/-, G7uo D4 OCa&oto M4 3id&ar DD4 Gla!! AD (*LLL. Re'ulation of a putative hi'h/affinity nitrate transporter (#t&rt+B*. in roots of Arabid*psis thaliana. 5lant ` JF? MS0/MSGonia LE4 Stebbin! NE4 Pola**o DC (*LLM. Essential role of urease in 'ermination of nitro'en/ limited Arabid*psis thaliana seeds. 5lant 5hysiol J'F? *,LT/**,0

*,,

VALORISATION DES COMPETENCES Un nouveau cha !"#e $e %a "h&'e

Patricia MRIGOUT
Accompagne du mentor )ric

BI#LF1)G

)cole &octorale ABI)4

Agriculture = Alimentation = Biologie = )nvironnements H 4ant I@4,I,1, @A,IF@AL A6#F@F7I?1) (A#I4=6#I6@F@

tude du mtabolisme de la plante en rponse lapport de diffrents fertilisants et adjuvants culturaux.

Influence des phytohormones sur le mtabolisme azot.

h"se soutenue le +0 novembre +,,S !irectrice de th"se? 3ranXoise CE!E1E

*,*

AVANT-PROPOS
1es jeunes docteurs sont confronts un march du travail complexe@ au%uel ils ne sont pas ou peu prpars. Initi il y a maintenant six ans@ le pro'ramme 4al*risati*n des c*+p0tences - un n*u,eau chapitre de la th@se vise accompa'ner les doctorants afin de faciliter leur insertion professionnelle@ en les aidant valoriser leurs ac%uis dvelopps au cours de leur trois annes de recherche. 1Gassociation $ernard ;re'ory (#$;@ http?WW999.ab'.asso.fr. est maNtre doeuvre pour le compte du 2inist"re de lGEducation &ationale@ de lGEnsei'nement 4uprieur et de la Recherche@ avec le soutien de la R'ion Ile/de/3rance et du 6&R4. 1es doctorants %ui se prEtent cet exercice bnficient de laccompa'nement de mentors@ consultants en ressources humaines@ %ui aident notamment les doctorants identifier et valoriser les ac%uis autres %ue scientifi%ues de leur th"se. 2a candidature au n*u,eau chapitre de la th@se est une dmarche volontaire@ encore peu rpandue chez les doctorants. `envisa'e de rejoindre le monde de lentreprise au terme de ma th"se@ et cette prise de recul me semble ncessaire. `esp"re %ue cet exercice me donnera les atouts pour valoriser ma th"se comme une exprience professionnelle part enti"re aupr"s de futurs recruteurs. Eric $irlouez ma accompa'n dans mes rflexions tout au lon' de cet exercice. `e lui adresse mes plus sinc"res remerciements.

*,+

I. $adre gnral & en<eu* de ma thse

Fb<et% conte*te et en<eu* de mon pro<et de thse
2a th"se a port sur [ltude du mtabolisme de la plante en rponse lapport de diffrents fertilisants et adjuvants culturaux@ en particulier lure et les substances marines. 6e travail de recherche sinscrivait au cmur des enjeux a'ronomi%ues@ conomi%ues@ sociaux et environnementaux aux%uels notre a'riculture doit faire face aujourdhui. En effet@ celle/ci est confronte un terrible dilemme conomi%ue et environnemental ? comment la'riculteur peut/il concilier de forts rendements avec le respect de lenvironnement s 3inance par une convention 6I3RE (6onvention Industrielle de 3ormation par la Recherche.@ ma th"se a dbut en juin +,,0. Elle sinscrivait dans le prolon'ement de six annes de collaboration entre le laboratoire de &utrition #zote des 5lantes de lI&R# de Cersailles (&#5. et la socit $iotech2arine@ dont deux annes consacres des recherches sur les en'rais azots et lure %ue javais moi/mEme menes au &#5 dans le cadre de contrats dure dtermine. 1e pro'ramme scientifi%ue de ma th"se avait t dfini en accord et selon les intrEts de chacun des trois acteurs ? 2onsieur )avier $RI#&!@ mon tuteur industriel@ 2adame 3ranXoise CE!E1E@ ma directrice de th"se@ et moi/mEme@ la doctorante. 1a socit $iotech2arine@ filiale du ;roupe Roullier@ est une 52E implante 5ontrieux (6Ates d#rmor. et diri'e par )avier $RI#&!. 6re en *L--@ la socit emploie aujourdhui une %uarantaine de personnes et ralise plus de S, J de son chiffre daffaires linternational. 4on activit sest structure autour de deux pAles? les sciences de la beaut et les sciences du v'tal. $iotech2arine fournit des en'rais et amendements %ui visent rpondre aux besoins dune a'riculture la fois productive et respectueuse de lenvironnement. 5arall"lement@ la socit commercialise des substances biolo'i%uement actives int'res dans des fertilisants foliaires mais 'alement utiliss sur le march de la cosmti%ue et de la pharmacie. #u cours de ma th"se je me suis attache ltude des effets de lure et des substances marines sur le mtabolisme azot de la plante. En effet@ lure reprsente %uantitativement la principale forme sous la%uelle lazote est pandu sur les cultures dans le monde@ mais elle est toutefois peu utilise en 3rance. Zuant aux substances extraites des al'ues@ elles ont des vertus particuli"res ? meilleure 'estion de la fertilisation dans le respect de lGenvironnement@ induction de la croissance divers stades de culture@ dfense contre les patho'"nes et renforcement de la %ualit des cultures (protines et sucres.. 6ette valuation des effets a t ralise la fois au niveau physiolo'i%ue et molculaire 'rQce une analyse de la rponse de la plante au niveau de lexpression 'ni%ue. 1objectif tait didentifier@ laide de puces #!&@ les '"nes dont lexpression est module en rponse ces diffrents apports de fertilisants. 1un des buts de ces recherches tait de situer plus clairement lintrEt de lure compare aux autres formes possibles dapport dazote (nitrate et ammonium.. !autre part@ apr"s avoir valid les effets positifs des extraits dal'ues sur lassimilation de lazote par la plante@ nous souhaitions isoler les molcules responsables de ces effets et expliciter les modalits daction des bio/stimulants sur la physiolo'ie des plantes.

)nvironnement scientifi'ue de ma thse

2es activits de recherche se sont droules sur le site de lI&R# de Cersailles@ au sein du laboratoire de &utrition #zote des 5lantes (&#5@ =RM**.@ sous la direction de 3ranXoise *,0

CE!E1E. 1aboratoire renomm au niveau national et international@ le &#5 est spcialis dans ltude de lassimilation de lazote et de son impact sur le dveloppement de la plante. 4i le mtabolisme associ aux formes nitrate et ammonium est bien dcrit@ en revanche@ lure reprsentait une source dazote dont lassimilation par la plante navait encore jamais t tudie au &#5. #ussi mon projet de th"se tout en sint'rant pleinement dans la thmati%ue du laboratoire@ ouvrait une nouvelle voie de recherche. 1e &#5 et trois autres units de recherche de lI&R# de Cersailles (la 4tation de ;nti%ue et d#mlioration des 5lantes@ le 1aboratoire de $iolo'ie 6ellulaire@ et le 1aboratoire de $iolo'ie des 4emences. se sont re'roups en +,,+ pour former lInstitut `ean/5ierre $our'in (I`5$.. 1I`5$ permet ainsi la mise en commun de dmarches et outils de recherche pour dvelopper des approches ori'inales dans divers domaines de la biolo'ie v'tale. 1e &#5 dveloppe 'alement de nombreuses collaborations avec dautres units comme lunit de Recherche en ;nomi%ue C'tale (=R;C@ Evry. avec la%uelle nous avons ralis notre analyse fonctionnelle du 'nome sur puces #!&@ ou lunit Environnement et ;randes 6ultures (E;6@ ;ri'non. %ui a ralis certaines de nos analyses physiolo'i%ues. 1e laboratoire entretient aussi des relations avec les or'anismes de recherche implants dans le 'rand sud parisien. #u niveau national@ le &#5 travaille avec dautres laboratoires I&R# (par exemple@ un certain nombre de nos analyses ont t effectues 2ontpellier.. 6ompte tenu des enjeux a'ronomi%ues@ conomi%ues et environnementaux %ui lui sont lis@ lazote est tudi dans de nombreux laboratoires. 6ependant lure reste une source dazote actuellement peu explore. 1Institut de la &utrition des 5lantes de luniversit de <ohenheim 4tutt'art en #llema'ne@ a dbut en +,,0 un pro'ramme de recherche sur lutilisation des fertilisants base dure par les plantes et la caractrisation des transporteurs dure chez les v'taux. #u cours dune rencontre en #llema'ne avec le responsable du projet (or'anise ma demande.@ chacun dentre nous a prsent ses propres travaux@ tablissant ainsi un chan'e dinformations entre nos deux laboratoires. 6oncernant nos travaux sur les substances marines@ la socit $iotech2arine est notamment en concurrence directe avec ;oimar (4aint/2alo..

(our'uoi cette thseB

4uite aux deux annes consacres des recherches sur les en'rais azots et lure %ue javais moi/mEme menes au &#5 dans le cadre de contrats dure dtermine avec la socit $iotech2arine@ la directrice du &#5 ma propos de poursuivre le travail au cours dune th"se 6I3RE. `ai tr"s vite accept@ dune part parce %ue %uel%ues rsultats intressants mer'eaient@ et@ dautre part@ parce %ue jai t motive par le caract"re appli%u et la finalit a'ronomi%ue du projet. En effet@ tr"s proche de la nature depuis lenfance@ je nenvisa'eais pas dentreprendre des tudes de biolo'ie v'tale sans rapports directs et concrets avec le monde v'tal %ui nous entoure. En outre@ envisa'eant plutAt une carri"re professionnelle de recherche et dveloppement dans une 52E@ une th"se 6I3RE reprsentait pour moi une excellent opportunit pour dcouvrir le monde de lentreprise. 1es 'randes li'nes du projet de th"se taient donc dj traces@ et nous avons tabli ensemble@ le laboratoire@ la socit et moi/mEme@ les diffrentes strat'ies mettre en oeuvre afin de rpondre la problmati%ue de recherche.

*,I

II. &roulement% gestion & coIt de mon pro<et

)valuation et cadrage de mon pro<et de thse
2on projet de th"se devait rpondre aux objectifs et intrEts spcifi%ues non seulement de lentreprise mais aussi du laboratoire. 1e volet relatif aux voies de si'nalisation des substances al'ales intressait particuli"rement $iotech2arine. 6ependant compte tenu du caract"re alatoire des effets des extraits dal'ues sur les cultures@ la responsable du laboratoire ainsi %ue moi/mEme ne voulions nous en'a'er sur ce seul axe de recherche. 1e deuxi"me volet relatif ltude des effets de lure sur le mtabolisme et le transport de lazote permettait la fois de prendre en compte les intrEts du &#5 et de limiter le ris%ue de ne pas obtenir de rsultats si'nificatifs lissue de mon projet de recherche son terme.

$onduite de mon pro<et

!ans un premier temps@ jai analys limpact dune nutrition mixte (ammonium et nitrate. contentant ou non de lure sur des plantes de 'randes cultures comme le bl ou le ma7s (les rsultats de ces expriences initiales ont t re'roups dans un article accept pour publication sous rserve de modifications.. `ai ensuite utilis la plante mod"le Arabid*psis thaliana pour analyser plus finement ces rponses. `ai ainsi mesur leffet de laddition dure dautres sources azotes sur linflux de nitrate@ dammonium ou dure. 6es analyses physiolo'i%ues ont t compltes par des mesures ralises sur des param"tres lis au mtabolisme azot comme@ par exemple@ le contenu en nitrate ou en acides amins libres au niveau foliaire ou racinaire. !es rsultats tr"s prometteurs ont t obtenus ? ces expriences ont en effet permis de mettre en vidence des adaptations du mtabolisme ces diffrentes sources dazote %ui sont rassembles dans un second article. En parall"le@ les mEmes types dexpriences ont t effectus sur des plantes cultives sur une seule source dazote et ayant reXu ou non une pulvrisation dextraits dal'ues fournis par notre partenaire industriel $iotech2arine. 1e travail sest ensuite poursuivi au niveau molculaire par une analyse de la rponse de la plante au niveau de lexpression 'ni%ue (rponse lure ainsi %uaux extraits dal'ues.. H la fin de lanne +,,M@ nous avons fait une demande de prolon'ation de ma bourse aupr"s de l#&R . En effet nous tions toujours en attente des rsultats de ces derni"res analyses dont le temps dexploitation assez lon'. 2on financement devant se terminer fin mai +,,S@ cette chance ne me laissait pas le temps dexploiter au mieux les rsultats et den raliser le transfert vers notre partenaire priv. #fin %ue je puisse terminer ce projet et prsenter une th"se rassemblant un ensemble pertinent de donnes@ nous avons donc demand une prolon'ation de mon financement de six mois@ %ue nous avons obtenue. 6es I+ mois de th"se se sont drouls au sein dune ambiance a'rable@ sans obstacles majeurs. $nficiant dune bourse 6I3RE@ il ma fallu rpondre aux objectifs et attentes de ma directrice de th"se et de mon responsable industriel tout au lon' de ma th"se. En plus de mes deux tuteurs@ %uatre personnes ont t directement associes mon projet. Isabelle Z=I11ER (IR I&R#.@ 6hristian 2EhER (!R+ I&R#.@ 4ylvain 6<#I11:= (5r I&#/5;. et 4ylvie 4#1#2#;&E ($iotech2arine. ont particip mon encadrement scientifi%ue. &ous avons 'alement constitu un comit de th"se runissant deux reprsentants de $iotech2arine ()avier $riand et 4ylvie 4alama'ne.@ et cin% reprsentants de lI&R# (3ranXoise Cedele@ Isabelle Zuiller@ 6hristian 2eyer@ 4ylvain 6haillou et `ean/2arie 2#6<E (I&R# 1aon... &ous tions tous lis par une obli'ation de discrtion absolue

*,M

concernant les informations dont la divul'ation serait de nature nuire aux intrEts de la socit $iotech2arine. ous les six mois@ je runissais lensemble des reprsentants du comit de th"se 5aris@ devant le%uel jexposais mes derniers travaux. 4en'a'eait alors une discussion criti%ue de mes rsultats au cours de la%uelle nous dcidions des nouvelles tapes du projet. H lissue de cha%ue runion@ je rdi'eais un compte/rendu %ui devait ensuite Etre valid par la totalit des reprsentants du comit techni%ue. 5ar ailleurs@ jai rdi' des rapports dactivit annuels dcrivant ltat davancement de mes travaux@ %ue je communi%uais mes deux tuteurs industriel et scientifi%ue@ ainsi %u l#'ence &ationale de la Recherche echni%ue (#&R . pour le renouvellement de ma bourse 6I3RE. `e prsentais aussi lavancement de mon projet ainsi %ue les probl"mes rencontrs@ au cours de runions d%uipe hebdomadaires. `or'anisais 'alement des runions informelles avec ma directrice de th"se et mes responsables scientifi%ues@ cha%ue fois %ue le besoin sen faisait sentir (pour rsoudre un probl"me prcis ou prendre une dcision relative lorientation de mon projet.. ous les ans@ jexposais lavancement de mes travaux devant les %uatre %uipes du &#5@ ce %ui suscitait toujours des discussions enrichissantes. `ai 'alement prsent mon travail de th"se au cours dun expos de mi/th"se@ ouvert tous les a'ents du centre I&R# de Cersailles. Enfin jai eu lopportunit dentrer en relation avec dautres %uipes travaillant sur des projets similaires ou approchants. `ai ainsi t invite prsenter oralement mes travaux en an'lais@ luniversit de <ohenheim 4tutt'art@ dans le laboratoire du 5rof. !r. &icolaus von 8irn.

*,S

6estion financire de mon pro<et

5our raliser ce projet de recherche@ jai bnfici dune bourse 6I3RE de *S-M w brut par mois@ soit un total de T,TM+ w pour lensemble des trois annes et demi de th"se. En contrepartie des en'a'ements pris par le laboratoire &#5 pour la ralisation de mon projet@ la socit $iotech2arine lui a vers la somme annuelle de *-+0+ w 6. H la si'nature du contrat de collaboration@ le co_t annuel estim (salaires@ char'es salariales et patronales. slevait M-,,, w@ dont *IS0M w seraient pris en char'e par l#&R . 1ensemble des dpenses associes au projet est rpertori dans le tableau suivant. Te&"! *on!a*r au "ro@et I+ mois 0x+ mois I mois Ix* mois +x* mois No&bre IS, +,, S, 0, +S, +Salaire brut &en!uel 8en V9 *S-M 0,,, IM,, *M,, *M,, CoWt unitaire 8Vuro!9 0@,, +@0, +T@,, *, L **M CoWt !alarial total 8en V9 **0+0+ +--,, +--,, LS,, I-,, JAH#$# CoWt total 8Vuro!9 *0-, IS, *S+, 0,, +0I, 0++, E$#' CoWt total 8Vuro!9 M,,, JEEHH#

Per!onnel a::e*t au "ro@et !:6 :R#& 0 Responsables scientifi%ues !irecteur de th"se I techniciens + secrtaires Sou!-total Anal-!e! Physiologiques et biochimiques &itrate #zote total #cides #mins 4pectromtrie de masse Influx Transcriptomiques Sou!-total Autre! d "en!e! TOTAL

N*te= c*At salarial B salaire brut C c*tisati*ns s*ciales patr*nales8 s*it salaire brut . 186 Dle +*ntant des charges patr*nales a en effet 0t0 esti+08 en +*-enne8 E 6F G du salaire brut9.

III. $omptences & savoir=faire

$omptences techni'ues et scientifi'ues
out au lon' de mon parcours dtudiante@ jai dcouvert avec intrEt les secrets de la physiolo'ie cellulaire et molculaire de la plante. `ai dvelopp une expertise scientifi%ue assez lar'e allant des techni%ues classi%ues danalyses physiolo'i%ues@ molculaires et cellulaire@ aux techni%ues de pointe comme lanalyse transcriptomi%ue. 1ensemble de ces

*,T

comptences tant dcrit dans mon manuscrit@ je vais mattacher ici identifier les autres atouts %ue jai pu dvelopper ou mEme ac%urir au cours de ces I+ mois de th"se.

$omptences mthodologi'ues
6omme tout projet professionnel scientifi%ue@ industriel@ etc]@ la ralisation dune th"se ncessite de dterminer des objectifs prcis. 5our les atteindre@ je me suis pleinement investie dans mon travail de recherche et jai dvelopp et ac%uis des comptences multiples en gestion de projet. `ai dispos de I+ mois et dun financement dtermin pour rpondre lensemble des %uestions %ui se posaient au fur et mesure de lavancement de la th"se. `ai donc d_ mettre en place un plannin'@ respecter des chances@ or'aniser et hirarchiser mes activits@ adopter et adapter certaines mthodes de travail@ faire des choix et tablir des priorits. 6omme je lai dj vo%u@ priodi%uement je ralisais des bilans dtape@ de mEme %ue je rdi'eais r'uli"rement des comptes/rendus@ des tats davancement de mon projet@ des rapports dactivits] 1a rpartition du travail avec mes coll"'ues du laboratoire@ mais aussi dans le cadre de collaborations extrieures@ a for' un peu plus mon exprience du travail de groupe. `ai travaill en coordination avec les partenaires du projet@ demandant des efforts de communication et de transmission dinformations@ par exemple travers la rdaction de rapports dactivit tous les six mois. `ai ainsi dvelopp des comptences en gestion de partenariats. `ai aussi d_ 'rer les aspects financiers et matriels de ma th"se@ notamment pour les tudes du transcriptome %ui demandent un financement assez cons%uent. Il ma aussi fallu mettre au point un plan exprimental de culture scientifi%uement intressant et techni%uement ralisable@ %ui a t la base de toutes mes exprimentations au cours de ma th"se. 1ure et les substances marines ntant pas des objets dtude tr"s familiers pour le laboratoire@ jai d_ raliser une importante recherche biblio'raphi%ue et veille scientifi%ue@ et notamment rechercher des informations sur diffrents sites 9eb consacrs la'riculture et la%uaculture. 6ette activit ma conduite appli%uer une mthodolo'ie ri'oureuse pour rechercher@ classer@ mettre jour] afin de ne pas se perdre dans la masse des ressources disponibles. `ai aussi mobilis des capacits de synthse et esprit critique pour extraire les informations utiles et pertinentes au re'ard du projet. 2es capacits de communication ont 'alement t lar'ement mises profit. En permanence au contact dinterlocuteurs et de publics varis et multiculturels@ jai d_ apprendre expli%uer@ adapter mon lan'a'e en fonction de mes auditeurs ou lecteurs (scientifi%ues@ commerciaux@ ].@ et ainsi dvelopper mes capacits de [vul'arisation dun sujet complexe. 1aboratoire public et partenaire industriel navaient pas les mEmes attentes et des sensibilits bien distinctes. Il a donc t ncessaire %ue je madapte et %ue japprenne communi%uer avec des personnes dotes dune formation diffrente de la mienne et un lan'a'e commercial au%uel je ntais pas habitue. 1a rdaction de trois publications scientifi%ues@ de compte/rendu et de rapports dactivit@ mais aussi la ralisation de posters lors de con'r"s de scientifi%ues@ ont t autant doccasions pour renforcer mes capacits rdactionnelles ainsi %ue ma maNtrise de lan'lais. 6ela ma conduit synthtiser et choisir des termes justes et prcis.

7es 'ualits personnelles

1es expriences vcues au cours de ma th"se mont conduite non seulement mobiliser mes atouts personnels@ mais aussi en dvelopper de nouveaux et amliorer certains points faibles. #u/del des comptences scientifi%ues et des savoir/faire prati%ues dvelopps au cours de ma th"se@ ces trois annes mont apport un 'rand enrichissement personnel.

*,-

`e ne compte plus les fois oD jai d_ vaincre ma timidit naturelle? dcrocher le tlphone@ interpeller autrui@ intervenir en public] parfois dans une autre lan'ue %ue ma lan'ue maternelle] 4i ces dmarches sont aises pour certains@ elles constituaient pour moi de vritables preuves. ous ces efforts de communication ont consolid ma confiance en moi@ et aujourdhui@ jhsite beaucoup moins aller au contact dautrui. #utonomie@ flexibilit et persvranceB ces trois %ualits ont t tr"s fr%uemment sollicites au cours de ma th"se. 2on partenaire industriel tant 'o'raphi%uement loi'n@ et ma directrice de th"se ayant des responsabilits multiples@ jai souvent port seule mon projet@ et mon sens de lautonomie en a t renforc. 4i le partenariat publicWpriv apporte de nombreux avanta'es / notamment celui de dcouvrir la culture de lentreprise@ tr"s diffrente de celle dun laboratoire public / il saccompa'ne aussi de multiples obli'ations et contraintes. Il importe de faire preuve dcoute@ de patience et de flexibilit afin de satisfaire au mieux les attentes spcifi%ues de cha%ue partenaire. Enfin@ mon projet naurait jamais abouti si javais man%u de persvrance. 5ourtant@ jai bien souvent eu envie de baisser les bras@ notamment suite aux refus de publication de mon premier article. Enfin@ en dehors du cadre de ma th"se@ jai particip la vie du laboratoire en parta'eant avec une coll"'ue la responsabilit du 6omit d:r'anisation des 3Etes du laboratoire. &ous devions or'aniser un [pot de dpart cha%ue fin de contrats de sta'e@ th"se@ post/doctorat... 5our fEter &oil@ nous dcorions le hall dentre du traditionnel sapin de &oil@ et nous or'anisions cha%ue anne le repas de &oil. 3Ete des Rois@ pi%ue/ni%ue avant les dparts dt] cha%ue occasion faisait lobjet dune petite fEte. out ceci ma demand du temps@ de la patience et de la diplomatie pour rcolter des fonds aupr"s de mes coll"'ues@ de la crativit pour rechercher de nouvelles ides] 6ette exprience a t dune 'rande richesse humaine et encore une fois@ elle ma rendue plus forte face aux difficults %uotidiennes.

I0. #sultats & impacts de ma thse

4ur le plan scientifi%ue@ mon travail a accru la comprhension des mcanismes dabsorption et dassimilation de lure par les plantes. !ans le cadre de mon projet@ un protocole de dosa'e de lure dans la plante a t mis au point au laboratoire. 1ure tait jus%u prsent une source dazote non explore par les %uipes du laboratoire et mon travail a ouvert une nouvelle voie de recherche. Enfin@ ne n'li'eons pas lapport financier de mon projet pour le laboratoire@ ainsi %ue son ouverture au monde industriel. 5our le partenaire industriel@ la meilleure connaissance des processus mis en oeuvre par la plante pour utiliser lure va permettre dapporter des rponses aux a'riculteurs encore rticents utiliser lure comme en'rais azots. H plus lon' terme@ la commercialisation des fertilisants uri%ues sera peut/Etre accrue. En outre@ nos rsultats sur les substances marines pourraient contribuer une future homolo'ation et mise sur le march de lextrait dal'ue test au cours de ma th"se. Enfin@ suite ce travail@ trois articles scientifi%ues ont t rdi's (ou sont en cours de rdaction.. H ce jour@ le premier est accept pour publicationB le deuxi"me ncessite des corrections avant dEtre soumisB et le dernier est en cours de rdaction. !un point de vue personnel@ je suis fi"re dEtre arrive au bout de ce lon' chemin] &anmoins@ je suis aussi toute aussi impatiente de tourner la pa'e et de men'a'er vers un autre chemin. #ujourdhui je souhaite mettre mes comptences la disposition dune petite ou moyenne entreprise du secteur a'ro/alimentaire. # la diffrence dun 'roupe industriel ou *,L

dune 'rande entreprise@ une 52E peut me permettre daccder rapidement des niveaux de responsabilit importants@ en lien avec plusieurs fonctions? concevoir et piloter un projet de recherche et dveloppement@ dfinir et 'rer la politi%ue %ualit@ assurer la 'estion des aspects r'lementaires] 1es comptences ac%uises me permettront aussi dlar'ir mon march de lemploi des domaines tels %ue la scurit alimentaire@ lvaluation du ris%ue ou encore les tudes toxicolo'i%ues propres la'roalimentaire. `e ncarte pas non plus la possibilit de prospecter les entreprises spcialises dans lenvironnement.

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