PRACTICA No. 9 CRECIMIENTO DE MICROORGANISMOS GRAMNEGATIVOS EN DIFERENTES MEDIOS DE CULTIVO Cuestionario: 1.

- Investiga la frmula y preparacin de los siguientes medios de cultivo: Agar Mac Conkey, Agar SS, Agar sulfito de bismuto, agar XLD, agar ENDO y agar EMB Agar Mac Conkey Frmula* purificada por litro de agua Rojo neutro 0,03 Cristal violeta 0,001 Agar 13,5

Digerido pancretico de gelatina 17,0 g Digerido pancretico de casena 1,5 Digerido pptico de tejido animal 1,5 Lactosa 10,0 Sales biliares 1,5 Cloruro sdico 5,0

Preparacin Suspender 50 g del polvo por litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar hasta uniformar. Calentar suavemente y hervir 1 a 2 minutos hasta disolver. Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos.

Agar SS Frmula (en gramos por litro)

Verde brillante 0.00033 Rojo neutro 0.025

Preparacin Pluripeptona 5.0 Extracto de carne 5.0 Lactosa 10.0 Mezcla de sales biliares Citrato de sodio 8.5 Tiosulfato de sodio 8.5 Citrato frrico 1.0 Agar 13.5 Suspender 60 g del polvo por litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar hasta homogeneizar. Calentar a ebullicin durante 2 o 3 minutos. NO ESTERILIZAR EN AUTOCLAVE. Enfriar a 45-50C y distribuir unos 20 ml por placa. Secar la superficie del medio unos minutos en la estufa.

8.5

Agar sulfito de bismuto Frmula (en gramos por litro) Peptona bacteriolgica 10.00 Fosfato Disodico 4.00 Indicador bismuto sulfito 8.00 Sulfato Ferroso 0.30 Extracto de Carne 5.00 Verde Brillante 0.025 Dextrosa 5.00 Agar Bacteriolgico 20.00 Final pH 7.5 0.2 a 25C Preparacin Suspender 52,3 gramos del medio en un litro de agua destilada. Mezclar bien y calentar agitando continuamente. Hervir durante un minuto o hasta que el medio se disuelva por completo. EVITAR EL SOBRECALENTAMIENTO.NO AUTOCLAVAR Dejar que el medio se enfre a 45C (muy importante) y sin dejar de agitar verter en placas de Petri. El color del medio preparado es blanco opaco con tinte verde. El medio preparado en placa debe conservarse entre 8-15C. El medio deshidratado debe ser homogneo, libre de floculos y de color beige claro. Si hay algn cambio fsico no utilizar el medio.

Agar XLD Frmula (en gramos por litro) Xilosa 3,75 g L- Lisina 5,0 g Lactosa 7,5 g Sacarosa 7,5 g Cloruro de Sodio 5,0 g Extracto de Levadura 3,0 g Rojo Fenol 0,08 g Desoxicolato de Sodio 2,5 g Tiosulfato de Sodio 6,8 g Citrato Frrico de Amonio 0,8 g Agar 15,0 g Agua destilada c.s.p. 1000 mL

pH final 7,4 0,2

Preparacin Suspender 57 g de medio en un litro de agua destilada. Mezclar vigorosamente. Calentar con agitacin suave hasta que el medio llegue a ebullicin. Evitar el sobrecalentamiento ya que puede provocar la precipitacin del medio. Este medio NO se puede esterilizar por autoclave. Enfriar en una temperatura entre 45-55C en un bao mara y verter en placas de Petri estriles

Agar ENDO

Frmula (en gramos por litro) Fosfato dipotsico 3,5 g Digerido pptico de tejido animal 10,0 g Agar 15,0 g Lactosa 10,0 g Sulfito de sodio 2,5 g Fucsina bsica 0,5 g Agua destilada c.s.p. 1000 mL pH final 7,5 0,2

Preparacin Suspender 41.5 g del polvo deshidratado en un litro de agua destilada. Mezclar vigorosamente. Calentar agitando frecuentemente y dejar hervir durante un minuto para disolver completamente los gradientes. Esterilizar a 121 C durante 15 minutos. Dejar enfriar entre 45-50C y resuspener el precipitado por agitacin antes de su uso.

Agar EMB Frmula (en gramos por litro) Peptona 10.0 Lactosa 5.0 Sacarosa 5.0 Fosfato dipotsico Agar 13.5 Eosina 0.4 Azul de metileno pH final: 7.2 0.2 Preparacin Suspender 36 g del polvo en un litro de agua destilada. Reposar 5 minutos; mezclar, calentando a ebullicin durante 1 o 2 minutos hasta su disolucin. Esterilizar en autoclave a no ms de 121C durante 15 minutos. Enfriar a 45C y distribuir agitando suavemente.

2.0

0.065

2.- Da 5 ejemplos de microorganismos gramnegativos Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Proteus mirabilis Enterococcus faecalis Shigella flexneri Salmonella typhimurium

3.- Qu componentes estn presentes en un medio de cultivo?

Consta de un gel o una solucin que cuenta con los nutrientes necesarios para permitir, en condiciones favorables de pH y temperatura, el crecimiento de virus, microorganismos, clulas, tejidos vegetales o incluso pequeas plantas. Segn lo que se quiera hacer crecer, el medio requerir unas u otras condiciones. Generalmente se presentan desecados en forma de polvo fino o granular antes de ser preparados; ya preparados pueden encontrarse en estado slido, semislido o lquido.

4.- Menciona el fundamento del Mac Conkey En el medio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y la mezcla de sales biliares y el cristal violeta son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de gran parte de la flora Gram positiva. Por fermentacin de la lactosa, disminuye el pH alrededor de la colonia. Esto produce un viraje del color del indicador de pH (rojo neutro), la absorcin en las colonias, y la precipitacin de las sales biliares. Los microorganismos no fermentadores de lactosa producen colonias incoloras.

5.- Qu otros medios de cultivo, diferentes a los empleados en esta prctica, pueden ser utilizados para el crecimiento de gramnegativos? AGAR BBE ( Bacteroides Bilis Esculina) AGAR KLIEGER (KIA) AGAR MUELLER-HINTON AGAR THAYER-MARTIN AGAR CLED

6.- De los medios utilizados en la prctica llena el siguiente cuadro

Medio

Tipo de medio Diferencial selectivo Diferencial selectivo

Indicadores

Vire del indicador (pH) cido neutro bsico Rojo: lactosa positivo Amarillo/incoloras: lactosa negativo Rosas/rojo: acido Incoloras: bsico Negro: produccin de cido sulfhdrico Precipitado negro: produccin de sulfuro de hidrogeno Halo negro con brillo metlico: reduccin de iones bismuto Amarillo: acido Centro negro: produccin de H2S (condiciones alcalinas) Rojo: alcalino Negro azulado: acido Transparente: alcalino

Inhibidores

Fuente de carbono lactosa

Mac Conkey SS

Rojo neutro

Cristal violeta Sales biliares Sales biliares Verde brillante

Rojo neutro

lactosa

Sulfito de bismuto

Selectivo

Indicado sulfito de bismuto

Sulfito de bismuto Verde brillante

Dextrosa

XLD

Selectivo diferencial

Rojo de fenol Tiosulfato de sodio y citrato frrico de amonio

Desoxicolato de Lactosa sodio Sacarosa Lisina

EMB

Selectivo

Eosina Azul de metileno

Lactosa Sacarosa

7.- Dibuja las placas antes y despus de inocular

Shiguella Sonnei
Agar: Mac Conkey EMB SS SB XLD

Vibrio choleare
Agar TCBS

PRACTICA No. 10 OBSERVACIN DE MORFOLOGA COLONIAL GRAMNEGATIVOS Cuestionario: 1.- Morfolgicamente Qu tipos de colonias bacterianas existen? (Esquematiza)

2.- Completa la siguiente tabla: Caracterstica Agar: EMB Agar: XLD Agar: Mc C Agar: TCBS Tamao (mm) Color 2 CAFE 2 ROJOAMARILLO Forma: puntiforme circular irregular Elevacin: plana elevada convexa pulvinada umbonada Superficie: lisa rugosa Aspecto: hmedo seco Bordes: enteros irregulares filamentosos Luz reflejada: brillante mate
Luz transmitida:

2 CAF

3 AMARILLO

* *

* *

* * * * * * * * * * * * * * * *

opaca translcida transparente Consistencia suave dura

* * * * * * * *

3.- Se present la misma morfologa en los diferentes medios de cultivo?, si hubo variaciones explica a qu crees que se deban?

A la presencia de inhibidores o bien por fallas en la inoculacin

4.- Por qu es importante conocer la morfologa de las bacterias en los diferentes medios de cultivo? Para identificar al microorganismo

5.- Realiza la tincin de gram y dibuja tus observaciones

PRACTICA No. 11 CRECIMIENTO DE MICROORGANISMOS GRAMPOSITIVOS EN DIFERENTES MEDIOS DE CULTIVO Cuestionario: 1.- Menciona 5 ejemplos de bacterias grampositivas Bacillus, Clostridium Corynebacterium Lactobacillus, Listeria Staphylococcus Streptococcus

2.- Qu otros medios de cultivo, diferentes a los empleados en esta prctica, pueden ser utilizados para el crecimiento de grampositivos? Agar Gardnerella Estafilococo 110 Agar Mueller Hinton Agar

3.- Menciona el fundamento del sal y manitol e indica el grupo bacteriano que crece en este medio Se trata de un medio altamente selectivo debido a su alta concentracin salina. Los estafilococos coagulasa positiva hidrolizan el manitol acidificando el medio; las colonias aparecen rodeadas de una zona amarilla brillante. Los estafilococos coagulasa negativos, presentan colonias rodeadas de una zona roja o prpura. Las colonias sospechosas, se repicarn en un medio sin exceso de cloruro de sodio para efectuarles, posteriormente, la prueba de la coagulasa. En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, constituyen la fuente de carbono, nitrgeno, vitaminas y minerales, el manitol es el hidrato de carbono fermentable, el cloruro de sodio (que se encuentra en alta concentracin) es el agente selectivo que inhibe el desarrollo de la flora acompaante, y el rojo fenol es el indicador de pH.

Las bacterias que crecen en un medio con alta concentracin de sal y fermentan el manitol, producen cidos, con lo que se modifica el pH del medio y vira el indicador de pH del color rojo al amarillo. Los estafilococos crecen en altas concentraciones de sal, y pueden o no fermentar el manitol. Los estafilococos coagulasa positiva fermentan el manitol y se visualizan como colonias amarillas rodeadas de una zona del mismo color. Los estafilococos que no fermentan el manitol, se visualizan como colonias rojas, rodeadas de una zona del mismo color o prpura. 4.- De los medios utilizados llenar el siguiente cuadro:

Medio Sal y manitol Sangre cordero

Tipo de medio Selectivo diferencial

Indicadores Rojo de fenol

Vire del indicador (pH) cido neutro Amarillo: acido Rojo/purpura: alcalino bsico

Inhibidores Cloruro de sodio

Fuente de carbono Pluripeptona

Enriquecido Infusin de Msculo de Corazn

Halo transparente alrededor de estas: microorganismo beta-hemoltico. Halo color verdoso alrededor de estas: microorganismo alfa-hemoltico. Sin hemlisis: microorganismo gamma-hemoltico.

Peptona

Chocolate

Enriquecido

Peptona

PRCTICA 12 OBSERVACIN DE MORFOLOGA COLONIAL GRAMPOSITIVOS Cuestionario: 1.- Se present la misma morfologa en los diferentes medios de cultivo?, si hubo variaciones explica a qu crees que se deban? Si, la cual se ve alterada por el tipo de medio as como del microorganismo e inoculacin

2.- Realiza la tincin de gram y dibuja tu observacin

SAL Y

ASC

3.- Completa la siguiente tabla: Caracterstica Agar: SM Agar: CHOCOLATE 1. tamao (mm) 2. color 3 Forma: puntiforme circular irregular 4. elevacin: plana elevada convexa pulvinada umbonada 5. superficie: lisa rugosa 6. aspecto: hmedo seco 7. bordes: enteros irregulares filamentosos 8. luz reflejada: brillante mate
9.luz transmitida:

Agar: SC

0.5 ROSA

NEG CAFE

2 ROJO

* *

* * * *

opaca translcida transparente

10. consistencia:

* *

suave dura