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TRABAJO PRCTICO N 2

Obtencin e identificacin de macrfagos peritoneales de ratn

Julia DAngelo Tatiana Noya Abad Inmunologa e Inmunogentica Ciencias Biolgicas Universidad Maimnides 2013

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INTRODUCCIN
Los macrfagos juegan un papel crtico en el desarrollo de la respuesta inmunitaria, debido a que actan como primera barrera de defensa, al detectar y eliminar partculas extraas (microorganismos, macromolculas txicas, clulas propias daadas o muertas) mediante fagocitosis o secrecin de enzimas, citoquinas o produccin de especies reactivas de oxgeno (ROS) y nitrgeno (RNS). Durante la respuesta inmunitaria adaptativa los macrfagos presentan antgenos a los linfocitos T en el contexto de MHC-II y/o MHC-I, y colaboran con la respuesta humoral en la eliminacin de agentes extraos. Adems, los macrfagos tienen un papel importante en procesos de reparacin de heridas y resolucin de la inflamacin, promoviendo el reclutamiento de otras clulas inflamatorias hacia los focos de inflamacin, as como a remodelacin de matriz extracelular y angiognesis. En consecuencia, el trmino macrfago agrupa una multiplicidad de clulas cuya finalidad es el mantenimiento de la homeostasis y la integridad tisular. Se originan a partir de HSC, y derivan en su mayora de monocitos circulantes que se extravasan a los tejidos por el influjo de citoquinas y quimioquinas. A pesar de ello, un pequeo porcentaje de macrfagos (aprox. 5%) derivan de la divisin local de fagocitos mononucleares en los tejidos. Los macrfagos juegan un papel central en la modulacin de la inmunidad humoral y celular en contra de enfermedades infecciosas y del cncer. Las funciones inmunomoduladoras del macrfago dependen de su activacin por seales de sensibilizacin, provistas principalmente por citocinas, tales como el interfern-gamma (IFN-) y por seales de activacin como el lipopolisacrido (LPS). Los macrfagos

activados producen mediadores de citotoxicidad, tales como el xido ntrico y el factor de necrosis tumoral-alfa (TNF-), los cuales protegen al organismo en contra del desarrollo de infecciones y tumores.

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OBJETIVOS
- Llevar a cabo, de manera precisa, la metodologa planteada, para obtener el resultado esperado. - Obtener e identificar macrfagos peritoneales de ratn. - Leer la fluorescencia resultante de la unin macrfago anticuerpo. - Observar la diferencia entra macrfagos activos con LPS y no, por medio de la incorporacin o no del NBT.

METODOLOGA
Se inyect intraperitonealmente, mediante el uso de una jeringa de 5 ml, 3 ml de medio de cultivo suplementado con 0,02 % de EDTA y 5 % de suero bovino fetal (SBF) a seis ratones. Se sacrificaron y se les masaje suavemente la zona abdominal durante unos minutos. Se realiz un corte longitudinal en la piel del animal, se realiz un pequeo orificio en el msculo para extraer el lquido peritoneal con una pipeta pasteur y se verti en dos tubos Falcon de 15 ml en hielo (un tubo para el medio extrado de tres ratones: muestra 1, y otro para lo extrado de los otros tres ratones: muestra 2). Se centrifug los dos tubos 10 min a 1500 rpm. Se resuspendi el pellet obtenido en cada uno en 5 ml del medio de cultivo suplementado. Se repiti la centrifugacin (10 min a 1500 rpm) y la resuspensin del pellet obtenido (lavado). Se tom 50 l de cada suspensin celular (muestra 1 y 2) y se colocaron, cada una, en un tubo eppendorf con 950 l de cido actico (dilucin 1:20). Tanto la muestra 1 como la 2 se sembraron en una cmara de Neubauer por separado, con el fin de realizar el recuento de clulas mononucleares totales. Luego de contar y obtener el nmero de clulas por ml, se sembraron las dos muestras en dos Lab-teck. En uno de los Lab-teck, en el primer well se agreg 450 l de la muestra 1 ms el anticuerpo anti macrfago de ratn floresceinado (F4/80), en el segundo well se verti 220 l de la muestra 2 ms dicho anticuerpo, y en el tercero 220 l de la
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muestra 2 con PBS sin el anticuerpo como control negativo. En el segundo Lab-teck, en el primer well se agreg 220 l de la muestra 2 ms 100 l de LPS (lipopolisacrido de E. coli) ms 200 l de NBT 0,15 % (nitroblue de tetrazolio), y en el otro 450 l de la muestra 1 con 100 l de plasma humano normal sin LPS como control negativo. El Lab-teck con LPS, se incub 30 min en estufa a 37 C, mientras que el Lab-teck con el anticuerpo se incub 1 h en heladera. Ambos, envueltos en papel de aluminio. Se retir el sobrenadante (clulas no adherentes), el segundo Lab-teck se ti con safranina durante 2 min (tincin de contraste), y ambos se lavaron 2 veces con medio fresco. Se sac el ltimo sobrenadante del lavado, se dej secar los Lab-teck, se retiraron las paredes de los mismos, se coloc un cubreobjetos en cada uno, y se observ la fluorescencia del primer Lab-teck (en un microscopio de fluorescencia), y los macrfagos activados que incorporaron el NBT del segundo Lab-teck en un microscopio ptico.

RESULTADOS
Tras realizar el conteo en la cmara de Neubauer, se obtuvieron 2.650.000 clulas/ml en la muestra 1 y 4.150.000 clulas/ml en la muestra 2, mediante el siguiente clculo: N de clulas totales x 20 ml x 10 ml
x 1000

4 cuadrantes Referencias: N de clulas totales = suma de las clulas mononucleares contadas en los 4 cuadrantes 20 ml = 20/1 (la inversa de la dilucin realizada) 10 ml = volumen de la cmara 1000 = pasaje de mm a ml

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En un microscopio de fluorescencia se observ un gran nmero de macrfagos fluorescentes, gracias a la unin de los mismos con el anticuerpo anti F4/80 (anti macrfagos de ratn fluoresceinado) en el primer y segundo well del Lab-teck, no as en el tercer well o control negativo (sin anticuerpo). En un microscopio ptico, en el segundo Lab-teck, se observ la diferencia entre los macrfagos activos con LPS y no. Los activos del primer well incorporaron NBT, por lo que se visualizaron de color rosa con grnulos azules denominados formazn. En el segundo well o control negativo (sin LPS) no se vieron macrfagos activos (con formazn).

DISCUSIN
Durante la experiencia, se utiliz ms la muestra 2 que la 1, debido a que contena un mayor nmero de clulas. La activacin de los macrfagos de ratn se puede lograr mediante el IFN-g secretado por el TH, o por la endotoxina (lpido A) de las bacterias gram-negativas. A su vez, los macrfagos activados secretan TNF-a, que al actuar sobre otros macrfagos ya activados provocan una mayor potenciacin de sus capacidades por medio de la ruta dependiente del xido ntrico. El NBT en su forma no reducida es una tintura amarilla y nicamente es introducido dentro de los fagosomas si las clulas son estimuladas para la actividad fagoctica. Al producirse la reduccin intracelular forma cristales azules (formazn) que son visibles al microscopio ptico. Por lo tanto esta tcnica brinda informacin acerca de la funcin fagoctica, y al mismo tiempo sirve como parmetro de actividad metablica ya que su reduccin se debe principalmente al trasporte de electrones de NAD(P)H a NADH durante el metabolismo de la glucosa 6 fosfato. Cabe destacar la acciona de la safranina (colorante
biolgico)

utilizada como contraste en esta tcnica de tincin. La Resultados arrojaron que

en el segundo Lab-teck, exista una diferencia entre los macrfagos activos con LPS y los que no se encontraban activos. Se observ que en el primer well la incorporacin de NBT
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fue exitosa, por lo que los macrfagos se visualizaron de color rosa con grnulos azules denominados formazn, mientras que en el segundo well o control negativo no se observaron macrfagos activos (con formazn), ya que no posean LPS. La inmunohistoqumica es un grupo de tcnicas que se basan en la capacidad de los anticuerpos de unirse especficamente a los correspondientes antgenos. Esta reaccin es visible slo si el anticuerpo est marcado con una sustancia que absorbe o emite luz o produce coloracin. Sin afectar la capacidad del anticuerpo para formar un complejo con el antgeno, aplicado a una muestra de tejido orgnico, correctamente fijada e incluida en parafina. Utilizando alguna de las tcnicas especficas (peroxidasa antiperoxidasa, fluorescena, etc.), el complejo antgeno - anticuerpo as formado puede localizarse e identificarse en las muestras tisulares o citolgicas a estudiar, con lo que se identifican los marcadores antignicos caractersticos de distintas lneas de diferenciacin y funcionalismo celular y se determina el tipo de clula involucrado en la muestra. En este prctico se utiliz inmunouorescencia directa con el anticuerpo de rata anti-ratn F4/80 es especfico de macrfagos Se observ un gran nmero de macrfagos fluorescentes, gracias a la unin de los mismos con el anticuerpo anti F4/80 en el primer y segundo well del Lab-teck, no as en el tercer well o control negativo ya que estaba incubado sin anticuerpo.

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BIBLIOGRAFA
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