LIBRO Nuevas Fuentes de Antioxidantes Naturals

PORTADA INTERNA DEL LIBRO
CRDITOS
Indice
Pgina
Introduccin ........................................................................................................10 FUENTES NOVELES DE ANTIOXIDANTES ...........................................................10 Alejandro Fernndez Barrero, M. Mar Herrador del Pino, Pilar Arteaga Burn, Jos Qulez del Moral y Jess Fernndez Arteaga MERCADO Y TECNOLOGAS DE EXTRACCIN ...................................................10 Ana Tymoschouk LA AUTOXIDACIN Y LA RANCIDEZ. TEORA....................................................10 Alfredo Rosas Romero AUTOXIDACIN Y RANCIDEZ. ANALTICA ..........................................................10 Alfredo Rosas Romero EL ESTRS OXIDATIVO. TEORA..........................................................................10 Olga Sonia Len de Fernndez ESTRS OXIDATIVO. ANALTICA Mtodos de estudio in vivo de extractos y productos antiinamatorios .....10 Ros JL, Recio MC, Giner RM y Mez S Determinacin de la actividad antioxidante en sistemas biolgicos ...........10 Schinella G.R., Tournier H., Gngora L., Ros J.L. EL DISEO EXPERIMENTAL ................................................................................10 Alfredo Rosas Romero y Gloria Saavedra DESCRIPCIN DE LAS PLANTAS Introduccin ..................................................................................................10 Alfredo Rosas Romero Plantas bolivianas .........................................................................................10 Gloria Saavedra Frutas colombianas .......................................................................................10 Benjamn Rojano Plantas paraguayas .......................................................................................10 Edelira de Velzquez Plantas mediterrneas ..................................................................................10 Jos Luis Ros LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE 41 PLANTAS BOLIVIANAS ..........................10 Alfredo Rosas Romero, Benjamn Rojano y Gloria Saavedra
CAPACIDAD ATRAPADORA DE RADICALES LIBRES Y CONTENIDO DE FENOLES DE ALGUNAS FRUTAS TROPICALES COLOMBIANAS ....................10 Benjamn Rojano, Francoise Bonavoir, Carlos Andrs Gaviria M, Carlos E Monsalve, Guillermo Arrazola y Alfredo Rosas Romero LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE PLANTAS PARAGUAYAS .............................10 Alfredo Rosas Romero y Edelira Velzquez ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE Y CAPTADORA DE RADICALES EN NUEVE ASTERACEAE BOLIVIANAS ...............................................................10 Irene Parejo, Francesc Viladomat, Jaume Bastida, Alfredo Rosas Romero, Gloria Saavedra, M. Antonia Murcia, Antonia M. Jimnez, Carles Codina COMPUESTOS ANTIOXIDANTES DEL HINOJO AMARGO. Foeniculum vulgare .....10 Carles Codina, Irene Parejo, Jaume Bastida, Jess Burillo, Francesc Viladomat Helichrysum italicum. COMO ANTIOXIDANTE Y ANTIINFLAMATORIO ................10 Ros JL, Schinella GR, Sala A, Recio MC Phagnalon rupestre. COMO ANTIOXIDANTE Y ANTIALRGICO Ros JL, Schinella GR, Gngora L, Mez S, Giner RM PODER ANTIOXIDANTE DE LOS ESTILBENOS. RELACIONES, ACTIVIDAD, ESTRUCTURA Y MECANISMOS ................................10 Alejandro Fernndez Arteaga FITOQUMICA DE Ophryosporus heptanthus .........................................................10 Alejandro F. Barrero, Pilar Arteaga, M. Mar Herrador, Jess F. Arteaga y Alfredo Rosas Romero DOMESTICACIN Y EXPLOTACIN COMERCIAL de la Salvia canariensis............10 Javier G. Luis, Luca S. Andrs, Joaqun G. Marrero DOMESTICACIN DE PLANTAS AROMTICAS Y MEDICINALES COMO FUENTE POTENCIAL DE ANTIOXIDANTES ...................10 Jess Burillo, Irene Parejo, Francesc Viladomat, Jaume Bastida, Alfredo Rosas Romero, Carles Codina
Prologo I
Resltame sumamente grato prologar esta obra, producto de la labor mancomunada de un conjunto de prestigiosos profesionales liderados con eciencia y capacidad por parte del Dr. Alfredo Rosas Romero. El tema motivo de estos estudios es harto importante, en primer lugar para nuestra regin, pero adems para el mundo industrializado. Los antioxidantes de uso habitual actualmente son de origen sinttico y en ello radica su pecado de origen: se encuentran fuertemente cuestionados, cuando no en algunos casos prohibidos, en sus aplicaciones en alimentos, frmacos o cosmticos. All reside, precisamente, la razn de ser y fortaleza del presente estudio. En el mismo, se ha efectuado una exhaustiva bsqueda y seleccin de especies vegetales de nuestra regin posibles de proveer molculas aptas por su poder antioxidante. Una vez obtenidos los extractos del caso, se realizaron los ensayos de determinacin de dicho poder. Todo ello implic una labor cooperativa llevada a cabo entre los distintos grupos de investigacin participantes segn fuera su especializacin. Con ello, estamos cumpliendo con uno de los requisitos del CYTED: incentivar la labor cooperativa. Va de suyo que tambin hemos cumplido con el otro requisito bsico cual es el de producir resultados de utilidad para las sociedades de nuestra regin con posibilidades ciertas de transferencia al sector productivo. En todo ello radica nuestro orgullo y obliga a extender a todos los responsables de esta obra nuestras ms efusivas congratulaciones.
Roberto E. Cunningham Coordinador Internacional del Subprograma IV del CYTED
Prologo II
Tiene usted en sus manos los resultados del trabajo de investigacin realizado por los integrantes del Proyecto IV.11 del CYTED, titulado Desarrollo de Antioxidantes de Origen Natural e Inters Comercial. Durante cuatro aos nos hemos dedicado a la evaluacin de potenciales nuevas fuentes de antioxidantes naturales. Participaron 12 instituciones de 7 pases iberoamericanos: Argentina, Bolivia, Colombia, Cuba, Espaa, Paraguay y Venezuela. De los resultados no hablaremos en estas lneas, porque sucientes pginas dedicaremos luego a ello. Preferimos referirnos a frutos del proyecto que por su naturaleza intangible podran pasar desapercibidos. El primero de ellos es habernos conocido. Haber trabajado coordinadamente, en una relacin de pares entre pares, fue una de las caractersticas denitorias de la ejecucin del proyecto y , para nosotros, unos de los ms importantes logros. En suma, pertenecemos a 10 universidades y 2 institutos de investigacin. Sobre esa infraestructura nos apoyamos, porque sin ella no sera factible la cooperacin entre 7 pases. Las exigencias del proyecto nos enfrentaron con las fortalezas y debilidades de nuestras instituciones, con lo que nos qued rearmado el sentido de pertenencia a ellas y la inminente necesidad de compartir y cooperar. Jos Antonio Cordero ejerci la Secretara del CYTED durante el lapso de ejecucin del proyecto. Su liderazgo gerencial y su calidez humana fueron estmulos determinantes para lograr las metas que tenamos planteadas. Al personal del CYTED en Madrid, nuestras palabra de reconocimiento. Roberto Cunningham, Coordinador de nuestro Subprograma CYTED, el IV: Biomasa como Fuente de Productos Qumicos y Energa, con su proverbial habilidad y estilo, pendiente en todo momento del curso, timone el proyecto como imperceptiblemente. Sin rdenes, con la opinin. Grata experiencia. Nos hemos esforzado por redactar en lenguaje asequible a industriales y profesionales de campos vecinos; cuidndonos de mantener el rigor que nos exigen los especialista del rea. Y, de antemano ofre-
cemos nuestras excusas por las costuras que se notarn en esta obra tejida a varias manos. Dedicamos el libro a nuestros estudiantes. Tiene usted en sus manos los resultados del trabajo de investigacin realizado por los integrantes del Proyecto IV.11 del CYTED, titulado Desarrollo de Antioxidantes de Origen Natural e Inters Comercial.
Alfredo Rosas Romero, editor Coordinador Internacional del Proyecto IV.11. Caracas, 2 de abril de 2004
Programa de Cooperacin Iberoamericano Ciencia y Tecnologa para el Desarrollo (CYTED) www.cyted.org

El Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnologa para el Desarrollo (CYTED) fue creado en 1984 mediante un Acuerdo Marco Interinstitucional rmado por 19 pases de Amrica Latina, Espaa y Portugal. El Programa CYTED se dene como un programa internacional de cooperacin cientca y tecnolgica multilateral, con carcter horizontal y de mbito iberoamericano. El Programa CYTED tiene como objetivo principal contribuir al desarrollo armnico de la Regin Iberoamericana mediante el establecimiento de mecanismos de cooperacin entre grupos de investigacin de las Universidades, Centros de I+D y Empresas innovadoras de los pases iberoamericanos, que pretenden la consecucin de resultados cientcos y tecnolgicos transferibles a los sistemas productivos y a las polticas sociales.
D. Fernando Aldana Mayor
Secretario General Programa Cyted C/ Amaniel, 4 28015. Madrid ESPAA Telfonos: (34) 609 000 189 / (34) 91 531 63 87 Fax: (34) 91 522 78 45 Subprograma IV. BIOMASA COMO FUENTE DE PRODUCTOS QUIMICOS Y ENERGIA Dr. Roberto E. Cunningham, Coordinador Internacional Proyecto IV.11. Desarrollo de Nuevas Fuentes de Antioxidantes de Inters Industrial Dr. Alfredo Rosas Romero, Coordinador
FUENTES NOVELES DE ANTIOXIDANTES

Alejandro Fernndez Barrero, M. Mar Herrador del Pino, Pilar Arteaga Burn, Jos Qulez del Moral y Jess Fernndez Arteaga afbarre@goliat.ugr.es
Alejandro Fernndez Barrero, M. Mar Herrador del Pino, Pilar Arteaga Burn, Jos Qulez del Moral y Jess Fernndez Arteaga
Departamento de Qumica Orgnica, Facultad de Ciencias, Instituto de Biotecnologa, Universidad de Granada, Campus de Fuentenueva, s/n. 18071 Granada, Espaa.
Introduccin
Los antioxidantes son compuestos que inhiben o retrasan la oxidacin de otras molculas, inhibiendo la iniciacin o propagacin de las reacciones oxidativas en cadena. Los antioxidantes naturales constituyen un amplio grupo de compuestos que incluye principalmente compuestos polifenlicos y vitaminas (Velioglu et al., 1998). Hoy da numerosas enfermedades se asocian con la formacin de oxgeno reactivo y la induccin de peroxidacin lipdica. Las especies de oxgeno reactivo constituyen un mecanismo de injuria tisular y son relevantes en procesos de inamacin y envejecimiento, en trastornos cardiovasculares y neurodegenerativos, etc. (Ramarathman et al., 1996). Esto ha conducido a una intensa investigacin del uso de los antioxidantes presentes en los alimentos, as como de los procedentes de otras fuentes, para la prevencin de este tipo de enfermedades. Por otra parte, el inters de los antioxidantes no solo reside en su utilidad como frmacos, sino tambin en su uso como aditivos industriales. Fundamentalmente se utilizan como conservantes de alimentos, plsticos, caucho, cosmticos y aceites y grasas industriales.
Fuentes de compuestos polifenlicos con actividad antioxidante

Este tipo de compuestos constituyen el grupo ms numeroso de antioxidantes, encontrndose en un amplio nmero de plantas. Dife13
NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES
rentes fracciones butanlicas obtenidas a partir del extracto etanlico del orujo, subproducto obtenido en la produccin de aceite de oliva, han mostrado interesantes propiedades antioxidantes (Amro et al., 2002). En las fracciones ms potentes se han identicado los cidos ferlico 1, cafico 2, cinmico 3, cumrico 4 y protocatequico 5. La presencia de estos compuestos hacen a estos extractos tiles para su aplicacin en cosmticos, principalmente en cremas antiarrugas.
El alpechn, otro subproducto obtenido en la elaboracin del aceite de oliva, tiene un alto contenido en hidroxitirosol 6, compuesto que ha mostrado notable actividad antioxidante, adems de los cidos ferlico 1, cafico 2 y cumrico 4. Algunos polifenoles aislados del alpechn se emplean como antioxidantes de grasas y aceites (Janer del Valle, 1980).
El propio aceite de oliva contiene quercetina 7 y trans-resveratrol 8, antioxidantes muy efectivos en inhibir la activacin endotelial, lo que puede explicar su efecto ateroprotector. Los avonoles quercetina 7, myrcetina 9, kaempferol 10, y las avonas luteolina 11 y apigenina 12, debido a su actividad antioxidante disminuyen el riesgo de mortalidad por enfermedad coronaria (Gordon, 1996). Estos compuestos se encuentran en ctricos.
14
Los avonoides presentes en el vino inhiben la oxidacin de LDL in vitro (Gordon, 1996). trans-Reverastrol 8, otro compuesto polifenlico existente en el vino, tambin inhibe la oxidacin de LDL. Esta oxidacin es uno de los factores que inicia la patologa de la ateroesclerosis. Hypericum triquetrifolium Turra (Fam. Hypericaceae) es una planta nativa del este de Europa y del rea mediterrnea, usada tradicionalmente como sedante, antihelmntica, antiinamatoria y antisptica (Baytop, 1984). Recientemente se ha estudiado la actividad antioxidante de esta planta (Conforti et al., 2002). Dicha actividad se debe a la presencia de los avonoides 13-16.
15
La infusin acuosa de la planta del t (Camellia sinensis) es rica en antioxidantes de tipo polifenlico (Graham, 1992). El componente mayoritario del t negro es theaavin galato 17 y del t verde (-)- epigalocatequin galato 18. Este ltimo presenta actividad anticancergena junto con las avonas tangeretin 19 y nobiletin 20 presentes en ctricos (Gordon, 1996).
16
El extracto acuoso de hojas de espinacas (Spinacia oleracea) ha mostrado una actividad antioxidante semejante a la de la vitamina E (Bergman et al., 2001), siendo los responsables de la misma los compuestos 21-26.
Los extractos de las hojas de Ginkgo biloba se usan en medicina popular china desde hace unos 5000 aos. Actualmente se recomiendan sus extractos para el tratamiento de problemas cardiacos, de la enfermedad arterial perifrica y en la insuciencia cerebral (DeFeudis, 1991; Kleijnen et al., 1992; Kunkel, 1993). Recientemente se ha estudiado la actividad antioxidante de esta planta como posible mecanismo de su utilidad clnica. Los resultados de este estudio han mostrado que la actividad antioxidante del Ginkgo biloba se debe a su contenido en avonoides (Yuting et al., 1990; Husain
17
et al., 1987; Bors et al., 1990), entre ellos kaempferol-3-O-glucosido 27, kaempferol-3-O-rutinosido 28, theaavin galato 17 y epigalocatechin galato 18.
El extracto metanlico de las hojas de Tachigalia paniculata Aubl. (Fam. Leguminosae) muestra actividad antioxidante debido fundamentalmente a la presencia de los glicsidos avonoides 29 y 30 (Ciof et al., 2002).
Achyrocline satureioides Lam. (Fam. Compositae) es una planta medicinal ampliamente usada como colertica, antiespasmdica y hepatoprotectora en la regin de Chaco y tierras bajas meridionales, (Uruguay, Paraguay, sureste de Bolivia, noreste de Argentina y sur de Brasil). El estudio toqumico de las partes aereas de esta planta ha conrmado la presencia de quercetina 7 y de los cidos polifenlicos cafico 2, clorognico 31 e isoclorognico 32 (Broussalis et al., 1989). Debido a su alto contenido en compuestos polifenlicos se ha estudiado la actividad antioxidante de esta planta, resultando efectiva en la disminucin de la peroxidacin lipdica (Lissi et al., 1992).
18
Achyrocline accida (Weinm) DC, especie relacionada con la anterior, tambin ha mostrado interesantes propiedades antioxidantes, debidas a la presencia de la avanona 33 y de la chalcona 34 (Pay et al., 1996).
Los avonoles metoxilados 35-37 se han aislado de las partes aereas de Plucchea sagittalis (Lam.) Cabrera (Fam. Compositae). Aunque no se ha determinado la actividad de estos compuestos, deben ser los responsables de la actividad antioxidante de esta planta (Fraga et al., 1987).
19
Otra planta sudamericana interesante es la yerba mate (Ilex paraguariensis). Sus hojas tienen diferentes usos medicinales, entre ellos analgsico, estimulante cardiaco y del SNC, diurtico, lipoltico, etc. La yerba mate tiene adems una actividad antioxidante signicativa (Filip et al., 2000; Schinella et al., 2000; Actis-Goretta et al., 2002; Kalousova et al., 2002). Una infusin de yerba mate inhibe la peroxidacin lipdica, particularmente la oxidacin de LDL y la formacin de AGEs. La formacin de AGEs juega un papel importante en el desarrollo de las complicaciones asociadas a la diabetes mellitus. Entre los metabolitos secundarios de la yerba mate se encuentran los compuestos polifenlicos quercetina 7, kaempferol 10, cido cafico 2, cido clorognico 31, cido isoclorognico 32 y cido 5-cafeoilqunico 38 (Alikaridis, 1987).
Los ruibarbos (rizomas de Rheum palmatum L., R. tanguticum Maxim., R. ofcinale Baill., R. coreanum Nakai y R. undulatum L.) se usan en medicina oriental como purgantes. Los extractos metanlicos de estos rizomas han mostrado signicativa actividad antioxidante, siendo el ms activo el extracto de R. tanguticum (Matsuda et al., 2001). Estos autores tambin han estudiado la actividad antioxidante de los metabolitos de naturaleza polifenlica aislados del extracto metanlico de R. undulatum siendo los ms potentes los derivados estilbnicos rhaponticin 39 y piceatannol 40, que presentan una actividad semejante a la vitamina E (Matsuda et al., 2001).
20
Hoy da aunque se siguen utilizando como fuentes de antioxidantes naturales organismos terrestres, tambin se efectan bsquedas de antioxidantes en organismos marinos. Recientemente se ha estudiado la actividad antioxidante de una serie de metabolitos aislados de esponjas, algas y cianobacterias marinas (Takamatsu et al, 2003). Cymopol 41 (aislado de Cymopolia barbata), 7-hidroxicymopol 42 (aislado de C. barbata), avrainvilleol 43 (aislado de Avrainvillia ssp.), fragilamida 44 (aislado de Martensia fragilis), puupehenona 45 (aislado de Hyrtios spp.), aaptamina 46 (aislado de Aaptos aaptos) e isoaaptamina 47 (aislado de A. aaptos) han mostrado interesantes propiedades antioxidantes.
21
Los compuestos 41-45 actan como potentes antioxidantes no solo en ensayos en disolucin, sino tambin sobre clulas vivas, mientras que los compuestos 46 y 47 no muestran actividad signicativa sobre clulas vivas. Del alga marrn Cystoseira crinita se han aislado una serie de tetrapreniltoluquinoles, tripreniltoluquinoles y tetrapreniltoluquinonas que han mostrado interesantes propiedades antioxidantes, siendo las tetrapreniltoluquinonas 48 y 49 los compuestos ms potentes (Fisch et al., 2003).
Fuentes de vitaminas y anlogos con actividad antioxidante

La vitamina E (a-tocoferol, 50) se encuentra mayoritariamente asociada a la LDL plasmtica, evitando su oxidacin y su consumo disminuye el riesgo de sufrir trastornos coronarios (Steinberg, 1997; Gordon, 1996).
22
Del aceite de palma (Euterpe spp., Fam. Arecaceae) se aislan una serie de tocotrienoles que son mejores antioxidantes que la vitamina E (Duke et al., 1994). Otras fuentes de tocotrienoles son las especies vegetales Elaeis guineensis Jacq (Fam. Arecaceae) e Iryanthera grandis Duke (Fam. Myristicaceae). De estas plantas se aisla g-tocotrienol 51.
Portulaca oleracea L. (Fam. Portulacaceae) es una excelente fuente de antioxidantes, entre ellos: a-tocoferol 50, cido ascrbico (vitamina C, 52) y b-caroteno 53 (Simopoulos, 1992).
Otros carotenoides con actividad antioxidante son a-caroteno 54, g-caroteno 55, licopeno 56 y lutein 57 (Krinsky, 1989).
23
La mayora de los antioxidantes pertenecientes a este grupo se usan tambin como aditivos en las industrias agro-alimentaria y cosmtica.
Antioxidantes sintticos
Los antioxidantes sintticos se usan industrialmente como aditivos. Estos antioxidantes retrasan o previenen los procesos oxidativos que causan el deterioro de los alimentos, el endurecimiento del caucho, el cambio de color y/o enranciamiento de los aceites y grasas, etc. Butil hidroxitolueno (BHT, 58), butil hidroxianisol (BHA, 59), tert-butilhidroquinona (TBHQ, 60) y di-tert-butilhidroquinona (DTBHQ, 61) son antioxidantes utilizados en la industria agro-alimentaria, en la de cosmtica y en la de plsticos como conservantes.
Los tetrahidrocurcuminoides 62-64 son derivados de los curcuminoides, metabolitos aislados de la raz de Curcuma longa. Su actividad antioxidante es mayor que la de BHT, utilizndose como aditivos en
24
la industria cosmtica, principalmente en cremas protectoras de la piel y para prevenir el enranciamiento de algunos componentes usados en la elaboracin de cosmticos.
Bibliografa
Actis-Goretta L, MacKenzie GG, Oteiza PL, Fraga CG (2002): Comparative study on the antioxidant capacity of other plant-derived beverages. Ann NY Acad Sci 957: 279-283. Alikaridis F (1987): Natural constituents of Ilex species. J Ethnopharmacol 20: 121-144. Amro B, Aburjai T, Al-Khalil S (2002): Antioxidative and radical scavenging effects of olive cake extract. Fitoterapia 73: 456-461. Baytop T (1984): Therapy with medicinal plant in Turkey. Instanbul University. Instanbul. Bergman M, Varshavsky L, Gottlieb HE, Grossman S (2000): The antioxidant activity of aqueous spinach extract: chemical identication of active fractions. Phytochemistry 58: 143-152. Bors W, Heller W, Michel C, Saran M (1990): Flavonoids as antioxidants: determination of radical-scavenging efciencies. Methods Enzymol 189: 342-355. Broussalis A, Ferraro G, Gurni A, Coussio J (1989): Aspectos toqumicos de especies argentinas del gnero Achyrocline. Acta Farm Bonaerense 8: 11-16. Ciof G, DAuria M, Braca A, Mendez J, Castillo A, Morelli I, De Simone F, De Tommasi N (2002): Antioxidant and free-radical scavenging activity of constituents of the leaves of Tachigalia paniculata. J Nat Prod 65: 1526-1529. Conforti F, Statti GA, Tundis R, Menichini F, Houghton P (2002): Antioxidant activity of methanolic extract of Hypericum triquetrifolium Turra aerial part. Fitoterapia 73: 479-483. DeFeudis FV (1991): Ginkgo biloba extract (EGb 761): pharmacological activities and clinical applications. Elsevier, Paris. Duke JA, Vasquez R (1994): Amazonian ethnobotanical dictionary, CRC Press, Boca Raton.
25
Filip R, Lotito SB, Ferraro G, Fraga CG (2000): Antioxidant activity of Ilex paraguariensis and related species. Nutr Res 20: 1437-1446. Fisch KM, Bhm V, Wright AD, Knig GM (2003): Antioxidative meroterpenoids from the brown alga Cystoseira crinita. J Nat Prod 66: 968-975. Fraga CG, Martino VS, Ferraro GE, Coussio JD, Boveris A (1987): Flavonoids as antioxidants evaluated by in vitro and in situ liver chemiluminescence. Biochem Pharmacol 36: 717-720. Gordon MH (1996): Dietary antioxidants in disease prevention. Nat Prod Reports: 265-273. Graham HN (1992): Green tea composition, consumption and polyphenol chemistry. Prev Med 21: 334-350. Husain SR, Cillard P (1987): Hydroxyl radical scavenging activity of avonoids. Phytochemistry 26: 2489-2491. Janer del Valle L (1980): Contaminacin de las aguas por el alpechn y posibles soluciones al problema. Grasas y Aceites 31: 273-279. Kalousova M, Skrha J, Zima T (2002): Advances glycation end-products and advanced oxidation protein products in patients with diabetes mellitus. Physiol Res 51: 597-604. Kleijnen J, Knispschild P (1992): Ginkgo biloba for clinical insufciency. Br J Clin Pharmacol 34: 352-358. Krinsky N (1989): Antioxidant functions of carotenoids. Free Rad Biol Med 7: 617635. Kunkel H (1993): EEG prole of three different extractions of Ginkgo biloba. Neuropsychobiology 27: 40-45. Lissi E, Pascual C, del Castillo M (1992): Luminol luminescence induced by 2,2-azobis(2-amidinopropane) thermolysis. Free Rad Res Com 17: 299-311. Matsuda H, Morikawa T, Toguchida I, Park J-Y, Harima S, Yoshikawa M (2001): Antioxidant constituents from rhubarb: structural requeriments of stilbenes for the activity and structure of two new anthraquinone glucosides. Bioorg Med Chem 9: 4150. Pay M, Silla M, Vay E, Alcaraz MJ, Coussio J, Ferraro G, Martino V, Hnatyszyn O, Debenedetti S, Broussalis A, Muschietti L (1996): Inhibitory effects of various extracts of argentine plant species on free radical-mediated reactions and human neutrophil functions. Phytother Res 10: 228-232. Ramarathnam N, Ochi H, Takeuchi M (1996). Antioxidant defense in vegetable extracts. En: Natural antioxidants chemistry, health effects and applications. Shahidi F (Ed), pp 76-78. Schinella GR, Troiani G, Dvila V, de Buschiazzo PM, Tournier HA (2000): Antioxidant effects of an aqueous extract of Ilex paraguariensis. Biochem Biophys Res Commun 269: 357-360. Simopoulos A, Norman H, Gillaspy J, Duke J (1992): Common purslane: a source of omega-3 fatty acids and antioxidants. J Am College Nutrition 11: 374-382. Steinberg D (1997): LDL oxidation and its pathological signicance. J Biol Chem 272: 20963-20966.
26
Takamatsu S, Hodges TW, Rajbhandari I, Gerwick WH, Hamann MT, Nagle DG (2003): Marine natural products as novel antioxidant prototypes. J Nat Prod 66: 605-608. Velioglu YS, Mazza G, Gao YL, Oomah BD (1998): Antioxidant activity and total phenolics in selected fruits, vegetables and grain products. J Agric Food Chem 46: 4113-4117. Yuting C, Rongliang Z, Zhongjian J, Yong J (1990): Flavonoids as superoxide scavengers and antioxidants. Free Rad Biol Med 9: 19-21.
27
MERCADO Y TECNOLOGAS DE EXTRACCIN

Ana Tymoschouk anrotym@alpha.arcride.edu.ar

Ana Tymoschouk
anrotym@alpha.arcride.edu.ar INSTITUTO DE DESARROLLO Y DISEO INGAR. Consejo Nacional de Investigaciones Cientcas y Tcnicas. Fundacin ARCIEN para el Arte, la Educacin, la Ciencia y la Tecnologa. Direccin postal: Avellaneda 3657, 3000. Santa Fe, Agentina.
Introduccin
Los antioxidantes son sustancias que disminuyen la extensin de reacciones de oxidacin espontneas del oxgeno atmosfrico con sustancias orgnicas provocando cambios en sus atributos de calidad, de los cuales el principal es la disminucin de la vida til de muchos productos de la industria de los alimentos, de cosmticos, y qumica. Las industrias de los polmeros y los plsticos y de los aceites vegetales y minerales otorgan una gran importancia al uso de aditivos antioxidantes para la preservacin de sus productos. En el consumo humano, las sustancias antioxidantes comenzaron a popularizarse mundialmente en las ltimas dcadas a partir de la difusin de los resultados cientcos obtenidos en pruebas de compuestos aislados o en los componentes naturales de alimentos y material vegetal y animal. Estas evidencias impulsaron la consideracin de los antioxidantes en aplicaciones farmacolgicas para tratamientos de prevencin de enfermedades como el cncer o la osteosporosis y con efectos favorables para la salud humana en general. En el rea de los cosmticos los antioxidantes surgieron como protectores de los productos o con efectos especcos contra el envejecimiento de la piel. Y en los alimentos los antioxidantes resultan de inters para incrementar la estabilidad de los productos, reduciendo la velocidad de degradacin de compuestos por la oxidacin y la prdida de la calidad nutritiva. Hay una estrecha relacin entre el rea farmacolgica y alimenticia por la ingesta de los antioxidantes sea como nutracuticos en
31
el primer caso o como alimentos funcionales en el segundo. La diferencia est en la denicin de ambos. Los alimentos funcionales son aquellos cuya composicin se integra de sustancias como glutatin, vitamina A, y otras, con valores nutritivos y siolgicos. Pueden ser denidos como alimentos que contienen niveles signicativos de componentes biolgicamente activos que brindan benecios a la salud s de la nutricin bsica. Un ejemplo son los yogures con cultivos probiticos. Son preventivos de enfermedades, por ejemplo del cncer y de la osteoporosis, pero las certezas cientcas de que puedan curar esas enfermedades no son sucientes y necesitan continuar la investigacin en esa direccin. En cambio los nutracuticos contienen sustancias o agentes bioactivos de efectos farmacolgicos sobre la salud, cientcamente comprobados y pueden ser presentados en otra forma distintas a la del alimento, con dosis superiores de los mencionados agentes. Los nutracuticos pueden denirse como alimentos a ser consumidos bajo supervisin mdica y para tratamientos especcos de enfermedades con requerimientos nutricionales particulares. Por ejemplo los productos marinos de cartlago de tiburn se recetan para enfermedades articulares. La antocianina de los berries y los betacarotenos de la zanahoria reducen el riesgo de cncer y mejoran el sistema inmunolgico. Los extractos de ginko biloba ayudan a la circulacin sangunea y reducen el riesgo del mal de Alzheimer. La hierba de San Juan ayuda a la recuperacin de los pacientes con depresiones moderadas y los extractos de ginseng y guarana reducen fatiga y estrs. La valeriana promueve el sueo. Las isoavonas de la soja son toestrgenos ideales para la prevencin de las osteosporosis. Los cidos grasos omega 3 reducen el riesgo de enfermedades cardiovasculares. El consumo de nutracuticos y de alimentos funcionales, de preferencia para los productos naturales y con una marcada disminucin de los sintticos tiene que ver con la tendencia mundial hacia lo natural. En USA se increment el consumo de los alimentos sanos, naturales, con mnimo procesamiento, en contraposicin a los platos preparados listos para cocinar pero con alguna prdida del valor nutritivo. Si bien esto se compens en parte con la incorporacin de adi32
tivos nutrientes como la niacina y la riboavina, se preeren las fuentes naturales de estos nutrientes contenidas en el mismo alimento. El consumo de este tipo de alimentos ha sido tradicionalmente el de los jugos naturales de verduras y frutas pero en los ltimos tiempos ha incorporado las bebidas y alimentos con contenido de hierbas, de soja, enriquecidos con minerales, entre otros ingredientes. Algo similar ocurre con los pases europeos, que adems privilegian la dieta mediterrnea, con hortalizas, vegetales, aceite de oliva, pescados, todos de alto contenido en antioxidantes. Respecto a los japoneses y a los asiticos, hay una contraposicin entre la dieta tradicional, pobre en grasas animales pero de alto valor nutritivo con el arroz, la soja, el pescado y las hortalizas, y los alimentos rpidos hamburguesas, pizzas y otros productos ricos en hidratos de carbono. Dada la preferencia hacia lo natural, sinnimo de sano, la industria incorpora aditivos que fortalecen las deciencias de los alimentos preparados. Estas alternativas juegan un papel de publicidad para las grandes empresas, que dicen no olvidar lo saludable y proponer alimentos funcionales. Hay un nmero importante de sustancias en la naturaleza que tienen propiedad antioxidante, es decir, la de cumplir con la funcin de atrapar molculas de oxgeno inestables y disminuir la velocidad de oxidacin de sustratos in vitro in vivo. Los antioxidantes pueden producirse en el mismo cuerpo humano (glutationa, co-enzima Q10, etc.). Los vegetales y las frutas en general son fuentes ricas en estos compuestos (vitaminas E y C, carotenoides, avonoides, etc.). Los antioxidantes se pueden incorporar al organismo humano mediante la ingesta equilibrada de alimentos ricos en estos compuestos, como frmacos o como suplementos dietticos. Estos ltimos son combinaciones de varios antioxidantes y otras sustancias que en conjunto ejercen un sinergismo favorable para la funcin de proteccin de la oxidacin. A su vez se incorporan minerales como cinc, cobre y/o selenio para potenciar el efecto de los suplementos. Los antioxidantes ms consumidos son las vitaminas C, E, betacaroteno y selenio mineral, pero han surgido con mucha fuerza las proantocianidinas (avonoides de las semillas de uva, de la corteza de pino y de
33
los vinos), la N-n-acetilcistena, la co-enzima Q10, el ginko biloba, el t verde, y frmulas de carotenoides y polifenoles. Las hierbas culinarias y medicinales han demostrado tener propiedades antioxidantes. Las hierbas secas de organo, salvia, menta, tomillo, clavo de olor y las hierbas medicinales chinas tienen antioxidantes en concentraciones mayores a 75 milimoles cada 100 gramos. Cientcos japoneses y noruegos arman que una ingesta de este tipo de hierbas en la dieta normal mejora signicativamente el total de antioxidantes incorporados a travs de alimentos ricos en estos compuestos y presentes en frutas, cereales y vegetales. Una preparacin a partir de una hierba medicinal Stronger Neo-Minophagen C, usada como inyeccin intravenosa para tratamiento de hepatitis crnica, favoreci la ingesta de antioxidantes totales y favoreci el tratamiento curativo. Los cientcos concluyen que varios de los efectos de estas hierbas se deben a su actividad antioxidante. Las industrias de antioxidantes se muestran optimistas respecto al incremento de consumo y de ventas. Pero no se logra denir exactamente el mercado por la diversidad de los ingredientes y su capacidad antioxidante. A pesar de esto hay especial atencin en el poder antioxidante de hierbas y plantas, como extracto de berries, de semilla de uva, de madera de roble, y de otras variedades ms exticas. Esto destaca un potencial interesante en aquellas especies que se desarrollan en abundancia y naturalmente en algunas regiones del mundo, pero que requieren de investigacin en su capacidad antioxidante. Este aspecto es de suma importancia para considerar el desarrollo sustentable de las plantas en su aprovechamiento para la extraccin o utilizacin de sus principios activos. Empresas alemanas de antioxidantes han puesto a los extractos de plantas en un rango de importancia en su funcin y su precio. Arman que a nivel mundial se evidenci un cambio respecto a la identicacin de grupos antioxidantes en los alimentos y eso permite hacer algn tipo de recomendacin en relacin a los alimentos funcionales y los suplementos con mayor concentracin de tocompuestos en forma natural o agregada. Los antioxidantes tienen una gran atraccin medicinal porque se asocian a la pre34
vencin de las enfermedades y el mantenimiento de la salud en ciertas condiciones. Sin embargo el perl de los consumidores es muy fragmentado y existe la necesidad de que la ciencia brinde la plataforma de despegue de las estrategias de comercializacin para asegurar una conanza sustentable para un producto en un grupo determinado. En ese aspecto, la comunicacin y la informacin son elementos esenciales para posicionar y diferenciar productos. La legislacin apropiada completa el conocimiento sobre las aplicaciones y las dosis recomendadas de cualquier aditivo. Pero en el rea de los antioxidantes de origen natural hay ausencia en general sobre este aspecto, a tal punto que la falta de reglamentacin de la FDA de USA trae como consecuencia una gran diversidad de productos en el mercado cuyas leyendas en las etiquetas anuncian actividades o propiedades que no poseen y que confunden o descreen al consumidor. An con la evolucin favorable de aceptacin de los antioxidantes y la informacin sobre sus benecios, los consumidores no aprecian claramente la diferencia entre las distintas sustancias antioxidantes. Una de las causas es la complejidad del mecanismo de reaccin de proteccin contra los radicales libres y la diversidad de los sistemas donde se dan este tipo de reacciones. Los consumidores tienen un conocimiento general de los antioxidantes comunes y de algunas acciones sobre la salud, como las vitaminas C y E, y el selenio, pero no conocen sobre los nuevos ingredientes como la lutena, el licopeno, los tocotrienoles y los avonoides. Se necesita entonces un trabajo de informacin sobre bases cientcas para que los antioxidantes sean aceptados para el consumo y de la legislacin adecuada que regule la calidad y exija la estandarizacin de los productos. La otra cuestin importante es la preferencia a consumir lo natural en contraposicin a lo sinttico. Esto se evidencia en el consumo de la vitamina E natural y sinttica, donde la primera creci en preferencia. La actitud se refuerza por el comportamiento de regiones donde la medicina tradicional ha alcanzado un alto grado de aceptacin, lo que consolida el uso de sustancias provenientes de fuentes naturales.
35
Los grandes industriales de las industrias farmacuticas y de alimentos consideran que el crecimiento del mercado de los antioxidantes requiere de la educacin apropiada del consumidor y de investigaciones cientcas. La orientacin es hacia los benecios que produce en la salud a modo preventivo.
Mercado mundial
Las cifras de consumo y comercializacin mundiales de antioxidantes a partir de hierbas, plantas o productos comercializados como antioxidantes, sea para su consumo en formas tradicionales o para su elaboracin mediante un proceso a escala de laboratorio o industrial, se encuentran dispersas en aplicaciones de tipo frmaco y en alimentos. Se puede considerar una clase de antioxidantes de origen vegetal que provienen de especias, hierbas culinarias, o plantas de las cuales se han obtenido productos comerciales de aplicacin industrial como el caso de la salvia, el romero, el organo, el t verde, entre otros, y cuyos cultivos estn difundidos o promocionados como alternativas de recursos econmicos. La otra clase de antioxidantes de origen vegetal incluye las plantas silvestres o medicinales o con biodisponibilidad en algunas regiones del mundo y con alguna informacin o tradicin en su uso por sus propiedades. En relacin a los aditivos de alimentos, hay datos de estudios de mercado de los antioxidantes por parte de la empresa Business Communications Company (BCC) de Estados Unidos. Los antioxidantes y preservantes muestran marcado aumento de los productos naturales a pesar de no ser competitivos en precio con los aditivos sintticos. El tamao de mercado de ambos tipos de productos es semejante al de colorantes de alimentos con un valor de 321 millones en el 2001 y con un crecimiento esperado en un 3 % para llegar a 372 millones de dlares en 2006. El impulso de ese aumento lo brinda la preferencia del consumidor hacia los aditivos naturales en lugar de los aditivos qumicos o derivados de sntesis qumicas. Los analistas de mercado Frost & Sullivan sin embargo han detectado que los antioxidantes naturales no son abrumadores como esperaron los fabricantes. Los productos sintticos comparten un 40% del
36
mercado total por tener menor costo que los antioxidantes naturales, pero la presin del consumidor conduce este segmento a menores porcentajes de mercado. As se estima que en el 2009 el mercado de USA y Europa crecer desde los 190 millones de dlares actuales a 240 millones. Los precios de los antioxidantes en Europa caen generalmente por el crecimiento competitivo de mercados asiticos y occidentales . En Estados unidos los precios de los productos naturales uctan en comparacin con los sintticos que permanecen estables. Se estima que los antioxidantes sintticos se desplazarn a aplicaciones de la industria plstica y de lubricantes mientras que los naturales particularmente derivados de hierbas se desarrollarn para la industria de los alimentos, cosmtica y frmacos. Otro criterio para ubicar y analizar la importancia comercial de los antioxidantes derivados de las plantas silvestres es buscar la informacin disponible del mercado de los tofrmacos. Los tofrmacos son medicamentos obtenidos mediante modernas tecnologas de produccin industrial y que contienen un extracto estandarizado de una planta que constituye su componente biolgicamente activo. Estos medicamentos se producen en variadas formas tales como tabletas, grageas, cpsulas y lquidos. Segn el criterio de expertos de la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) los medicamentos herbarios o tomedicamentos se denen como Productos medicinales acabados y etiquetados cuyos ingredientes activos estn formados por partes areas o subterrneas de plantas u otro material vegetal, o combinaciones de stos, en estado bruto o en forma de preparaciones vegetales. Por material vegetal se entienden: jugos, resinas, aceites vegetales y cualquier otra sustancia de naturaleza semejante. Los medicamentos herbarios pueden contener excipiente adems de las ingredientes activos. Si el material se combina con sustancias activas denidas desde el punto de vista qumico, inclusive constituyentes de plantas aislados y qumicamente denidos, no se consideran medicamentos herbarios. Esta denicin brinda una ubicacin de los antioxidantes de las plantas en la categora de tofrmacos con la funcionalidad principal
37
de la proteccin de sustratos contra la oxidacin. La aplicacin como tal puede extenderse a los alimentos y cosmticos.
Situacin comercial de los tofrmacos

El mercado mundial de plantas medicinales o tofrmacos no est totalmente determinado porque una parte sustancial de la produccin no se registra y las estadsticas ociales de comercio no identican individualmente las plantas o no separan su uso de otros, tales como perfumes, hierbas culinarias y especias, aceites esenciales, funguicidas y otros. Como ejemplo, el regaliz se usa como expectorante y antiinamatorio, pero tambin para saborizar cigarrillos, chocolates, cerveza y pastas dentales, y para estabilizar espumas en extinguidores de fuego. La papana, del extracto de la papaya, usada para tratamientos de dispepsia, desrdenes gastrointestinales y coagulantes de sangre, se usa tambin como tiernizante en la industria alimenticia. Datos del IMS (Institute of Medical Statistical) y del Herbal Medical Data Base de 1993 indicaron que en Europa se produjeron los mayores volmenes de ventas minoristas de medicinas herbarias, por una cantidad de aproximadamente 6 billones de dlares estadounidenses; mientras que en Japn las ventas minoristas alcanzaron 2,1 billones de dlares; 2,3 billones de dlares en el resto de Asia, y aproximadamente 1,5 billones en Norte Amrica. Estas cifras demuestran el volumen de mercado en distintas regiones, con una tendencia general creciente. Hay datos de la velocidad de crecimiento anual de las Ventas de Fitomedicamentos por Regin (en porcentaje) como se muestra en la siguiente tabla:
Regin Crecimiento 1985-1991 Crecimiento 1991-1992 Proyeccin 1993-1998 Fuente: Actas del III Simposio Internacional Qumica de Productos Naturales y sus Aplicaciones, Chile 1996.
Norteamrica Unin Europea Resto de Europa Japn Sudeste asitico India y Pakistn
10 10 12 18 15 12
12 5 8 15 12 15
12 8 12 15 12 15
38
El mercado europeo para suplementos de hierbas se estima sobre 2,7 billones de dlares y para remedios, 0,9 billones. Alemania va a la cabeza, con un crecimiento anual del 4 % en remedios de hierbas y mas rpido en suplementos de hierbas. El mercado norteamericano est alcanzando la saturacin con un pico de 6 a 8 billones de dlares en pocos aos. Su mercado de suplementos dietario de hierbas se estima en 4 billones con un crecimiento de 6 a 8 % por ao. El lder del mercado es Alemania con ventas anuales de 3 billones de dlares estadounidenses y con una cobertura del 50 % del mercado europeo. El gasto promedio en tomedicinas por habitante es de 37 dlares anuales. Francia sigue a Alemania con US$1,6 billones de dlares y el 26,5 % del mercado europeo. A continuacin siguen Italia, Gran Bretaa, Espaa, Holanda y Blgica. El gasto de tomedicinas por habitante europeo se aprecia en la siguiente tabla:
Pas miembro Alemania Francia Italia Reino Unido Espaa Holanda Blgica Resto Total Total en millones 3000 1600 600 300 230 100 40 130 6000 % 50 26,5 10 5 4 1,5 1 2 100 Gasto anual per cpita U$S 37 28 10,5 5 6 6,5 4 4,5 17,4
Este comportamiento en el consumo y en las ventas de las tomedicinas se detecta en el registro de las tomedicinas. Alemania design una comisin especial del Bundesgesundheitsamt (la versin alemana del FDA (Food and Drug Administration)) dedicadas a realizar monografas sobre plantas, con ms de 230 publicadas en el Bundesanzeiger, organismo de registros alemn. Francia obtuvo una
39
lista con 200 plantas y 37 indicaciones de sus usos tradicionales. En ambos casos muchas tomedicinas estn subsidiadas. En general, los organismos gubernamentales del rea de la salud de Alemania, Francia e Italia han regulado el consumo de estos productos con compensaciones por los sistemas de seguro de salud. En cambio Gran Bretaa y Holanda han considerado a las tomedicinas como suplementos dietarios sin ninguna argumentacin medicinal. Con el advenimiento de la Unin Europea surgi la necesidad de unicar las reglamentaciones vigentes en sus pases miembros sobre el uso de las hierbas medicinales y los tofrmacos en tratamientos de la salud. La European Scientic Cooperative for Phytotherapy (ESCOP) realiza resmenes de las caractersticas de los productos (SPC), que deberan ser usadas como base para los registros europeos de las tomedicinas. A la par de los registros nacionales de cada pas miembro de la Comunidad Europea existe un registro descentralizado desde 1995. Si un estado miembro registra una droga, solicita el reconocimiento a otros miembros, con un tiempo de 90 das de espera. Si no hay acuerdo, la Agencia Central de la UE (Committee for Proprietary Medicinal Products, CPMP) tiene que encontrar una decisin que una a todos los estados miembros. Con esta organizacin se observa una tendencia importante en el consumo de productos naturales debido a la preocupacin ambiental. Las drogas alternativas biolgicas naturales cobran importancia en los pacientes. Las tomedicinas pueden ser consideradas como el vnculo entre las drogas convencionales con alta tecnologa y las medicinas tradicionales. La aceptacin se da mayoritariamente en Europa y en Asia. En Estados Unidos ambas medicinas se ven como contradictorias y los organismos de legislacin como la Dietary Supplement Health and Education Act (DSHEA), creada en 1994, trata el consumo de los tofrmacos como suplementos dietarios. Esto revela la limitacin principal de uso de las hierbas como drogas o productos teraputicos porque se deben administrar slo como suplemento dietario (alimento), aunque en la etiqueta se puede incluir una recomendacin y una
40
explicacin de la relacin entre el nutriente o alimento y una condicin de salud o enfermedad especca. La FDA considera que si las hierbas se usan para sabor, aroma o valor nutritivo deben considerarse alimentos, mientras que si se venden para propsitos de salud, son drogas. Por esta razn las empresas deben comercializar en USA sus tofrmacos como suplementos dietarios bajo los trminos de la DSHEA. A pesar que en los ltimos aos en Estados Unidos aument el consumo de los productos derivados de plantas medicinales, convirtindose en uno de los segmentos de mayor crecimiento de ventas en comercios minoristas, no es posible controlar los canales de venta y distribucin por su diversidad, con lo cual no hay precisin del tamao del mercado de los productos herbarios medicinales. Algunos datos muestran que en general se ha advertido un incremento en las ventas por un valor de $441,5 millones en 1997, con un incremento del 79,5 % respecto a 1996 (Glovsky, 1998).
Tendencias y futuro de los antioxidantes derivados de plantas

Las investigaciones recientes sobre el conocimiento de las propiedades de algunas plantas son un factor de aceleramiento del desarrollo de nuevos suplementos y medicinas. En este aspecto los antioxidantes tienen un potencial importante y una amplia e insatisfecha demanda en el mercado. En relacin a la metodologa de ingreso al mercado de los frmacos, donde los ensayos tienen costos millonarios en dlares, los antioxidantes de origen natural pueden ser sus alternativas rentables atractivas porque vinculan aspectos de las medicinas tradicionales con la medicina aloptica moderna. La falta de conocimiento general dentro del mercado mundial acerca del rango completo de medicinas tradicionales disponibles, entre las que se incluye la de los antioxidantes, hace que el consumo de estos productos an no est desarrollado signicativamente. En la medida que se avance en la investigacin se prevee un aumento de la demanda, siempre teniendo en cuenta la seguridad del consumidor.
41
Se estima que la demanda de hierbas medicinales aumentar como fuente de agentes teraputicos y como materia prima bsica para la extraccin de compuestos qumicos empleados en cosmticos, perfumes y alimentos. Como se describi anteriormente, hay muchos avances cientcos sobre actividad antioxidante de extractos de hierbas y sustancias aisladas de los mismos que orientan los esfuerzos hacia productos de comercializacin masiva para la industria y para el consumo humano. Tal es el caso de hierbas con tradicin culinaria como el organo, la salvia y el romero cuyos principios activos antioxidantes se debe a los cidos carnsico y rosmarnico y sus derivados. Varias empresas disponen de productos comerciales con diferentes precios y presentaciones (extractos, compuestos aislados, lquidos, en polvo, etc.) y aplicaciones para alimentos y cosmticos. El parcial conocimiento cientco sobre el amplio rango de plantas hace necesaria la exploracin de la produccin sustentable comercialmente. En este aspecto cabe destacar que el inters global en plantas medicinales ha creado un sostenido y amplio mercado no ocial en estos productos, recogidos en forma irregular con cosechas indiscriminadas de variedades silvestres con serios daos a la biodiversidad. En la mayora de los casos, la fuentes vegetales de sustancias antioxidantes y farmacolgicas en general provienen de pases en vas de desarrollo, con riqueza en recursos naturales, pero con una posicin poco favorable en el rea comercial, debido a la baja prioridad en las inversiones nacionales, investigacin y desarrollo de exportacin por el desconocimiento del valor comercial de los productos. El ingreso a los mercados europeos debe superar algunos obstculos como la disponibilidad de dinero y facilidades de investigacin y desarrollo para la aceptacin de los productos. Los pases proveedores de materias primas para la obtencin de productos naturales, entre ellos los antioxidantes, disponen de tecnologas precarias para la recoleccin y almacenamiento inadecuado de los productos. La falta de sistemas de medicin, de estndares, de inspeccin y control de calidad requerido por los exportadores hace que los productos se
42
alejen de los estndares de higiene, especicacin y calidad y sus precios sean bajos y poco atractivos. Tampoco se conoce el verdadero destino industrial o de consumo de las plantas no cultivadas y el aseguramiento de la provisin es desconocido. Las perspectivas y proyecciones de cultivos son parciales y en general se carece de recursos y capacidad institucional para recomendar sobre polticas y mecanismos que suministren consistentemente productos de alta calidad. El know-how en tecnologas de procesamiento es deciente, tanto como la disponibilidad de procesos de produccin sustentables. Los pases en desarrollo tienen oportunidades de expandir sus exportaciones globales en plantas para la obtencin de antioxidantes o de los productos extrados con procesos tecnolgicos adecuados. La atencin en la comercializacin no debe centrarse nicamente al consumo humano en las formas descriptas en este trabajo. La aplicacin en la industria de los plsticos, papeles y polmeros en general es importante y con menos restricciones de uso en relacin a las reglamentaciones segn sea su destino.
Bibliografa
Duke J A (1993): Medicinal plants and the pharmaceutical industry. p. 664-669. In: J. Janick and J.E. Simon (eds.), New crops. Wiley, New York. Enterprise Works Worldwide (EWW) (1999): Natural products commodity report. Washington, D.C. FAO (1995): Report of the International Expert Consultation on Non-Wood Forest Products. Non-Wood Forest Products No. 3. Roma. FAO (1995): Non-wood forest products for rural income and sustainable forestry. Non-Wood Forest Products No. 7. Roma. Food additives growth driven by natural products. (2002): FoodNavigator.com. May Freese CH (1998): Wild species as commodities. Washington, D.C., Island Press. Hsn Can Baser K (1999): Industrial Utilization of Medicinal and Aromatic Plants, p. 177-191. Proceedings of the Second World Congress on Medicinal and Aromatic Plants WOCMAP-2, Acta Horticulturae, ISHS, 503. Israelsen LD (1993): Phytomedicines as a new crop opportunity. p. 669-671. In: J. Janick and J.E. Simon (eds.), New crops. Wiley, New York.
43
ITC International Trade Center, Product Prole: Medicinal Plants. (2001): Third United Nations Conference On The Least Developed Countries. Business Sector Round Table. Prole products: medicinal plants. Brussels, 16 May. ITC International Trade Center, Product Prole: Medicinal Plants. (2001): Third United Nations Conference On The Least Developed Countries. Business Sector Round Table. Prole products: spices and culinary herbs. Brussels, 16 May. Market Conditions and Regulatory Climate For Herbs in the United States (1999): American Botanical Council. Nicholas Hall Report (1994): Natural Remedies, International Overview. Nicholas Hall Company, Southend-on-Sea. Price drive for antioxidants (2003): Breaking News on Food & Beverage Development. FoodNavigator.com Proops S (1999): Comparacinn entre los mercados de alimentos funcionales en la Unin Europea, Estados Unidos y Japn. The IPTS Report (Institute for Prospective Technological Studies). European Comission. Jan. Richman A and Witkowski J P (2001): Annual Herb Sales Survey. Whole Foods Magazine. October 23, 24, 26, 28, 30. The U.S. Botanical Market - An Overview. (1966): HerbalGram. American Botanical Council 36:49
Tecnologa de extraccin
El desarrollo de un proceso de extraccin de antioxidantes consiste en una serie de etapas que comienzan con la idea de elaborar un producto hasta su insercin en el mercado. En el presente proyecto se ha comenzado con la identicacin de plantas con contenido en antioxidantes y sus pruebas de efectividad en la antioxidacin y toxicidad para el consumo humano. Seleccionadas las plantas de inters con comprobados efectos antioxidantes e investigada su biodisponibilidad y el mercado potencial o concreto de productos, sigue la etapa de investigacin y desarrollo de los procesos extractivos y la bsqueda de las condiciones de mayor rendimiento de extraccin y/o de selectividad de los antioxidantes. Este tipo de tareas son importantes para completar la informacin sobre propiedades de las sustancia de inters y su relacin con las condiciones operativas del proceso de extraccin, y orientar al procedimiento de obtencin del producto, con datos conables porque de lo contrario se correra el riesgo de
44
continuar con desarrollos largos y costosos que nalmente debern desecharse o abandonarse. Estas actividades son las que generalmente se llevan a cabo en los proyectos de CYTED siguiendo con el estudio de algunas etapas de desarrollo con un anlisis preliminar de factibilidad tcnica y econmica del proceso que justiquen continuar hacia la bsqueda de un proyecto rentable. En este captulo se hace una breve descripcin de algunos aspectos importantes en los procesos extractivos y de las tecnologas ms comunes y factibles de implementar.
Procesos de extraccin
Los compuestos antioxidantes se extraen de material vegetal mediante una serie de procesos segn la especicacin del producto nal, dependiendo si se trata de un extracto o si se purica el compuesto hasta su aislamiento total. En estas especicaciones siempre se debe considerar la seguridad del producto mediante anlisis y pruebas de toxicidad porque la procedencia a partir de un material natural no siempre es seguro para el consumo humano en sus distintas formas. El proceso general de extraccin de antioxidantes tiene las siguientes etapas, comunes a otros procesos extractivos de oleorresinas y tofrmacos: 1. Recoleccin, acondicionamiento y almacenamiento del material vegetal. 2. Molienda. 3. Extraccin con solvente. 4. Filtracin y tratamiento del material residual. 5. Eliminacin y recuperacin del solvente. 6. Puricacin y cristalizacin (puede o no incluirse segn el tipo de producto buscado). 7. Estandarizacin o acondicionamiento del producto nal. La extraccin de antioxidantes a partir de material vegetal se hace con hojas, races, semillas y diferentes partes de la estructura de las plantas que contengan las sustancias de inters. El rendimiento del
45
proceso depende tambin de la madurez, la procedencia, los factores ambientales, el tiempo y el modo de la recoleccin y el almacenamiento de la materia prima vegetal. En las plantas se han encontrado numerosos compuestos antioxidantes que pertenecen a la familia de los polifenoles. Estos tienen una alta eciencia en su funcin de proteccin contra la oxidacin en la mayora de los casos, potenciada en general por otros compuestos que actan como agentes sinergsticos y mediante una serie de mecanismos de reaccin entre ellos favorecen la accin de antioxidacin. La cosecha, recoleccin y almacenamiento del material vegetal requieren de un manejo cuidadoso y de un acondicionamiento para proteger los principios activos. El corte de las plantas implica una prdida de agua y cambios en la composicin de las mismas. Para reducir el deterioro de la materia prima es necesario secar inmediatamente las partes vegetales a ser procesadas y almacenarlas en ambientes controlados en humedad y temperatura. La trituracin o molienda del material vegetal favorece el rendimiento de extraccin porque las sustancias quedan expuestas a la accin del solvente. En consecuencia, el tamao de partcula es uno de los factores de inters en la bsqueda de las condiciones operativas ptimas. El tamao de partculas obtenidos en la molienda puede clasicarse mediante el tamizado con mallas de tamaos estndares. Las partculas se clasican en un rango de tamaos entre 50 milmetros y 50 micrones. La obtencin de tamaos de partculas uniforme es favorable al rendimiento de extraccin, como tambin el tamao. En el caso de las partculas ms pequeas se pueden obtener mayores rendimientos pero los nos pueden traer inconvenientes en los procesos posteriores. Para reducir el tamao de partculas hay distintos mtodos: por friccin, por presin, por impacto o por corte. Cuando se aplican enzimas para provocar una mayor ruptura de las paredes celulares del material vegetal se mejora el rendimiento. Esto se debe generalmente a la accin de las enzimas pectinasas y celulasas. En el caso de la obtencin de los tofrmacos y de los aceites esenciales suele hacerse la trituracin con molinos criognicos para evitar el deterioro o prdida de los compuestos con alta volatilidad,
46
usando sustancias criognicas como el nitrgeno lquido y el dixido de carbono lquido. Este tipo de operaciones es aplicable a los antioxidantes segn estudios previos de comportamientos. Los antioxidantes se obtienen mediante una extraccin slido - lquido de las partes de las plantas trituradas con solventes. La sustancia de inters contenida el tejido vegetal triturado se disuelve en el solvente y se difunde hacia el volumen lquido desprendindose del material vegetal. El proceso se detiene cuando se llega a la concentracin de equilibrio, momento en que se alcanza la diferencia mnima en el contenido del antioxidante en la fase solvente y en la fase slida del material vegetal. El punto de equilibrio est determinado por el tipo de antioxidante, la cantidad, el grado de humedad y de trituracin, el tipo de solvente y la cantidad o relacin slido/lquido. Otra de las variables que inuyen en la extraccin por solventes es el pH. En el caso de los polifenoles se han detectados variaciones en los rendimientos con pH alcalinos como favorables al proceso en algunos casos. La temperatura afecta al rendimiento de extraccin de cualquier compuesto antioxidante en las etapas de secado del material vegetal y en la extraccin. En el primer caso la temperatura acta en la degradacin enzimtica y en la estabilidad qumica. Esta tambin se ve comprometida en la extraccin y en el almacenamiento del producto nal. En los compuestos polifenlicos se han comprobado distintos mecanismos que producen otros compuestos de la familia del principio activo antioxidante, algunos con las mismas propiedades y otros sin actividad antioxidativa. El mtodo convencional de extraccin con solventes requiere de una serie de ensayos con distintos solventes para seleccionar aquel que extrae la fraccin de principios activos de inters con mayor rendimiento. Estos ensayos se complementan con determinaciones analticas cromatogrcas y espectromtricas para establecer los constituyentes, en este caso, de la fraccin antioxidantes. Los principios activos pueden ser sustancias solubles en solventes orgnicos como hidrocarburos alifticos, aromticos o clorados, alcoholes, cetonas, cidos carboxlicos, steres, teres y tambin pueden
47
ser solubles en solventes inorgnicos como el agua y el dixido de carbono. En general los procesos extractivos usan solventes polares voltiles con los que, luego de evaporarlos, se logra una alta concentracin nal de antioxidantes. Se debe tener precaucin en la eleccin del solvente porque hay una dependencia importante en el rendimiento y la actividad antioxidante del extracto por la polaridad de los componentes. Tambin las legislaciones de los pases han restringido la cantidad de solvente residual permitido en los productos nales y en algunos casos directamente han prohibido el uso de algunos de ellos, en especial los clorados. Los solventes usados por su disponibilidad y costo son el agua y el etanol. Juega aqu tambin el tratamiento posterior en relacin al medio ambiente y a la reutilizacin en la extraccin. Los solventes no polares como etil acetato y dietil ter tienen una accin de alta selectividad para la extraccin de polifenoles y los productos obtenidos tienen mayor poder antioxidante que si se los extrajera con metanol, etanol, butanol, propanol, isopropanol o sus mezclas. Otros solventes pertenecientes a la familia de los hidrocarburos clorados como el cloroformo, el diclorometano, el tetracloruro de carbono o sus mezclas suelen usarse con diferentes rendimientos para cada tipo de sustancia antioxidante. Otro mtodo de extraccin por solventes utiliza aceites neutros que, adems de disolver o capturar los antioxidantes del material vegetal, no necesitan separarse en el producto nal, esto es son soportes de los principios activos del antioxidante. Algunas oleorresinas comerciales de romero, salvia y organo utilizan el MCT u otros de los aceites mencionados como solventes y a la vez soportes de los principios activos antioxidantes y sus aplicaciones se orientan a alimentos crnicos y cereales. Los aceites neutros generalmente son triglicridos de cadena media (Medium Chain Triglycerides (MCT)), con cadenas de diez a 12 tomos de carbono. Tambin se usan aceites de almendra, de ssamo, de maiz y de man. En estos casos se debe considerar que este tipo de solventes no coneran fuerte olor y sabor al producto, no se enrancien y no se tornen turbios.
48
El mtodo de extraccin de antioxidantes de plantas con uidos supercrticos se lleva a cabo en condiciones de temperatura y presin de un solvente superiores al punto crtico del mismo. El solvente ms usado en esta extraccin es el dixido de carbono. Tambin se usan el agua, el etano, el eteno, el propano, el xenn y el xido nitroso. Los uidos en estado supercrtico tienen gran poder disolvente y penetracin en slidos, con buen y rpido rendimiento de extraccin. Los extractos se separan del solvente mediante cambios en las condiciones de presin o temperatura del uido. El proceso tiene cuatro etapas: extraccin a alta presin, expansin mediante una vlvula reductora, separacin con un separador de baja presin y compresin del solvente a travs de una bomba para poder reciclarlo en el proceso. El slido triturado se carga en el extractor. Luego de cerrado el equipo se ingresa el dixido de carbono con una presin de 100 a 400 bar y temperaturas entre 30 a 60 grados centgrados obtenidas por el pasaje previo del gas en un intercambiador de calor. La salida del gas con los componentes extrados del material vegetal se hace a un separador a travs de una vlvula de reduccin donde la presin alcanzada ronda entre los 50 y 150 bar. En esas condiciones el extracto precipita y el gas sigue curso hacia un enfriamiento y compresin y vuelve al proceso. El extracto puede separarse en forma seleccionada controlando las condiciones operativas del proceso y utilizando ms de un separador segn las solubilidades de las sustancias y la especicacin del producto buscado. El dixido de carbono puede ser mezclado con otro uido para hacer una extraccin ms selectiva. El mtodo reviste una alta eciencia de extraccin porque, adems de un buen rendimiento obtenido hasta agotar el material vegetal de los principios activos antioxidantes, las condiciones del proceso son favorables para conservar las propiedades de las sustancias extradas y minimizar su degradacin, dadas por las bajas temperaturas, el contacto con un solvente inerte y los mnimos procesos posteriores para obtener el producto nal. La versatilidad de este mtodo ayuda a realizar extracciones selectivas de sustancias presentes en el extracto modicando las condiciones operativas. Pero este aspecto demanda
49
de ensayos experimentales para la bsqueda de dichas condiciones en sus puntos ptimos. Las temperaturas de extraccin moderadas protegen a los componentes de la degradacin trmica. El producto queda despojado de solvente y de contaminantes biolgicos con lo cual prolonga su vida til. Este es el aspecto de mayor valor para el consumo humano porque es un producto inocuo sin trazas de solventes ni de otro tipo de contaminantes perjudiciales para la salud. A su vez el proceso permite usar mezclas de solventes de extraccin supercrticas, y gobernar las variables del proceso para obtener el mejor rendimiento. Tambin no genera contaminantes peligrosos para el medio ambiente y se trabaja en general con equipos altamente automatizados dadas las condiciones de trabajo. La extraccin por solvente en condiciones normales tiene un costo moderado en equipamiento y servicios. Se extraen un nmero importante de sustancias para lo cual se requiere de separaciones selectivas si se quiere aislar un principio activo o sustancia deseadas. Este sera el principal costo. A su vez, las reglamentaciones exigen mnimos e insignicantes residuos de solventes lo cual incrementa los costos en la recuperacin. En el caso de la extraccin por uidos supercrticos los equipos deben soportar el rango de altas presiones de trabajo con lo cual el material, el diseo, los equipos auxiliares y el control de los dispositivos son aspectos claves para la seguridad y el funcionamiento del equipo. A los costos de equipamiento se le suman los de consumo de energa para las etapas del proceso lo cual convierte a este tem en un elemento clave. La extraccin con uidos supercrticos es apta para plantas de extraccin de varios productos, para lo cual se requiere de ensayos previos para buscar las condiciones de operacin ptimas y los datos de equilibrio para conocer la distribucin del componente en las distintas fases y determinar la composicin del producto extrado para cualquier composicin de la mezcla inicial. Este tipo de extraccin se utiliza para la obtencin de aceites esenciales destinados a perfumera, esencias de especias y oleoresinas, frmacos naturales, colorantes, t y caf descafeinados, etc.
50
Optimizacin del proceso de extraccin

Cualquiera sea el mtodo de extraccin por solvente, para que el proceso sea competitivo a escala industrial, se deben optimizar los costos operativos e inversin en equipamiento. Para ello es importante disponer de un modelo para el proceso de extraccin utilizado que relacione las variables de proceso con los componentes del costo. El modelo mencionado se construye a partir de las ecuaciones de balance y equilibrio que describen al sistema, incluyendo los parmetros de cada uno de los procesos tales como volumen de los extractores, velocidad o tiempos de alcance del estado de equilibrio, relacin slido/solvente, tamao de partculas slidas, temperatura, etc. Se relacionan luego los costos como costo de solvente por volumen del extractor, gastos de funcionamiento de cada equipo, etc. Tabla: implementacin del modelo en planilla de clculo
VARIABLES DE OPTIMIZACION Tiempo de prensado [minutos] Presin de prensado [kg/cm2] Relacin MCT/romero [litros/kg] VARIABLES DEL PROCESO Lotes de AC B [kg AC] = Concentracin MCTx[grAC/ml] = MCT retenido a t innito = Avance del prensado = Lotes de romero F [kg] = Tamao de la prensa m2 = 0.38095238 0.07669947 0.02763587 0.85340868 21.3683681 1.03636585 Suma parcial 441469.553 70 40 0.3 COSTOS DE PRODUCCION [$/ao] Prensa Romero MCT 112434.079 140229.916 188805.559 CAPACIDAD DE PRODUCCION Q [kg/ao] H [hr/ao] 1000 3500
A partir de un listado inicial de variables de proceso sospechadas de tener un impacto sobre el diseo del proceso de extraccin se debe realizar un primer diseo de experiencias destinado a caracterizar la inuencia de cada una. Las variables comunes a todos los procesos se dan por la relacin slido/solvente, grado de
51
humedad de las muestras, tamao de las partculas del slido, solubilidad del slido en el solvente seleccionado, tiempo de alcance del equilibrio, entre otras. Algunas sustancias extrables pueden tener ciertas caractersticas particulares que deben considerarse junto con el grupo anterior. Con los resultados obtenidos se pueden determinar cotas operativas para las variables que establecen una relacin de compromiso entre componentes del costo del proceso industrial. A modo de ejemplo, un proceso de extraccin de antioxidantes de romero (cido carnsico (AC)) con solventes no voltiles o aceites neutros mencionados anteriormente (MCT) por presin hidrulica se model con las ecuaciones de balance y equilibrio del sistema. Las variables de optimizacin seleccionadas fueron el tiempo de prensado la presin de prensado y la relacin MCT/romero. Se consider un objetivo de produccin Q = 1000 kg por ao de cido carnsico con H = 3500 hr de produccin por ao, que corresponde a 2 turnos diarios. Esta produccin correspondera a un volumen de ventas de 1.000.000 $/ao considerando que el precio del producto est determinado por su actividad antioxidante, por ejemplo 40 $/kg para un producto con 4% de AC u 80 $/kg para un 8% de AC (el agente extractivo y soporte MCT es un insumo cuyo valor no se recupera en el precio del producto porque no se reutiliza en el proceso de extraccin ya que forma parte del producto nal). Se determin el tamao de los lotes a producir, la concentracin del producto X por balance de materia considerando el estado de equilibrio, el volumen de solvente retenido en el slido, el grado de avance del prensado, el tamao de la prensa, el costo anual de la operacin de prensado y de los insumos romero y MCT. Se obtuvieron nueve ecuaciones representativas del sistema y se implementaron en Microsoft Excel para su optimizacin, como se muestra en la tabla con los valores ptimos de las variables T, P, R. Considrese que a la suma parcial de los costos considerados debern adicionarse los de molienda, mezclado, envasado, mano de obra, gastos jos, etc., y que el valor estimado de ventas es de un milln de
52
pesos anuales, de manera que optimizar este importante componente del costo (aproximadamente 50 %), es crucial para la viabilidad econmica del proceso. Esto vale tanto para la etapa de desarrollo como para un proceso en produccin, por cuanto ante una variacin en los precios de los insumos, ser importante readaptar el valor de las variables (en este caso para cada tipo de capacidad de prensa), para trabajar en las condiciones que optimicen econmicamente la produccin. El efecto de econmico de cada variable del proceso se resume en los siguiente: incrementando T aumenta el tamao de los lotes (se deben procesar menos lotes ms grandes) con lo que aumenta el tamao y por tanto el costo de la prensa. Pero a su vez se incrementa el avance del prensado con lo que se consumen menos romero y MCT. Ambos efectos se compensan alrededor de un tiempo de prensado T = 70 minutos. el tamao de lotes de AC y avance del prensado se mantienen constantes (dependen del tiempo de prensado), lo mismo ocurre con la concentracin de AC en el producto, que depende de R. Al aumentar la presin se reduce el contenido de MCT en el slido a tiempo innito y conduce a extraer ms producto: se reduce el tamao de los lotes de romero y por tanto el costo en romero y MCT. El tamao de la prensa tambin disminuye monotonnicamente, esto es, la tendencia de la respuesta disminuye o aumenta siempre en los rangos considerados y no hay puntos ptimos intermedios. Sin embargo el incremento de la presin de diseo ocasiona un sostenido incremento en el costo de la prensa. Los efectos se compensan con un ptimo alrededor de una presin de prensado P = 40 kg/cm2 al incrementar la relacin romero/MCT se incrementa el costo directo en MCT, sin embargo la cantidad de AC extrado se incrementa con lo que se requieren lotes cada vez menores de romero. Esto se traduce en una disminucin constante de los costos por el consumo de romero y una reduccin tambin monotnica del tamao y costo de la prensa. Estos efectos se compensan alrededor de una relacin ptima R = 0.3.
53
El trabajo descrito ilustra un estudio orientado a la bsqueda de las alternativas ms favorables del proceso aprovechando experiencias a escala de laboratorio y utilizando modelos del proceso y su simulacin. Se destaca la importancia de la realizacin de ensayos preliminares, bajo un diseo organizado para obtener la mayor informacin con el mnimo costo en dinero y tiempo. Estos resultados resultan de utilidad para las etapas siguientes del desarrollo del proyecto a escala industrial que se describen a continuacin: 1. Especicaciones de productos. Mtodos analticos de las propiedades. Especicacin y suministro de materias primas. 2. Informacin del mercado del producto y formas de comercializacin, y los precios de las materias primas e insumos para estimar el precio del producto y el volumen de produccin. 3. Informacin general del proyecto con temticas de localizacin, infraestructura, disponibilidad de servicios, sistemas de transporte, para la instalacin de una empresa. 4. Determinacin de la capacidad de produccin. Descripcin del proceso general y bsqueda de alternativas mediante la realizacin de balances de materia y energa para seleccionar equipos y servicios auxiliares. 5. Anlisis de rentabilidad con el estudio de las inversiones requeridas, costos de produccin y estimacin de benecios y rentabilidad. 6. Evaluacin tcnica y econmica para determinar las condiciones de factibilidad del proyecto. La realizacin de este conjunto de etapas se hace en forma iterativa, ya que puede ser necesario profundizar en detalles del mercado, de los equipamientos y de otros elementos para hacer los ajustes necesarios y buscar el proceso de mayor rentabilidad para la produccin a escala comercial de los productos antioxidantes. Estos son los aspectos que necesita abordar el proyecto de antioxidantes de origen natural de CYTED conducentes a la evaluacin de los procesos de extraccin de los productos nales a nivel de ingeniera de procesos.
54
Bibliografa
Aeschbach R, Bachler R, Rossi P, Sandoz L and Wille HJ (1993): Nestl Research Centre, Switzerland. Oils and Fats Internationals, 9(2), 18-22. Hudson B (1994): Food Antioxidants. Elsevier Applied Science. Douglas JM (1988): Conceptual Design of Chemical Process, Mc Graw-Hill, New York. Moure A, Cruz J, Franco D, Domnguez M, Sineiro J, Domnguez H, Nez M and Paraj C (2001): Natural Antioxidant from Residual Sources. Food Chem 72, 145171. Tymoschuk AR, Mato RO e Iribarren OA (1998): Modelo para escalar extracciones slido-lquido por Prensado. Jornadas Argentinas de Qumica Fina, Santa Fe, julio 1-3. Tymoschuk AR, Mato RO and Luna J (1999): Obtention of Rosemary Antioxidant Oleoresins by Extraction under Pressure. Acta Horticulturae, 503, 45-51. List P and Schmidt P (1989): Phytopharmaceutical Technology, CRC Press.
55
LA AUTOXIDACIN Y LA RANCIDEZ. Teora

Alfredo Rosas Romero arosas@usb.ve
LA AUTOXIDACIN Y LA RANCIDEZ OXIDATIVA. Teora

Alfredo Rosas Romero
arosas@usb.ve Universidad Simn Bolvar. Departamento de Qumica. Apartado 89000 Caracas 1080A. Venezuela
Introduccin
Por autoxidacin designamos la reaccin del oxgeno que conlleva la degradacin oxidativa de ciertas substancias orgnicas, en general de los lpidos insaturados, y en particular de las grasas y los aceites. Asimismo, llamamos rancidez oxidativa a las consecuencias de la autoxidacin, esto es a la acumulacin de productos secundarios causantes de malos olores y sabores que nos inducen a rechazar el producto. Eventualmente estas reacciones disminuyen la calidad nutricional del alimento y nalmente lo pueden tornar txico. El mismo criterio lo aplicamos a cualquier otro producto que posea una fraccin grasa oxidable, como es el caso de las pinturas, los cosmticos, los lubricantes, entre otros ejemplos, que por autoxidacin son propensos a enranciar, con la consiguiente prdida de calidad.
El mecanismo
El mecanismo de la autoxidacin es una reaccin en cadena propagada por radicales libres:
59
Iniciacin
Es aqu donde, a partir del sustrato oxidable, se producen los primeros radicales libres. Una amplia variedad de factores afectan la velocidad de este paso, de los cuales, uno de los ms importantes es la presencia de trazas de metales pesados: RH + M+n R + H+ + M+ (n-1)
Otro factor es la reaccin con el oxgeno singulete, formado por reacciones fotoqumicas de la molcula de oxgeno en su estado fundamental (triplete) en la presencia de un sensibilizador:
Donde 1 S : 1 * S : 3 * S : 3 O2 : : 1 O2* : h :
Estado singulete del sensibilizador Estado singulete excitado del sensibilizador Estado triplete excitado del sensibilizador Oxgeno en estado triplete normal Estado singulete excitado Fotones UV
En general, podemos hablar de la iniciacin como la reaccin del sustrato con una especie iniciadora, In, que puede ser generado foto60
LA AUTOXIDACIN Y LA RANCIDEZ. TEORA
qumica, radioltica o trmicamente, o por la accin de otros radicales libres originalmente presentes - o generados - en el medio. RH + In R. + InH
Como se ve, la reaccin de iniciacin ser acelerada por la accin de la luz y por la de compuestos que generen radicales libres; por lo que ser inhibida al proteger los sustratos oxidables de la accin de la luz y por compuestos que reaccionen con los radicales libres para formar productos que sean estables. En las primeras etapas, la velocidad de la autoxidacin -normalmente lenta- est determinada por la tasa de iniciacin, la cual describimos cinticamente como: Ri = ki [In] Por su representatividad, usaremos el cido linoleico como ejemplo para ilustrar el mecanismo de la autoxidacin. As los primeros radicales libres son generados durante la iniciacin por ataque al alfametileno activado por los dos dobles enlaces vecinos. Este radical libre se presenta bajo las tres posibles estructuras:
61
Propagacin
El primer paso de la propagacin es dependiente de la presin parcial de oxgeno en el medio. Es aqu donde se generan los prime62
ros radicales peroxilos. La molcula de oxgeno se adiciona al radical y produce una tpica isomerizacin cis-trans. En el segundo paso de la propagacin, que ya no depende de la presencia del oxgeno, el radical peroxilo reacciona con otra molcula del linoleico para generar los hidroperxidos isomricos, y un nuevo radical libre del cido graso que entrar en la cadena de propagacin. Como es de esperarse, la formacin de los hidroperxidos conjugados est favorecido por lo que constituyen el 90% de los hidroperxidos que se forman. Los sustratos monosaturados, aun a 50 C, reaccionan muy lentamente. Y los saturados no reaccionan en esas condiciones sino que se comportan como sustratos inertes.
Fase monomolecular
Al comienzo la autoxidacin est regulada por la descomposicin monomolecular de los hidroperxidos formados durante la propagacin. Esta reaccin es lenta porque los hidroperxidos no se acumulan todava en concentraciones apreciables, por lo cual aun no se establece la rancidez y el producto es estable. ROOH RO. + HO.
La duracin de esta etapa determina la vida de mercado del producto; relacionada con el perodo de induccin, el cual es un valor emprico que denimos como el tiempo necesario para alcanzar la oxidacin del primer 1% del sustrato. Al sobrepasar este punto, y establecerse la reaccin de propagacin en cadena, ya la estabilidad del producto se ver seriamente reducida, lo que signica que la estabilizacin el producto por la accin de los compuestos antioxidantes debe realizarse durante esta fase monomolecular.
Fase bimolecular
Cuando la concentracin de hidroperxidos ha alcanzado una concentracin sucientemente alta, la descomposicin de los hidroperxidos cambia a un mecanismo mucho ms eciente, el bimolecular.
63
2ROOH
RO. + ROO. + H2O
A partir de este punto la accin de los antioxidantes es muy poco efectiva. El drstico incremento en la velocidad de la autoxidacin conduce rpidamente a la rancidez y a la prdida del valor comercial del producto.
Terminacin
Este paso involucra la interrupcin de la reaccin en cadena porque a partir de los radicales libres se forman compuestos estables que ni inician la reaccin ni la propagan, con lo cual se interrumpe la cadena. La reaccin ms probable en la terminacin depender de la abundancia relativa de las diferentes radicales libres en la reaccin. Despus de la fase monomolecular, el paso ms probable ser la reaccin entre dos radicales perxidos (RO2.). R. + R. RO2.+ R. RO2. + RO2. Productos que no inician ni propagan la reaccin
Formacin de productos secundarios

La rancidez es consecuencia de los olores y sabores desagradables que se acumulan debido a la formacin de una amplia variedad de productos secundarios voltiles, durante los pasos de propagacin y terminacin de la autoxidacin. La siguiente gura ilustra la formacin de productos secundarios durante las reacciones de propagacin. En el paso A se genera el altamente reactivo radical perxido. Las reacciones B y D representan el clivaje de los radicales perxidos para dar origen a: aldehdos insaturados, alcanos, cidos grasos de cadenas ms cortas y aldehdos saturados. La reaccin C explica la interaccin entre un radical perxido y una molcula fresca del sustrato (un cido graso en este ejemplo) para formar un alcohol secundario insaturado.
64
Ntese que en todas estas reacciones se genera un nuevo radical del cido graso libre, el cual se encargar de continuar la reaccin de propagacin de manera autocataltica.
Mediante las reacciones de terminacin se produce una amplia gama de compuestos secundarios voltiles que tambin contribuyen al enranciamiento. Abajo ilustramos los posibles mecanismos para explicar la generacin de cetonas insaturadas, alcoholes, steres, perxidos, polmeros y epxidos. El siguiente mecanismo explica la formacin de aldehdos de cadena corta de tamao variable, de dialdehdos y polmeros carbonocarbono y oxgeno-oxgeno. Ntese que la consecuencia de las reacciones de terminacin es la eliminacin de dos radicales libres en cada paso y la formacin de compuestos secundarios estables que no participan en la autoxidacin, aunque s en la rancidez.
65
Consecuencias de la autoxidacin
En alimentos lo ms importante son los olores y sabores desagradable que llevan al rechazo del producto. En otros casos lo ms relevan66
te podra ser el dao a las protenas, la destruccin de las membranas celulares, la descomposicin de las vitaminas, en particular de las vitaminas C y E; el dao oxidativo al ADN, la perdida de las propiedades fsicas de las pinturas, gomas, plsticos, cauchos y lubricantes o de la estabilidad de los cosmticos o de los frmacos. En productos terminados, el estudio de la autoxidacin se hace mucho ms complicado que lo que hemos expuesto por la participacin de diferentes componentes del producto como los carbohidratos, las protenas, los antioxidantes naturales, los amino cidos libres, los metales y dems prooxidantes; y de las condiciones fsicas del medio tales como la actividad del agua, el pH, el estado de agregacin del producto, la temperatura y la disponibilidad del oxgeno. Agregando, nalmente, que los efectos de estos factores generalmente estn ntimamente interrelacionados.
Modelo cintico de la autoxidacin
67
De acuerdo con el mecanismo aceptado para la autoxidacin:
Donde In : Iniciador ri : Velocidad de iniciacin ki : Constante de velocidad de iniciacin ko : Constante de velocidad del paso que depende del oxgeno kp : Constante de velocidad de propagacin kt kt Constantes de velocidad de terminacin kt La reaccin procede de acuerdo con la siguiente ley de velocidades:
(1)
68
donde velocidad de absorcin de oxgeno
velocidad de formacin de hidroperxido k, k : ri : [RH]: [O2] : Constante de velocidad Velocidad de iniciacin Concentracin del sustrato Concentracin de oxgeno
Aceptemos que la reaccin puede ser tratada de acuerdo a la aproximacin de Boldstein del Estado Estacionario, o sea, que en el estado estacionario la tasa de cambio de las concentraciones de cada tipo de radical es aproximadamente cero una vez que el mecanismo de la reaccin se haya instaurado:
Cuando el oxgeno no es limitante, podemos aceptar que inicialmente todo el oxigeno consumido formar hidroperxidos. Y supongamos tambin que la mayora o todos los radicales formados estarn bajo la forma de radicales hidroperxidos (ROO.), por lo cual la terminacin ser debida a la reaccin de dos de estos radicales. Entonces la ecuacin (1) se convierte en: (2)
Perodo monomolecular
69
Donde ki : [M] : ri : Constante de velocidad de iniciacin monomolecular Catalizador, metal, concentracin Velocidad de iniciacin monomolecular
La velocidad de iniciacin viene dada por:
Sustituyendo en (2), tenemos: (3)
Al comienzo de la reaccin podemos suponer que el consumo del sustrato oxidable es muy poco y que por lo tanto su concentracin es constante, por lo que podemos denir una constante global de velocidad monomolecular: (4)
Sustituyendo esa expresin en (3), obtenemos: (5)
Dado que a estos niveles de oxidacin la concentracin de los hidroperxidos es aproximadamente igual al oxgeno consumido: (6)
70
Integrando: (7)
De all que un grco de la raiz cuadrada de la cantidad de oxgeno consumida o de la concentracin de hidroperxidos formados, contra el tiempo de reaccin, dar una lnea recta cuya pendiente ser igual a Km/2, tal como mostramos en la siguiente grca:
Perodo bimolecular
Cuando la concentracin de hidroperxidos ha crecido por encima de un cierto umbral, al nalizar el perodo de induccin, el mecanismo de la descomposicin de los hidroperxidos cambia a la fase bimolecular
71
La nueva tasa de iniciacin ser:
Donde kii : Constante de velocidad de iniciacin bimolecular rii : velocidad de iniciacin bimolecular Sustituyendo en (2) (8)
Supongamos que la descomposicin de los hidroperxidos aun no es signicante y que el oxgeno absorbido sigue siendo aproximadamente igual a la cantidad de hidroperxido formado, entonces:
Pero, en estas circunstancias, el consumo del sustrato si ser apreciable por lo que su concentracin en cada momento se reducir a: (10) (11) Donde [RH0] es la concentracin inicial del sustrato oxidable y [RH] es su concentracin en un tiempo t. Agrupando todas las constantes, obtenemos la expresin para la constante global de velocidad bimolecular, Kb. (12)
72
Sustituyendo 10 y 11 en 12:
que al integrar produce: (13)
De all que un graco del logaritmo de y/(1-y) sea una lnea recta con pendiente igual a Kb , como mostramos en la siguiente grca:
El clculo de las constantes globales Km y Kb, arroja excelentes resultados para el estudio de sistemas modelo, donde las concentraciones de los reaccionantes y dems variables de reaccin, pueden mantenerse bajo control, y cuando la reaccin transcurre en ausen-
73
cia de compuestos antioxidantes (Rosas Romero y Morton, 1975a, 1975b, 1977a,1977b).
Modelo cintico de la autoxidacin en presencia de antioxidantes

La reaccin de autoxidacin puede ser inhibida por la accin de compuestos que intereran con los pasos de iniciacin y de propagacin de la reaccin en cadena. La actuacin de estos antioxidantes puede ser mediante el acomplejamiento de metales; por descomposicin de los radicales peroxilos y de los hidroperxidos para dar compuestos no radicales; por entrampamiento de los radicales libres que haya en el medio. La reaccin tambin puede ser inhibida ajustando las condiciones fsicas para eliminar el oxgeno o prevenir la accin de la irradiacin solar. ROO. + AH Kinh ROOH + A.
Si el antioxidante no reacciona con el oxgeno y el radical A. no propaga la reaccin, esto es, si: AH + O2 A. + RH HOO. no reaccin
Entonces, la velocidad de propagacin sufrir una disminucin y, cuando la constante de la inhibicin sea mayor que la de iniciacin, Kinh>>Ki, la ley de velocidades podr escribirse como: -d[O2]/dt = [RH] (ri)1/2 Kp/Kinh [AH] Donde ri es la velocidad de la reaccin de iniciacin. En general, el antioxidante puede volver a reaccionar segn: A. + nROOH no radicales
por lo que debemos reescribir la ecuacin cintica como:

74
-d[O2]/dt = [RH] (ri)1/2 Kp/nKinh [AH] La estequiometra de la reaccin inhibida, esto es, el valor de n, la podemos determinar midiendo el perodo de induccin, , cuando la reaccin no est totalmente inhibida, y es iniciada a velocidad constante (y conocida) por el uso de un generador de radicales libres, como el ABAP (Burton e Ingold, 1981). Recordando que el perodo de induccin lo hemos denido como el tiempo de duracin de la fase monomolecular de descomposicin de los hidroperxidos, nos queda que:
n = ri
/[AH]
Donde ri est determinada por la cantidad de iniciador utilizada. Y, como la extensin del perodo de induccin, , es proporcional a Kinh y a la concentracin del antioxidante, [AH], podemos calcular Kinh experimentalmente gracando el consumo de oxgeno durante el perodo de induccin en funcin del logaritmo de (1-t/ ); donde t es el tiempo transcurrido de la reaccin. La pendiente ser -Kp [RH]/nKinh (Barclay et al, 1995); donde Kp es la constante del paso de propagacin, conocida para el sustrato que se est empleando, y [RH] es la concentracin inicial del sustrato. De esa manera podremos medir la accin antioxidante, calculando las constantes absolutas de reaccin.
Midiendo la autoxidacin
En el captulo La Autoxidacin y la Rancidez Oxidativa. Analtica discutimos las tcnicas apropiadas para este n.
Bibliografa
Barclay LRC, Edwards CD, Mukai K, Egawa Y y Nishi T (1995): Chain breaking naphtolic antioxidants: Antioxidant activities of polyalkylbenzochromanol, and 2,3-
75
Dihydro-5-hydroxy-2,2,4-trimethylnaphtol[1,2-b]furan compared to a alpha-tocopherol model in sodium dodecyl sulfate micelles. J Org Chem 60, 2739-2744. Burton GW e Ingold U (1981): Autoxidation of Biological Molecules. 1. The antioxidant activity of vitamin E and related chain-breaking phenolic antioxidants in vitro. J Am Chem Soc 103, 6472. Rosas Romero AJ y Morton ID (1975a): Autoxidation of Fatty Acids and their Methyl Esters. J Sci Food Agric 26, 536. Rosas Romero AJ y Morton ID (1975b): A kinetic study of the competitive oxidation of oleic- linoleic acid mixtures. J Sci Food Agric 26, 1353. Rosas Romero AJ y Morton ID (1977a) Competitive Oxidation of Fatty Acids. Effect of the Degree of Unsaturation. J Sci Food Agric 28, 916. Rosas Romero AJ y Morton ID (1977b): Competitive oxidation of Fatty Acids. Effect of the Carboxylic Group and of Saturated Fatty Acids. J Sci Food Agric 28, 921.
76
LA AUTOXIDACIN Y LA RANCIDEZ. Analtica

Alfredo Rosas Romero arosas@usb.ve
LA AUTOXIDACIN Y LA RANCIDEZ OXIDATIVA. Analtica

Una de las maneras ms directas de estudiar la cintica de la autoxidacin, es medir la cantidad de oxgeno absorbido en funcin del tiempo, lo cual puede realizarse mediante una tcnica manomtrica empleando un respirmetro de Warbourg (Rosas Romero y Morton, 1975).
El mtodo del Rancimat

Es ampliamente empleado en la industria de alimentos, mide el perodo de induccin a alta temperatura para acelerar la velocidad de la oxidacin a valores prcticos para la determinacin (Murcia et al., 2001) La actividad antioxidante tambin puede medirse basndose en la velocidad de aparicin de los productos de la autoxidacin. Entre estas tcnicas las ms usadas son: La determinacin del Valor Perxido: la oxidacin de los cidos grasos y sus derivados, produce una mezcla de hidroperxidos, los cuales se acumulan al transcurrir la reaccin. La cantidad total de estos compuestos puede ser determinada iodomtricamente (AOCS, 1989) y espectromtricamente (El-Saadani et al., 1989) La prueba del cido Tiobarbitrico. (Botsoglou et al., 1994): Los hidroperxidos formados por la autoxidacin de la fraccin grasa se transforman en aldehdos. Esta tcnica se basa en la determinacin de los productos resultantes de la reaccin de esos aldehdos (fundamentalmente el malonaldehdo) con el cido tiobarbitrico (TBA).
79
La determinacin de los hidroperxidos (LOOH) y de los hidrxidos de los cidos grasos (LOH). (Teng y Smith LL, 1985). Los hidroperxidos e hidrxidos que se acumulan con el transcurso de la autoxidacin, pueden determinarse cuantitativamente por cromatografa lquida. Estos valores estn relacionados con la cintica de la oxidacin. La determinacin de los hidroperxidos por Cromatografa de Gases-Espectroscopa de Masas (Terao et al., 1984). Este es un mtodo ms sensible que el anterior, pero tiene la desventaja de que requiere la derivacin del material lipdico para convertirlo en compuestos sucientemente voltiles para poder usarlos en cromatografa de gases. Esta manipulacin generalmente involucra la estericacin de los cidos grasos libres, la sililacin y en algunos casos tambin es necesario reducir los dobles enlaces. El ensayo de Kreis: el oroglucinol forma compuestos fuertemente coloreados al ser atacado por los perxidos, lo cual permite la evaluacin colorimtrica del progreso de la autooxidacin o de la actividad antioxidante (Pool y Pratter,1945). La deteccin por cromatografa de gases de la formacin de alcanos, 1-pentanol, o hexanal (Koelsch et al., 1991 y Park y Goins, 1992). La quimiluminiscencia generada por la hidroperoxidacin de los lpidos al reaccionar con compuestos como el luminol (Miyazawa et al., 1987 y Parejo et al., 2000) Y, similarmente, por ourescencia (Ghiselli et al., 1995). Por la absorbancia del radical oxgeno (Cao et al., 1993) y por la formacin de dienos conjugados como consecuencia de la formacin de los hidroperxioso a partir de cidos grasas polinsaturados y sus derivados (Esterbauer et al.,1989). A continuacin explicaremos las tcnicas que hemos usado en nuestro proyecto: la basada en la decoloracin del -caroteno y la que mide el entrampamiento de los radicales libres producidos por el DPPH. Asimismo hemos desarrollado una tcnica, basada en la formacin de dienos conjugados, para estudiar la autoxidacin cuando
80
LA AUTOXIDACIN Y LA RANCIDEZ. ANALTICA
las soluciones absorben a frecuencias cercanas a la de la absorcin del -caroteno.
Decoloracin del -caroteno Fundamento de las tcnica

En el medio de reaccin se desarrolla la propagacin de la reaccin de autoxidacin del cido linoleico, que podemos representar como: L. + O2 LOO2 + LH LOO2. LOOH + L.
Donde: LH = una molcula de cido linoleico LOOH = hidroperxido del cido linoleico. L. = radical del cido linoleico LO2. = radical perxilo
Estructura del -caroteno
Los radicales libres as formados, reaccionan con el -caroteno presente en el medio destruyendo la conjugacin original de sus dobles enlaces, y en consecuencia disminuyendo la intensidad del color anaranjado que l aporta a la solucin. Esta perdida de absorbancia es la que medimos en funcin del tiempo, como una expresin del transcurso de la autoxidacin del cido linoleico. Esta reaccin del cido linoleico puro la tomamos como el control para nuestras determinaciones. En otras celdas de reaccin agregamos, a la solucin control, los extractos o fracciones que deseemos evaluar, y la velocidad de dis81
minucin de la intensidad del color del -caroteno estar relacionada con el poder antioxidante de las muestras bajo evaluacin.
Resultado tpico de la tcnica de decoloracin del caroteno. Los nmeros representan la colocacin de las celdas. La celda 1 es la referencia fotomtrica, 100% T.
Denimos la actividad antioxidante de una muestra, , como la inhibicin de la reaccin de oxidacin del cido linoleico, tomando a la accin de BHA como 100%. Y la calculamos mediante la siguiente expresin: = [(Pc Pm) / (Pc PBHA)] x x 100 Donde Pc = es la pendiente de la reaccin control, sin antioxidante agregado Pm = es la pendiente de la muestra bajo evaluacin
82
PBHA = es la pendiente de la reaccin que contiene el antioxidante de referencia, BHA = es la concentracin del BHA/concentracin de la muestra, en mg/mL; igual a 1 en nuestro diseo. Las pendientes se calculan mediante la regresin de la absorbancia en funcin del tiempo, empleando los datos de la zona lineal, en la seccin D, de la celda correspondiente. Una discusin detallada de la parte experimental de esta tcnica se encuentra en EL DISEO EXPERIMENTAL.
Capacidad de captura de radicales libres (dpph) Fundamento de la tcnica
La molcula de DPPH contiene un radical libre estable. Como consecuencia del color prpura de sus soluciones, esta molcula absorbe a 517 nm. El ensayo se fundamenta en la disminucin del color prpura de sus soluciones como consecuencia de la donacin de un electrn por un compuesto con poder antioxidante. Calculamos el porcentaje de actividad de acuerdo con la siguiente expresin: %DPPH = [1-(Amuestra-Ablanco)]x100/ADPPH
83
Los resultados de esta tcnica los expresamos como la concentracin de la muestra que inhibe 50% del efecto promotor de radicales libres del DPPH, a lo que llamaremos EC50, en g/mL. Una discusin detallada de la parte experimental de esta tcnica se encuentra en El Diseo Experimental.
Comparacin de las dos tcnicas

Escogimos estas dos tcnicas para nuestro trabajo de monitoreo porque son fciles de ejecutar, demandan pequeas cantidades de muestra, arrojan resultados reproducibles, y miden la actividad antioxidante de los extractos y fracciones desde dos puntos de vista muy diferentes. La tcnica basada en la decoloracin del caroteno est muy bien relacionada con el fenmeno de rancidez en grasas y aceites, ya que trabaja, cercana a la temperatura ambiente, con una emulsin de cido linoleico en agua, donde la cantidad de oxgeno no es limitante; mientras que la tcnica del DPPH est relacionada especcamente con el entrampamiento de los radicales libres generados por el DPPH en un ambiente altamente polar, a temperatura ambiente, en ausencia de un sustrato lipdico oxidable. De esa manera, para que un extracto o sustrato sea considerado como interesante, no es necesario que produzcan buenos resultados en ambas tcnicas; ya que buenos resultados con la tcnicas del caroteno signica una alta capacidad para inhibir el proceso global de la rancidez de los sustratos lipdicos, mientras que la misma muestra puede dar bajos resultados con el DPPH, lo cual signica meramente que su actividad antioxidante no est basada en la inhibicin de la accin de radicales libres tipo DPPH. Situaciones contrarias tambin son frecuentes (Brand-Williams et al., 1995). Nosotros proponemos el uso simultneo de estas dos tcnicas para los trabajos de monitoreo de la actividad antioxidante en fuentes naturales, porque de esa manera se obtiene una mejor informacin sobre la potencialidad de los extractos o fracciones que se estudien, y sobre su eventual aplicacin industrial; ya que la primera nos habla del poder antioxidante frente a los procesos de rancidez oxidativa, y con el DPPH identicamos los extractos o fracciones que tienen una alta capacidad para inhibir la accin de los radicales libres.
84
El uso simultneo de estas dos tcnicas tambin contribuira a enfrentar el problema ocasionado por el uso, por los diferentes grupos involucrados con este tipo de trabajo, de una amplia variedad de tcnicas para medir la actividad antioxidante, con la consiguiente dicultad en el momento de comparar los resultados, tal como est claramente documentado en la literatura del rea (Arnao et al., 1999; Niki y Noguchi, 2000; Antolovich et al., 2002; Koleva et al., 2002 y Emmons et al., 1999).
Mtodo de los dienos conjugados

Esta tcnica la diseamos para evaluar el poder antioxidante de fracciones y extractos de plantas que absorben en la misma frecuencia que se usa en la tcnica de la decoloracin del -caroteno. Mientras el ensayo del -caroteno trabaja a 460 nm, el que presentamos lo hace a 235 nm con lo cual evitamos la interferencia.
85
El esquema explica como en los primeros pasos de la autoxidacin, como consecuencia de la formacin de los hidroperxidos, el sustrato sufre una isomerizacin, de cis-cis a cis-trans, que produce la aparicin de los dienos conjugados en el sustrato. En el espectro UV-Visible, estos dienos aparecen como una nueva absorbancia a 235 nm, la cual usamos para seguir la cintica de la autoxidacin.
Parte experimental
Solucin de dodecilsulfato de sodio (SDS) 0,12 M Disolvemos, en un frasco mbar, 6,9220 g de SDS en 200 mL de agua desionizada, agitamos hasta lograr una solucin homognea, a temperatura ambiente. Esta solucin tiene un tiempo mximo de estabilidad de 15 das. Solucin tampn de fosfato 0,3 M a pH 7,4 Disolvemos, en 100 mL de agua desionizada, 1,6015 g de NaH2PO4.H2O y 4,9309 g de Na2HPO4.7H2O. Ajustamos el pH a 7,4 con NaOH al 10%, luego agregamos 1 g de CHELEX-100 (para eliminar cualquier traza de metales) y agitamos por 24 horas. Filtramos y guardamos en frasco mbar. La solucin es estable por 15 das. Emulsin de cido linoleico 2,6 mM En un frasco mbar mezclamos con agitacin 8.330 L de SDS 0,12 M, 1.660 L de la solucin tampn de fosfato y 8,1 L de cido linoleico hasta obtener una solucin homognea. Si se conserva bajo refrigeracin, la solucin es estable durante el da de trabajo. Solucin del blanco de absorbancia Mezclamos en un frasco mbar 8,330 L de SDS 0,12 M con 1660 L de la solucin tampn de fosfato. La solucin es estable por 10 das. Solucin de iniciador (AIBN) 0,15 M Disolvemos 0,0543 g de 2,2-azobis(2-metilpropionitril) en 1000 L de metanol, termotatizamos la solucin a 40 C y la usamos inmediatamente. Solucin patrn de actividad antioxidante
86
Se selecciona un antioxidante patrn, por ejemplo BHA recristalizado, y se prepara una solucin que est a un 80% de la inhibicin total de la reaccin. A esta actividad le asignamos el 100%. Soluciones de las muestras Para cada muestra a la que se le vaya a medir la actividad antioxidante, preparamos una solucin metanlicas a la misma concentracin (en peso en el caso de extractos, en molaridades para compuesto puros) que la solucin patrn de antioxidante. Solucin control Es idntica a la solucin de las muestras, pero sin muestra.
Procedimiento de la evaluacin
Disponemos de 8 celdas termostatizadas en el espectrofotmetro, en la primera colocamos el blanco de absorbancia. En la octava el control (todo menos muestra) y nos queda capacidad para evaluar seis muestras simultneamente. Las celdas contienen un volumen total de 1.030 L: 1.000 L de la emulsin, 20 L del iniciador AIBN y 10 L de la muestra (de metanol para el control). Medimos la absorbancia durante seis minutos; cuando se ha alcanzado el equilibrio
87
trmico, iniciamos la oxidacin aadiendo la alcuota indicada del iniciador, agitamos las celdas, con un vortex, por 2 minutos y medimos la absorbancia durante 10 minutos ms. Finalmente, adicionamos la muestra (metanol en el control y el blanco), volvemos a agitar y continuamos la medida de la absorbancia. Trabajamos a 235 nm, tomamos lecturas cada 60 segundos durante 20 minutos adicionales. Repetimos el experimento tres veces. Durante la regin A se establece el equilibrio trmico, luego se agrega el iniciador y, durante B se establece el estado estacionario de la reaccin de autoxidacin no inhibida. En el punto C se agregan las muestras y las medidas de absorbancia durante los siguientes 20 minutos, se utilizan para calcular la pendiente de cada muestra. Mediante una regresin lineal de los valores de la absorbancia contra el tiempo, calculamos la pendiente durante los ltimos 20 minutos del experimento, esto es, durante la regin D. Calculamos la actividad antioxidante, como porcentaje de la actividad del patrn, mediante la siguiente ecuacin: % A = [(Pc Pm) / (Pc PBHA)] x x 100 donde: Pc = es la pendiente de la reaccin control, sin antioxidante agregado Pm = es la pendiente de la muestra bajo evaluacin PBHA = es la pendiente de la reaccin que contiene el antioxidante de referencia, BHA = es la concentracin del BHA/concentracin de la muestra, igual a 1 en nuestro diseo.
Bibliografa
Antolovich M, Prenzler PD, Patsalides E, Mcdonald S y Robards K (2002): Methods for testing antioxidant activity. Analyst 127: 183-198. AOCS (1989): Ofcial Methods and Recommended Practices. Am Oils Chem Soc. Champaign, IL
88
Arnao MB, Cano A y Acosta M (1999): Methods to measure the antioxidant activity in plant material. A comparative discussion. Free Radical Res 31:S89-S96. Botsoglou N, Fletouris D, Papageorgiu G, Vassilopoulos V, Mantis A y Trakatellis A (1994): Rapid, Sensitive and Specic Tiobarbituric Acid Method for Measuring Lipid Peroxidation in Animal Tissue, Food and Feedstuff Samples. J Agric Food Chem, 42, 921-932 Brand-Williams W, Cuvelier ME y Berset C (1995): Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity. Lebennm Wiss Tecnol 28: 25-30. Cao G, Helaine M y Cutler RG (1993): Oxygen-radical absorbance capacity assay for antioxidants. Free Rad Biol Med 14, 303-311. El-Saadani M, Esterbauer H, El-Sayed M, Goher M, Nassar AY y Jurgens G (1989): A spectrophotometric assay for lipid peroxides in serum lipoproteins using a commercially available reagent. J Lipid Res 30, 627-30 Emmons CL, Peterson DM y Paul GL (1999): Antioxidant capacity of oat (Avena sativa L.) extracts. 2. In vitro antioxidant activity and contents of phenolic and tocol antioxidants. J Agric Food Chem 47: 4894-4898. Esterbauer H, Striegl G, Puhl H y Rotheneder M (1989): Continuous monitoring of in vitro oxidation of human low density lipoprotein. Free Radic Res Commun 6, 6775. Ghiselli A, Serani M, Miani G, Azzini E y Ferro-Luzzi A (1995): A uorescencebased method for measuring total plasma antioxidant capacity. Free Rad Biol Med 18, 29-36. Koelsch CM, Downes TW y Labuza TP (1991): Hexanal formation via lipid oxidation as a function of oxygen concentration: Measurement and kinetics. J Food Sic, 56, 816-820, 834. Koleva II, Vanbeek TA, Linssen JPH, Degroot A y Evstatieva LN (2002): Screening of plant extracts for antioxidant activity. A comparative study on 3 testing methods. Phytochem Anal 13: 8-17. Miyazawa T, Fujimoto K y Kaneda T (1987): Detection of picomole levels in lipid hydroperoxides by a chemiluminescence assay. Agric biol Chem 51(9), 2569-2573. Murcia MA, Jimnez AM y Martnez-Tom M (2001): Evaluation of the antioxidant properties of Mediterranean and tropical fruits compared with common additives. J Food Protection 64, 2037-2046 Niki E y Noguchi N (2000): Evaluation of antioxidant capacity - What capacity is being measured by which method. IUBMB Life 50: 323-329. Parejo I, Codina C, Petrakis C y Kefalas P (2000): Evaluation of scavenging activity assessed by Co(II)/EDTA-induced luminol chemiluminescence and DPPH (2,2-diphenyl1-picrylhydrazyl) free radical assay. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods 44, 507-512. Park PSW y Goins RE. 1992: Determination of volatil lipid oxidation products by dynamic headspace-capillary analysis with application to milk-based nutritional products. J Agric Food Chem, 40, 1581-1585. Pool MF y Pratter AN (1945): A modied Kreis test suitable for photocolorimetry. Oil & Soap 22, 215-216
89
Rosas Romero AJ and Morton ID (1975): Autoxidation of Fatty Acids and their Methyl Esters., J Sci. Food Agric, 26, 536 Rosas-Romero A, Rojano B, Hernndez C, Martnez C, Silva J y Herrera J (1999): A novel approach to quantitative structure-property relationships in antioxidants. Ciencia 7: 78-87. Teng JI y Smith LL (1985): High-performance liquid chromatography of linoleic acid hydroperoxides and their corresponding alcohol derivatives. J Chrom 350(2), 445-51. Terao J, Inoue T, Yamagata S, Murakai H y Matsushita S (1984): Gas Chromatography-Mass Spectrometric Analysis of Monohydro peroxide Isomers and their Secondary Oxidation Products of Methyl Linoleate and Methyl Linolenate. Agric Biol Chem, 48(7), 1735-1743
90
EL ESTRS OXIDATIVO. Teora

Olga Sonia Len de Fernndez olga@infomed.sld.cu
EL ESTRS OXIDATIVO. Teora

Olga Sonia Len de Fernndez
olga@infomed.sld.cu Centro de Investigaciones y Evaluaciones Biologicas (CEIEB)-IFAL-UH Ave. 23 # 21425 e/214 y 222. La Coronela La Lisa. La Habana. Cuba
Especies reactivas del oxigeno

El trmino Especies Reactivas de Oxgeno (ERO) es una denominacin que engloba los radicales libres (RL) (tomos, iones o molculas con uno o ms electrones no pareados en el orbital ms externo) y a molculas derivadas del oxgeno que tengan alta capacidad reactiva. A continuacin referimos una cronologa de los descubrimientos ms importantes que han tenido lugar en la investigacin sobre esta temtica: 1775 Joseph Pristley, el descubridor del oxgeno, sugiri por primera vez que este gas podra ser txico a las clulas. 1900 Moses Gomberg, demostr la existencia del radical trifenilmetilo (Ph3C) 1952 Conger & Fairchild (Proc Natl Acad Sci USA) demostraron por primera vez que el dao oxidativo mediado por las ERO ocurra en los organismos vivos pues al aumentar la presin parcial de O2 aumentaba la frecuencia de aberraciones cromosmicas en granos de polen. 1954 Gerschman et al. (Science) propusieron que la toxicidad del oxgeno y el dao inducido por la radiacin UV tenan al menos un mecanismo comn, posiblemente relacionado con la formacin de RL. 1969 McCord y Fridovich demostraron que la eritrocuprena (una protena que se encuentra en altas concentraciones en los eritrocitos) cataliza la descomposicin del anin radical
93
superxido en H2O2 y O2. Esto constituy uno de los avances ms importantes en la biologa debido a que sugiri por vez primera que los RL de O2 se producen in vivo en cantidades signicativas. El O2 molecular es un biradical, al tener 2 electrones sin parear. Sin embargo, los 2 e- sin parear tienen el mismo spin, lo que impide que el O2 reaccione directamente con otros compuestos. La reduccin directa por otros 2 e- (a la vez) del O2 molecular est impedida por el hecho de que 2 e- no pueden ocupar un mismo orbital con el mismo spin. El principio de exclusin de Pauli (1925) establece que un orbital atmico no puede ser ocupado por ms de 2 electrones y para que estos 2 electrones lo ocupen deben tener spines contrarios (+ y -). La restriccin de spin puede evadirse de tres formas (lo que permite que el O2 pueda ser utilizado para la generacin de energa): 1. Al excitarse el O2, uno de los electrones sin parear puede pasar a otro orbital de ms energa y as invertir su spin. De esta forma se forma el oxgeno singlete (altamente reactivo) conocido como 1O2. 2. La unin del O2 a un metal de transicin que contiene electrones sin parear forma complejos que pueden aceptar un par de electrones de otros substratos sin violar el Principio de Exclusin de Pauli. 3. La restriccin de spin puede violarse aadiendo electrones al O2 paso a paso. La reduccin univalente del O2 involucra la produccin de Especies parcialmente reducidas de O2 (Fig.1.1).
Fig. 1.1 Reduccin del oxgeno molecular mediante la adicin sucesiva de electrones.
94
EL ESTRS OXIDATIVO. TEORA
El estudio de las ERO ha sido de gran signicacin para la prctica mdica, fundamentalmente aportando nuevos conocimientos acerca de la etiologa de diversas enfermedades, en la medida que: Se descubre cmo Sustancias Antioxidantes son efectivas en el tratamiento de estos desrdenes. Cmo frmacos, de ecacia comprobada en diferentes enfermedades, poseen propiedades Antioxidantes. La repercusin de las investigaciones sobre esta temtica se reejan en el nmero de artculos publicados sobre RL en las bases de datos de corte biomdico (Fig. 1.2).
Fig. 1.2 Artculos publicados en la temtica de radicales libres en la ltima dcada
Principales fuentes o mecanismos generadores de ERO

Los mecanismos fundamntales por los que se produce la generacin de ERO son: Cadena de transporte electrnico mitocondrial
95
Produccin del anin radical superxido por la cadena de transporte electrnico mitocondrial
Iones de metales de transicin
Fagocitos activados
96
Reacciones bioqumicas redox dependientes de O2 que tienen lugar en el metabolismo celular Monoamino-oxidasa (MAO)
Fenmenos de isquemia/reperfusin En condiciones de isquemia (baja pO2, pH bajo), la produccin de RL ocurre fundamentalmente por las siguientes vas: 1) Disfuncin mitocondrial 2) Avivacin de la Xantina oxidasa 3) Incremento del metabolismo del cido araquidnico 4) Inltracin de polimorfonucleares (PMNs) 5) Avivacin de la Oxido Ntrico Sintetasa Hiperoxia La formacin de O2- por la mitocondria (especcamente la ubisemiquinona) es proporcional a la pO2. Se estima que
97
aproximadamente 85% de las ERO que se producen en el pulmn expuesto a 100% de O2 provienen de las monooxigenasas de funcin mixta. La mitocondria contribuye con el otro 15%. Exceso de ejercicio fsico El consumo de O2 por el organismo aumenta 20 veces y en msculo se eleva hasta casi 100 veces, para incrementar la produccin de ATP por fosforilacin oxidativa mitocondrial. EL aumento en la utilizacin del O2 trae aparejado un incremento en la generacin de O2-. Y, la Xantina Oxidasa produce la activacin del catabolismo de nucletidos de adenina. Radiaciones ionizantes La radiacin ionizante proveniente de la atmsfera o de la radioterapia es absorbida fundamentalmente por el H2O (por su abundancia), producindose un gran nmero de compuestos en aproximadamente 10-9 segundos luego de la exposicin.
Contaminantes ambientales Componentes del humo del tabaco
ERO ms representativas y sus caractersticas Especies radicalarias

Dentro de las especies radicalarias de mayor inters desde el punto de vista biolgico estn el radical anin superxido (O2-), hidroxilo (OH), xido ntrico (NO), hidroperoxilo (HO2), peroxilo (RO2), alcoxilo (RO).
Especies no radicalarias
Las especies no radicalarias de mayor inters biolgico son: cido hipocloroso (HOCL), peroxinitrito (ONOO)-, perxido de hidrogeno (H2O2) y oxgeno singlete (1O2).
98
Mecanismos de defensa antioxidante

Las ERO se generan en condiciones siolgicas en muchas clulas. Por su potencial efecto destructivo, los leucocitos las producen contra agentes externos y son beneciosos en este caso, pero la mayor parte de las veces, el organismo utiliza potentes mecanismos para evitar la acumulacin de las ERO. El primer componente de los mecanismos de defensa antioxidante es la barrera siolgica que limita el paso del oxgeno desde el aire inspirado hasta las clulas (Garca et al., 1994). El resto de los componentes se describen a continuacin.
Antioxidantes primarios:
Los llamados antioxidantes primarios son los que previenen la formacin de nuevas ERO. Esto lo consigue convirtiendo las ERO en molculas menos perjudiciales, antes de que puedan reaccionar, o evitando su produccin a partir de otras molculas. En este grupo se destacan las enzimas SOD, GPx y protenas de unin a metales como la ferritina y la ceruloplasmina (RANDOX, 1996). Las Superxido dismutasas (EC 1.15.1.1) son un grupo de metaloenzimas que pueden dividirse en dos familias logenticas diferentes CuZn-SOD y Fe/Mn-SOD. Las SOD catalizan la conversin de O2- a H2O2 y O2 con una constante de reaccin de 2109 M-1 s-1 para la CuZn-SOD (Guiseppe, 1972). En los organismos eucariotas existen tres tipos diferentes de SOD atendiendo a su localizacin que, en su conjunto, contribuyen a regular las concentraciones de O2- (Marklund, 1992). Superxido dismutasa dependiente de cobre y cinc (Cu/ZnSOD) Primera lnea de defensa antioxidante. Superxido dismutasa dependiente de Manganeso (MnSOD) Superxido dismutasa extracelular (EC-SOD) Tiene control primario sobre la inactivacin del NO Superxido dismutasa dependiente de nquel (NiSOD) Presente en microorganismos Las Glutatin peroxidasas (E.C. 1.11.1.9), son dos enzimas selenio dependientes que ejercen su accin detoxicante por la reduccin del H2O2 o los ROOH.
99
La catalasa (EC 1.11.1.6) participa en el metabolismo del H2O2. Aunque su anidad por el H2O2 es inferior a la que exhibe la GPx, bajo condiciones de sobreproduccin puede asumir el papel protagnico en la eliminacin del H2O2 (Fulbert y Cals, 1992; Garca et al., 1994). Este grupo se completa con: las tiorredoxinas, la tiorredoxina reductasa, las transferrinas, la lactoferrina, la ferritina, la ceruloplasmina, las albminas, las haptoglobinas y hemopexinas y las metalotionenas.
Antioxidantes secundarios:
Los antioxidantes secundarios capturan los radicales y evitan las reacciones en cadena. Ejemplos de ellos son la vitamina E y C, -caroteno, cido rico, bilirrubina, albmina y ubiquinona.
Sustancias endgenas con capacidad antioxidante

Glutatin El glutatin se descubri en el 1888 por J. De Rey-Pailhade quien lo nombr primeramente philothion (griego: amor por el azufre). En el 1929 fue identicada su estructura en detalles. Es un tripptido, -glutamil-cisteinil-glicina, que se encuentra en todas las clulas en concentraciones relativamente altas (0.4-12 mM) y es el compuesto con grupos SH ms abundante en los tejidos (SH no proteicos). Funciones del GSH 1) detoxicacin de compuestos electroflicos 2) captura de RL 3) cofactor de GPx 4) mantenimiento del estatus de grupos SH en protenas al prevenir su oxidacin 5) reservorio de Cys 6) modulador de procesos celulares como la sntesis de DNA y funciones inmunes Urato El urato est presente en el plasma en el rango de 180-420 M. Es capaz de quelatar Fe libre y cobre, adems reacciona con
100
HClO, atena la oxidacin de lpidos, lipoprotenas y cidos grasos poliinsaturados inducida por ozono y elimina directamente los radicales peroxilo, alcoxilo e hidroxilo. Bilirrubina La bilirrubina est presente en el plasma en concentraciones menores de 20 M. Es capaz de eliminar el oxgeno singlete y radicales peroxilo. La bilirrubina unida a la albmina plasmtica contribuye signicativamente a las defensas antioxidantes no enzimticas presentes en el plasma. Ubiquinonas (coenzima Q) Las ubiquinonas son derivados de las quinonas que contienen un a cola isopeno. La forma reducida de las ubiquinonas, los ubiquinoles son liposolubles y actan como antioxidantes ecientes. Los ubiquinoles tienen mayor capacidad antioxidante que las ubiquinonas.
Antioxidantes terciarios
Los antioxidantes terciarios son los encargados de la reparacin de las biomolculas daadas. En este grupo se incluyen las enzimas reparadoras de ADN y la metionina sulfxido redutasa. (Fig. 2)
Toxicidad celular de las ERO. Blancos principales

Las alteraciones funcionales, mediadas por ERO, son una consecuencia directa de sus interacciones con macromolculas esenciales. Resulta importante, por tanto, analizar la naturaleza de estas reacciones, que modican la estructura y alteran la funcin permitiendo acercarnos a los eventos bsicos de la enfermedad y a los probables mecanismos de accin de agentes protectores con capacidad antioxidante. Las molculas blanco del ataque de las ERO de mayor importancia son:
ADN
Los daos fundamentales son la hidroxilacin de las bases de ADN, entre-cruzamientos, escisin de hebras e inhibicin de la sntesis de protenas, nucletidos y cidos grasos (Southorn, 1988), y son causa101
Figura 2: Representacin de la integracin entre los sistemas antioxidante.
dos por OH y oxgeno singlete (1O2), este ltimo ataca fundamentalmente a la guanina.
Protenas
Muchas ERO son capaces de oxidar los grupos suldrilos (-SH) de las protenas y, en ocasiones, genera daos puntuales a protenas que estn unidas a metales de transicin (Stadtman y Oliver, 1991; Aruoma, 1994). Otro importante dao oxidativo, que tiene lugar en las protenas, es la oxidacin de los grupos amino de los aminocidos, a
102
grupos carbonilos. Por otro lado, el ONOO- tambin es responsable del dao a las protenas (Simonian y Coyle, 1996)
Lpidos
Las ERO provocan la oxidacin de los cidos grasos polinsaturados y de los fosfolpidos de membrana. La POL conduce a un aumento considerable de la permeabilidad de las membranas celulares, originando alteraciones irreversibles de las propiedades funcionales de la clula que pueden conducir a su lisis total (Fulbert y Cals 1992). Los procesos de peroxidacin conducen a la formacin de numerosos derivados txicos, los hidroperxidos, el malonildialdehdo (MDA) y otros (Dennis y Shibamoto 1989).
Patogenia de las Especies Reactivas de Oxgeno Estados siopatolgicos mediados por ERO
Se conoce en la actualidad que el estrs oxidativo, desbalance temporal o a largo plazo en las concentraciones de ERO, ya sea por incrementos en su produccin o por disminucin de los mecanismos de defensa antioxidante, est relacionado con decenas de patologas o estados siopatolgicos (Aruoma, 1994). En la actualidad existen controversias sobre si el estrs oxidativo es la causa o la consecuencia de las enfermedades, o si la terapia con antioxidantes puede prevenir o modular su progresin favorablemente. Es probable que algunas enfermedades sean causadas por perturbaciones en los factores que regulan la produccin de ERO. Otras patologas pueden inicialmente ser independientes de estos factores pero la enfermedad, por s misma, puede conducir a un incremento del estrs oxidativo que puede exacerbar el dao tisular y la progresin de la afeccin (Delanty y Dichter, 1998).
ERO y dao por isquemia/reperfusin heptica

El hgado es considerado un rgano altamente sensible a la anoxia y al dao celular luego de un evento isqumico (Castillo et al., 1990). La proteccin del hgado frente al dao celular por isquemia/reperfusin (I/R) es uno de los factores ms importantes que determina el xito
103
de la ciruga heptica, porque es necesario con frecuencia interrumpir el ujo sanguneo en varios procederes quirrgicos como la reseccin y el transplante de hgado (Nakano et al., 1995).
Fisiopatologa de la Isquemia Cerebral

En condiciones normales el cerebro utiliza glucosa y O2 para la produccin de ATP. La isquemia rpidamente (en segundos) conduce a un agotamiento de O2 y cesa la fosforilacin oxidativa. El fallo energtico por s solo no determina la degeneracin neuronal. Otros procesos como la acidosis celular, la liberacin de excesivas cantidades de glutamato que conducen a la excitotoxicidad, el inujo de Ca2+, la estimulacin de la degradacin de los fosfolpidos de membrana y la generacin de ERO juegan un papel importante en la neurodegeneracin durante el proceso de I/R cerebral (MacDonald y Stoodley, 1998).
Las ERO durante el ejercicio

La actividad fsica vigorosa puede incrementar el consumo de oxgeno en 10 a 15 veces por encima del valor de reposo para satisfacer las demandas de energa. El elevado consumo de oxgeno resultante produce un estrs oxidativo que conduce a la generacin de RL y a la peroxidacin de lpidos.
Bibliografa
Akins P T, Liu P K and Hsu C Y (1996): Stroke, 27, 1682-1687 Aruoma OI (1989): Free Rad Biol Med, 6, 593-597 Aruoma O I (1996): Free Rad Biol Med 20, 675-705 Beckman JS, Beckman TW and Chen J (1990): Proc Natl Acad Sci, 87, 1620-1624. Brent JA and Rumack BH (1993): Clin Toxicol 31(1), 139-171 Cabelli D E I and Bielski B H J (1983): J Phys Chem, 87, 1809-1812. Cheeseman K H (1993): Lipid peroxidation and cancer. In DNA and Free Radicals. Ed. B. Halliwell and O.I. Aruoma. Ellis Horwood, Londres, 109-144 Chen H and Tappel AL (1995): Free Rad Biol Med, 18, 949-953 Cutrin J, Llesuy S and Boveris A (1998): Cell Biochem Funct 16, 65-72
104
Dawson TM and Dawson VL (1997): Protection of the brain from ischemia. In: Cerebrovascular Disease. Edited by H. Hunt Batjer. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 319-325 Dawson, V. L.; Kizushi, V. M.; Huang, P. L. (1996). J. Neurosci. 16, 2479-2487. Dianzani MU (1993): Crit Rev Oncol Hematol, 15, 125-147 Diplock AT (1994): Mol Asp Med, 15, 293-376 Farooqui AA, Haun SE and Horrocks LA (1994): Ischemia and hypoxia. In: Basic Neurochemistry: Molecular, Cellular and Medical Aspects, 5th Edition. Edited by G. J. Siegel et al. Raven Press Ltd. New York, 867-883 Fontham ETH (1994): Vitamin C, vitamin C foods, and cancer: Epidemiologic studies. In: Natural antioxidants in human health and disease. Frei, B., ed. London, Academic Press, 157-197 Fridovich I. (1989): J Biol Chem, 264, 7761-7764 Fulbert JC and Cals MJ (1992): Path Biol 40(1), 66-77 Garca, T, Morn BS, Cspedes MA, Caples EM, Olembe H y Simplice S (1994): Rev Cub Inv Biomed 13, 12-18 Gardner HW (1989): Free Rad Biol Med, 7, 65-86 Goldstein S (1993): Free Radic Biol Med, 15, 435-445 Goldstein S (1993): Free Radic Biol Med, 15, 435-445. Gonzlez-Flecha B, Cutrin JC, Boveris A (1993): J Clin Invest, 91, 456-464 Grisham MB and McCord JM (1986): Chemistry and cytotoxicity of reactive oxygen metabolites. In: Physiology of Oxygen Radicals. Taylor A E, Matalon S and Ward P, eds., Bethesda, Maryland: American Physiological Society, 1-18 Grootveld M and Halliwell B (1988): Biochem J 237, 499-504 Guiseppe R (1972): Biochim Biophys Acta 268, 605-609 Halliwell B (1990): Free Rad Res Comm, 9, 1-32 Halliwell B, Gutteridge JMC, Aman P, Harkonen H, Hallmans G, Bach KKE, Mazur W and Adlercreutz H (1988): ISI Atlas Sci Biochem 1, 48-52 Hamer I, Wattiaux R, Wattiaux D and Coninck S (1995): BBA 1269, 145-152 Henderson LM, Chappell JB and Jones OTG (1989): Biochem J, 264, 249-255 Hogg N, Darley-Usmar VM, Wilson M T and Moncada S (1992): Biochem. J, 281, 419-424 Huie RE and Padmaja S (1993): Free Rad Res Comms 18, 195-200 Jaeschke H, Farhood A, Bautista AP, Spolarics Z, Spitzer JJ and Smith CW (1993): Hepatology 17, 915-923 Kaur H, Fagerheim I, Groodveld M, Puppo A and Halliwell B (1988): Anal Biochem, 172, 360-367 MacDonald RL and Stoodley M (1998): Neurol Med Chirurgica, 38, 1-11 Marklund SL (1992): J Biol Chem 267, 696-701 Moncada S, Palmer R MJ and Higgs EA (1991): Pharmacol Rev, 43, 109-143. Muller DPR (1995): Redox Rep, 1, 239-245 Nakamura Y, Ohtaki S, Makino R, Tanaka T and Ishimura Y (1989): J Biol Chem, 264, 4759-4761 Nikki E (1987): Am NY Acad Sci, 493, 186-199 Nishikimi M (1975): Biochem Biophys Res Commun, 63, 463-468
105
Olson AJ (1993): J Nutr Sci Vitaminol, 39, 557-565 Olson AJ (1996): J Nutr, 126, 12 085-12 125 Radi R, Beckman JS, Bush KKM and Freeman BA (1990): J Biol Chem, 266, 4 244-4 250 RANDOX (1996). Radicales Libres. Ed. Randox Laboratories Ltd. Crumlin, U.K. 1-16 Schoneich C, Asmus KD, Dillinger U and Bruchhausen Fv (1989): Biochem Biophys Res Common, 161, 113-120 Southorn PA and Powis G (1988) Mayo Clinic Proc, 63, 381-389 Thompson CB (1995): Science 267, 1456-1462 Ungemach FR (1987): Chem Phys Lipid, 45, 171-205 Weiss SJ (1989): New England J Med, 320, 365-376
106
EL ESTRS OXIDATIVO. Analtica

Ros JL, Recio MC, Giner RM y Mez S
MTODOS DE ESTUDIO IN VIVO DE EXTRACTOS Y PRODUCTOS ANTIINFLAMATORIOS

Ros JL, Recio MC, Giner RM y Mez S
Jose.L.Rios@uv.es Departament de Farmacologia, Facultat de Farmcia, Universitat de Valncia, Espaa
Generalidades
En la bsqueda de nuevos agentes antiinamatorios es importante el empleo de modelos experimentales en animales, ya que dependiendo del protocolo experimental, los resultados se pueden en parte extrapolar al posible comportamiento en humanos. Existen varios tipos de protocolos en funcin de la forma de aplicacin, agente irritante utilizado o duracin del proceso inducido. 1. En funcin de la forma de aplicacin se emplean mtodos que provocan una irritacin tpica, aguda o subcrnica y son vlidos para el estudio de sustancias activas en procesos inamatorios de piel y mucosas. La administracin oral o parenteral es til para estudio de agentes de efecto sistmico, independientemente del agente irritante. 2. El agente irritante vara en funcin del modelo que se quiera mimetizar, puede ser cido araquidnico (AA), acetato de tetradecanoilforbol (TPA), serotonina (5-HT), histamina, carragenina, bradiquinina (BK), fosfolipasa A2 (PLA2), entre otros. Unos de administracin tpica y otros de empleo parenteral. 3. La duracin del proceso y del tratamiento va a condicionar la posible utilidad del extracto o agente antiinamatorio. En algunos procesos agudos se cuantica el edema inducido, que a veces dura minutos y otras horas. Otros procesos inducen una autntica inamacin, por lo que adems de edema se pueden valorar otros parmetros, como enzimas inducidas, o mediadores liberados.
109
La medicin del efecto farmacolgico se puede hacer mediante la medicin del espesor de la oreja o pata inamada (derecha) y su comparacin con la oreja o pata no inamada (izquierda), o bien por la diferencia de peso entre una seccin calibrada de las orejas, en este caso se requiere el sacricio previo del animal. El porcentaje de inhibicin del edema se reere al grupo control (no tratado) al cual se le administra solamente el agente irritante (100 % de inamacin). Es imprescindible comparar el resultado con una sustancia o frmaco de referencia. A continuacin recopilaremos los mtodos ms tiles en la bsqueda de nuevos agentes antiiamatorios, especialmente citaremos su aplicacin al estudio de extractos vegetales y productos naturales.
Edema agudo en oreja de ratn inducido por cido araquidnico (AA)

La administracin tpica del AA provoca un edema de corta duracin, con un comienzo rpido asociado al incremento de los niveles de prostaglandinas (PG), tromboxano B2 (TXB2) y leucotrieno B4 (LTB4), con un ligero aumento de los niveles de LTC4. Varios minutos despus de su aplicacin, comienza la vasodilatacin, a los 10 min se incrementa la permeabilidad vascular desarrollndose el edema que alcanza su mximo al cabo de 1 h y desapareciendo prcticamente a las 6 h, aunque queda un eritema residual. Desde un punto de vista histolgico, a los 30 min se observa extasis sanguneo y a los 60 min se aprecia claramente en la dermis la inltracin de clula polimorfonucleares (PMN) y mononucleares (MN). El nmero de clulas inltradas comienza a disminuir a las 3 h, desapareciendo casi completamente a las 6 h. El AA apenas estimula la actividad mittica epidrmica y la sntesis de DNA, por lo que no hay hiperplasia epidrmica. El estudio bioqumico demuestra que el AA es rpidamente metabolizado (aproximadamente 15 min), dando lugar a la formacin de eicosanoides, principalmente PGE2, LTC4 y LTD4. La reduccin del edema por la administracin tpica de agentes activos est relaciona110
EL ESTRS OXIDATIVO. ANALTICA
da con la inhibicin de la formacin de mediadores producidos por la lipoxigenasa (LOX), siendo poco efectivos los inhibidores de la ciclooxigenasa (COX). En ningn caso se puede extrapolar el resultado de inhibicin de edema con posible mecanismo de accin, debido a la poca selectividad del mtodo. Como frmaco de referencia o control positivo en este test se emplearn cido nordihidroguayartico (NDGA) o fenidona, dos inhibidores de la LOX.
Edema agudo en oreja de ratn inducido por acetato de tetradecanoil forbol (TPA)
El TPA es un potente agente oggeno y promotor de tumores que se encuentra en el aceite de croton (Croton tiglium L.). La administracin tpica de TPA provoca un edema agudo con inltracin leucocitaria. El TPA acta a travs de la activacin de la proteinquinasa C (PKC), dependiente de Ca2+ y fosfolpidos. La PKC desempea un papel importante en la transduccin de seales de una gran variedad de sustancias que activan funciones celulares y de proliferacin. La enzima es activada por diacilglicerol (DAG) liberado a partir de inositol-fosfolpidos de la membrana. El TPA y otros steres del forbol cuando se intercalan en la membrana pueden actuar como sustitutos del DAG, activando la PKC de forma ms permanente que el mediador endgeno, ya que el TPA es difcilmente degradable. La PKC activada acta a diferentes niveles, incluyendo la liberacin de AA, formacin de prostanoides, incremento de radicales libres y sntesis de diversas protenas proinamatorias. Tras la aplicacin de TPA en oreja de ratn, se produce un eritema y vasodilatacin entre 1-2 h, a las 3-4 h aumenta el grosor como consecuencia de la extravasacin de lquido, siendo el edema mximo a las 6-8 h. Transcurridas 12-14 h el edema desaparece, aunque la vasodilatacin y el eritema persisten hasta las 24-48 h. A nivel histolgico se observa agregacin plaquetaria a las 2 h, agregacin y adherencia de leucocitos PMN a las clulas endoteliales entre 4-6 h, y migracin hacia el tejido y desgranulacin de mastocitos a partir de las 6 h. Al cabo de 6-24 h comienza el acmulo de leucocitos en la dermis que
111
dan lugar a abscesos subcorneales a las 48-72 h. Por ltimo, tras 4896 h se observa hiperplasia en la membrana basal epidrmica, debida al incremento del nmero de clulas en divisin. El estudio bioqumico demuestra un incremento de AMPc, PGE2 y PGE2, adems de actividad de la enzima ornitn-descarboxilasa (ODC) y de sntesis proteica. Los frmacos de referencia ms adecuados son los inhibidores de la sntesis de prostaglandinas, como indometacina, aunque los inhibidores de la COX, LOX y PLA2 dan buenos resultados, adems de corticoides y antihistamnicos. La ventaja del mtodo es la rapidez y poca muestra necesaria para desarrollar un estudio e incluso una curva dosis-efecto. El principal inconveniente radica en la falta de selectividad, ya que un elevado nmero de frmacos y sustancias objeto de anlisis suelen dar resultados positivos en este test. Otro problema adicional es que el frmaco se administra conjuntamente con el irritante, lo que permitira conocer un grado de proteccin no de curacin real.
Inamacin en oreja de ratn inducida por aplicacin repetida de TPA.

El mtodo, considerado un modelo que mimetiza procesos crnicos o subcrnicos de inamacin cutnea, tiene la gran ventaja de que el compuesto objeto de estudio se aplica cuando el proceso inamatorio ya est en curso, lo que ocurre en la realidad teraputica. El modelo es vlido para la evaluacin de frmacos que acten como los corticosteroides y tambin se han descrito buenos resultados con los inhibidores selectivos de la produccin de LTs. El TPA se aplica 5 veces durante 10 das. El tercer da se observa un aumento del espesor de la epidermis e inltracin de PMN, hay edema, hiperplasia, inltracin celular y brosis. En el cuarto da la hiperplasia ya es uniforme. Es un buen mtodo, muy selectivo y que permite estudiar potenciales frmacos con actividad en diversas patologa que cursan produciendo dermatitis. Adems siempre actan cuando el proceso inamatorio est establecido, es decir actan como curativos.
112
Reaccin de hipersensibilidad retardada en oreja de ratn inducida por oxazolona

La oxazolona es un compuesto alergnico que penetra en la piel y se conjuga con las protenas de las clulas epidrmicas, que son las causa de la sensibilizacin. En una segunda exposicin al alergeno hay reclutamiento de clulas que migran al lugar del segundo contacto, liberando mediadores proinamatorios y radicales libres, los cuales pueden agravar el estado patolgico del tejido inamado. La oxazolona afecta nicamente a determinadas reas, caracterizadas por una necrosis epidrmica importante en los oricios de los folculos pilosos, seguida de acumulacin de PMN en la capa epidrmica donde se ha producido la necrosis. Los PMN se acumulan en las pstulas intraepidrmicas y se extienden hacia la regin subepidrmica. Si se trata con un frmaco adecuado, hay regeneracin epidrmica y reduccin gradual del nmero de leucocitos en la dermis, pero si el tratamiento no es ecaz puede haber prdida de porciones de tejido auricular por necrosis. Los corticoides, debido a sus propiedades antiinamatorias e inmunodepresoras, son los frmacos ms efectivos en este protocolo experimental, reduciendo tanto la fase de induccin como la lesin inamatoria. Este protocolo es muy exigente en cuanto a los resultados, ya que a diferencia de los procesos agudos, solo un nmero limitado de compuestos son activos.
Otros protocolos de hipersensibilidad retardada

Existen otros protocolos experimentales de hipersensibilidad retardada menos agresivos o de menor duracin, y por lo que se preeren en algunos estudios. Ejemplos como el dinitroclorobenceno (DNCB) o dinitrouorobenceno (DNFB), pueden sustituir a la oxazolona, mientras que la reaccin frente a eritrocitos de cordero (SRBC), se emplea para detectar reacciones alrgicas tipo tuberculnicas.
Edema inducido por carragenina en pata de ratn

En el mtodo original se utilizaba la rata como animal de experimentacin. Sugishita y colaboradores, en 1981 adaptaron el mtodo para
113
el estudio en ratn, lo que es de mxima utilidad por el ahorro en animales y productos a ensayar. La adaptacin del mtodo requiere la administracin oral de los productos en estudio, para evitar un falso resultado debido al efecto contrairritante que se puede producir por la administracin intraperitoneal. El mtodo consiste en provocar un edema en la regin subplantar por la administracin de -carragenina. En una primera fase (0-1 h) se inicia el proceso inamatorio por la liberacin de aminas y pptidos vasodilatadores (histamina, serotonina y bradiquinina). En una segunda fase (1-6 h) se liberan prostaglandinas y hay inltracin de neutrlos, cuya activacin libera otros mediadores, incluyendo radicales libres que potencian la respuesta inamatoria. El mximo es aproximadamente a las 3 h, por lo que se aconseja la lectura del edema a 1, 3 y 5 h despus de inyectar el agente irritante. En la fase tarda, comprendida en el periodo que va desde la 1 hora hasta la 5 h, es cuando los antiinamatorios no esterodicos tienen mayor efecto, lo que demuestra que el proceso est mediado bsicamente por la COX inducida o COX-2. El mtodo permite estudiar compuestos que se administran va oral, lo que supone una forma comn de administracin en la prctica teraputica. Tambin sirve para el estudio de compuestos cuyo mecanismo de accin pueda estar relacionado con la inhibicin de la actividad COX o afecte a la induccin de la enzima. El empleo de ratn en vez de rata ha simplicado el protocolo experimental.
Edema inducido por fosfolipasa A2 (PLA2) en pata de ratn
La administracin subplantar de PLA2 en el ratn, permite el estudio de agentes antiinamatorios en cuyo mecanismo de accin est implicada la inhibicin de la enzima, la inhibicin de la desgranulacin de mastocitos o la actividad antiserotonnica. La fosfolipasa ms comnmente utilizada es la procedente del veneno de Naja naja, si bien actualmente se emplea el de N. mossambica, debido a la escasez del primero. La administracin de PLA2 provo114
ca la liberacin de AA de lpidos de membranas y paralelamente una ruptura de las membranas de los mastocitos que provoca la salida de aminas vasoactivas que inducen un rpido edema, el cual se mide con un pletismmetro a diferentes tiempos para ver su evolucin. Frmacos inhibidores de la actividad PLA2 como los corticoides, los inhibidores de la desgranulacin de mastocitos y los antiserotonnicos, son los compuestos activos en este modelo experimental.
Edema inducido por serotonina en pata de ratn

La administracin subplantar de serotonina provoca un rpido edema, que se mide a los 12 min. El mtodo se emplea con varios nes, uno el detectar agentes que inhiben la respuesta de la serotonina, sin embargo no es lo ms frecuente. El mtodo se ha descrito principalmente para el estudio de agentes cuyo mecanismo est relacionado con el de los corticosteroides. La aplicacin de frmacos o compuestos que necesitan un largo periodo de latencia, puede alargar en exceso un protocolo experimental. En este caso la administracin de serotonina acorta el periodo debido a rpido efecto. Sugishita y colaboradores desarrollaron el mtodo original para realizar estudios sobre posibles formas de actuacin in vivo de corticosteroides, para lo cual se bloquean selectivamente el receptor esterodico (progesterona), la transcripcin (actinomicina D) o la sntesis de protenas (cicloheximida). Actualmente se preere la administracin de mifepristona en vez de progesterona, por ser ms selectivo como antagonista del receptor esterodico.
Otros protocolos experimentales

En el estudio de agentes antiinamatorios se pueden seleccionar otros agentes irritantes que permiten un conocimiento ms selectivo se la forma de actuar de la sustancia objeto de estudio. Es el caso de los mediadores siolgicos bradiquinina o histamina, o los ms selectivos resiniferatoxina, capsaicna y xileno, que provocan una inamacin de origen neurognico, mientras que el empleo de fenilpropiolato de etilo (EPP) permite estudiar agentes antiinamatorios con un largo periodo de latencia, como son los corticosteroides.
115
Bibliografa
Atta-ur-Rahman, Choudhary MI, Thomsen WJ (2001): Bioassay techniques for drug development. Harwood Academic Publishers, Amsterdam. Cirino G, Peers SH, Wallace JL, Flowers RJ (1989): A study of phospholipase A2induced oedema in rat paw. Eur J Pharmacol 166, 505-510. De Young LM, Kheifets JB, Ballaron SJ, Young JM (1989): Edema and cell inltration in the phorbol ester-treated mouse ear oedema are temporally separate and can be differentially modulated by pharmacological agents. Agents Actions 26, 335341. Laufer S, Neher K, Bayer B, Homman J, Reutter E, Tries S (1995): In vitro test system for the evaluation of dual cyclooxygenase and 5-lipoxygenase inhibitors. Pharm. Pharmacol Lett 4, 166-169. Mosmann T (1983) Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: applications to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Meth 65, 55-63. Neves PCA, Neves MCA, Bella Cruz A, Santana AEG, Yuner RA, Calixto JB (1993): Differential effects of Mandevilla velutina compounds on paw oedema induced by phospholipase A2 and phospholipase C. Eur J Pharmacol 243, 213-219. Stanley PL, Steiner S, Havens M, Tramposch KM (1991): Mouse skin inammation induced by multiple topical applications of 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate. Skin Pharmacol 4, 262-271. Sugishita E, Amagaya S, Ogihara Y (1981): Anti-inammatory testing methods: comparative evaluation of mice and rats. J Pharm Dyn 4, 565-575. Sugishita E, Amagaya S, Ogihara Y (1983): Studies on the mechanism of antiinammatory activities of papyriogenin A and C. J Pharm Dyn 6, 287-94 Young JM, De Young LM. (1989): Cutaneous models of inammation for the evaluation of topical and systemic pharmacological agents. In: Modern Methods in Pharmacology. Pharmacological Methods in the Control of Inammation (Spector S, Back N, eds.), Alan R. Liss. New York, pp. 215-231.
116

Determinacin de la Actividad Antioxidante en sistemas biolgicos
Schinella G.R.1, Tournier H.1, Gngora L.2, Ros J.L.2
1
Ctedra de Farmacologa, Facultad de Ciencias Mdicas, Universidad Nacional de la Plata, Argentina 2 Departament de Farmacologia, Facultat de Farmacia, Universitat de Valncia, Espaa
Introduccin
La actividad antioxidante es ampliamente usada como parmetro para caracterizar diferentes materiales vegetales. Esta actividad se relaciona con compuestos capaces de proteger un sistema biolgico del efecto potencialmente daino de procesos que causan excesiva oxidacin involucrando especies reactivas del oxigeno. Existen diversos mtodos para la evaluacin de la capacidad antioxidante de muestras biolgicas. Algunos de ellos utilizan la produccin de un radical orgnico o especies reactivas del oxgeno y otros se basan en la oxidacin-reduccin de iones metlicos. Un ensayo universal de la actividad antioxidante in vitro no existe debido a que la actividad anti-radicalaria depende fundamentalmente de la naturaleza del radical y del mtodo de generacin del mismo. La eleccin de un sistema qumico para generar especies reactivas es un punto crtico en el desarrollo de cualquier ensayo antioxidante con el n de obtener resultados relevantes [Aruoma, 2003].
Inhibicin de la peroxidacin lipdica en mebranas microsomales

La peroxidacin lipdica es un proceso de oxidacin de los cidos grasos poliinsaturados (AGPI) mediado por radicales libres, que causa degradacin de los lpidos. Estas reacciones en cadena se inician en AGPI debido a la facilidad con que algunos radicales son capaces de sustraer un hidrgeno del grupo metileno presente entre dos insatu117
raciones, y la estabilidad de las mltiples estructuras resonantes de los radicales formados (AGPI.). La propagacin ocurre debido a que en la mayora de los casos, la rpida reaccin de estas formas resonantes con el oxgeno molecular conduce a la formacin de radicales lipoperxidos (AGPIOO.) reorganizados con dobles enlaces conjugados.
Este radical puede de nuevo sustraer un hidrgeno de un AGPI, para formar un hidroperxido (AGPIOOH) y un segundo radical AGPI., el cual vuelve a reaccionar con el oxgeno molecular regenerando un nuevo radical lipoperxido, propagando el proceso. LOO + LH L + O2 LOOH + L LOO.
118
La fase de nalizacin ocurre cuando dos radicales libres reaccionan entre s, o cuando el radical reacciona con una sustancia donante de tomos de hidrgeno (llamada antioxidante, reductor o captador de radicales libres), dando lugar a productos inactivos. Como productos nales del proceso estn los hidroperxidos, hidroxicidos grasos, epoxicidos grasos, aldehdos poliinsaturados, hidroxialdehidos, dialdehdos, cetonas y otros, que pueden reaccionar con grupos amino de protenas, fosfolpidos o cidos nucleicos, comprometiendo el buen funcionamiento y la calidad del sistema biolgico o elementos que los contienen. Uno de los productos formados en este proceso es el malonildialdehido (MDA), que tiene la capacidad de formar aductos coloreados (rosa) con el TBA, dando un mximo de absorcin a 532 nm. Este es el mecanismo qumico ms usado para determinar la extensin de la peroxidacin [Schinella et al., 2002].
Preparacin de microsomas hepticos de rata

Se utilizan ratas Wistar macho (200-250 g) mantenidas en ayunas desde el da anterior. Los animales son sacricados y los hgados rpidamente extirpados y colocados en disolucin amortiguadora fosfato 10 mM, pH 7,4, conteniendo 11,5 g/L de KCl a 0 C, sobre hielo. El rgano es pesado, cortado en trozos y lavado tres veces con disolucin amortiguadora a 0 C. Se homogeneiza en disolucin amortiguadora a 0 C en proporcin 1:3 (p/v). Se centrifuga a 12000 g durante 30 min a 4 C. El sobrenadante obtenido se centrifuga a 100000 x g durante 60 min, recogiendo el precipitado que se homogeneiza con tampn en una proporcin tal que se obtengan tantos mL como peso inicial de hgado. Se fracciona en alcuotas de 2-3 mL y se conservan a 70 C, usndose dentro de los dos meses siguientes.
Peroxidacin lipdica no enzimtica: Sistema Fe2+ / ascorbato

La generacin no enzimtica de OH. puede ocurrir a partir de la autooxidacin del Fe2+ y la posterior dismutacin del O2.-, haciendo que la
119
reaccin del H2O2 con el Fe2+ remanente promueva la formacin de radical OH., que iniciar la peroxidacin lipdica de las membranas microsomales. Fe2+ + O2 2 O2 + 2 H+ Fe2+ + H2O2 Fe3+ + O2 O2 + H2O2 OH + OH + Fe3+
En este sistema, la mezcla Fe2+/ascorbato se comporta como un catalizador de la peroxidacin lipdica, ya que el ion ferroso que pasa a estado frrico durante el proceso, es reducido nuevamente por el ascorbato. La mezcla de reaccin contiene 2 mg/ml de protena microsomal en solucin 1:2 v/v de tampn Tris-HCl 0,1 M (pH 7,4) y KCl 1,12%. La peroxidacin lipdica es inducida por la adicin de ascorbato (5 M) y FeSO4 (500 M). La reaccin se realiza a 37 C durante 20 min, tras lo cual se detiene por el agregado de acido tricloroacetico (TCA) al 10%, mantenindose en hielo durante 10 min. Tras centrifugar durante 10 min a 3000 g y 4 C se toma 1 mL del sobrenadante y se le aade 1 mL TBA 0,7%. Los tubos son calentados en bao de agua a 90 C durante 30 min y nalmente, tras ser enfriados se mide la absorbancia a 532 nm. En cada experiencia tendremos un tubo control, donde la absorbancia ser mxima puesto que es donde mayor peroxidacin lipdica se produce, un tubo blanco para conocer el grado de peroxidacin espontnea del material lipdico en ausencia del inductor, un tubo de la muestra a ensayar y otro con su blanco. En la medida que los productos ensayados sean activos, la generacin de material reactivo se ver disminuido. Las muestras ensayadas, al igual que la referencia BHT se disuelven en DMSO. La actividad antioxidante se evala mediante el clculo del porcentaje de inhibicin de la peroxidacin lipdica, segn la frmula siguiente:
120
Siendo:
Peroxidacin lipdica enzimtica: Sistema CCl4/NADPH
El sistema citocromo P450 presente en la membrana de los microsomas hepticos es activado por la adicin de NADPH, como consecuencia de esto, el CCl4 previamente aadido se trasforma en una especie radicalaria muy reactiva, como es el radical triclorometilperoxilo, que inicia la peroxidacin lipdica.
La mezcla de reaccin contiene la disolucin generadora de NADPH, compuesta por NADPNa2 (0,2 mM), glucosa-6-fosfato Na2 (4 mM) y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (0,6 U/mL) en una disolucin formada por 18 mL de KCl (0.15 M), 12 mL de tampn Tris-HCl (0.1 M, pH = 7,4) y 8 mL de H2O, todo ello ajustado a un pH de 7,4. Posteriormente se adiciona la muestra a ensayar o vehculo, CCl4 disuelto en DMSO (0,2 M) y tras la adicin de la suspensin microsomal (1,5 mg/mL), se agitan y se incuban los tubos a 37 C durante 15 min. La peroxidacin se detiene aadiendo TCA (10 %) y manteniendo los tubos en hielo durante 10 min. Tras centrifugar a 3000 g, durante 10 min a 4 C, se opera como en el protocolo anterior. Al igual que en el sistema Fe2+/ascorbato, tendremos un tubo control que presentar el mximo de absorcin, un tubo muestra y los respectivos blancos. En estos ltimos se medir el grado de peroxidacin inducida exclusivamente por el NADPH presente en el medio de reaccin en ausencia de CCl4. Los productos y la referencia (BHT) se disuelven en DMSO. La actividad antioxidante se evala mediante el
121
clculo del porcentaje de inhibicin, segn la frmula expresada en el apartado anterior.
Actividad captadora de especies reactivas del oxgeno Radical superxido

El radical superxido es el primer producto de la reduccin univalente del oxgeno. Aunque no es muy reactivo es importante, porque a partir de l se generan otras especies oxigenadas de ms relevancias. Se puede generar con distintos sistemas qumicos y enzimticos. La deteccin del anin superxido generado puede realizarse con medios qumicos sencillos, debido al carcter reductor de esta molcula. Puede reducir compuestos tales como el ferricitocromo c y el azul de nitrotetrazolio (NBT) que son los ms frecuentemente usados.
Generacin del radical superxido mediante el sistema hipoxantina/xantina oxidasa

La xantina oxidasa es capaz de generar O2.- in vivo por la oxidacin de los productos que provienen del catabolismo de las bases pricas. Esta enzima cataliza las siguientes reacciones de oxidacin: Hipoxantina Xantina cido rico + O2 + H2O2
El O2.- generado en esta secuencia de reacciones, debido a su carcter reductor, puede reducir compuestos como el NBT, que al ser reducido por el O2.- da lugar a la formacin de un cromforo (formazn) que presenta un mximo de absorcin a 560 nm. Aquellos compuestos captadores de O2.- disminuirn la velocidad de formacin de dicho cromforo. Es necesario descartar una posible interferencia del compuesto con la enzima mediante una modicacin del ensayo. Igualmente se ha de determinar si el mismo compuesto puede comportarse como reductor del NTB. Este mtodo es altamente sensible y aunque el NBT no es reducido de modo especco por el O2.-, no es fcilmente reducible por compuestos fenlicos, lo que lo hace un mtodo de eleccin cuando
122
se evalan muestras que contienen este tipo de principios, especialmente con sustitucin catecol. Conforme al protocolo seguido [Haliwell y Guteridge, 1989] la mezcla de reaccin (volumen total de 1 mL, en cubeta de plstico o cristal) contiene tampn KH2PO4-KOH (50 mM, pH 7,4), hipoxantina (100 M), Na2EDTA2H2O (1 mM), NBT (100 M) y 10 L del producto a ensayar, de la referencia pirogalol o del vehculo. La reaccin se inicia con la adicin de xantina oxidasa (0,06 UI/mL), determinando cintica de la variacin de la absorbancia a 560 nm durante 2 min. El grupo control presenta el mximo de radical superxido generado durante la reaccin segn nuestras condiciones experimentales. Tambin ensayamos blancos de la reaccin, en los que no se adiciona la enzima para comprobar que no existe reduccin espontnea del NBT. Si adicionamos a la mezcla de reaccin un producto que se comporte como captador de radicales superxido, disminuye la velocidad de la reaccin de reduccin del NBT. Es importante ensayar blancos del producto a n de descartar una posible interferencia del producto en estudio con el sistema detector, ya que algunos compuestos podran reducir al NBT. Se realiza la determinacin cintica de la variacin de la absorbancia durante 2 min y los resultados se expresan como porcentajes de inhibicin de la reduccin del NBT. El porcentaje de inhibicin de la produccin de radical superxido se expresa segn la frmula:
Siendo:
123
Inhibicin de xantina oxidasa

Productos que inhiben la actividad de la xantina oxidasa producirn una disminucin en la generacin de anin superxido por este sistema, por tanto la reduccin de NBT ser menor que en los controles. As pues, es necesario comprobar si los compuestos en estudio actan a este nivel. Tal como se describi previamente, esta enzima cataliza la oxidacin de las bases xnticas a cido rico, cuyo mximo de absorcin se encuentra a 295 nm, lo cual permite hacer un seguimiento espectrofotomtrico de la reaccin. Para ello, se introduce en una cubeta de reaccin xantina oxidasa (0,06 UI/mL) y la muestra a ensayar, el vehculo (blanco) o la sustancia de referencia (alopurinol). Se incuba a temperatura ambiente durante 15 min, transcurrido dicho tiempo se aaden tampn KH2PO4-KOH (50 mM, pH 7,4), Na2EDTA (1 mM) y xantina (100 M). Se realiza la determinacin cintica de la variacin de absorbancia a 295 nm durante dos min. Los resultados se expresan como porcentajes de inhibicin de la produccin de cido rico.
Generacin del radical superxido mediante el sistema fenazina metasulfato (PMS) / NADH
Este sistema generador de radical superxido puede ser utilizado como alternativo cuando los extractos o compuestos ensayados inhiben a la xantina oxidasa. Es un sistema sencillo en el cual la fenazina metosulfato (PMS) reducida por NADH interacta con el oxgeno, con lo que se produce radical superxido que a su vez reduce el NBT a formazn [Betts, 1985]. La mezcla de reaccin contiene tampn KH2PO4-KOH (20 mM, pH 7,4), NADH (150 M), NBT (43 M) y producto a ensayar (grupo problema), producto de referencia (pirogalol) o vehculo (blanco). Tras agitar se dispone en la celda espectrofotomtrica y se inicia la reaccin con la adicin de PMS (2,7 M), e inmediatamente se realiza la determinacin cintica de la variacin de la absorbancia a 560 nm durante 2 min. La actividad antioxidante se evala mediante el clculo del porcentaje de inhibicin, segn la frmula expresada en el apartado anterior.
124
Radical hidroxilo
Entre las especies reactivas derivadas del oxgeno, el radical hidroxilo es uno de los ms inestables y reactivos, posee un gran poder oxidante siendo capaz de reaccionar con otras molculas tales como cidos grasos, aminocidos, azucares, cidos nucleicos, etc.
Generacin de radical hidroxilo (sistema Fe3+EDTA / H2O2 / ascorbato)
La tcnica para obtener radical hidroxilo se basa en la reaccin del ion ferroso con el H2O2 (reaccin de Fenton) Fe2+ + H2O2 HO + HO + Fe3+
Esta reaccin esta favorecida por el agregado de quelantes del hierro (EDTA, citrato) y agentes reductores como cido ascrbico. Cuando en el medio de agrega desoxirribosa, el radical generado la degrada, generando una mezcla de productos que reaccionan con el cido tiobarbiturico (TBA) para dar un producto con un cromforo con un mximo de absorbancia a 532 nm [Halliwell et al., 1987]. La mezcla de reaccin contiene solucin tampn KH2PO4 KOH (10 mM; pH 7,4), ascorbato (50 M), FeCl3 (20 M), EDTA (100 M), H2O2 (1,42 mM), desoxirribosa (2,8 mM) y la muestra a ensayar. El ascorbato, perxido de hidrogeno y desoxirribosa se disuelven en la solucin tampn. Se incuba esta mezcla a 37 C durante 60 min, tras los cuales se determinan sustancias reactivas al TBA. El ensayo tambin se realiza en ausencia de ascorbato con el n de estudiar el posible efecto pro-oxidante de los componentes a ensayar. Como sustancias de referencia se utilizan dimetilsulfxido (DMSO) o manitol.
Capacidad antioxidante total

Se han desarrollado varios mtodos espectrofotomtricos para la determinacin del potencial antioxidante de diferentes sistemas bioqumicos. Estos mtodos son de rpida aplicacin, escasa manipulacin de material biolgico y bajas necesidades instrumentales por lo que su aplicacin es sencilla. La ecacia antioxidante de las muestras en125
sayadas se compara con patrones conocidos como cido ascrbico o Trolox. Estos ensayos se pueden diferenciar por el procedimiento de las reacciones. Algunos utilizan el retraso en la oxidacin como parmetro de la actividad antioxidante, otros analizan la capacidad de captacin del radical libre o reduccin del in metlico o catin radical [Arnao et al., 1999]. Los mtodos que se mencionan a continuacin son ampliamente usados en diferentes estudios de la capacidad antioxidante de sistemas biolgicos (como plasma sanguneo o tejidos), tanto de extractos y compuestos aislados de especies vegetales como productos derivados de procesos industriales.
Reaccin con el radical 2,2-azino-bis (3-etilbenztiazolin-6-sulfonato de amonio (ABTS+)

La base del mtodo consiste es formar un radical catinico ABTS+ (cromforo verde) basado en la accin oxidativa de peroxidasas u oxidasas sobre ABTS. Una solucin estable de ABTS+ tambin puede ser preparada con agentes oxidantes tales como dixido de manganeso o persulfato de potasio. El radical ABTS+ presenta mximos de absorcin a 414 nm y en las proximidades del infrarrojo (645, 732 y 815 nm). Esta propiedad da la posibilidad de evitar interferencias generadas por cromgenos de la muestra a estudiar. El fundamento de este mtodo consiste en observar la decoloracin del radical ABTS debido a la interaccin con especies donantes de hidrgeno ABTS (incoloro) ABTS+ + R H - 1 e ABTS+ (verde) ABTS + R
El radical ABTS+ se produce utilizando una mezcla de reaccin que contiene ABTS (7 mM) y persulfato de potasio (2,45 mM) en tampn fosfato pH 7,0. La mezcla de reaccin se prepara 12 h antes de su uso y se mantiene a temperatura ambiente y en ausencia de luz. Se ajusta la absorbancia de la disolucin ABTS + a 0,7 unidades a 732 nm con tampn [Pannala et al., 2001].
126
La actividad antioxidante se evala midiendo el cambio de absorbancia a 732 nm de la solucin de ABTS + cuando se alcanza el estado estacionario (Arnao, 1999). La capacidad captadora de radicales libres se calcula como se indica en el apartado anterior.
Medida de la capacidad reductora: Mtodo FRAP

Este mtodo evala la capacidad antioxidante de una muestra biolgica de acuerdo a su capacidad para reducir un determinado compuesto. Originariamente este mtodo se lo denomin Ferric reducing ability of plasma (FRAP) porque fue utilizado para medir la actividad antioxidante del plasma humano. Actualmente se lo denomina Ferric reducing/antioxidant power y su utilizacin se ha extendido al estudio de diferentes compuestos, mezclas o extractos biolgicos. La base del mtodo consiste en la reduccin de un compuesto o mezcla de compuestos (X) sobre el Fe+3 presente en un complejo con un compuesto orgnico: Tripyridyltriazine (TPTZ). Cuando el hierro del complejo es reducido a la forma ferrosa toma un color azul que presenta un mximo de absorcin a 593 nm y cuya intensidad de color es proporcional a la capacidad reductora del compuesto o compuestos ensayados (Benzoe et al., 1996). TPTZ-Fe+3) (Color pardusco) [X] +1eTPTZ-Fe+2 (Color azul intenso)
La determinacin de la capacidad reductora se lleva a cabo en tampn actico - acetato de sodio 0,3 M a pH 3,6 conteniendo TPTZ (1 mM) y FeCl3 (2 mM). Las soluciones deben ser preparadas el mismo da del ensayo. Para la medida de la capacidad antioxidante se mezcla un volumen de la muestra con 10-100 volmenes del reactivo recientemente preparado. Se determina la absorbancia a 593 nm a tiempo 0 (A0) y luego de 8 min (A8). La diferencia (A8) (A0) se compara con la obtenida en una determinacin paralela utilizando una sal de Fe+2 (FeSO4, 100 1000 M) como compuesto de referencia.
127
Las actividades de las muestras en estudio se expresan como equivalentes de Fe+2. Tambin se puede utilizar cido ascrbico como compuesto de referencia. Los volmenes a utilizar dependern de los instrumentos disponibles ya que la determinacin se puede realizar en forma automatizada o manual. El tiempo que se requiere para completar la reaccin puede ser muy variable en funcin de los compuestos o mezclas de ellos a estudiar, variando desde segundos hasta minutos, aunque se considera que tras 8 minutos la reaccin se completa, al menos con la mayora de compuestos ensayados. La relacin dosisrespuesta es linear hasta un Abs de 2,0 para concentraciones de compuestos de 1 mM o superiores. Se puede realizar tambin un monitoreo cintico determinando las pendientes de crecimiento de la absorbancia a tiempos variables, si el objetivo del trabajo lo requiere.
Reaccin con el radical 2,2-difenil-1-picril hidrazilo (DPPH)

El fundamento de esta tcnica consiste en la medicin a 517 nm de la reduccin del radical estable 2,2-difenil-1-picril hidrazilo (DPPH.). La absorbancia caracterstica de este radical que posee un color violeta intenso, disminuye en presencia de un antioxidante (AH) u otro radical (R.). Es posible, por tanto, cuanticar la capacidad captadora de radicales libres que poseen determinados compuestos mediante la determinacin del grado de decoloracin que provocan a una disolucin metanlica de DPPH [Brand-Williams et al., 1995]. DPPH + AH DPPH + R DPPH-H + A DPPH-H
Segn el protocolo de Cavin et al. (1998) se introduce en un tubo de reaccin 7,5 L de la muestra a ensayar, vehculo o compuestos de referencia (butilhidroxitolueno o BHT, quercetina) a las concentraciones estudiadas, 250 L de agua destilada y 500 L de la disolucin de DPPH (20 mg/mL). Tras incubacin a temperatura ambiente y en oscuridad durante 30 min, se lee la absorbancia a 517 nm.
128
La capacidad captadora de radicales libres (capacidad de decoloracin) se determina mediante la siguiente frmula:
siendo:
Bibliografa
Arnao M, Cano A, Acosta M (1999): Methods to measure the antioxidant activity in plant material. A comparative discussion. Free Rad. Res. 31:S89-96. Aruoma O (2003): Methodological considerations for characterizing potential antioxidant actions of bioactive components in plant foods. Mutation Res. 523-524: 9-20. Benzie IFF, Strain JJ (1996) The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of antioxidant power: The FRAP assay. Anal. Biochem. 239:70-76. Betts WH (1985): Detecting oxy radicals by chemiluminescence. In: Greenwald, E.A. (ed.) Handbook of Methods for Oxygen Radical Research. CRC Press, Boca Raton, pp. 197-201 Brand-Williams W, Cuvelier ME, Berset C (1995): Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity. Lebensm.-Wiss u. Technol. 28:25-30. Cavin A, Hostettmann K, Dyatmyko W, Potterat O (1998): Antioxidant and lipophilic constituents of Tinospora crispa. Planta Med. 64:393-396. Halliwell B, Gutteridge JMC (1989) Free Radicals in Biology and Medicine. Oxford: Clarendon Press. Halliwell B, Gutteridge, JMC, Aruoma O (1987): The deoxyribose method: a simple test tube assay for determination of rate constants for reaction of hydroxyl radicals. Anal. Biochem. 165:215-219. Pannala AS, Chan TS, OBiren J, Rice-Evans C (2001): Flavonoid B-ring chemistry and antioxidant activity: Fast reaction kinetics. Biochem. Biophys. Res. Comm. 282:1161-1168. Schinella GR, Tournier, HA, Prieto JM, Mordujovich de Buschiazzo P, Ros JL (2002): Antioxidant activity of anti-inammatory plant extracts. Life Sci. 70: 1023-1033.
129
130
EL DISEO EXPERIMENTAL
Alfredo Rosas Romero y Gloria Saavedra arosas@usb.ve / gloriasa@fcyt.umss.edu.bo
1
arosas@usb.ve / gloriasa@fcyt.umss.edu.bo 1 Universidad Simn Bolvar. Departamento de Qumica. Apartado 89000 Caracas 1080A. Venezuela 2 Centro de Tecnologa Agroindustrial, Facultad de Ciencias y Tecnologa, Universidad Mayor de San Simn, PO Box 992, Cochabamba, Bolivia.
Alfredo Rosas Romero y 2Gloria Saavedra
En la bsqueda de nuevas fuentes de antioxidantes naturales, estudiamos una coleccin de plantas bolivianas, paraguayas, mediterrneas, y frutas colombianas. Nuestro diseo experimental parte de la recoleccin del material vegetal, al que clasicamos taxonmicamente. Este material lo sometimos luego a un proceso de extraccin y fraccionamiento. El siguiente paso del diseo es la evaluacin de la actividad antioxidante en los extractos crudos y las fracciones resultantes del proceso anterior. Para obtener informacin de inters para la industria de grasas y aceites, plsticos y polmero, cosmticos, alimentos, y en general, para investigar sobre las aplicaciones frente al fenmeno de la rancidez oxidativa, Empleamos la tcnica de la decoloracin del -caroteno y el ensayo del Rancimat para la estabilidad oxidativa. Por su parte, mediante el uso de la tcnica del DPPH obtenemos sobre la actividad antioxidante global de cada una de nuestras muestras. Y, para evaluar la actividad como bioantioxidantes, frente a procesos inamatorios, alrgicos y como protectores ante la accin de las Especies Radicales de Oxgeno, empleamos ensayos ms particulares como las tcnicas del Fe2+ - ascorbato, CCl4NADPH, anin Superxido y la actividad atrapadora del radical hidroxilo. Con las plantas bolivianas y paraguayas, preparamos un extracto metanlico del material vegetal, y luego lo fraccionamos con solven133
tes de polaridad creciente (hexano, cloroformo, acetato de etilo y la fraccin acuosa remanente). Empleando las tcnicas de la decoloracin del -caroteno y del entrampamiento de los radicales producidos por el DPPH, determinamos el poder antioxidante en el extracto crudo y en cada una de las fracciones. Esto no da una respuesta al potencial uso de esas plantas como fuentes de antioxidantes de aplicabilidad industrial. Con las frutas colombianas, preparamos un extracto acuoso al cual le determinamos el poder antioxidante siguiendo la tnica del DPPH, y tambin medimos el contenido de fenoles, entre otros anlisis. Este trabajo se reere a la eventualidad de mercadear estas frutas como suplementos dietticos de antioxidantes. Para las plantas mediterrneas, el poder antioxidante lo medimos de acuerdo a las tcnicas del Fe2+ - ascorbato, CCl4NADPH,.anin Superxido y el DPPH, junto con pruebas de actividad antialrgica, antiinamatoria. En esta seccin presentamos la descripcin de los protocolos experimentales y de las tcnicas empleadas. Informacin detallada la presentaremos en la discusin de los resultados especcos. Realizamos un estudio singular sobre los estilbenos en el ruibarbo (Rheum undulatum L.). Realizamos el estudio toqumico del extracto del rizoma y evaluamos la actividad como antioxidante y bioantioxidante de los compuestos resultantes. Finalmente, arribamos a varias conclusiones sobre la relacin actividad antioxidanteestructura de estos compuestos y sobre el mecanismo de la actividad antioxidante. Segn nuestra propuesta, despus de la seleccin del material vegetal ms apropiado de acuerdo a los resultados de la evaluacin de la actividad antioxidante, debe realizarse un estudio toqumico para identicar los compuestos mayoritarios determinantes de la actividad. Presentamos el estudio toqumico del Ophryosporus heptanthus, recolectada a 3-5 Km al sur de Tarata (Bolivia). Tambin realizamos el estudio toqumico del HINOJO AMARGO (Foeniculum vulgare) y la evaluacin de la actividad antioxidante de los compuestos puros aislados, empleando el mtodo del DPPH, el de los radicales
134
hidroxilo por el mtodo de quimioluminiscencia (QL), y/o el del anin superxido (SO). Finalmente, la especie que, de acuerdo a nuestros resultados, sea seleccionada como fuente de antioxidantes, debe ser sometida a un proceso de domesticacin para obtener las mejores condiciones para su cultivo a escala industrial. Presentaremos dos casos de domesticacin, uno realizado en Tenerife y el otro en Zaragoza. En el primero trabajamos con Salvia canariensis, una xerla endmica del Archipilago Canario. Nuestro objetivo nal es tratar de rentabilizar como un recurso econmico para Canarias la especie endmica Salvia canariensis va la domesticacin y cultivo de la misma para su explotacin industrial en su vertiente doble de aceites esenciales, para la industria de la perfumera y de sustancias de alto valor aadido como antioxidantes, para la industria cosmtica, farmacutica de nutricientes. En el segundo estudio, en Zaragoza, trabajamos con una serie de plantas importantes comercialmente por su contenido de aceites esenciales. El material vegetal remanente de la destilacin de esos aceites lo evaluamos luego como fuente de antioxidantes. En ambos casos realizamos la domesticacin de las plantas respectivas, para adaptarlas al cultivo industrial sustentable.
135
Sobre el material vegetal Recoleccin

Antes de efectuar la recoleccin del material vegetal, realizamos una amplia prospeccin de especies, seleccionando plantas adultas que de ser posible, estuvieran en estadio de oracin-fructicacin, para poder contar con rganos reproductivos (or y/o fruto) para vericar la identicacin taxonmica. Colectamos muestras de especies con diferentes tallos o hbitos de crecimiento: herbceos, arbustivos y arbreos. Tomamos 4 muestras representativas por planta: una para el herbario (clasicacin taxonmica), otra para intercambio con otros herbarios, una tercera para enviar a especialista y la cuarta para los trabajos de caracterizacin. Realizamos el acondicionamiento utilizando la tcnica del alcohol, para facilitar el transporte y evitar que las muestras se malograsen durante el traslado por efecto de la humedad. Ya en el Herbario, las prensamos y cada 2 das cambiamos el cartn secante. Una vez secas las muestras las envolvimos en paquetes y las refrigeramos por 48 - 72 hrs, a 8 C para eliminar cualquier agente contaminante, que pudiera deteriorar la muestra. Las muestras destinadas para las extracciones las acondicionamos en bolsas de plstico trenzado para su transporte.
Identicacin Taxonmica
La descripcin botnica de cada planta, que incluimos en el captulo DESCRIPCIN DEL MATERIAL VEGETAL, la hemos realizado basndonos en la observacin directa de la muestra y en una revisin bibliogrca de la literatura. La prospeccin se reere a: lugar de colecta, colector, nmero del colector y el Herbario donde se encuentra la muestra. La identicacin la realizamos siguiendo la metodologa convencional, esto es, mediante claves y referencias bibliogrcas a familia, gnero y especie; por comparacin en consulta con material botnico de los herbarios: Herbario Forestal Nacional Martn Crdenas de Cochabamba (BOLV) y el Herbario Nacional de La Paz (LP); y, por consulta a especialistas como Nee, M. (1998) especialista en Solanceas, y S. Beck y R. Michel (especialistas en varias familias).
136
Despus de prensarlas y secarlas, identicamos taxonmicamente todas las muestras; primero hasta familia, utilizando claves generales como la de Cronquist (1981); luego seguimos claves a gneros y de estos a especies. Para las muestras de los Valles Secos, la bibliografa ms usada fue la ora de Jujuy y la de Entre Ros; para las muestras de las zonas hmedas se uso la Gua de rboles de Bolivia, Flora del Per, Flrulas de las Reservas Biolgicas de Iquitos Per y otras monografas (Burkat, 1969a; Burkat, 1969b; Burkat et al., 1987; Cabrera, 1993; Cabrera, 1983; Cabrera 1978; Killeen et al., 1993; Macbride, 1936, 1937, 1938, 1941, 1943, 1956, 1960, 1991a, 1991b; Vsquez, 1997; Moreno, 1984). Una vez que llegamos al gnero o especie, vericamos nuestros resultados con la descripcin botnica del taxn en la bibliografa y/o por comparacin con muestras del Herbario. Aquellas muestras anes o por conrmar o que no pudimos identicar en el Herbario Forestal Nacional Martn Crdenas, las enviamos al Herbario de La Paz, donde se prosigui con la identicacin. Finalmente, aquellas plantas con identicacin dudosa las enviamos a especialistas en el exterior del pas. Esa informacin la agregaremos en el lugar correspondiente a esas plantas, en el captulo Descripcion del Material Vegetal.
Caracterizacin botnica
Los datos de campo tomados fueron: fecha y lugar de recoleccin, hbitat de la zona (tipo de suelo, clima y altitud), caractersticas de la planta y color y olor de la corteza interna y externa de rboles. En las muestras de herbario, el material para su identicacin se suavizo con agua tibia, para poder observar las siguientes caractersticas morfolgicas: nmero de estambres, tipo e insercin de anteras, numero de ptalos y spalos, posicin de ovario (nfero, supero o medio), nmero de pistilos, estilos y estigmas en el gineceo, tipo de placentacin (corte transversal del ovario), nmero de lculos en el ovario, nmero de vulos, tipo de insercin de los diferentes verticilos, forma del estilo, presencia de pelos, tipo de fruto, tipo de ores o inorescencias, forma, nerviacin y arreglo de las hojas, presencia o ausencia de pelos, glndulas, tricomas.
137
Extraccin y fraccionamiento Preparacin de los extractos crudos

A partir de la parte area de las plantas, previo secado a temperatura ambiente, bajo sombra, preparamos un extracto metanlico. Para ello empleamos 30 g del material vegetal, lo molimos y lo extrajimos, a temperatura ambiente, con 600 mL de metanol. Despus de 24 horas de maceracin descartamos los slidos, ltrndolos a travs de papel de ltro, y eliminamos el metanol a presin reducida. Al material resultante de esta extraccin lo denominamos extracto crudo (EC).
Fraccionamiento de los extractos crudos

Con el objeto de obtener fracciones con compuestos de polaridad creciente, disolvimos el extracto crudo (EC1) en la mnima cantidad necesaria de metanol y le agregamos 200 mL de agua destilada. Despus de 24 horas de refrigeracin, eliminamos los slidos por ltracin con papel de ltro. La solucin acuosa resultante la particionamos con pequeos volmenes de hexano, resultando la fraccin de solubles en hexano, que llamaremos FHX, y a la solucin acuosa remanente, libre de solubles en hexano, lo llamaremos EC2. Luego fraccionamos con cloroformo, llamaremos FC3 a esta fraccin con los solubles en cloroformo, y, nalmente, fraccionamos con acetato de etilo, para obtener la fraccin FAC. La solucin acuosa remanente la liolizamos, a esta fraccin la llamamos FOH. Los solventes de las fracciones orgnicas los eliminamos a presin reducida. Este procedimiento se lo aplicamos a todas las plantas.
Evaluacin de la Actividad Antioxidante Decoloracin del -caroteno Fundamento de las tcnica

En el medio de reaccin se desarrolla la propagacin de la reaccin de autoxidacin del cido linoleico, que podemos representar como: L + O2 LOO2
138
LOO2 + LH
LOOH + L
Donde: LH = una molcula de cido linoleico LOOH = hidroperxido del cido linoleico. L = radical del cido linoleico LO2 = radical perxilo
Estructura del -caroteno
Los radicales libres as formados, reaccionan con el -caroteno presente en el medio destruyendo la conjugacin original de sus dobles enlaces, y en consecuencia disminuyendo la intensidad del color anaranjado que l aporta a la solucin. Esta perdida de absorbancia es la que medimos en funcin del tiempo, como una expresin del transcurso de la autoxidacin del cido linoleico. Esta reaccin del cido linoleico puro la tomamos como el control para nuestras determinaciones. En otras celdas de reaccin agregamos, a la solucin control, los extractos o fracciones que deseemos evaluar, y la velocidad de disminucin de la intensidad del color del -caroteno estar relacionado con el poder antioxidante de las muestras bajo evaluacin.
Procedimiento
Preparacin de la solucin de ABAP. Disolver 54,2 mg de 2,2azobis(2-amidinopropano) dihidrocloruro (ABAP) en 50 L de agua puricada, saturada con argn. Preparacin de la solucin de BHA. 2-t-butil-4-metoxifenol (BHA) es el antioxidante de referencia empleado para esta tcnica. Recristalizarlo de etanol. Disolver 24,6 mg de BHA en 100 mL de dimetilsulfxido (DMSO). Preparacin de la solucin de caroteno. Recristalizar el caroteno de etanol y conservarlo a 15 C, bajo atmsfera de argon seco. Disolver 20 mg de caroteno en 500 L de cloroformo. Esta solucin es estable por varios das.
139
Preparacin de la solucin de la emulsin de caroteno. Puricar 500 L de la solucin de caroteno, pasndola a travs de una minicolumna SEP-PAK, que ha sido previamente activada con 5 mL de ter de petrleo. Eluir con cuatro porciones de 2 mL de del mismo solvente. Recoger el eluyente en un baln volumtrico de 100 mL, evaporar el solvente con argn seco, hasta 10% de su volumen original, agregar 200 mg de Tween 20 y 13,5 mmoles de cido linoleico y eliminar el remanente del solvente con argn seco. Enrasar con agua puricada, saturada con argn seco. Llevar el baln a un bao de ultrasonido para eliminar los gases y homogeneizar la emulsin. La emulsin resultante debe ser transparente. Tomar 30 mL de esta emulsin, saturarla con oxgeno durante 60 s, y usarla de inmediato. Preparacin de las soluciones de las muestras a evaluar. Preparar soluciones del material a evaluar a la misma concentracin del BHA (24,6 mg/mL). Usar DMSO como solvente. Otras recomendaciones. Mantener el cido linoleico, en ampolla de vidrio, bajo una atmsfera de argn seco, a 15 C. El agua debe ser desionizada y triple destilada, con una conductividad menor que 4 uS, de lo contrario no se lograrn emulsiones homogeneas afectando la reproducibilidad de los datos. Despus de su uso, limpiar los cartuchos SEP PAK con etanol y 10 mL de ter de petrleo. Descartar los cartuchos si le aparecen grietas. Trabajar en un ambiente de luz de baja intensidad. Puricar el argn pasndolo sucesivamente por columnas de carbn activado, tamiz molecular y silica gel. Procedimiento de la evaluacin. La celda 1 (referencia espectroscpica, 100% T) contiene 2100 L de una solucin de 100 g de Tween 20 en 50 mL de agua puricada. Todas las otras celdas contienen 1990 L de la emulsin de caroteno. Colocar las celdas en el soporte termostatado del espectrofotmetro y esperar seis minutos para el equilibrio trmico a 32.0 + 0,1 C. Agregar 10 L de la solucin de ABAP a las celdas 2-8, para iniciar la oxidacin del cido linoleico, agitar, en un vortex, cada
140
celda durante 20 s y medir la absorbancia, a 460 nm, cada 2 minutos, durante 10 minutos. Al concluir este lapso, agregar 100 L de la solucin de BHA a la celda 2, y el mismo volumen de las cinco soluciones a evaluar, a las celdas 3-7, respectivamente. Agregar 100 L de DMSO a la celda 8 (control, no contiene antioxidante, mide la oxidacin del linoleico sin ningn agregado). Agitar las celdas 2-8 en un vortex, durante 20 s. El espectrofotmetro toma las medidas de absorbancia de todas las celdas automticamente, cada 2 minutos, durante 90 minutos. Realizar todos los experimentos por triplicado. Para asegurar la reproducibilidad de los datos, en todos los experimentos se debe incluir el BHA y el control fotomtrico (celdas 2 y 8) (Rosas-Romero et al., 1999). Clculos. En la gura que mostramos abajo representamos un experimento tpico. El equilibrio trmico se logra durante la seccin A. Al nal de este tiempo, agregamos el iniciador de la formacin de radicales (ABAP).Es conveniente apuntar que este iniciador permite mantener constante la velocidad inicial de la oxidacin del linoleico, y que esta velocidad es dependiente de la cantidad de ABAP agregada; con lo cual aseguramos, dentro del error experimental, que el cido linoleico inicia su oxidacin a la misma velocidad en todos nuestros experimentos. Durante la seccin B se establece el estado estacionario de la cintica de oxidacin del linoleico. En el tiempo C agregamos la solucin de BHA a la celda 2, como patrn de referencia de la inhibicin de la oxidacin; agregamos las soluciones de las muestras que vamos a evaluar, a las celdas 3-7 y le mismo volumen de solvente a la celda 8, como control de la oxidacin del linoleico sin antioxidante agregado. Se obtendrn resultados incorrectos si eliminamos esta celda de control, porque ella representa la velocidad mxima de la oxidacin del linoleico en nuestras condiciones, o sea, esta celda evidencia el 0% de inhibicin. La diferencia aritmtica del valor de las pendientes, de las reacciones durante la seccin D, es lo que relacionaremos con el poder antioxidante.
141
Resultado tpico de la tcnica de decoloracin del caroteno. Los nmeros representan la colocacin de las celdas. La celda 1 es la referencia fotomtrica, 100% T.
Denimos la actividad antioxidante de una muestra, , como la inhibicin de la reaccin de oxidacin del cido linoleico, tomando a la accin de BHA como 100%. Y la calculamos mediante la siguiente expresin: = [(Pc Pm) / (Pc PBHA)] x x 100 Donde, Pc = es la pendiente de la reaccin control, sin antioxidante agregado Pm = es la pendiente de la muestra bajo evaluacin PBHA = es la pendiente de la reaccin que contiene el antioxidante de referencia, BHA = es la concentracin del BHA/concentracin de la muestra, en mg/mL; igual a 1 en nuestro diseo.
142
Las pendientes se calculan mediante la regresin de la absorbancia en funcin del tiempo, empleando los datos de la zona lineal, en la seccin D, de la celda correspondiente.
Capacidad de captura de radicales libres (dpph) Fundamento de la tcnica

La molcula de DPPH contiene un radical libre estable. Como consecuencia del color prpura de sus soluciones, esta molcula absorbe a 517 nm. El ensayo se fundamenta en la disminucin del color prpura de sus soluciones como consecuencia de la donacin de un electrn por un compuesto con poder antioxidante.
Procedimiento
Preparacin de la solucin de DPPH. Disolver 2,0 mg de 2,2di-(4-t-octilfenil)-1-picrilhidrazilo (DPPH) en 100 mL de etanol (20 mg/L). Usar esta solucin de inmediato y conservarla en oscuridad. Preparacin de las soluciones a evaluar. Preparar soluciones a la concentracin de 300 g/mL y, a partir de ellas, preparar soluciones con las siguientes concentraciones: 100, 50, 10, 5 y 1 g/mL.
143
Procedimiento de la evaluacin. La celda 1 (referencia, 100% T) debe contener 2250 L del solvente (metanol:agua 2:1 v/v). La celda 2 (ADPPH) contiene 1500 L de la solucin de DPPH y 750 L de agua puricada. La celda 3 (Ablanco) contiene 1500 L de la solucin del solvente y 750 L de la solucin de la muestra a evaluar. Las celdas 4-8 (Amuestra) contienen 1500 L de la solucin de DPPH y 750 L de las soluciones de las muestras. Despus de 5 minutos, medir la absorbancia a 531 nm (Brand-Williams et al., 1995). Trabajar a temperatura ambiente. Realizar todos los experimentos por triplicado. Trabajar en el mximo de absorbancia de la solucin de DPPH. Clculos. Calcular el porcentaje de actividad de acuerdo con la siguiente expresin: %DPPH = [1-(Amuestra-Ablanco)]x100/ADPPH Los resultados de esta tcnica los expresamos como la concentracin de la muestra que inhibe 50% del efecto promotor de radicales libres del DPPH, a lo que llamaremos EC50, en g/mL.
Comparacin de las dos tcnicas

Escogimos estas dos tcnicas para nuestro trabajo de monitoreo porque son fciles de ejecutar, demandan pequeas cantidades de muestra, arrojan resultados reproducibles, y miden la actividad antioxidante de los extractos y fracciones desde dos puntos de vista muy diferentes. La tcnica basada en la decoloracin del caroteno est muy bien relacionada con el fenmeno de rancidez en grasas y aceites, ya que trabaja, cercana a la temperatura ambiente, con una emulsin de cido linoleico en agua, donde la cantidad de oxgeno no es limitante; mientras que la tcnica del DPPH est relacionada especcamente con el entrampamiento de los radicales libres generados por el DPPH en un ambiente altamente polar, a temperatura ambiente, en ausencia de un sustrato lipdico oxidable. De esa manera, para que un extracto o sustrato sea considerado como interesante, no es
144
necesario que produzcan buenos resultados en ambas tcnicas; ya que buenos resultados con la tcnicas del caroteno signica una alta capacidad para inhibir el proceso global de la rancidez de los sustratos lipdicos, mientras que la misma muestra puede dar bajos resultados con el DPPH, lo cual signica meramente que su actividad antioxidante no est basada en la inhibicin de la accin de radicales libres tipo DPPH. Situaciones contrarias tambin son frecuentes (Brand-Williams et al., 1995). Nosotros proponemos el uso simultneo de estas dos tcnicas para los trabajos de monitoreo de la actividad antioxidante en fuentes naturales, porque de esa manera se obtiene una mejor informacin sobre la potencialidad de los extractos o fracciones que se estudien, y sobre su eventual aplicacin industrial; ya que la primera nos habla del poder antioxidante frente a los procesos de rancidez oxidativa, y con el DPPH identicamos los extractos o fracciones que tienen una alta capacidad para inhibir la accin de los radicales libres. El uso simultneo de estas dos tcnicas tambin contribuira a enfrentar el problema ocasionado por el uso, por los diferentes grupos involucrados con este tipo de trabajo, de una amplia variedad de tcnicas para medir la actividad antioxidante, con la consiguiente dicultad en el momento de comparar los resultados, tal como est claramente documentado en la literatura del rea (Arnao et al., 1999; Niki y Noguchi, 2000; Antolovich et al., 2002; Koleva et al., 2002 y Emmons et al., 1999).
Fenoles totales
Para esta determinacin empleamos el mtodo de Folin-Ciocalteu (Singleton y Rossi, 1965). La mezcla de reaccin est contituida por 0,1 mL del extracto, 7,9 mL de agua destilada, 0,5 mL del reactivo de Folin-Ciocalteu y1,5 mL de una solucin de bicarbonato de sodio al 20 %. Mezclamos los frascos de reaccin y los dejamos reposar por 2 horas. Medimos la absorbancia a 765 nm en un espectrofotmetro HITACHI U-2000. El contenido total de fenoles lo expresamos como equivalentes de cido glico/mg de muestra.
145
Actividad atrapadora del radical hidroxilo

Esta actividad la determinamos empleando el sistema Co(II)/EDTA/. OH/H2O2-luminol, siguiendo el mtodo que hemos publicado previamente (Parejo et al., 2000). La intensidad de la quimioluminescencia (QL) la medimos como unidades relativas de luz (URL), en un luminmetro TD-20/20. La mxima intensidad de luminiscencia (la radiacin de control) disminuye por la accin de las substancias atrapadoras del radical hidroxilo (Parejo et al., 2000, Merfort, et al., 1996). El medio de reaccin lo preparamos en una solucin tampn, pH=9, una solucin de Co(II)/EDTA, luminol y la solucin metanlica de la muestra a estudiar. Como control, usamos metanol.. Finalmente agregamos H2O2 para comenzar la reaccin en ausencia de luz. Medimos la quimioluminiscencia despus de 20 minutos de haber comenzado la reaccin. Calculamos el porcentaje de inhibicin de la siguiente manera: % Inhibicin = [1 - (URLSAMPLE/URLCONTROL)] x 100 Mediante una regresin lineal del porcentaje de inhibicin, en funcin de la concentracin de la muestra, calculamos la concentracin de muestra necesaria para inhibir el 50% de la QL, valor que denominamos IC50.
Actividad atrapadora del radical superxido

Generamos in vitro los radicales superxido, empleando el sistema hipoxantina/xantina oxidasa y debido al carcter reductor de este anin, medimos su reaccin con el azl de nitrotetrazolio (NBT), a 560 nm. Los compuestos antioxidantes son capaces de inhibir esta reduccin (Cos et al., 1998, Chu et al., 2000). La mezcla de reaccin la preparamos en solucin tampn de fosfato, pH 7,5, agregando EDTA (0,05 mM), hipoxantina (0,2 mM), NBT (1 mM), una solucin acuosa o etanlica de la muestra y, de ltima la xantina oxidasa (1,2 U/L). Preparamos un blanco para cada muestra. Las soluciones las preparamos diariamente y las mantuvimos protegidas de la luz. Los resultados los expresamos como porcentaje
146
de inhibicin de la reduccin del NBT con respecto a la mezcla de reaccin sin muestra (blanco de control), para ello empleamos la siguiente expresin: % Inhibicin = {[(CABS - BCABS) - (SABS - BSABS)] / (CABS - BCABS)} x 100 Donde CABS, BCABS, SABS y BSABS representan la absorbancia del control, del blanco de control, de la muestra y del blanco de la muestra, respectivamente.
El ensayo del rancimat para la estabilidad oxidativa

Para este ensayo maceramos el extracto seco (o el antioxidante de referencia), en aceite de maz, a10 g/mL, la cual es la concentracin mxima permitida en la industria alimentara para antioxidantes sintticos. El mtodo del Rancimat (Metrohm model 743, Herisan, Switzerland) determina el perodo de induccin mediante la medicin de de los subproductos voltiles de la oxidacin del aceite a 110C en presencia de un ujo de aire de 20 L/h. Luego, por conductimetra, medimos la concentracin de los productos de degradacin, los cuales son recogidos en agua destilada. A mayores perodos de induccin, mayor ser la actividad antioxidante de la muestra en estudio. La actividad relativa la expresamos como el Factor de Proteccin (FP), el cual lo calculamos dividiendo el perodo de induccin del aceite en presencia del extracto en estudio, por el valor respectivo al del control, esto es el aceite de maz sin nada agregado (Schwarz y Ernst, 1996). Decidimos emplear esta tcnica, a pesar de sus limitaciones (Frankel, 1993), porque es empleada comnmente en la industria de alimentos y en laboratorios gubernamentales de varios pases (Murcia et al., 2001).
147
Bibliografa
Antolovich M, Prenzler PD, Patsalides E, Mcdonald S y Robards K (2002): Methods for testing antioxidant activity. Analyst 127: 183-198. Arnao MB, Cano A y Acosta M (1999): Methods to measure the antioxidant activity in plant material. A comparative discussion. Free Radical Res 31:S89-S96. Brand-Williams W, Cuvelier ME y Berset C (1995): Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity. Lebennm Wiss Tecnol 28: 25-30. Burkat A (1969a): Flora Ilustrada de Entre Rios (Argentina), Parte V: Dicotiledoneas Metaclamideas, Generalidades; (Gamoptalas), I.N.T.A. Tomo VI,V Buenos Aires, Argentina. Burkat A (1969b): Flora Ilustrada de Entre Rios (Argentina), Parte VI: Dicotiledneas Metaclamideas, Generalidades; (Gamoptalas), I.N.T.A. Tomo VI, Buenos Aires, Argentina. Burkat A, Troncoso N yBacigalupo N (1987): Flora Ilustrada de Entre Ros (Argentina), Parte II: Dicotiledoneas Archiclamideas A: Salivales a Rosales (incluso leguminosas), I.N.T.A. Tomo VI, III, Buenos Aires, Argentina. Cabrera A (1978): Flora de la provincia de Jujuy. Parte X. Compositae, I.N.T.A., Buenos Aires Argentina. Cabrera A (1983): Flora de la provincia de Jujuy. Parte VIII-Clethraceas a Solanaceas, I.N.T.A., Buenos Aires Argentina. Cabrera A (1993): Flora de la provincia de Jujuy. Parte IX. Verbenceas a Calicerceas, I.N.T.A., Buenos Aires Argentina. Chu Y, Chang C y Hsu H (2000): Flavonoid content of several vegetables and their antioxidant activity. J Sci Food Agric 80, 561-566. Cos P, Ying LY, Calomme M, Hu JH, Cimanga K, Van Poel B, Pieters L, Vlietinck AJ y Vanden Berghe D (1998): Structure-activity relationships and classication of avonoids as inhibitors of xanthine oxidase and superoxide scavengers. J Natural Prod 61, 71-76. Emmons CL, Peterson DM y Paul GL (1999): Antioxidant capacity of oat (Avena sativa L.) extracts. 2. In vitro antioxidant activity and contents of phenolic and tocol antioxidants. J Agric Food Chem 47: 4894-4898. Frankel EN (1993): In search of better methods to evaluate natural antioxidants and oxidative stability in foods lipids. Trends Food Sci Technol 4, 220-225. Killeen T, Garca E y Beck S (1993): Huya de rboles de Bolivia. Ed. Quipus S.A. La Paz Bolivia. Koleva II, Vanbeek TA, Linssen JPH, Degroot A y Evstatieva LN (2002): Screening of plant extracts for antioxidant activity. A comparative study on 3 testing methods. Phytochem Anal 13: 8-17. Macbride, F (1936): Flora of Peru. Field Museum of Natural History. Vol. XIII. Parte I. Chicago-USA. Macbride, F (1937): Flora of Peru. Field Museum of Natural History. Vol-. XIII. Parte II Chicago-USA.
148
Macbride, F. (1938): Flora of Peru. Field Museum of Natural History. Vol. XIII. Parte II. Chicago-USA. Macbride, F (1941): Flora of Peru. Field Museum of Natural History. Vol. XIII. Parte IV. Chicago-USA. Macbride, F (1943): Flora of Peru. Field Museum of Natural History. Vol. XIII. Parte III.Chicago-USA. Macbride, F (1956): Flora of Peru. Field Museum of Natural History. Chicago-USA. Macbride, F (1960): Flora of Peru. Field Museum of Natural History. Vol. XIII. Parte V. Chicago-USA. Macbride, F (1991a): Flora of Peru. Field Museum of Natural History. Vol. XIII. Parte II. Chicago-USA. Macbride, F (1991b): Flora of Peru. Field Museum of Natural History. Asteraceae Parte V. Chicago-USA. Merfort I, Heilmann J, Weiss M, Pietta P y Gardana C (1996): Radical scavenger activity of three avonoid metabolites studied by inhibition of chemiluminescence in human PMNs. Planta Medica 62, 289-292. Moreno NP (1984): Glosario Botanico Ilustrado. Ed. Continental. Mxico. Murcia MA, Jimnez AM y Martnez-Tom, M (2001): Evaluation of the antioxidant properties of Mediterranean and tropical fruits compared with common additives. J Food Protection 64, 2037-2046. Niki E y Noguchi N (2000): Evaluation of antioxidant capacity - What capacity is being measured by which method. IUBMB Life 50: 323-329. Parejo I, Codina C, Petrakis C y Kefalas P (2000): Evaluation of scavenging activity assessed by Co(II)/EDTA-induced luminol chemiluminescence and DPPH (2,2-diphenyl1-picrylhydrazyl) free radical assay. J Pharmacol Toxicol Meth 44, 507-512. Rosas-Romero AJ, Rojano B, Hernndez C, Martnez C, Silva J y Herrera J (1999): A novel approach to quantitative structure-property relationships in antioxidants. Ciencia 7: 78-87. Schwarz K y Ernst H (1996): Evaluation of antioxidative constituents from thyme. J Sci Food Agric 70, 217-223. Singleton VL y Rossi J (1965): Colorimetry of total phenolic with phosphomolybdicphosphotungstic acid agents. American J Enol Viticult 16, 144-158. Vsquez R (1997): Florula de las Reservas de Iquitos Per. Missouri Botanical Garden, USA.
149
150
DESCRIPCIN DE LAS PLANTAS
Gloria Saavedra gloriasa@fcyt.umss.edu.bo Benjamn Rojano brojano@perseus.unalmed.edu.co Edelira de Velzquez edelira@qui.una.py Jos Luis Ros Jose.L.Rios@uv.es Alfredo Rosas Romero arosas@usb.ve
INTRODUCCIN
En esta seccin presentamos una descripcin detallada de las plantas estudiadas, su taxonoma, ubicacin geogrca, usos reportados, entre otros datos. Para cada planta preparamos un extracto metanlico crudo (EC1), el extracto metanlico libre de solubles en hexano (EC2), una fraccin hexnica (FHX), una clorofrmica (FC3), una de acetato de etilo (FAC) y una que contiene los compuestos remanente en solucin acuosa (FOH). Mediante una escala cualitativa junto con la descripcin de cada planta o fruta, incluimos los resultados de la evaluacin de la actividad antioxidante de cada extracto o fraccin.
Preparacin de los extractos crudos

A partir de la parte area de las plantas, previo secado a temperatura ambiente, bajo sombra, preparamos un extracto metanlico crudo (EC1). Para ello empleamos 30 g del material vegetal, lo molimos y lo extrajimos, a temperatura ambiente, con 600 mL de metanol. Despus de 24 horas de maceracin descartamos los slidos, ltrndolos a travs de papel de ltro, y eliminamos el metanol a presin reducida. Al material resultante de esta extraccin lo denominamos extracto crudo (EC1).
Fraccionamiento de los extractos crudos

Con el objeto de obtener fracciones con compuestos de polaridad creciente, disolvimos el extracto crudo (EC1) en la mnima cantidad
153
necesaria de metanol y le agregamos 200 mL de agua destilada. Despus de 24 horas de refrigeracin, eliminamos los slidos por ltracin con papel de ltro. La solucin acuosa resultante la particionamos con pequeos volmenes de hexano, resultando la fraccin de solubles en hexano, que llamaremos FHX, y a la solucin acuosa remanente, libre de solubles en hexano, lo llamaremos EC2. Luego fraccionamos con cloroformo, llamaremos FC3 a esta fraccin con los solubles en cloroformo, y, nalmente, fraccionamos con acetato de etilo, para obtener la fraccin FAC. La solucin acuosa remanente la liolizamos, a esta fraccin la llamamos FOH. Los solventes de las fracciones orgnicas los eliminamos a presin reducida. Este procedimiento se lo aplicamos a todas las plantas. Medimos la actividad antioxidante de los diferentes extractos y fracciones empleando la tcnica de lka decoloracin del beta caroteno y por la tcnica del entrampamiento de los radicales DPPH. Junto con la descripcin de cada planta, incluimos una escala cualitativa que nos permite formarnos una idea de la actividad de sus extractos y fracciones.
Escala cualitativa Tcnica de la decoloracin del beta caroteno

En este ensayo el 100 % de actividad lo adjudicamos a una solucin patrn de BHA recristalizado con 10 g/mL. La actividad de todas las muestras las referiremos porcentualmente a esa solucin patrn. Hemos establecido que slo consideraremos interesantes para los objetivos de este trabajo, aquellas muestras que presenten una actividad mayor o igual a 50 % la actividad de la solucin patrn de BHA. +++++ ++++ +++ 80-100 % 65-79 % 50-64 %
Queda claro que la escala contina por debajo de +++, pero esos valores no nos interesan y los sealaremos como n.a. (no actividad).
154
DESCRIPCIN DE LAS PLANTAS
Tcnica del DPPH

La concentracin de una muestra necesaria para entrampar el 50 % de los radicales DPPH, la denominamos EC50, este valor para el BHA recristalizado fue 11,1 g/mL. Por ello aceptamos como interesantes aquellas muestran que presentaron un EC50 menor que 20 g/mL ***** **** *** <10 g/mL 11-15 g/mL 16-20 g/mL
Igual que arriba, la escala contina hasta valores correspondientes a * y **, pero esas muestras no interesan para nuestro trabajo y las sealaremos como n.a. (no actividad).
155
Plantas Bolivianas
Gloria Saavedra
gloriasa@fcyt.umss.edu.bo Centro de Tecnologa Agroindustrial, Facultad de Ciencias y Tecnologa, Universidad Mayor de San Simn, PO Box 992, Cochabamba, Bolivia.
Baccharis aff. grisebachii Hieron ASTERACEAE Charina (Quechua) Mata Vacas (Espaol) Sinonimia botnica Baccharis abientina Kuntze Ref.: Cabrera, 1978. Descripcin de la planta
Arbusto de 1-2m de altura, con numerosos tallos divididos en la base, provistos de ramitas muy cortas (braquiblastos), densamente hojosas, pluricostadas, laxamente tomentulosas. Hojas alternas sobre los braquiblastos con entrenudos brevsimos, lineales, obtusas o semi-agudas en el pice, glabrescentes en el haz y densamente griseotomentosas en el envs (casi glabras). Captulos numerosos, pedicelados, dispuestos en cimas 3-5 cfalas en los pices de los braquiblastos, formando en conjunto una falsa panoja cilndrica hojosa. Captulos femeninos con involucro acampanado, de 5mm de altura por 4mm de dimetro, larias en 3 series, oblongas, agudas, levemente tomentosas en la parte superior del dorso; ores numerosas, aquenios cilndricos, costados de 2.5 mm de largo; papus de color leonado. Captulos masculinos con involucro acampanado de 4mm de altura por 4 mm de dimetro, larias oblongo-lanceoladas, agudas, ligeramente tomentosas; ores numerosas, con corola tubulosa penta-lobada. Voucher M. Mercado 1824 (Bolv).
Hbitat
Pas (es) de Regin Sub-andina : Bolivia. Especie distribuida en la pradera de la regin alto-andina y de puna del Departamento de Cochabamba, a 3500 msnm. Se encuentra en laderas secas a semi-hmedas con pendientes medias a escarpadas y sobre quebradas rocosas.
156
DESCRIPCIN DE LAS PLANTAS / PLANTAS BOLIVIANAS
Sitio de recoleccin
Esta especie fue colectada en laderas de cerro de la Comunidad Icoya (Kami, Independencia), Provincia Ayopaya.
Fenologa y reproduccin
No se tienen datos sobre oracin y fructicacin. Su reproduccin es a travs de semillas.
Propiedades y usos
Altamente txica para el ganado, en algunos casos produce muerte inmediata.
Resultados de la Evaluacin Antioxidante EC1 Beta caroteno: DPPH: **** ***** EC2 FHX FC3 FAC +++ ***** FOH
157
Baccharis pentlandii DC. ASTERACEAE Chilka, Mayu Chilka (Quechua) Descripcin de la planta
Arbusto, pequeo de 1,60 hasta 4m; enramado desde la base, tallos castaos rojizos; hojas lanceoladas de 7 x 2.50 cm. Haz glabro y envs algo puberulento, agudas aserradas; inorescencia racemosa de captulos tubulosos, de corola pentmera por ser de ores masculinas; involucro acampanado, tetra-seriado, brcteas obtusas, fruto aquenio negruzco con vilano de color blanquecino. Voucher: M. Mercado 1825 (BOLV).
Hbitat
Pas (es) de Regin Sub-andina: Bolivia. Especie distribuida en la pradera de la regin alto-andina y de puna del Departamento de Cochabamba, a 3500 msnm. Crece en suelos superciales, con bajo contenido de materia orgnica, seco a semi-hmedo y poco pedregoso. Se encuentra en laderas con pendientes medias a escarpadas, y sobre quebradas angostas y rocosas. La especie ha sido tambin identicada en en Departamento de La Paz, distribuyndose en un rango altitudinal de 2900 a 4050 msnm ( J.C. Salomn, 1981; M. Lewis, 1988; D.N. Smith, 1989, citados en el Ann. of the Missouri Botanical Garden).
Sitio de recoleccin
Especie colectada en la Comunidad Kami, Independencia, Provincia Ayopaya.
Fenologa y Reproduccin
Se observa con ores en noviembre. No se tiene datos de fructicacin. Su multiplicacin es a travs de semillas.
Propiedades y usos
Especie aromtica con propiedades medicinales La infusin de hojas frescas es utilizada para la tos; emplastos de las hojas se usan para aliviar los dolores causados por luxaciones, torceduras, dislocaciones y reumatismo. As mismo, las hojas frescas expuestas al sol se usan en forma de emplastos sobre heridas infectadas y lceras, actuando como antisptico.
Resultados de la Evaluacin Antioxidante: EC1 Beta caroteno: DPPH: *** EC2 FHX FC3 FAC FOH
158
Baccharis platypoda DC. ASTERACEAE Kellu Tola (Quechua) Descripcin de la planta

Arbusto en forma de arbol de 8 m de altura, 15 cm de dimetro, corteza surada, ramas terminales glabras glndulo-resinosas. Hojas alternas pecioladas de 5-20 mm de largo, lmina elptico-oblanceolada u oblanceolada, subovata, pice atenuado o acuminado, base cuneada, margen largamente dentado, lmina de 3-12 cm de longitud y 1-1.5 cm de ancho, glabra, glandulosa, resinosa-pulverulenta. Inorescencia en panculas axilares. Captulos casi ssiles, pedicelos de 0.5-10 mm de longitud. Captulos femeninos sub-globoso campanulados de 6-8 mm de alto, involucro campanulado glanduloso de 4,5-5 mm de alto y 3-4 mm de dimetro, larias penta-seriadas, imbricadas membranceas-escariosas. Captulos masculinos globoso acampanados de 6-7 mm de alto con 18-30 larias membranceas en 4 a 5 series. Voucher: M. Mercado 1838 (Bolv).
Hbitat
Pas (es) de Regin Sub-andina: Bolivia y Per. En Bolivia esta especie se halla distribuida en matorrales micro-foliados y restos de bosque seco caducifolio de la regin de los valles secos interandinos del Departamento de Cochabamba, a una altura de 2800 a 3680 msnm. Crece en lugares abiertos, solo o inmerso dentro la vegetacin, en laderas de pendiente variable, y bordes de camino, en suelos secos a sub-hmedos, superciales o poco profundos de textura franco areno-limosa con bajo contenido de materia orgnica.
Sitio de recoleccin
Especie colectada en el trayecto a Independencia, Comunidad Achaca. Tambin se encuentra en el trayecto a KamiIndependencia, en bordes de camino y laderas de cerro.
Inicia su oracin a mediados de Mayo y se extiende hasta Julio. En su mbito natural se reproduce por semillas.
Propiedades y usos
Especie aromtica, utilizada por los campesinos como lea de buena calidad y para realizar cercos de proteccin de los cultivos. Aporta materia orgnica al suelo.
Resultados de la Evaluacin Antioxidante EC1 Beta caroteno: DPPH: **** EC2 FHX FC3 FAC FOH
159
Baccharis salicifolia Pers. ASTERACEAE Huaycha (Quechua) Sinonimia botnica Baccharis glutinosa Pers. Baccharis iresinoides Kundth Baccharis lanceolata Kundth Baccharis parviora Pers. Baccharis viscosa (Ruiz & Pavn) Kuntze Molina parviora Ruiz & Pavn. Ref.: Brako, L & J.L. Zaraccuchi, 1993; Cabrera, A. L., 1978; Jorgensen, P.M., & S.Len- Yaez (eds) 1999. Descripcin de la planta
Arbusto de 1-2 m de alto, ramoso, densamente punteado-glanduloso, con tallos redondeados, hojosos hasta el pice. Hojas alternas, brevemente pecioladas, lanceoladas u oblanceolada, agudas en el pice y cuneiformes en la base , aserradas en la mitad superior del margen o entera, trinervadas desde cerca de la base, de 4-9 cm de longitud por 0.7-1.5 cm de ancho, ores numerosas, con corola liforme. Fruto aquenio cilndrico, rojizo, papus blanco. Voucher: M. Zrate 369 (Bolv).
Hbitat
Pas (es) de Regin Sub-andina: Argentina, Bolivia, Ecuador, Per y Paraguay. En Bolivia esta especie se encuentra distribuida en el bosque pluvial sub-andino de la vertiente occidental del Departamento de Cochabamba a 248 msnm. Crece en lugares abiertos, sub-hmedos a hmedos, riberas y lechos de ro. Se desarrolla en suelos arenosos, poco profundos, de bajo contenido de materia orgnica. Tambin se la encuentra en La Paz, Santa Cruz y Tarija, a una altura de 600 a 3000 msnm (Cabrera, A.L., 1960).
Sitio de recoleccin
Especie colectada a orillas del ro Salvador, Colonia San Salvador, Provincia Carrasco.
Las ores se pueden observar a nales de Junio hasta mediados de Agosto. Se reproduce a travs de semillas.
Propiedades y usos
Se utiliza como lea y para la construccin de chozas. Como forraje es poco palatable para el ganado.
Resultados de la Evaluacin Antioxidante EC1 Beta caroteno: DPPH: **** *** EC2 FHX FC3 FAC +++ ***** *** FOH
160
Chromolaena tunariense (Hieron) B.L.Rob. ASTERACEAE Sinonimia botnica Eupatorium tunariense (Hieron.) B.L. Rob. Eupatorium conyzoides var. tunariense Hieron Ref. Cabrera, A.L., 1978. Descripcin de la planta
Sufrtice de 80-100 cm de altura, con tallos erectos, ramosos en la parte superior, con ramas redondeadas, hirsutas, densamente hojosas en la parte inferior y laxamente en la superior. Hojas opuestas, cortamente pecioladas, con pecolos delgados, hirsutos, de 5-10 mm de largo y lminas ovadas o rmbico-ovadas, atenuadas en el pice y deltoideas en la base, irregularmente aserradas en el margen con pocos dientes grandes, trinervadas, hirsutas en ambas caras, de 50-70 mm de longitud por 25-40 mm de ancho. Pedicelos cortos, densamente pubescentes. Flores de color lila. Aquenios de 4-5 mm de largo, glabros. Papus blanco-amarillento. Voucher: M. Mercado 1830 (Bolv).
Hbitat
Pas (es) de Regin Sub-andina: Bolivia. Especie que forma parte de los matorrales micro-foliados y restos de bosque seco caducifolio de la regin de los valles interandinos del Departamento de Cochabamba, a 2200-3100 msnm. Se desarrolla en lugares abiertos, colinas de poca pendiente y riberas de quebrada, en suelos poco profundos, pedregosos, semi-hmedos, con bajo contenido de materia orgnica, de textura franco arenosa y franco limosa.
Sitio de recoleccin
Especie colectada en el Trayecto a Comunidad Vega, Independencia (Provincia Ayopaya), a una altitud de 2670 msnm.
Esta especie se encuentra en oracin en los meses de Enero a Marzo, posteriormente se forman los frutos. En su ambiente natural se multiplica por semillas.
Propiedades y usos
Especie aromtica, sin usos especcos en la zona.
Resultados de la Evaluacin Antioxidante EC1 Beta caroteno: DPPH: EC2 FHX FC3 +++ ***** FAC FOH
161
Erechtites hieracifolia (L.) Raf. Ex DC. ASTERACEAE Clavelin (Espaol) Aslla Wari Chilka (Quechua) Sinonimia botnica Erechtites cacalioides (Fisch. Ex Spreng.) Less, Senecio cacaclioides Fisch. Ex Spreng, Senecio hieraciifolius L., Lepianthes peltatum (L.) Raf., Piper pruinosum Kunth, Piper speciosum Kunth, Pothomorphe peltata (L.) Miq., Pothomorphe tecumensis Trel. Ref.Czerepanov, S.K., 1981, Brako, L & J.L. Zarucchi, 1993; Steyemark, J. Et.al., 1995, Flora of China Checklist Editorial Committee, 2002. Descripcin de la planta
Hierba de 1-3 m, glabras o disperso pubescente con hojas variables en forma oblongas, oblongo-lanceoladas o lanceoladas, 5-15 x 1-4 cm, pice agudo acuminado, base aguda, truncada o sub-cordada, subenteras a sinuoso-dentadas o sub-pinnatifdas, sub-ssiles o amplexicaules. Inorescencias de 5-20 cm de largo, 1 cm de largo, pedicelos de 1-3 cm largo, con involucro de brcteas linear-subuladas. Aquenios de 3 mm de largo, papus suave blanco de 1 cm de largo. Voucher: M. Zrate 340 (Bolv).
Hbitat
Pas (es) de Regin Sub-andina: Bolivia, Colombia, Ecuador, Paraguay, Per y Venezuela. En Bolivia, la especie ha sido identicada en La Paz, Beni y Santa Cruz, a 190-1800 msnm (E. Zardini, 1984: M. Nee, 1986, M. Del Aguila & .E. Gullison, 1991: J. Muller, 1997, y N. Ritter & P. Foster, 1996 citados en el Ann. of the Missouri Botanical Garden). Esta especie se halla distribuida en bosque siempre verde estacional de la llanura beniana del Departamento de Cochabamba, a 300 msnm, en suelos medio profundos, de textura franco arcillosa, poco frtiles y semi-hmedos. Crece en forma silvestre en parcelas y terrenos chaqueados.
Sitio de recoleccin
Especie colectada en Senda D, Chimor, Provincia Chapare.
Florece en Septiembre. No se tiene datos de fructicacin. Su multiplicacin es a travs de semillas.
Propiedades y usos
Especie aromtica con propiedades medicinales. Las hojas y ores se utilizan en infusin como depurativo de la sangre y la raz en decoccin para afecciones cardiacas.
Resultados de la Evaluacin Antioxidante EC1 Beta caroteno: DPPH: **** ***** ***** ***** EC2 FHX FC3 FAC FOH
162
Erechtites valerianaefolia Wolf ASTERACEAE Encame (Quechua) Sinonimia botnica Cacalia prenanthoides Kunth Erechtites prenanthoides (Kunth) Greenm & Hieron Senecio valerianifolius Link ex Spreng Senecio valerianifolius Wolf Ref.: Williams, L.O., 1976; Steyemark, J. et.al., 1995; Jorgensen, P. M. & S. Len Yaez, 1999; Stevens, W.D., C. Ulloa, A. Pool & O.M. Montiel, 2001. Descripcin de la planta
Hierba erecta de 1 a 1.5 m de altura, hojas alternas, profundamente pinnatisectas, con lbulos lanceolados aserrados, glabros en ambas caras de mas de 20 cm de longitud. Captulos numerosos dispuestos en cimas paniculares, axilares y terminales. Involucro cilndrico de unos 10 mm de altura, aquenios con papus rosado de 2.5 mm de altura. Voucher M. Zrate 319 (Bolv).
Hbitat
Pas (es) de Regin Sub-andina: Bolivia. Especie que se encuentra distribuida en el bosque hmedo montaoso de yungas del Departamento de Cochabamba, a una altitud de 1851 msnm. Se encuentra inmersa dentro la vegetacin del bosque hmedo, tambin en bordes de camino y dentro de suelos cultivados, generalmente en terrenos planos y abiertos. El suelo donde se desarrolla es supercial, de textura francoarcillosa, alto contenido de materia orgnica, sub-hmedo y poco pedregoso. En Bolivia se ha identicado la especie en La Paz, distribuida entre los 1400 a 1500 msnm (Gentry Al, J. Solomon & E. Zardini, 1984, citados en el Annals of Missouri Botanical Garden).
Sitio de recoleccin
Esta especie fue colectada en Villa Palmarcito, Comunidad San Jos, Provincia Chapare.
Florece desde Junio hasta Agosto. Su reproduccin es a travs de semillas.
Propiedades y usos
No tiene uso especco, no es apetecible por el ganado.
Resultados de la Evaluacin Antioxidante EC1 Beta caroteno: DPPH: ***** ***** *** ***** EC2 FHX FC3 FAC FOH +++ *****
163
Gynoxys psylophylla Klatt ASTERACEAE Salancachi (Quechua) Descripcin de la planta

Arbusto de 1 m, tallos jvenes tomentosos, pelos blancos. Hojas ovadas, opuestas glabras, borde aserrado, pice agudo, base truncada. Inorescencias en cimas corimbiformes terminales, involucro acampanado, por una serie de larias mas o menos iguales entre s, sub-coriceas, oblongas, con algunas brcteas lineales, ores amarillas dimorfas, las marginales pocas uni-seriadas, femeninas, con corola ligulada, las del disco hermafrodita, con corola tubulosa de tubo angosto y limbo acampanado, penta-dentado, aquenios con papus formado por cerdas rgidas, barbeladas. Voucher M. Mercado 1839 (Bolv).
Hbitat
Pas (es) de Regin Sub-andina: Bolivia. Esta especie se encuentra en los matorrales micro-foliados y restos de bosque seco caducifolio de la regin de los valles interandinos como tambin forma parte de la pradera andina de la regin alto-andina y de puna del Departamento de Cochabamba. Se encuentra en lugares abiertos y soleados, crece en laderas de pendiente moderada a fuerte y cerca de parcelas cultivadas, en suelos superciales y pedregosos, a una altura de 2900-3900 msnm.
Sitio de recoleccin
Especie colectada en el Trayecto a Independencia, Comunidad Sivingani, Provincia Ayopaya, en bordes del camino y laderas de cerro.
La oracin empieza a mediados de Mayo y se extiende hasta principios de Agosto. La maduracin de frutos se efecta simultneamente con la oracin. Se reproduce de forma natural a travs de semillas.
Propiedades y usos
Se utilizan los tallos para atar fardos, por la alta resistencia de sus bras. Por sus caractersticas la emplean como lea y la hojarasca aporta materia orgnica al suelo. No es palatable para el ganado.
Resultados de la Evaluacin Antioxidante EC1 Beta caroteno: DPPH: *** **** ***** ***** EC2 FHX FC3 FAC FOH
164
Helogyne straminae D.C. B.L. Rob ASTERACEAE Chini Tola Descripcin de la planta
Arbusto de 1-2 m de altura, ramoso, con ramas redondeadas, hojosas hasta la inorescencia, cortamente pubescentes o glabras. Entrenudos de 1-2 cm de largo. Hojas inferiores opuestas, las superiores alternas, ssiles, lineal-lanceoladas o lineales, enteras con una nervadura principal gruesa y dos o ms venas laterales tenues, glabras en ambas caras y con puntuaciones glandulares, de 10-50 mm de largo por 2-10 mm de ancho. Captulos muy numerosos, dispuestos en cimas corimbiformes densas en los extremos de las ramas. Pedicelos cortos, densamente glanduloso-pubrulos. Involucro cilndrico-acampanado, de 5-6 mm de altura. Presenta 5 ores, con corola blanca amarillenta de 5mm de largo, cortamente penta-dentada. Aquenios de 2-2.5 mm de largo, con glndulas esfricas esparcidas, papus amarillento.
Hbitat
Pas (es) de Regin Sub-andina: Bolivia. Especie que se distribuye en los valles y cabeceras de valle de Cochabamba. Forma parte de los matorrales micro-foliados y restos de bosque seco caducifolio de la regin. Crece en suelos de relieve plano y colinas de pendiente suave, en suelos superciales, pedregosos, de textura franco areno-limosa y con bajo contenido de materia orgnica.
Sitio de recoleccin
Esta especie fue colectada en Capinota (Provincia Capinota) a 2530 msnm.
Se observa con ores a nes de Mayo hasta Julio; posteriormente se inicia la formacin de frutos. Se reproduce mediante semillas.
Propiedades y usos
Especie aromtica sin uso especcos en la zona. A veces la utilizan como lea.
Resultados de la Evaluacin Antioxidante EC1 Beta caroteno: DPPH: EC2 FHX FC3 +++ ***** FAC FOH
165
Mikania buchtienii B.L.Rob. ASTERACEAE Wuaca Yuyo (Quechua) Descripcin de la planta

Arbusto apoyante, hojas opuestas, de borde entero, pice acuminado, haz con pocos pelos dispersos, envs tomentoso. Captulos tetraoros pequeos, numerosos dispuestos en cimas corimbiformes, ores isomorfas hermafroditas, con corolas tubulosas penta-dentadas en el limbo, receptculo glabro. Aquenios pentagonales, papus formado por cerdas blancas. Tallos y cliz tomentoso, con pelos de color marrn. Voucher M. Zrate 307 (Bolv).
Hbitat
Pas (es) de Regin Sub-andina: Bolivia. Especie que se distribuye en el bosque hmedo montaoso de yungas del Departamento de Cochabamba, a 1694 msnm. Se encuentra en lugares planos apoyadas sobre otras especies, crece en suelos superciales, poco profundos y pedregosos.
Sitio de recoleccin
Esta especie fue colectada en Conchumayu, Provincia Chapare, a orillas del camino, bordes de terrenos en descanso y riberas del ro.
Con las primeras lluvias comienza el rebrote de follaje, se inicia la oracin en Febrero y se extiende hasta Mayo, siendo esta la poca de formacin de semillas. La planta se seca durante el invierno. La reproduccin natural es por semillas.
Propiedades y usos
Es una especie muy apetecible por el ganado vacuno, consumen las ramas y brotes tiernos como forraje.
Resultados de la Evaluacin Antioxidante EC1 Beta caroteno: DPPH: +++ ***** ***** ***** EC2 FHX FC3 FAC FOH +++ *****
166
Mikania psilostachia DC. ASTERACEAE Sinonimia botnica Mikania consanguinea Gardner, Mikania fockeana Miq., Mikania scabra DC., Willoughbya psilostacya (DC.) Kuntze, Mikania racemulosa Benth Mikania polystachya DC. Ref. Holmes, W.C. & S. Mc daniel, 1982; Brako, L. & J.L. Zarucchi, 1993; Pruski, J.F., 1997; Jorgensen, P.M. & S. Len Yanez (eds.) 1999.
Descripcin de la planta
Lianas escabrosas y a veces ferrugineo-pubrulas, entrenudos de 20 cm de largo aproximadamente. Hojas elpticas u ovadas, 4-13 x 2-5 cm, pice agudo o atenuado-cuspidado, base aguda a redondeada, margen entero, ondulado o aserrado, peciolos de 1-3 cm de largo. Inorescencias paniculadas de 10-20 cm de largo, con ramas especiformes y ramosas, cabezuelas de 8-11 mm de largo, con involucro de brcteas linearlanceoladas u oblongas de 5-6 cm de largo, ores blancas. Aquenios de 3 mm de largo aproximadamente, glandulares, papus de 40 cerdas, pilosas y blancas de 5-6mm de largo. Voucher: M. Zrate 394 (Bolv).
Hbitat
Pas (es) de Regin Sub-andina: Bolivia, Colombia, Ecuador, Per y Venezuela. En Bolivia se la encuentra en el bosque siempre verde estacional de la llanura beniana del Departamento de Cochabamba. Esta especie crece en forma silvestre en el interior del bosque, en suelos medianamente profundos, poco frtiles y semi-hmedos de textura franco arcillosa. Se halla tambin en La Paz y Santa Cruz, a 200-1800 msnm (James C. Solomon, B. Stein & M. Uehling, 1984; M. Nee, 1984; L. Sanchez, E Gutierrez & J. Surub, 1997, citados en el Ann. of the Missouri Botanical Garden).
Sitio de recoleccin
Especie colectada en Senda D, Chimor, Provincia Chapare, a una altitud de 310 msnm
Florece en Diciembre, no existen datos de fructicacin. Su multiplicacin es a travs de semillas.
Propiedades y usos
Especie aromtica sin usos especcos en la zona.
Resultados de la Evaluacin Antioxidante EC1 Beta caroteno: DPPH: *** ***** ***** ***** EC2 FHX FC3 FAC FOH
167
Ophryrosporus heptanthus (Sch. Bip. Ex Wedd) ASTERACEAE Sinonimia botnica Eupatorium amori Cuatrec., Eupatorium heptanthum Sch. Bip. Ex Wedd. Eupatorium origanoides Meyen & Walp, Ophryosporus origanoides (Meyen & Walp) Hieron Ref.: Brako, L. & J.L. Zaraccuchi, 1993. Descripcin de la planta
Sufrtice de 20-50 cm de altura, tallos ascendentes o erectos, muy ramicado en la parte inferior, con pelos pluricelulares cortos y tricomas glandulares. Hojas opuestas, pecioladas y pubescentes; lminas ovadas, acuminadas en el pice y redondeadas o cortamente deltoideas en la base; aserradas, con 3-6 dientes agudos a cada lado, tri-nervadas desde la base, laxamente pubescentes en ambas caras hasta casi glabras, de 15-30 mm de longitud por 4-20 mm de ancho. Captulos poco numerosos, dispuestos en cimas corimbiformes terminales paucicfalas. Pedicelos delgados, glanduloso-pubescentes de 2-5 mm de largo. Involucro hemisfrico-acampanado, cerca de 10 larias, dispuestas en dos series, lanceoladas, agudas, glanduloso-pubescentes en el dorso. Flores blancas con corola de aproximadamente 5 mm de largo, pentadentada en el pice. Aquenio pubescente de 2.5 mm con papus blanco. Voucher M. Mercado 1821 (Bolv).
Hbitat
Pas (es) de Regin Sub-andina: Bolivia y Per. En Bolivia esta especie se encuentra en el pramo yungueo de la regin alto-andina y de puna del Departamento de Cochabamba, a una altura de 2334 msnm. Crece en lugares planos, bordes de camino, orillas de ro y lomas de pendiente variable. El suelo donde prospera es poco profundo, franco arenoso, pedregoso, rido y con bajo contenido de materia orgnica.
Sitio de recoleccin
La especie fue colectada en bordes de camino y laderas de cerro en Chapapani, Provincia Tiraque.
El follaje rebrota despus del perodo de lluvias. Inicia la oracin a nes de Enero y se observan frutos a mediados de Mayo. Se multiplica a partir de semillas.
Propiedades y usos
Es consumida como forraje por los animales. En medicina tradicional la utilizan para aliviar dolores producidos por la menstruacin.
Resultados de la Evaluacin Antioxidante EC1 Beta caroteno: DPPH: **** EC2 FHX FC3 +++ ***** **** FAC FOH
168
Plazia daphnoides Wedd ASTERACEAE Thola (Quechua) Descripcin de la planta

Arbusto ramoso de alrededor de 1/2 metro de altura, con ramas viejas pardas, muy cicatricosas y ramitas nuevas muy densamente hojosas, pubescencia aterciopelada. Hojas con entrenudos de menos de 1mm, sub-coriceas, ssiles, oblongas u oblongo-espatuladas, agudas u obtusas en el pice, enteras en el margen, uninervadas pubescentes en ambas caras hasta casi glabras, de 10-18 mm de longitud, por 2-3.5 mm de ancho. Captulos solitarios en los pices de las ramitas, ssiles y rodeados por las hojas superiores. Aquenios cilindroides-turbinados, glabros o con algunas papilas en la parte superior, de 4 mm de largo. Papus de color pajizo, formado por numerosas cerdas speras. Voucher M. Ramirez 66 (Bolv).
Hbitat
Pas (es) de Regin Sub-andina: Bolivia y Per. En Bolivia esta especie se encuentra en las cabeceras de valle del Departamento de Cochabamba, a 3181 msnm, formando parte de la pradera punea semi-hmeda de la regin alto-andina y de puna.
Sitio de recoleccin
Especie colectada en la Comunidad Thorankali, Provincia Anzaldo, en laderas y quebradas pedregosas.
Se encuentra con or a partir del mes de Noviembre hasta Marzo. Paralelamente se observan frutos hasta Abril. En su ambiente natural se multiplica por semillas.
Propiedades y usos
Las ramas en agua se lleva a ebullicin y el lquido resultante se utiliza como colorante de lana, tambin se usa como lea de buena calidad y en la construccin de pirhuas (silos) para la conservacin de papa, maz y otros vegetales. No es consumida por el ganado.
Resultados de la Evaluacin Antioxidante EC1 Beta caroteno: DPPH: +++ ***** ***** EC2 FHX FC3 +++ ***** ***** **** FAC FOH
169
Pluchea sagittalis (Lam.) Cabrera ASTERACEAE Lucera (Espaol) Sinonimia botnica Conyza sagittalis Lam., Gnaphalium suaveolens Vell., Pluchea quitoc DC., Pluchea suaveolens (Vell.) Kuntze Ref. Cabrera, A.L., 1978:Steyemark, J.Etal, 1995; Flora of China Checklist Editorial Committee, 2002. Descripcin de la planta
Hierba perenne, de 0.5 a 2 m de altura, con tallos erectos, ramosos, alados, glabros o ligeramente pubescentes, hojosos hasta la inorescencia; alas enteras, reticulado venosos, de 1-2 mm de ancho. Hojas alternas ssiles, anchamente lanceoladas, agudas en el pice, atenuadas y decurrentes en la base; brevemente aserradas en el margen con dientes pequeos, obtusos y distantes, pubescentes en ambas caras, con pelos delgados pluricelulares y pelos glandulares cortos y gruesos formados por dos hileras de clulas de 80-140 mm de longitud por 15-40 mm de ancho. Captulos pequeos, hemisfricos, numerosos, dispuestos en cimas corimbosas terminales; pedicelos densamente pubescentes; larias en 2-3 series, las externas ovadas y agudas; las internas lanceoladas agudas, todas densamente pubrulas en el dorso. Flores blancas o rosadas con corola liforme y corola tubulosa. Aquenios costados, glabros de 0.5 mm de longitud, papus blanco. Voucher: M. Zrate 337 (Bolv).
Hbitat
Pas (es) de la Regin Sub-andina: Bolivia, Argentina, Colombia, Paraguay, Per y Venezuela. En Bolivia se encuentra distribuida en bosques hmedos de la llanura beniana del Departamento de Cochabamba, a 421 msnm. Se halla en la vegetacin de sotobosque, crece en bordes de camino, suelos poco profundos de textura franco-areno arcilloso y bajo contenido de materia orgnica. Tambin se halla en Beni, y Santa Cruz, a 200-2580 msnm (M. Nee, 1996: De La Barra, 1996 citados en el Ann. Of the Missouri Botanical Garden).
Sitio de recoleccin
La especie fue colectada en Bulo Bulo, Provincia Carrasco, en terrenos sin cultivar y bordes de camino, a una altitud de 421 msnm.
Florece de Diciembre a Marzo. Su multiplicacin es a travs de semillas.
Propiedades y usos
Especie aromtica con algunas propiedades medicinales. Los lugareos toman una infusin de las hojas para aliviar afecciones estomacales y hepticas.
Resultados de la Evaluacin Antioxidante EC1 Beta caroteno: DPPH: 170 ***** EC2 FHX FC3 FAC FOH
Senecio herzogui ASTERACEAE Falsa Mora Descripcin de la planta

Arbusto de 1 m de altura, tallos lanuginosos, hojas alternas, lanceoladas, envs lanuginoso, haz glabro, pice acuminado, base cuneada. Involucro cilndrico, acampanado o hemisfrico, formado por una sola serie de larias. Captulos discoideos, dispuestos en racimos axilares, todas las ores hermafroditas, con corola tubulosa diferenciada en un tubo estrecho y un limbo mas o menos ensanchado, penta-dentado o penta-lobado en el pice. Aquenios cilindroides, costados glabros. Voucher M. Zrate 304 (Bolv).
Hbitat
Pas (es) de Regin Sub-andina: Bolivia. Esta especie se halla distribuida en el bosque hmedo montaoso de yungas del Departamento de Cochabamba, a 2320 msnm. Crece en las orillas de los ros, bordes de camino, en terrenos planos a ligeramente inclinados. El suelo es supercial, , bastante pedregoso, seco a sub-hmedo, de textura franco-areno limosa y bajo contenido de materia orgnica.
Sitio de recoleccin
Especie colectada en el trayecto a Tablas Monte, Provincia Chapare.
Inicia su oracin a mediados de Julio y se extiende hasta Septiembre. Se reproduce a travs de semillas e hijuelos.
Propiedades y usos
No tiene uso especco. Tampoco es apetecible por el ganado.
Resultados de la Evaluacin Antioxidante EC1 Beta caroteno: DPPH: ***** EC2 +++ ***** FHX FC3 FAC +++ ***** ***** FOH
171
Tagetes maxima Kuntze ASTERACEAE Suico (Espaol), Alko Suico (Quechua) Descripcin de la planta
Arbusto de hasta 1,3 m de altura, tallos erectos, hojas bi-compuestas, opuestas, profundamente pinnatisectas, foliolos elptico lanceolados, mrgenes aserrados, presencia de glndulas oleferas. Captulos dispuestos en cimas corimbiformes. Voucher: M. Mercado 1837 (Bolv).
Hbitat
Pas (es) de Regin Sub-andina: Bolivia y Per. En Bolivia se halla distribuida en los matorrales microfoliados y restos de bosque seco caducifolio de la regin de los valles interandinos del Departamento de Cochabamba, a una altura de 2780 msnm. El suelo donde se desarrolla es supercial, seco a sub-hmedo, pedregoso, de textura franco areno-limosa y con bajo contenido de materia orgnica. Crece en lugares abiertos, solas o inmersas dentro de la vegetacin, en laderas de pendiente variable, bordes de camino y parcelas cultivadas. Esta especie se la encuentra tambin en los Yungas de La Paz, a 3200 msnm (Solomon, J., J. Luteyn y J. Dorr, 1990).
Sitio de recoleccin
Especie colectada en el Trayecto a Independencia, en las comunidades de Manzarani y Sivingani, Provincia Ayopaya, se halla en parcelas en descanso, bordes de parcelas cultivadas y bordes de camino, a una altitud de 2780 msnm.
El rebrote del follaje se efecta en la poca lluviosa. Florece abundantemente a partir de Marzo y se extiende hasta Mayo, la presencia de frutos se observa durante Junio y Julio, fecha apta para la recoleccin de semillas. La cada del follaje se efecta en los meses de invierno. Su reproduccin natural es a travs de semillas.
Propiedades y usos
Especie aromtica, txica y picante para el consumo animal. No tiene un uso especco en la zona. Los campesinos a veces utilizan sus ramas, hojas y ores como tinte (amarillo) para prendas de vestir.
Resultados de la Evaluacin Antioxidante EC1 Beta caroteno: DPPH: ***** EC2 +++ ***** ***** FHX FC3 FAC FOH +++ *****
172
Tagetes multiora H.B.K. ASTERACEAE Suico enano (Espaol) Sinonimia botnica Tagetes andina M. Ferraro Tagetes erythrocephala Rusby Tagetes multiora var rupestris Wedd. Ref.: Cabrera, A.L., 1978; Brako, L. & J.L. Zaraccuchi, 1993. Descripcin de la planta
Hierba anual de 4-20 cm de alto, con tallos ascendentes o casi erectos, glabros, ramoso, laxamente hojoso. Hojas opuestas cortamente pecioladas, elptico, pinnatisectas, con raquis lineal y 2-4 pares de segmentos lineales o lineal-lanceolados, enteros o aserrados, con glndulas oleferas puntiformes. Captulos pedunculados, dispuestos en cimas corimbiformes paucicfalas. Generalmente penta-larias, soldadas entre s, triangulares y agudas en el pice, glabras, rojizas, y con bolsas oleferas lineales en el dorso. Flores amarillas, dimorfas, las marginales femeninas, las ores del disco hermafroditas. Aquenios fusiformes, negros, pubescentes, de 6-7 mm de largo. Papus formado por 3-5 pajitas planas, aristiformes, de 6-7 mm de largo. Voucher M. Mercado 1823 (Bolv).
Hbitat
Pas (es) de Regin Sub-andina: Bolivia, Ecuador y Per. En Bolivia esta especie se encuentra en cabeceras de valle de la pradera alto-andina de la regin andina y de puna del Departamento de Cochabamba, a 3500 msnm. Crece en lugares abiertos, iluminados, planos a ligeramente inclinados, en bordes de camino, terrenos en descanso y prxima a parcelas cultivadas. El suelo donde se desarrolla es poco pedregoso, medianamente profundo, semi-hmedo, de textura franco limosa, con un contenido medio de materia orgnica.
Sitio de recoleccin
Especie colectada en laderas de cerro, parcelas cultivadas y bordes de acequias de la Comunidad Icoya (Kami, Independencia), Provincia Ayopaya.
Crece despus del perodo de lluvias, inicia su oracin en Febrero y se extiende hasta mediados de Abril.
Propiedades y usos
La parte rea de la planta se utiliza como saborizante de comidas (llajua).
Resultados de la Evaluacin Antioxidante EC1 Beta caroteno: DPPH: *** ***** ***** ***** EC2 FHX FC3 FAC FOH
173
Tessaria dodoneifolia (Hook et. Arn) Cabrera ASTERACEAE Descripcin de la planta

Arbusto resinoso de 3 m. de altura, con races gemferas y tallos erectos, glabros. Las hojas son lanceoladas, agudas en el pice y atenuados en la base, aserrados, glabras y cubiertas de glndulas puntiformes en ambas caras, de 48 80 mm de largo por 520 mm de ancho. Captulos densamente corimbosos en el extremo de las ramas. Brcteas numerosas dispuestas en varias series, las exteriores ciliadas en el margen y glandulosas punteadas en el dorso. Flores dimorfas, las marginales femeninas y las centrales masculinas de 35 ores, aquenios laxamente pubescentes.
Hbitat
Pas (es) de Regin Sub-andina: Bolivia. Especie que se encuentra 2420 msnm distribuida en los valles y cabeceras de valle del Departamento de Cochabamba, formando parte de los matorrales micro-foliados y restos de bosque seco caducifolio de la regin de valles secos interandinos. Crece en suelos de relieve plano y colinas de pendiente suave, en suelos superciales, pedregosos, de textura franco areno-limosa y con bajo contenido de materia orgnica.
Sitio de recoleccin
Esta especie fue colectada en el Trayecto UcuchiCapinota (Provincia Capinota).
Se observa con ores desde nes de Mayo hasta Julio; posteriormente se encuentra con frutos desde nales de Julio a Agosto. Se reproduce mediante semillas.
Propiedades y usos
Sin usos especcos reportados en la zona.
Resultados de la Evaluacin Antioxidante EC1 Beta caroteno: DPPH: ***** ***** *** ***** **** EC2 FHX FC3 FAC FOH
174
Tessaria fastigiata (Griseb.) Cabrera ASTERACEAE Ori Ori (Quechua) Sinonimia botnica Pluchea fastigiata Descripcin de la planta
Arbusto de 1-1.5 m de altura, ramoso, con ramas jvenes redondeadas, densamente velutino-velludas, hojosas hasta la inorescencia. Ramas viejas glabrescentes, de color castao, desprovistas de hojas. Entrenudos de 20-50 mm de longitud. Hojas alternas, cortamente pecioladas, con pecolos velludos de 2-10 mm de largo y lminas lanceoladas, agudas en el pice y cuneiformes en la base, enteras, pinatinervadas, velludas en ambas caras, de 50-130 mm de largo por 15-40 mm de ancho. Captulos muy numerosos, pequeos, dispuestos en cimas corimbiformes terminales; pedicelos velludos de 3-10 mm de longitud. Flores de color rosa, dimorfas, las marginales numerosas con corola liforme de 4 mm de largo, pentadentada en el pice con lbulos lineales papilosos. Aquenios pubescentes de 1 mm de largo. Papus blanco. Voucher: M. Mercado 1845 (Bolv).
Hbitat
Pas (es) de Regin Sub-andina: Bolivia. Especie ampliamente distribuida en la pradera semi-hmeda de la regin alto-andina y de puna del Departamento de Cochabamba, a 2500-3000 msnm. Crece en distintos tipos de suelo, de textura franco areno-limosa, profundidad variable y generalmente con bajo contenido de materia orgnica. Se encuentra en lugares planos y laderas de pendiente variable, riberas de ro, bordes de acequias y cerca a terrenos cultivados.
Sitio de recoleccin
Especie colectada en la cuenca del Ro KoraMontecillo, Tiquipaya, Provincia Quillacollo, en bordes del camino, riberas del Ro Kora y colinas aledaas, a una altitud de 2890 msnm
Se observa con ores a nales de Mayo hasta Julio. Se encuentra con frutos de Julio a Agosto. Tiene otra poca de oracin en Diciembre y Enero. Se reproduce en forma natural mediante semillas.
Propiedades y usos
Especie aromtica y melfera. La utilizan como lea.
Resultados de la Evaluacin Antioxidante EC1 Beta caroteno: DPPH: ***** ***** EC2 FHX FC3 FAC +++ ***** ***** FOH
175
Buddleja tucumanensis L. BUDDLEJACEAE Yurajwuasa (Quechua) Kishuara (Quechua) Sinonimia botnica Buddleja bangui Kraenzl., Buddleja canescens Rugby., Buddleja cochabambensis Rugby. Buddleja hypoleuca Kraenzl., Buddleja ignea Kraenzl., Buddleja inconspicua Kraenzl. Referencias : Zuloaga, F. 1997; Norman, E.M., 2000, citados en el Annual of the Missouri Botanical Garden. Descripcin de la planta
Arbusto semi-caducifolio de hasta 3 m. de alto, tronco ramicado desde la base, corteza que se desprende en tiras delgadas. Hojas opuestas, simples, ampliamente lanceoladas, de 3 a 10 cm. de largo, lmina foliar plana, haz verde lustroso, envs tomentoso, de color blanquecino, y borde entero. Flores hermafroditas y unisexuales, pequeas, anaranjadas, dispuestas en cabezuelas semi-globosas y apretadas en el extremo de las ramas. Fruto cpsula ovoidea, semillas diminutas y numerosas. Voucher M. Ramrez 51 (Bolv).
Hbitat
Pas (es) de Regin Sub-andina: Bolivia. Especie propia de valles y cabeceras de valle del Departamento de Cochabamba. Se distribuye entre 2400 a 3300 msnm., encontrndose frecuentemente en laderas empinadas, bordes de camino y riberas de quebradas, generalmente en suelos secos y degradados.
Sitio de recoleccin
La especie fue colectada en Apote-Tiquipaya, Provincia Quillacollo, a una altura de 2810 msnm.
Inicia la oracin a principios de Abril y se extiende hasta Junio. La formacin de semillas es a nales de Junio, se multiplica a travs de semillas.
Propiedades y usos
Especie aromtica utilizada como forraje para los animales (hojas, brotes y hojarasca). As mismo constituyen barreras vivas para controlar la erosin.
Resultados de la Evaluacin Antioxidante EC1 Beta caroteno: DPPH: ***** ***** ***** ***** EC2 FHX FC3 FAC FOH
176
Hedyosmun angustifolium (Ruiz&Pavon) CHLORANTHACEAE Matico menta (Espaol) Descripcin de la planta

Arbusto o pequeo rbol de 2.5-7 m de alto, dioico, aromtico, tallo blanco o anaranjado, los tallos jvenes cuadrangulares, verde o prpura, glabros. Hojas lanceoladas, angosta elptica-lanceolada de 11.5-14.8 cm de largo por 2.7-4.1 cm, pice acuminado, base cuneada a oblicuo, de margen aserrado a crenado. Inorescencia terminal o axilar, de 4-10.7 cm de longitud., compuestas por 1-3 espigas agrupadas. Brcteas foliosas, de 1-6.2 cm de ancho por 0.1-1.9 cm de ancho. En la or femenina trigono, 5-7 mm de longitud. Fruto azulado oscuro a prpura, irregularmente globoso a oblongo, semillas trgonas. Voucher M. Zrate 316 (Bolv).
Hbitat
Pas (es) de Regin Sub-andina: Bolivia. Especie que se distribuye en el bosque hmedo montaoso de yungas del Departamento de Cochabamba, a 1780 msnm. Se desarrolla en suelos superciales de textura franco-arenosa, con bajo contenido de materia orgnica.
Sitio de recoleccin
Especie colectada al interior del bosque primario en el Trayecto a la Comunidad Corani Pampa y Tablas Monte, Provincia Chapare.
Florece en los meses de Agosto a Octubre. Se han observado frutos desde el mes de Octubre hasta Diciembre. En su ambiente natural se reproduce a travs de semillas.
Propiedades y usos
La infusin de las hojas se toma como refresco y mate para aliviar dolores de estmago.
Resultados de la Evaluacin Antioxidante EC1 Beta caroteno: DPPH: EC2 FHX FC3 FAC +++ ***** FOH
177
Croton andinus Mull.Arg. EUPHORBIACEAE Duraznillo (Espaol) Descripcin de la planta

Arbusto pequeo que alcanza 80 cm de altura. Hojas alternas, estrechamente ovadas de 1.5-2.5 cm de largo, base redondeada o sub-aguda, con pelos estrellados en el haz y el envs. Espigas terminales, con ores unisexuales, ores femeninas con disco anular, ovario trilocular, estilos tri-bdos. Pedicelos femeninos de 3 mm de largo, estilos tomentuloso. Cpsula disgregndose en cocos bivalvos. Voucher M. Mercado 1808 (Bolv).
Hbitat
Pas (es) de Regin Sub-andina: Bolivia. Especie que se distribuye en cabeceras de valle de los matorrales micro-foliados y restos de bosque caducifolio de la regin de los valles secos interandinos del departamento de Cochabamba. Se encuentra entre 20002300 msnm. Crece en lugares abiertos, laderas de pendiente variable, y en bordes de camino.
Sitio de recoleccin
Especie colectada en la Comunidad Tahuada (Trayecto Mizque-Aiquile), Provincia Mizque, en laderas de cerro y bordes de camino.
La planta rebrota despus del perodo de lluvias, la oracin empieza a nales de Enero y se extiende hasta Marzo, mes en el cual se observa la presencia de frutos y semillas. Las semillas permanecen hasta mediados de Mayo. La planta desaparece en los meses de invierno hasta el perodo lluvioso.
Propiedades y usos
Los frutos son consumidos por los nios, por el sabor dulce que tienen.
Resultados de la Evaluacin Antioxidante EC1 Beta caroteno: DPPH: EC2 FHX FC3
++++
FAC
FOH
+++
178
Croton cf. emporiorum Croizat EUPHORBIACEAE Descripcin de la planta

Arbusto de hasta 80 cm de altura, hojas alternas pequeas de hasta 1.5 cm de largo por 0.9 mm de ancho, envs de color blancuzco, pubescente, pelos estrellados, haz de color verde oscuro, glabra. Ramas con pelos glandulosos. Inorescencia en espiga, terminal. Voucher: M. Mercado 1829; (Bolv).
Hbitat
Pas (es) de Regin Sub-andina: Bolivia. Especie que forma parte de los matorrales micro-foliados y restos de bosque seco caducifolio de la regin de los valles secos interandinos del Departamento de Cochabamba. Se desarrolla en suelos poco profundos, pedregosos, semi-hmedos, con bajo contenido de materia orgnica, de textura franco arenosa y franco limosa. Crece en lugares abiertos, colinas de poca pendiente y riberas de quebrada.
Sitio de recoleccin
Especie colectada en el trayecto a la comunidad Vega, Provincia Independencia, a una altura de 2670 msnm.
Sin datos registrados de oracin ni fructicacin. En su ambiente natural se reproduce por semillas.
Propiedades y usos
No tiene uso especco en la zona. Es poco palatable por el ganado.
Resultados de la Evaluacin Antioxidante EC1 Beta caroteno: DPPH: *** **** **** EC2 FHX FC3 FAC FOH +++ ***
179
Mimosa lepidota Herzog FABACEAE Jarka, Chatala, Achatala (Quechua) Descripcin de la planta
Arbusto de 2- 2.5 m de alto. Estpula persitente lanceovada de 1.5-3 mm. Inorescencia en captulo sin lamentos 5-5.5 mm de dimetro. Flores cuatro meras, 8 estambres, cliz membranceo campanulado 1.2-1.4 mm, corola en forma de vaso de 2.5-6 mm, lamentos blancos, exertos de 3.5-6 mm. Vaina de mas o menos 4 cm de largo, con 6-7 semillas, los artculos de 4 mm de largo. Voucher: M. Mercado 1812 (Bolv).
Hbitat
Pas (es) de Regin Sub-andina: Bolivia. Especie que se encuentra en los valles y cabeceras de valle de los matorrales micro-foliados y restos de bosque caducifolio de la regin de los valles secos interandinos del Departamento de Cochabamba. Altitudinalmente se encuentra a 2200 msnm. Crece con frecuencia en laderas, generalmente lugares abiertos e iluminados, bordes de camino, en suelos superciales a medianamente profundos, pedregosos, secos a semi-hmedos. Esta especie se encuentra tambin en Chuquisaca, Santa Cruz y Tarija, distribuida entre los 1800 a 2400 msnm (I. Vargas, 1989; M. Nee, 1991, Antezana, C., 1994, 1999, citados en el Ann. of the Missouri Botanical Garden).
Sitio de recoleccin
Especie colectada en el trayecto a la comunidad Rackay Pampa, Mizque a una altitud de 2249msnm.
Se observa con ores en Noviembre y presencia de frutos en Diciembre. En su ambiente natural se multiplica por semillas.
Propiedades y usos
Especie aromtica, sin uso especco en la zona.
Resultados de la Evaluacin Antioxidante EC1 Beta caroteno: DPPH:

+++++
EC2
+++
FHX
+++
FC3
+++
FAC
++++
FOH
+++++
****
****
***
180
Hyptis mutabilis (Rich.) Briq. LAMIACEAE Alucema (Espaol), Yunka Alhucema (Quechua) Sinonimia botnica Nepeta mutabili Rich., Hyptis canescens Kunth, Hyptis expansa Pohl. Ex. Benth, Hyptis micrantha Pohl Ex Benth Ref. Crespo, S. 1979; Jorgensen, P.M. & S. Len Yanez (eds.) 1999. Descripcin Botnica
Hierba perenne, de 1.5-3.5 m de alto, tallos erectos, pubescentes, escabrosos a lo largo de las aristas. Hojas pecioladas, peciolos de 1-4.5 cm de largo. Lminas enteras de 2-9 cm de largo por 0.5-4 cm de ancho, ovadas u ovadas-rmbicas, acuminadas en el pice, redondeadas en la base, irregularmente crenado aserradas en el borde, haz verde con pelos esparcidos, envs canescente. El nmero de ores oscilan entre 3-10 , separadas 1-2 cm entre s , pednculos de 5-10 mm de largo. Cliz con dientes subulados, corola lilcea. Voucher: M. Zrate 370 (Bolv).
Hbitat
Pas (es) de Regin Sub-andina: Argentina, Bolivia, Colombia, Ecuador, Paraguay y Per. En Bolivia se encuentra en el bosque siempre verde estacional de la llanura beniana del Departamento de Cochabamba, a 300 msnm. Se desarrolla en suelos medio profundos, textura franco arcillosa, poco frtiles y semi-hmedos. Tambin se encuentra en Beni, La Paz, Santa Cruz y Tarija distribuidos entre los 200 a 3200 msnm (James C. Solomon & M. Uehling, 1984; James C. Solomon, 1987; T.J. Killeen, 1994; C. Paz & J. Humaday, 1996; Isrrael G. Vargas, 1997, citados en el Ann. of the Missouri Botanical Garden).
Sitio de recoleccin
Especie colectada en Puerto Villarroel, Provincia Carrasco.
Florece desde Enero hasta Abril, luego se forman los frutos. Su multiplicacin es a travs de semillas.
Propiedades y usos
Especie melfera con ciertas propiedades medicinales. Las hojas y ores frescas se usan en infusin para aliviar dolores estomacales y para la evacuacin de gases intestinales.
Resultados de la Evaluacin Antioxidante EC1 Beta caroteno: DPPH: **** EC2 FHX FC3 FAC FOH
181
Piper aff. pilirameum C. DC. PIPERACEAE Matico (Espaol) Sinonimia botnica Piper pilirameum fo. Bc. DC. Ref. Yuncker, T.G., 1953. Descripcin de la planta
Arbustos o pequeos rboles de 2-4 m de alto, internudos de 3-6 cm de largo, villosos, pelos de 1mm o ms de largo. Hojas anchamente ovadas, pice acuminado y redondeado, base obtusa o abruptamente sub-aguda, u ocasionalmente ligeramente cordada. Glabras con el envs glauco , 8-14 ocasionalmente arriba de 19 cm de ancho x 18-35 cm de largo. Espigas de 3-4 mm de grosor x 8-12 cm de largo; pednculo de 5-15 mm de largo, villoso, brcteas triangulares redondeadassubuladas, pilosa; fruto sub-globoso lateralmente comprimido, glabro, estigma tres. Voucher: M. Zrate 405 (Bolv).
Hbitat
Pas (es) de Regin Sub-andina: Bolivia. Especie propia del bosque hmedo siempre verde estacional de la llanura beniana del Departamento de Cochabamba. Se desarrolla en suelo supercial a poco profundo, franco areno-arcilloso, sub-hmedo y con un contenido medio de materia orgnica. Se encuentra en lugares planos e iluminados. Crece con frecuencia en los bordes de camino y terrenos chaqueados. Esta especie tambin fue identicada en La Paz, Pando y Santa Cruz entre los 200 a 2200 msnm (James, C. Solomon, 1988; D.N. Smith, G. Quintana & C,. Negrete, 1989; L. Arroyo, 1996, citados en el Ann. of the Missouri Botanical Garden).
Sitio de recoleccin
Especie colectada en Colonia Tarija, Valle del Sajta, Provincia Carrasco, a una altitud de 300 msnm, con las coordenadas.
Presencia de espigas orales por madurar en los meses de Abril a Mayo. En su ambiente natural se multiplica por semillas.
Propiedades y usos
Especie aromtica, sin usos especcos en la zona.

+++++
EC2
++++
FHX
+++++
FC3
FAC
+++++
FOH
***
182
Piper cf. heterophyllum Ruiz & Pavn PIPERACEAE Matico Rugoso (Espaol) Sinonimia botnica Artanthe heterophylla (Ruiz & Pav.) Miq., Artanthe punctata Mic. Piper dispasum Ruiz & Pavn, Piper suspectum Tret. Schilleria heterophylla (Ruiz & Pavn) Kunth Ref.: MacBride, J.F.; Brako, L & J. L. Zarucchi, 1993. Descripcin de la planta
Arbusto hasta 3.5 m de altura. Hojas leucantes y ntidas cuando secas, ovado elpticas o lanceoladas, (10)20-30 x (5)7-11 cm, base asimtrica o simtrica; venas secundarias 5-7(9) pares, arqueadas hacia el pice. Espigas reexas, brcteas sub-triangulares y peltadas, densamente cinreas, mbriadas; anteras con conectivo desarrollado, separando completamente las tecas; estigmas y ssiles. Infrutecencia (40)100-210 x 5-6 mm. Voucher: M. Zrate 383 (BOLV).
Hbitat
Pas (es) de Regin Sub-andina: Bolivia, Brasil, Colombia, Ecuador y Per. En Bolivia esta especie es propia del bosque hmedo siempre-verde estacional de la llanura beniana del Departamento de Cochabamba. Crece en un suelo supercial a poco profundo, franco areno-arcilloso, sub-hmedo y con poco contenido de materia orgnica. Se halla en lugares abiertos, bordes de camino y terrenos chaqueados. Se la ha identicada tambin en Beni, La Paz, Pando y Santa Cruz, de 125 a 700 msnm.
Sitio de recoleccin
Esta especie fue colectada en el trayecto a Bulo BuloPuerto Greter, Provincia Carrasco, a una altitud de 330 msnm.
Se observa con ores en los meses de Agosto hasta Noviembre. No se tienen datos de fructicacin. En su ambiente natural se multiplica por semillas.
Propiedades y usos
Especie aromtica, la infusin de las hojas sirve para aliviar dolores estomacales. Generalmente los arbolitos se utilizan como lea.
Resultados de la Evaluacin Antioxidante EC1 Beta caroteno: DPPH: ***** EC2 FHX FC3 FAC FOH
183
Piper peltatum L. PIPERACEAE Matico (Espaol) Sinonimia botnica Heckeria peltata (L.) Kunth, Heckeria scutata Kunth, Heckeria speciosa Kunth, Lepianthes peltatum (L.) Raf., Piper pruinosum Kunth Piper speciosum Kunth, Pothomorphe peltata (L.) Miq. Pothomorphe tecumensis Trel. Ref. Brako, L & J.L. Zarucchi, 1993; Tebbs, M.C. , 1993: Jorgensen, P.M. & S. Len Yanez, 1999. Descripcin de la planta
Arbusto de 2 m, glabros o puberulos, hojas orbiculares, peltadas, 16-40 cm de dimetro, pice acuminado; venacin campildroma, 6-9 espigas, agrupadas en umbelas sobre un pednculo axilar; or con estambres 2; estigmas 3, ssiles. Drupas diminutas y piramidales. Voucher: M.Zrate 338 (Bolv).
Hbitat
Pas(es) de regin sub-andina: Bolivia, Brasil, Colombia, Ecuador y Per. En Bolivia, se halla en Beni y Santa Cruz, entre los 200 a 250 msnm (Williams,D. Et.al., 1989: M.Saldas, L.Arroyo, 1993, Ann. of the Missouri Botanical Garden). Esta especie es propia de bosques hmedos siempre-verdes de la llanura beniana del departamento de Cochabamba. Se encuentra en la vegetacin del bosque secundario a 270 msnm, en suelo supercial, plano, textura franco arcilloso, poco frtil y algo pedregoso.
Sitio de recoleccin
La especie fue colectada en Colonia Volcn, Bulo Bulo, en terrenos chaqueados y bordes de camino iluminados, a una altitud de 270 msnm. Fenologa y Reproduccin
Florece en Diciembre. No existen datos de fructicacin. Su multiplicacin es mediante semillas. Propiedades y usos
Especie aromtica con propiedades medicinales. Las hojas se usan como cataplasma para hinchazones y para aliviar quemaduras. Bebidas en infusin alivian dolores dentales y de la cabeza.

+++++
EC2
FHX
++++
FC3 *****
FAC ****
FOH
+++
*****
184
Polygonum punctatum Elliot POLYGONACEAE Sinonimia botnica Persicaria punctata (Elliot) Small, Polygonum acre Kunth Polygonum epilobioides Wedd., Polygonum hydropiperoides Puersh Polygonum robustius (Small) Fernald Ref. Duke, J.A., 1960: Wiggins, J.L. & D.M. Porter, 1971; Zuloaga, F., 1997. Descripcin de la planta
Hierba de tallos rastreros; hojas alternas, cortamente pecioladas , lanceoladas glabras de 5-15 cm. de longitud, con creas escariosas ciliadas; perigonio con puntuaciones glandulares oscuras, blanco verdoso, de 3-3,5 mm de longitud. Flores fasciculadas en las axilas, racimos laxos e interrumpidos formando falsas espigas lineares. Voucher: M. Zrate 346 (Bolv).
Hbitat
Pas (es) de Regin Sub-andina: Argentina, Bolivia, Colombia, Ecuador, Paraguay, Per y Venezuela. En Bolivia, la especie se encuentra tambin en el Beni y Santa Cruz, a 150-2740 msnm (R. Frey, P. Bettella & R. Quevedo, 1990; James, C & Solomon, 1985; E. Gutirrez, 1996; De La Barra, 1998 citados en el Ann. of the Missouri Botanical Garden). Esta especie es propia del bosque pluvial andino de la vertiente oriental sub-andina del Departamento de Cochabamba. Se desarrolla en suelos poco profundos, semi-hmedos, poco frtiles y de textura franco areno-arcillosa.
Sitio de recoleccin
Especie colectada en Ismael Montes, Provincia Chapare, a una altitud de 330 msnm.
Inicia su oracin en Febrero y se extiende hasta Mayo. Presencia de frutos en Junio a Septiembre. Su multiplicacin es a travs de semillas.
Propiedades y usos
Especie con propiedades medicinales. Las hojas en infusin alivian dolores estomacales, disenteras y para corregir afecciones cardacas; en decoccin acta como diurtico. Se usan como cataplasma contra mordeduras de serpientes.
Resultados de la Evaluacin Antioxidante EC1 Beta caroteno: DPPH: EC2 FHX FC3 FAC FOH +++
185
Alonsoa acutifolia R. & P. SCROPHULARIACEAE Sinonimia botnica Alonsoa acutifolia subsp. diversifolia. Lpez Guillen Ref. Brako, L & J.L. Zarucchi, 1993 Descripcin de la planta
Hierba anual o bienal de hasta 70 cm de altura, tallo erecto, anguloso, poco ramicado. Hojas opuestas pecioladas o verticiladas, ovalada-lanceolada, de 5 x 1,5 cm, de borde aserrado. Flores axilares y terminales de color naranja intenso y amarillo, ptalos aplanados. Voucher:M. Mercado 1822 (BOLV).
Hbitat
Pas (es) de Regin Sub-andina: Bolivia, Per y Venezuela. En Bolivia esta especie se encuentra en cabeceras de valle de la pradera alto-andina de la regin alto-andina y de puna del Departamento de Cochabamba, a 3500 msnm. Crece en lugares abiertos, iluminados, planos a ligeramente inclinados. Se encuentra en bordes de camino, terrenos en descanso y prxima a parcelas cultivadas. El suelo donde se desarrolla es medianamente profundo, semi-hmedo, de textura franco limosa, con un contenido medio de materia orgnica y poco pedregoso. La especie ha sido tambin identicada en La Paz, distribuyndose en un rango altitudinal de 2900 a 4050 msnm ( J.C. Salomn, 1981; M. Lewis, 1988; D.N. Smith, 1989, citados en el Ann. Of the Missouri Botanical Garden).
Sitio de recoleccin
La especie fue colectada en la comunidad Icoya, Kami Independencia, Provincia Ayopaya, en colinas de pendiente suave, bordes de camino y parcelas en descanso, a una altitud de 3500 msnm.
Florece en Diciembre. No se tienen datos de fructicacin. En su ambiente natural se multiplica por semillas.
Propiedades y usos
Especie aromtica con algunas propiedades medicinales. Las hojas frescas en decoccin alivian dolores dentales. As mismo, se emplean las hojas frescas en forma de cataplasma contra las contusiones.
Resultados de la Evaluacin Antioxidante EC1 Beta caroteno: DPPH: *** EC2 FHX FC3 FAC FOH
186
Aloysia gratissima (Gillies & Hook) Tron. VERBENACEAE Kutu Kutu (Quechua) Sinonimia botnica Aloysia lycioides Cham, Lippia lycioides (Cham) Steud Verbena gratissima Gillies & hook Ref.: Troncoso, N.S., 1979; Zuloaga, f., 1997. Descripcin de la planta
Arbusto de 1-3 m de altura, aromtico, ramoso, ramas rgidas, rectas y sub-pinescentes en el pice. Hojas opuestas o en fascculos, elpticas, oblongo-lanceoladas u obovadas, de 0.5-3.5 cm de longitud por 0.2-0.8 cm de ancho, agudas u obtusas. Inorescencia en racimos especiformes axilares, solitarios o geminados o en panojas mutantes. Flores blancas fragantes, verticiladas o sub-verticiladas. Brcteas obovadas, apiculadas, sub-cncavas en la base, caducas, de 0.8-1 mm de longitud. Cliz con dientes subulados, pubescentes y tubo densamente villoso, resinoso-punteado, de 2.3-2.7 mm de longitud. Corola glabra exteriormente y en la base de los lbulos densamente villosos, de 4-5 mm de longitud. Fruto cilndrico de 1.5 mm de largo. Voucher: M. Mercado 1804 (Bolv).
Hbitat
Pas (es) de Regin Sub-andina: Bolivia, Ecuador y Paraguay. En Bolivia esta especie se encuentra en los valles y cabeceras de valle de los matorrales micro-foliados y restos de bosque caducifolio de la regin de los valles secos interandinos del Departamento de Cochabamba. Crece con frecuencia en laderas, riberas de quebradas, generalmente lugares abiertos e iluminados, en suelos superciales a medianamente profundos, de textura franco areno-limosa, pedregosos, secos a semi-hmedos.
Sitio de recoleccin
Especie colectada en la Comunidad Tucma Baja, Mizque, Provincia Mizque, a una altitud de 2170 msnm.
Las hojas nuevas rebrotan despus del perodo de lluvias, se inicia la oracin a nales de Enero y continua hasta Abril. La formacin de semillas se inicia a nales de Abril.
Propiedades y usos
Especie aromtica con algunas propiedades medicinales. Las hojas son utilizadas en infusion para el desayuno y como mates para aliviar dolores estomacales, el tronco para la fabricacin del yugo (arado). Las ores se usan para estas populares, como misturas. Es una especie de gran importancia melfera.
Resultados de la Evaluacin Antioxidante EC1 Beta caroteno: DPPH: **** ***** **** EC2 FHX FC3 FAC FOH
187
Lantana camara L. VERBENACEAE Sinonimia botnica
Lantana aculeata L., Lantana armata Schauer Lantana glandulosissima Hayek, Lantana mista L.
Ref.Gibson, D.N. Et al,1993; Steyemark, J. Et.al, 1995; Jorgensen, P.M. & S. Len Yanez (eds.) 1999. Descripcin de la planta
Arbusto ramicado de 2 m de alto, tallos y ramas inermes o con aguijones. Hojas opuestas-decusadas ovales a oblongo-ovales, de 12-15 cm de largo y 2-6 cm de ancho, agudos o corto acuminados en el pice, agudamente estrechados o abruptamente redondeado en la base, crenado-aserrados el margen; peciolos de 7-12 mm de largo, acanalados por arriba. Inorescencias axilares, en cabezuelas siempre capitadas, globosas de 3 cm de largo, cliz delgado, 3 mm de largo, color amarillo anaranjado a rojo escarlata. Fruto en drupa carnosa, negra de 3 mm de dimetro. Voucher: M. Zrate 385 (Bolv).
Hbitat
Pas (es) de Regin Sub-andina: Bolivia, Brasil, Colombia, Ecuador, Paraguay y Per. En Bolivia esta especie se halla en el bosque hmedo siempre verde estacional de la llanura beniana del Departamento de Cochabamba, a 230 msnm, suelo supercial a poco profundo, franco areno-arcilloso, sub-hmedo y con un contenido medio de materia orgnica. Se encuentra inmerso en la vegetacin de sotobosque, lugares planos e iluminados. Crece con frecuencia en los bordes de camino y terrenos chaqueados. Tambin se la encuentra en La Paz, Pando y Santa Cruz, a 150-3300 msnm (E. Villanueva, C. Miranda & R. Foster, 1983; James C. Solomon, 1987, citados en el Ann. of the Missouri Botanical Garden).
Sitio de recoleccin
Especie colectada en el trayecto Entre RosValle del Sajta, Provincia Carrasco, a una altitud de 230 msnm.
Florece en Mayo. No existen datos de fructicacin. En su ambiente natural se multiplica por semillas.
Propiedades y usos
Especie ornamental con algunas propiedades medicinales, considerada txica, los frutos y hojas causan irritaciones en la piel; sin embargo, los lugareos usan las hojas maceradas en alcohol para dolores causados por reumatismo.
Resultados de la Evaluacin Antioxidante EC1 Beta caroteno: DPPH: *** ***** EC2 FHX FC3 FAC
++++
FOH *****
*****
188
Lantana magnibracteata Tronc. VERBENACEAE Janka Janka (Quechua)

Arbusto de 1-1.5 m de altura, ramas sub-tetrgonas, densamente incano hspidas. Hojas ovadas a sub-triangulares, de 2-7 cm de largo por 1.5-3.5 de ancho, de pice agudo y base truncada y atenuada en breve peciolo, dentadas a sub-crenadas, excepto en la base; sub-rugosas y escabriscula en el haz, densamente velutino-tomentosas, con pelos largos y suaves en el envs. Inorescencia en cabezuelas axilares, solitarias, largamente pedunculadas en las ramas principales. Flores blancas con fauce amarilla, el fruto es una drupa carnosa, color pardo oscuro de casi 3 mm de dimetro. Voucher: M. Mercado 1803 (Bolv).
Hbitat
Pas (es) de Regin Sub-andina: Bolivia. Especie que se encuentra en los valles y cabeceras de valle de los matorrales micro-foliados y restos de bosque caducifolio de la regin de los valles secos interandinos del Departamento de Cochabamba, a 2200 msnm. Crece con frecuencia en riberas de quebradas, bordes de camino, generalmente lugares abiertos e iluminados inmersos en la vegetacin arbustiva de la zona, en suelos superciales a medianamente profundos, de textura franco areno-limosa, pedregosos, secos a semi-hmedos.
Sitio de recoleccin
Especie colectada en bordes de camino y alrededor de terrenos cultivados de la Provincia de Mizque. Especie colectada en bordes de camino y alrededor de terrenos cultivados, a una altitud de 2200 msnm.
No se tienen datos sobre oracin ni fructicacin. En su ambiente natural se multiplica por semillas.
Propiedades y usos
Especie con propiedades insecticidas, las hojas machacadas en agua son utilizadas para fumigar algunos insectos del cultivo de la papa.

+++
EC2 ***
FHX
FC3
+++
FAC
+++
FOH
++++
*****
***
189
Lantana trifolia L. VERBENACEAE Verbena (Espaol) Sinonimia botnica Lantana maxima Hayek, Lantana trifolia var. geminata Loes Polygonum epilobioides Wedd., Polygonum hydropiperoides Puersh Polygonum robustius (Small)Fernald Ref. Jorgensen, P.M. & S. Len Yanez, 1999; Stevens, W.D., C. Ulloa; A. Pool & O.M. Montiel, 2001. Descripcin de la planta
Sufrtice de hasta 2 m de alto, tallos tetrgonos o hexagonales, escabroso-pilosos, hojas ternadas, opuestas o en verticilos de a 4; pecolos de 4-12 mm de largo; limbos mambranceos, reticulado-rugoso por el haz y muy escabroso, algo resinoso con pelos canescentes en el envs, oblongo a elptico-lanceolados u ovales acuminados en el pice, crenado-aserrados en el margen, atenuadas en la base. Inorescencia en espiga, cabezuela sub-globosa, luego cilndrica y alargada hasta 5 cm, densamente multiora. Brcteas lanceoladas u ovales. Corola color morado rosado. Fruto drupa de color prpura o verde violceo, de 2-3 mm. de dimetro. Voucher: M. Zrate 387 (Bolv).
Hbitat
Pas (es) de Regin Sub-andina: Bolivia, Ecuador, Paraguay, Per y Venezuela. En Bolivia se halla en el bosque hmedo siempre verde estacional de la llanura beniana de Cochabamba, se desarrolla en suelo supercial a poco profundo, franco areno-arcilloso, sub-hmedo y con un contenido medio de materia orgnica. Se halla inmerso en la vegetacin del sotobosque, lugares planos e iluminados. Se la encuentra tambin en el Beni, La Paz y Santa Cruz a 200-2550 msnm (Stephan G. Beck, 1986; M. Lewis, 1990; T. Killen, 1995; S. Arrazola, 1996, citados en el Ann. of the Missouri Botanical Garden).
Sitio de recoleccin
La especie fue colectada en parcelas del Fundo del Valle del Sajta, Provincia Carrasco, a una altitud de 220 msnm.
Florece de diciembre hasta marzo. Presencia de frutos de Febrero a Abril. Su multiplicacin es a travs de semillas.
Propiedades y usos
Especie ornamental con ciertas propiedades medicinales, se le atribuyen propiedades antiinamatorias, analgsicas y antipirticas. Tambin se utilizan las hojas como cataplasma para aliviar dolores causados por el reumatismo.
Resultados de la Evaluacin Antioxidante EC1 Beta caroteno: DPPH: 190

+++
EC2
+++
FHX
FC3
++++
FAC
++++
FOH *****
*****
****
*****
Lippia boliviana Rusby VERBENACEAE Tirka (Quechua) Sinonimia botnica Lippia integrifolia (Griseb.) Hieron Ref.: Zuloaga, F., 1997. Descripcin de la planta
Planta sub-leosa de 1.20 m de alto, hojas lanceoladas obtusas, sinuadas en la parte superior y opuestas de 30 x 6 mm, or pequea en espigas coniformes, las cuales se colocan en panculas de 10 cm, fruto capsular. Voucher: M. Mercado 1850 (Bolv).
Hbitat
Pas (es) de Regin Sub-andina: Bolivia. Especie distribuida en los valles bajos del Departamento de Cochabamba, de 2400 a 2700 msnm. Forma parte de los matorrales micro-foliados y restos de bosque seco caducifolio de la regin de valles interandinos. Crece en suelos de relieve plano y colinas de pendiente suave, en suelos superciales, pedregosos, de textura franco areno-limosa y con bajo contenido de materia orgnica.
Sitio de recoleccin
Especie colectada en la Comunidad Ucuchi, Provincia de Capinota, en laderas de colinas y bordes de camino, a una altitud de 2702 msnm.
Florece despus de las primeras lluvias, por lo general a nes de Diciembre hasta Marzo, se encuentra con frutos en el mes de Abril y parte de Mayo. En invierno, el follaje se seca totalmente. Se reproduce en forma natural a travs de semillas.
Propiedades y usos
Especie aromtica con algunas propiedades medicinales. Las hojas son utilizadas en infusiones para el desayuno y como mates para aliviar dolores estomacales. Las ramas son consumidas por el ganado ovino y caprino.
Resultados de la Evaluacin Antioxidante
EC1 Beta caroteno: DPPH:

+++
EC2 ***
FHX
+++++
FC3
FAC *****
FOH
191
Otras especies estudiadas, sin actividad
Familia ASTERACEAE EUPHORBIACEAE PIPERACEAE SOLANACEAE VERBENACEAE
Especie
Wulfa Baccata Ricinus communis Piper cf. Anonifolium Cestrum parqui Lippia alba
Bibliografa
BRAKO, L. & ZARUCCHI J.L., 1993, Catalogue of Flowering Plants and Gymnosperms of Per. CARDENAS, M., 1969, Manual de plantas econmicas de Bolivia, Ed. Icthus, Cochabamba, Bolivia. CORREA & BERNAL, 1990, Especies Promisorias de los Pases del Convenio Andrs Bello, Tomo V, SECAB, Bogot, Colombia, pp 565 . CUATRECASAS, J, 1968, Revista Acadmica de Colombia, pp 204. FLORA of Panam, 1973, Annals of the Missouri Botanical Garden. pp 60-70. GIRAULT, L., 1987, Kallawaya Curanderos Itinerantes de los Andes: Investigacin sobre Prcticas Medicinales y Mgicas. UNICEF, OPS, OMS, PL-480, ORSTOM, La Paz, Bolivia, pp 670. GUPTA, M. P., 1995, 270 Plantas Medicinales Iberoamericanas. Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnologa para el Desarrollo (CYTED), Ed. Presencia Ltda., Santa F de Bogot, Colombia, pp 615. JORGENSEN, P.M. & C. ULLOA, 1994, Seed Plants of the High Andes of Ecuador, AAU Reports, 34,pp 1 443. KILLEN, T.J., E. GARCIA & S. BECK, 1993, Gua de rboles de Bolivia, pp 1958. LOPEZ PALACIOS, S., 1977, Flora of Venezuela, pp 182. MONOGRAPHS in Systematic Botany from the Missouri Botanical Garden. MORETTI, C.; ARRAZOLA, S.; L. NAESSANY, 1990, Plantas Medicinales del Oriente Boliviano: Estudio Etno-botnico en el Trpico Cochabambino y sus Potencialidades Frmaco-botnicas, Serie Cientca: Vol. 1 (4), pp70. NORHEIM, T, 1996, Uso y Aprovechamiento Tradicional de Productos Forestales no Maderables, Programa de Bosques NativosSwed Forest, La Paz, Bolivia, pp 203. OBLITAS, P., 1969, Plantas Medicinales de Bolivia, Ed. Los Amigos del Libro, Cochabamba, Bolivia. PROBONA (Programa de Bosques Nativos Andinos), 1996, Ubicacin de los Bosques Nativos Andinos, Instituto Geogrco Militar, La Paz, Bolivia, pp53. SARAVIA, E. F., 1996, Estudios de la Vegetacin de las partes altas de las Provincias de Campero y Mizque, Cochabamba, Bolivia, pp 29.
192
STEYEMARK, J. et al., 1995, Flora of Venezuelan Guayana Project. TEBBS, M.C., 1993, Revision of Piper (Piperaceae) in the New World 3. The Taxonomy of Piper Sections Lepianthes and Radula, Bulletin of the Natural History Museum, London, 23 (1): pp 1150. TORRICO, G., PECA C., BECK S. & GARCIA, E., 1994, Leosas tiles de Potos, FAOGTZ, Potos, Bolivia, pp 467. UNZUETA, O., 1975, Mapa Ecolgico de Bolivia, Ministerio de Asuntos Campesinos y Agropecuarios (MACA), La Paz, Bolivia, pp 309. ZULOAGA, F., 1997, Catlogo de las Plantas Vasculares de la Argentina, Monographs in Sistematic Botany from the Missouri Botanical Garden.
193
Frutas Colombianas
Benjamn Rojano
brojano@perseus.unalmed.edu.co Universidad Nacional de Colombia. Departamento de Qumica. A.A. 3840, Medelln. Colombia.
El Mamoncillo Nombre cientco Melioccoca bijuga L. (de la familia de las sapindaceae). Origen y dispersin Melioccoca bijuga es originario de la regin Colombia-Venezuela-Guyana. Se encuentra tambin en la costa del Ecuador, en Amrica Central y en el Sur de Estados Unidos (4) Condiciones de desarrollo
Melioccoca bijuga es un rbol bastante resistente que puede medir hasta 25 metros. (1). No es estrictamente tropical y resiste un poco a las heladas. Crece en regiones con climas medios y clidos y es adaptado a regiones con poca lluvia (75-125 cm/ao). Melioccoca bijuga preere los suelos ricos y profundos, particularmente, los de origen calcaricos pero crece tambin sobre suelos muy pobres (se puede utilizar para repoblarlos.
Cultivo y cosecha
Generalmente, se da poco atencin al cultivo de esta fruta en cuanto a la fertilizacin o a la irrigacin. La fruta se desarrolla en racimos y se cosecha todo el racimo. Esta fruta no debe ser cogida prematuramente porque sino se vuelve negro pero se pueden conservar durante largo tiempo (4).
La fruta
El mamoncillo es de forma redonda con un dimetro de 2,5 cm (es la fruta la mas pequea de la familia de las Sapindiaceae). Es bien protegida en una cscara verde y delgada cuya apertura es fcil. La pulpa, viscosa y gelatinosa es de color amarilla y parece comprimida entre la cscara y la semilla que es muy importante. Es bastante difcil separar la pulpa y la semilla. La pulpa tiene un sabor dulce acdula. El mamoncillo se consume sobre todo sin preparacin. Se puede tambin consumir en bebidas refrescantes. A veces, para las frutas cuya pulpa es mas fcil separar de la semilla, se puede hacer mermelada o jalea.
194
DESCRIPCIN DE LAS PLANTAS / FRUTAS COLOMBIANAS
El Higo Nombre cientco Opuntia Ficus Indica L. (de la familia de las Cactaceae). Origen y dispersin Originario de tropical Amrica, Opuntia Ficus se encuentra en las zonas desrticas de Mxico y de frica del Norte. Existe de manera espordica en Colombia. (1-6). Condiciones de desarrollo
Opuntia Ficus Indica L. es un cactus que alcanza unos 5 metros de altura. Est formado de pencas que son porciones de tronco aplanadas y engarzadas una sobre otra a modo de hojas. Crece en los suelos pobres de los desiertos costeos y serranos. Necesita lleno sol y suelos muy secos.
Cultivo y cosecha
El cultivo de Opuntia Ficus Indica L. necesita poco cuidado, solo, a veces, poda (6). Las plantas son listas para producir de 2-3 aos despus de ser sembradas y se cosechan entre Enero y Marzo.
La fruta
El higo crece sobre los bordes de las pencas. De forma elptica y largo de unos 10 cm, tiene una piel de color verde o roja (segn su nivel de madurez) cubierta de pequeas espinas. La carne, de color amarillenta-rojiza contiene muchas pequeas semillas negras. De sabor dulce, el higo se come solo o con crema.
195
La Badea Nombre cientco Passiora quandrangularis L. (de la familia de las Passioraceae). Origen y dispersin Passiora quandrangularis es originario de tropical Amrica. Se encuentra desde Mxico hasta el Norte de Sur Amrica y tambin en India, Australia y las islas del Pacico (2). Condiciones de desarrollo
Passiora quandrangularis es un rbol, de 10-15m de altura. Crece en climas tropicales y necesita calor da y noche y mucha humedad (4). Tolera varios tipos de suelos pero se desarrolla mas sobre suelos frtiles, profundos y hmedos (pero bien drenados porque no soporta las inundaciones). El suelo debe ser cido a neutro: pH 6 (3). Crece hasta 1200m de altitud.
Cultivo y cosecha
Passiora quandrangularis es bastante resistente a las enfermedades y los insectos (3). Necesita irrigacin durante la estacin seca y fertilizaciones regulares en materia orgnica. Las frutas maduren en 62-85 das y se cosechan de Julio hasta Octubre cuando la piel de las frutas se vuelve amarilla en el pex. Cada rbol produce entre 25 y 35 frutas (4).
La fruta
La Badea es una fruta oblonga largo de 20-30cm y con un dimetro de 10-15cm. Su piel, lisa y brillante tiene un color verde amarillo. Dentro de un mesocarpio de 2,5-4cm, se encuentra una cavidad nica que encierre una pulpa verdusca y gelatinosa, salpicada de numerosas semillas platas y redondas. El mesocarpio, poco spido, casi no est consumido, a veces se hace jalea con l. La parte comestible es la pulpa gelatinosa que tiene un gusto dulce con un poco de acidez. Muchas veces se come simplemente la pulpa y las semillas con una cuchara despus de abrir la fruta, pero se puede hacer tambin jugos, sorbetes, postres (1).
196
El Zapote Nombre cientco Pouteria Sapota Jacq. (de la familia de las Sapotaceae). Origen y dispersin Pouteria Sapota es originario de la regin del Sur de Mxico- Norte de Nicaragua. Se encuentra tambin en Colombia, Ecuador, Venezuela y Brasil. Condiciones de desarrollo
Pouteria Sapota es un rbol sensible al viento y al fri que crece hasta 1500m de altitud. Se encuentra en regiones con lluvia moderada (178cm/ao) pero tolera bien los inundaciones. Le conviene suelos pesados y profundos pero puede crecer tambin sobre otros suelos.
Cultivo y cosecha
Pouteria Sapota no tiene que recibir mucho cuidado, solo es recomendado fertilizacin y irrigacin durante la estacin seca. Es difcil saber cuando las frutas son maduros: ellos tienen que empezar a colorarse en rojo. Son cogidos a la mano con cuidado y puestos en una castaas para no daarlos. Tienen que ser consumidos rpido porque potrean en algunos das.
La fruta
El Zapote tiene una forma ovoide o elptica y en punta en el pex. Su largura es de 7,5-22,8cm. Tiene una piel spera que se parece a madera. La piel y la pulpa sonde color rojo-anaranjado. La fruta contiene entre 1 y 4 semillas, tambin en forma de punta. Se consume muchas veces sin preparacin o tambin en mermeladas o heladas (4).
197
La Guayava Agria Nombre cientco Psidium acutangulum (de la familia de las Myrtaceae). Dispersin y condiciones de crecimiento Psidium acutangulum es un rbol de 8 13 metros que crece a bajas o medias elevaciones en las selvas de Amazona o en las montaas de Venezuela, Per, Ecuador y Colombia (4). Cultivos
Este rbol es bastante salvaje y poco cultivado, as es difcil conseguir datos. Solo existen algunos cultivos en Amazona. La cosecha se hace entre Octubre y Diciembre (4).
La fruta
La guayaba agria es una baya redondeada de 8 cm de dimetro. Tiene una piel liza de color verde amarillo. La pulpa, del mismo color, es semiblanda y contiene numerosas semillas distribuidas regularmente en la parte central que es mucho mas blanda que la periferia. De sabor muy cida, la guayaba agraria se consume sobre todo en jugos (1).
198
El Madroo Nombre cientco Rheedia Madruo Guttiferae (de la familia de las clusiaceae). Origen y dispersin Rheedia Madruo naci en la selva del occidente de Panam. Crece del sur de Mxico hasta Per (1). Condiciones de desarrollo
Rheedia Madruo es un rbol con mucha frondosidad que alcanza 3 metros. Es un rbol muy tropical que no soporta las heladas. No es muy exigente y tolera todos los tipos de suelos pero crece mas sobre suelos con pH altos. Tolera tambin tasas de sal altas.
Cultivo y cosecha
Rheedia Madruo es un rbol bastante salvaje y poco cultivado. Se cultiva solo en los jardines familiares as es difcil conseguir datos sobre esta fruta.
La fruta
El madroo es una fruta redonda, largo de 4 cm y ancho de 3 cm. Tiene un duro epicarpio amarillo de supercie sumamente spera cuya apertura es fcil. Este epicarpio contiene entre unos o tres semillas cubiertas con un arillo blanco que constituye la parte comestible. La pulpa tiene un gusto subacido muy agradable. Se consume sobre todo fresco, pero es bueno tambin en mermeladas.
199
El Hobo Nombre cientco Spondias Mobin L. (de la familia de las Anacardiaceae). Origen y dispersin Spondias Mobin es originario del Sur de Mxico. Se encuentra del Sur de Mxico hasta el Norte de Per pero tambin en frica, tropical, en India y en Indonesia. Condiciones de desarrollo
Spondias Mobin crece en regiones tropicales cuya temperatura media es alrededor de 24C. Es adaptado a las regiones hmedas y ridas (1) y crece hasta 1200 metros de altitud. Es un rbol que puede alcanzar unos 20 metros de altura y que prospera bien sobre suelos pobres (4).
Cultivo y cosecha
Spondias Mobin es poco cultivado. Es utilizado para hacer las cercas de las ncas, tanto para disfrutar de la frutas que de la umbra de este rbol (2).
La fruta
El hobo es una fruta de forma oblonga de unos 3-4 cm de largo. Tiene una piel delgada que contiene una semilla grande y una pulpa amarilla. Esta fruta de sabor dulce y ligeramente acidula est consumida en mayora sin preparacin, sobre todos por los nios. El jugo puede ser utilizado para hacer heladas o bebidas refrescantes (1).
200
La Guanbana Nombre cientco Annona muricata L. (de la familia de las annonaceae). Origen y dispersin Annona muricata es nativa de tropical Amrica. Se encuentra desde el Sur de Mxico hasta el Norte de Argentina, y tambin en el Sur de China, en Australia y en frica tropical (4). Condiciones de desarrollo
Annona muricata es un rbol de 4 a 7 metros de altura. Es muy tropical y no puede soportar algunos grados de helada. Crece en regiones con humedad moderada pero donde hay mucho sol y una temperatura media de 20-25C (1). Crece hasta una altitud de 300 metros (4) en lugares protegidos de los grandes vientos. Preere los suelos ligeramente cidos pero tolera bien el neutro (1).
Cultivo y cosecha
Annona muricata, como todas las Annonaceae necesita aireacin y drenaje del suelo. Necesita tambin fertilizacin, e irrigacin durante la estacin seca. Las frutas son muy atacadas por los aves y los insectos y necesitan ser protegidos. Annona muricata produce frutas durante todo el ao a razn de 20-24 frutas por rbol. La frutan se cogen cuando son verde-amarillos y para tener un gusto optimo deben ser consumido 5 o 6 das despus de la cosecha (4).
La fruta
La guanbana es muy grande (hasta 20cm de largura y un peso de 5-12 kilogramos). Es de forma ovoide o oblonga. Su piel, de color verde oscura es cubierta de numerosas eminencias mamiformes, suaves y discontinuas. La pulpa es de color crema, jugosa y suave al tocado. La fruta contiene numerosas semillas (hasta 200 por frutas ), de color negra y largas de 1,25-2 cm y que son separadas por segmentos brosos (1). De sabor subacida, la guanbana es deliciosa en jugos (con agua o con leche) o en heladas. Puede ser consumida tambin en cocktailes, en ensaladas o entero con una cuchara (4).
201
La Chirimoya Nombre cientco Annona cherimola Mil. (de la familia de las Annonaceae). Origen y dispersin Annona cherimola Mil. Es originario de la regin de Ecuador-Colombia. Se encuentra en Amrica del Sur de Mxico hasta Chile y Brasil, pero tambin en California, India, Norte y Este Afrecha. Condiciones de desarrollo
Annona cherimola Mil. Es un arbusto alto de 4-5m (1). Crece en regiones de altura media (entre 1500 y 2000 metros de altitud (1)) con una temperatura media de 17-20C (4). Preere los climas secos (127 cm/ lluvia /ao). Se desarrolla sobre suelos medios con una fertilidad moderada y un pH entre 6,5 y 7,6 (4).
Cultivo y cosecha
Annona cherimola Mil. Necesita enriquecimiento en materia orgnica e irrigacin para los rboles jvenes. Una eliminacin de las ramas bajas puede ser a veces necesaria (4). Las ores de este rbol son poca atractivas par los insectos, as se utiliza la polinizacin articial. Las frutas maduran en 9 semanas y se cosechan entre Agosto y Diciembre cuando su color est entre el verde oscuro y el amarillo. Tienen que ser cogidos con cuidado porque un dao en la supercie le da una coloracin oscura. Se deshidratan rpido lo que colorea su piel en morena, las frutas se vuelven as pocas atractivas pero eso no afecta ni la textura, ni el sabor (3). Lo mejor es consumirla 4-5 das despus de la cosecha (4).
La fruta
La chirimoya, de forma variable (redonda, cnica u ovale) tiene un dimetro de 15-20 cm para un peso entre 1-2 kg. Su piel blanda, delgada y de color verde-gris (se vuelven mas oscura con la madurez) se abre fcilmente y est formada de protuberancias lisas en forma de aeroles poligonales. Su carne, blanca, gruesa y cremosa contiene numerosas semillas. De sabor dulce, la chirimoya se come sobre todo sin preparacin con una cuchara para separar la carne de las semillas.
202
El Maraon Nombre cientco Anacardium occidentale L. Sin. de la familia (de las Anacardiaceae). Origen y dispersin Anacardium occidentale es originario del Brasil y se encuentra en Amrica tropical, de Mxico hasta Brasil y Per. Condiciones de desarrollo
Anacardium occidentale, alto de 6-10 metros, es bastante resistente y puede crecer sobre todo tipos de suelos y particularmente sobre suelos pobres de sabana con mucha arena y donde muchos rboles no pudieran desarrollarse. Se encuentra de las zonas tropicales muy secas hasta las selvas tropicales muy hmedas, pero especialmente en regiones costales con una temperatura anual entre 21 y 28C (4). Puede crecer hasta 1200 m de altitud (1).
Cultivo y cosecha
Anacardium occidentale no necesita mucha vigilancia. La primera cosecha se hace tres aos despus de sembrarlo. Las frutas maduran entre dos o tres meses. Cada rbol puede producir hasta 48 Kg de frutas por ao (800-1000 kg/ha) (4). Se puede hacer dos cosechas al ao (2).
La fruta
El maraon se compone de dos partes Un gran pednculo de color rojo o amarillo y que puede medir hasta 10cm (1). Esta parte es dulce pero de sabor poca agradable porque es demasiado astringente. Es mejor consumirla cocida porque crudo es custico (3). En el pice del pednculo, se encuentra una almendra reniforme que es envuelta por un epicarpio. Est nuez, tostada, es muy sabrosa. El Anacardium occidentale es utilizado en la medicina folklrica y la medicina homeoptica con utilizaciones muy diferentes segn las regiones. La parte mas comercializada es la nuez que se consume tostada como aperitivo. La fruta se consume entera, en mermeladas o en jugos (a veces fermentados). De la semilla se extrae tambin un aceite negro y viscoso que tiene muchas aplicaciones no alimentaras (4).
203
El Carambolo Nombre cientco Averhoa Carambola L. (de la familia de las Oxalidaceae). Origen y dispersin Averhoa Carambola es probamente originario de Ceiln. Se encuentra en el Sur de Asia, en Australia y en las islas del Pacico Sur, en frica tropical Oriental, en Sur y Central Amrica (4). Condiciones de desarrollo
Averhoa Carambola es un arbusto de 5-12 metros de altura y con una anchura de 20-30 cm que tiene ramas bajas, delgadas y exibles. Necesita mucho sol y mucha lluvia repartida sobre todo el ao. No soporta el viento y resiste poco a las heladas. Es poco tolerante tampoco a las inundaciones as necesita un drenaje importante y una irrigacin moderada durante la estacin seca . Crece hasta 1200 metros de altitud, sobre suelos cidos o neutros (pH 5,5-5,8) (4).
Cosecha
En buenas condiciones, la primera cosecha puede hacerse despus de dos aos despus de sembrarlo. Se puede hacer 3 cosechas por ao y cada rbol produce entre 45-146 kg de frutas / ao. La frutas maduran poco despus de la cosecha (4).
La fruta
La fruta, de 8-12 cm de largura y de 4-6 cm de anchura, es una baya con 4 o 5 celdas (con dos semillas en cada celda) lo que le da una forma de estrella (1). La pulpa es transparente y de color amarilla o verde clara segn las variedades. En efecto, existen dos variedades: una ms pequea, cida y de color verde y una mas grande, mas dulce y amarilla. As el gusto varia de muy cido hasta muy dulce segn las variedades. Este fruta se consume de diferentes maneras: en jugos (que son refrescantes por su acidez), en jalea o mermelada (para la variedad dulce), en aderezo para carnes (su forma es muy decorativa), en ensaladas, pasteles (4).
204
El Boroj Nombre cientco Borojoa Patinoi cuatr. (de la familia de las Rubiaceae). Origen y dispersin Borojoa Patinoi es originario del departamento del Choco (Colombia) y se encuentra sobre toda la costa Pacica Colombiana (5). Condiciones de desarrollo
Borojoa Patinoi se encuentra solo en la selva chocona. Es decir con temperaturas medias de 24C y muchas precipitaciones (unos 5000mm/ao) (5). Crece hasta 500 metros de altura sobre suelos pobres que se inunden con relativa frecuencia (2). Borojoa Patinoi mide hasta 5 metros de altura (5).
Cultivo y cosecha
Borojoa Patinoi no recibe mucha vigilancia durante su cultivo, es un rbol tpico de la huerta de la familia chocona. Puede producir hasta 50 frutas por rbol y por ao.
La fruta
El boroj es una baya muy grande de forma bastante redonda de unos 10 cm de dimetro. Tiene una piel de color verdoso y una pulpa parda y aceitosa, poco apetecible (1) Se consume sobre todo en jugos, particularmente en leche.
205
La Papaya Nombre cientco Carica Papaya L. (de la familia de la Caricaceae) Origen y dispersin Carica Papaya es originario de Amrica Central y se encuentra en todas las regiones tropicales entre las latitudes de 32 Norte y 32 Sur. Condiciones de desarrollo
Carica Papaya no es propiamente un rbol, no tiene corteza lignicada, as es mas un grande hierba de tamao entre 4-7 metros. El tronco es bastante blando y muy fcil de cortar. Crece hasta 1600m de altitud en regiones con mucha lluvia y con temperaturas media entre 22-25C y no soporta las heladas (1). Le necesita suelos profundos ricos en materia orgnica, con un pH de 5,5-6,7, pero este suelo no debe ser anegable: un anegamiento de 48h es letal para l porque su races pudren fcilmente (4).
Cultivo y cosecha
El cultivo de Carica Papaya L es bastante exigente y necesita fertilizaciones frecuentes. Las frutas se cogen cuando la piel est colorada a los 80%. En media, cada rbol produce 34 kg de fruta por ao. Generalmente, la planta produce durante 2 aos y est cortada a un metro del suelo el tercero ao (4).
La fruta
La papaya es una fruta de gran tamao que puede alcanzar 40 cm de largo y pesar hasta 8 kg. Es de forma oblonga. Tiene una piel tersa, de color verde-amarilla. Cada fruta contiene entre 400 y 600 semillas esfricas de 3-4mm de dimetro. La carne, de color anaranjada es muy jugosa y contiene poca bra. Tiene un sabor dulce y refrescante muy spida. Se consume fresca, o en blandas tejadas, en ensaladas, en dulce y en jugos (1).
206
El Mamey Nombre cientco Mammea Americana L. (de la familia de las Guttiferae). Origen y dispersin Originario de la parte Norte de Sur Amrica, Mammea Americana se encuentra del Sur de Mxico hasta Ecuador y el Norte de Brasil. Condiciones de desarrollo
Mammea Americana se encuentra en zonas tropicales hasta una altitud de 1000m. Es un rbol de 18-21m de alto, con un tronco de 0,9-1,2 m de dimetro. Preere los suelos profundos, ricos y bien drenados pero crece tambin sobre suelos de arena o calezos.
Cultivo y cosecha
Mammea Americana generalmente recibe poco cuidado durante su cultivo, solo a veces proteccin contra el fro. En Colombia se hace dos cosechas: una en Junio y otra en Diciembre pero el gran tamao de este rbol hace muchas veces la cosecha difcil. Cada rbol produce entre 300 y 400 kg de frutas/ ao. Muchas veces, la pulpa est despus condicionada en latas.
La fruta
El Mamey es una fruta pesada y dura, de forma bastante redonda que tiene un dimetro entre 10 y 20cm. Tiene una piel delgada de unos 3 mm y de color morena clara. La pulpa, anaranjada tiene poca bra y es muy jugosa. Contiene una semilla morena, de forma ovoide y larga de unos 6 cm. El Mamey es dulce con un sabor parecido al abrcot. Se come sin preparacin o en ensaladas con azcar o crema.
207
La Ciruela Nombre cientco Spondias Purpurea L. (de la familia de las Anacardiaceae). Origen y dispersin Spondias Purpurea es originario del Sur de Mxico y se encuentra de esta zona hasta Per y Brasil, en Filipinas y en Nigeria (4). Condiciones de desarrollo
Spondias Purpurea es un rbol que puede alcanzar unos 7 metros de altura (1). Crece en zonas con temperaturas medias de 24C y sobre todo en regiones que tienen una alternancia entre estacin hmeda y estacin seca (3). Se encuentra hasta 1200 metros de altitud y sobre todo tipos de suelos.
Cultivo y cosecha
Mientras que sea el mas cultivado de las Spondias (existen tambin S.Mobin, S.tuberosa y S.lutea) hay poco cultivos comerciales de Spondias Purpurea (solo algunos en Mxico y Venezuela). La fruta se desarrolla en racimos o de manera aislada y se cosecha de Junio hasta Diciembre (3).
La fruta
La ciruela es una drupa globulosa larga unos 3,5 cm y ancha de 2,5 cm. Tiene una piel lisa de color rojo brillante cuando est en llena madurez. Contiene una semilla de tamao grande que la imita en su forma oblonga. La pulpa, de color amarilla tiene un gusto bastante cido (1). Se consume sobre todo sin preparacin, a veces acompaando por azcar (4).
208
La Pomarossa Nombre cientco Syzygium Jambos L. (de la familia de las Myrtaceae). Origen y dispersin Syzygium Jambos es originario de las indias orientales. Se cultiva tambin en India, en Asa del Sur Este en las islas Pacicas y en Sur Amrica de Mxico hasta Per. Condiciones de desarrollo
Syzygium Jambos es un rbol alto de 7,5-12 m con ramas muy largas (muchas veces su anchura es mas importante que su altura) (4). Crece solo en climas tropicales y necesita una temperatura media de 22C. Puede crecer hasta una altura de 2300m. El suelo mejor para l son suelos limosos y profundos pero l orece tambin sobre suelos con mucho menos materia orgnica (1).
Cultivo y cosecha
Muchas veces los rboles de Syzygium Jambos no reciben mucha atencin. Los rboles producen frutas 4 aos despus de ser plantados. Cada rbol produce hasta 2 kg de fruta por rbol, lo que es muy poco para un rbol que toma tanto espacio. Las frutas se cosechan a la mano y deben ser consumidas prontamente (4).
La fruta
La pomarrosa de 3-4 cm de largo y de 2,5-3cm de ancho es de forma mas o menos redonda. Su pericarpio es de color blanco rosado. Dentro de la fruta existe una cavidad donde se encuentra uno o dos pares de semillas adosados pero sueltos (1). La pomarrosa tiene un sabor perfumada de ptalos de rosa. Esta fruta se vende poco sobre el mercado y tiene un consumo ms local, sobre todo por los nios. Se consume principalmente sin preparacin o en mermeladas. Se puede tambin hacer jarabe con ella (4).
209
La Pera de Malacca Nombre cientco: Syzygium Malaccense L. (de la familia de las Myrtaceae). Origen y dispersin Syzygium Malacccense es originario del archipilago de Malaya. Se encuentra tambin en Filipinas, Asia del Sur Este, India, Este frica y de manera espordica en Amrica Central y en el Norte de Amrica del Sur (4). Condiciones de desarrollo
Syzygium Malaccense es un rbol de 15-18m (1) que crece hasta 2740m de altitud (3). Se desarrolla en climas tropicales hmedos (mnimo 1525cm de lluvia/ ao) y sobre suelos que van de la arena al barro. Tolera un poco el cido (4).
Cultivo y cosecha
Syzygium Malaccense necesita poco cuidado: solo un poco de fertilizacin y irrigacin durante la estacin seca. Los rboles orecen dos o tres veces al ao y las frutas maduran en 60 das. Crecen en racimos muy abudantes y se cosechan a la mano para no daarlos. Cada rbol puede producir entre 21-85 kg de frutas/ ao (4).
La fruta
La perra de malacca es de forma oblonga y larga de 4-5cm y de una anchura de 2,5-7,5 en el pex. Tiene una piel rosa o muy roja (segn su madurez). La carne es blanca, jugosa y esponjosa. Contiene una semilla nica y morena clara, formada por varios embriones (1). De gusto dulce acidulo, la perra de malaca se consume muchas veces sin preparacin mientras que no sea muy spida. Se consume tambin en jalea, postres o cocinada con otra fruta en Asa. En puerto rico se hace vino con esta fruta (4).
210
El Tamarindo Nombre cientco Tamarindo indica L. (de la familia de las Caesalpiniaceae) Origen y dispersin El Tamarindo indica es originario de frica tropical (de la regin del Sudan). Se encuentra tambin en Arabia, India, Asa y en Amrica Central y del Sur. Condiciones de desarrollo
Tamarindo indica es un rbol de 24-30m que resiste muy bien al viento. Crece en climas clidos pero necesita una estacin seca durante el periodo de fruticamiento. Crece hasta 600m de altitud y es muy tolerante en cuanto al suelo (4).
Cosecha
Las frutas maduran en 6 meses. Se coge la fruta al a mano y muchas veces se separa la fruta de la semilla. Un rbol maduro puede producir entre 150 y 225 kg de frutas por ao (4).
La fruta
Los tamarindos son parecidos a un frjol e irregulares, tienen una largura de 2-7 cm y un dimetro de 23,2 cm (4). La pulpa semiblanda y muy cida (contiene mucho cido trtrico) constituye entre 30-40% de la fruta. Esta pulpa envuelta semillas que representan un volumen importante de la fruta (30-40%) y que son dispuestas a lo largo de una venia gruesa y frgil. La envuelta y las bras representan los 11-30 % de la fruta (1). La fruta se come en su forma natural o despus una transformacin en pulpa comprimida. Puede tambin ser utilizada como ingrediente de salsas y es excelente en jugos (que son muy refrescantes debido a su acidez).
211
Composicion quimica de las diferentes frutas
212
Bibliografa
(1) E: SARMIENTO GOMEZ, Frutas en Colombia, 1986, Ediciones Cultural. (2) R. ROMERO CASTAEDER, Frutas silvestres del Choco, 1985, Instituto Colombiano de cultura Hispnica, Ediciones de la segunda expedicin botnica. (3) S. NAGY, P.E. SHAW, W.F. WARDOWOKI, Fruits of tropical and subtropical origin, Composition, properties and uses, 1990, Florida science source inc. (4) J. MORTON, Fruits of warm climate, 1987, Miami FL. (http://www.hort.purdue.edu/newcrop) (5) http://museolili.cuao.edu.co/elboro.htm (6) http://perued.com/worldperu//99/Mbcacteaceas/opuntia_cus_indica.htm (7) ICBF (Instituto Colombiano de Bienestar Familial) Tablas de composicin de alimentos Colombianos, 1996
213
Plantas Paraguayas
Edelira de Velzquez
edelira@qui.una.py Facultad de Ciencias Qumicas. Universidad Nacional de Asuncin Casilla de correo 1055.Asuncin. Paraguay
Aristolochia giberti Hook Sinonimia botnica Aristolochia ipemi Parodi, Aristolochia esperanzae var. Cobra (Chodat) Chodat, Aristolochia esperanzae O. Kuntze var. Aristolochia cobra Chodat Nombre comn patito, ip-mi, buche de pavo Ref: Toursarkissian M, 1993, Zulema Ahumada. 1967 Descripcin de la planta
Planta volubles glabrescente con ramas cilndricas, estriado canaliculadas en seco y entrenudos pesudoestpulas de base cordada. Hojas con pecolo cilndrico, lmina suborbicular reniforme a veces subcordiforme, coricea con los lbulos basales redondeados, paralelos a divergentes con la parte media cuneada hacia el pecolo y el pice redondeado, a veces emarginado y poco apiculado. Flores solitarias, a veces dispuestas en cortos ramos oreros, pednculo ms ovario. Cpsulas oblongas a elipsoideas, transversalmente estriadas y rostradas. Semillas planas, aladas, en el dorso rugosas y con la nervadura media notable, ventralmente con una zona central cordiforme verrugosa. Voucher: M. Ortz 1455 (PAR)
Hbitat
Este de Brasil, Paraguay, Este de Argentina.
Sitio de recoleccin
Esta especie fue colectada en el Jardn de Plantas Utiles y Medicinales de la Facultad de Ciencias Qumicas.
Se reproduce de semillas
214
DESCRIPCIN DE LAS PLANTAS / PLANTAS PARAGUAYAS
Propiedades y usos
Races y hojas machacadas y maceradas en alcohol se utiliza en fricciones para disminuir hinchazones y la infusin de las hojas se toma en caso de dolores estomacales.
Evaluacion del poder antioxidante

EXTRACTO CRUDO METANOLICO TECNICA UTILIZADA CCl4 / NaDPH DPPH FRACCIONES Acetato de etilo
RESULTADO ++++
RESULTADO ++++
215
Schinus terebinthifolia Engler Sinonimia botnica Schinus mollisii Engl., Schinus mucronulatus Mart. Schinus terebinthifolius var. Raddianus Engl. Nombre comn Molle Ref: J. De Dios Muoz. 1990 Descripcin de la planta
Arbusto o rbol con ramas jvenes pilosas o glabras. Hojas compuestas imparipinnadas glabras, con excepcin del raquis y nervio central de los foliolos que son pubescentes. Pecolo subcilndrico, esparcidamente pubrculo, segmentos del raquis angostamente alados. Foliolos ssiles, puestos, anchamente lanceolados y lustrosos en el haz, ligeramente asimtricos, agudos en el pice y cuneados en la base. Inorescencias: panculas axilares esparcidamente puberulentas, brcteas pequeas, deltoides- lanceoladas, pubrulas en el dorso, con pelos simples y con pelos capitados rojos en el margen. Flores: con pedicelos pubescentes, spalos deltoide-aovados, subagudos, pubrulos en la supercie externa, con pelos simples en el margen. Ptalos oblongos, obtusos, con el pice revoluto, pubrulos en la supercie externa, a veces con algunas cilias en el margen.. Flores estaminadas con 5 estambres y ores pistiladas con estambres reducidos y ovario globoso. Frutos: drupas esferoides rojizas de 0,5 cm de dimetro. Voucher: R. Degen 3507
Hbitat
Sur de Brasil, este del Paraguay, noreste de Argentina.
Sitio de recoleccin
Esta especie fue colectada en el trayecto en el Jardn de Plantas Utiles y Medicinales de la Facultad de Ciencias Qumicas.
Se ha coleccionado en or desde diciembre hasta abril y con frutos hasta junio.

EXTRACTO CRUDO METANOLICO TECNICA UTILIZADA DPPH Fe+2/ Ascorbato CCl4 / NaDPH Superxido DPPH FRACCIONES Acetato de etilo Acuoso
RESULTADO +++++ +++++ +++++ +++++ RESULTADO +++++ +++++
216
Schinus weinmannifolia Engler Sinonimia botnica Schinus lentiscifolius Marchand, Schinus weinmannifolius var, pauciorus Engl. Nombre comn Molle-, arue-i Ref: I. Basualdo, N. Soria, Rojasiana 1996,
J. de Dios Muoz, 1990

arbusto de hasta 1,50 m de altura, ramicado desde la base con ramas subleosas, delgadas. Hojas alternas, compuestas, imparipinnadas pubescentes en el enves. Inorescencias: panculas axilares paucioras, con el eje esparcidamente piloso. Flores en panculas axilares. Frutos drupas esferoides 5-6 mm. Voucher: M. Ortz 1453 (PAR)
Hbitat
Se distribuye en Brasil, Paraguay , Argentina y Uruguay, habitando principalmente en los campos.
Sitio de recoleccin
Se han coleccionado ejemplares en or desde setiembre hasta marzo y con frutos hasta mayo
Propiedades y usos
La sumidad orida y/o fructicada es preparada en infusin o decoccin para combatir la faringitis, amigdalitis y gingivitis. De las hojas se extrae esencia que contiene safrol

EXTRACTO CRUDO METANOLICO TECNICA UTILIZADA CCl4 / NaDPH Superxido DPPH FRACCIONES Acetato de etilo
RESULTADO +++++ ++++
RESULTADO +++++
217
Eugenia uniora L. Sinonimia botnica Eugenia michelii Lam., Eugenia lacustris Bar. Rodr.; Stenocalyx michelii (Lam.) O. Berg Nombre comn angapiry. Ref: Burkart, A. (1987), Lopez, J.A. (1987) Descripcin de la planta
Arbusto muy ramicado y globoso, tomando a veces el tamao y forma de un arbolito, hojas opuestas, glabras, subssiles, aovado-lanceoladas, de 2,5-5 cm de largo. Flores blancas de 1-1,5 cm de dimetro, dispuestas en largos pednculos axilares, unioros, fasciculados. El fruto es una baya, depreso-globosa de 2-3 cm de dimetro, rojo o purprea, con el pericarpio surcado longitudinalmente formando costillas. Voucher: M. Ortz 1492 (PAR)
Hbitat
Se distribuye en Brasil, Paraguay, Argentina y Uruguay. Crece en el bosque especialmente en sitios hmedos.
Sitio de recoleccin
Florece de agosto a setiembre y fructica en primavera. Se reproduce por semillas.
Propiedades y usos
La infusin de las hojas es aromtica y eupctica, se consume como diurtico dbil y agente y para disminuir el colesterol.
Evaluacin del poder antioxidante

EXTRACTO CRUDO METANOLICO TECNICA UTILIZADA DPPH Fe+2/ Ascorbato CCl4 / NaDPH Superxido DPPH FRACCIONES Acetato de etilo Acuoso Hexano RESULTADO +++++ +++++ +++++ +++++
RESULTADO +++++ +++++ ++++
218
Cecropia pachystachya Trec Sinonimia botnica Cecropia adenopus Mart Nombre comn Ambay Ref: I. Basualdo, N. Soria, M. Ortiz. 1996
Rojasiana Vol 3 (2) 1996 M P. Gupta, 1995.

Arbol de 8 a 10 m de altura, hojas palmadas o degitado-compuesta, discolor. Flores en espigas verticiladas protegida por una espatada caediza. Frutos muy pequeos reunidos en grandes receptculos carnosos, digitados. Voucher: I. Basualdo 1069 (PAR))
Hbitat
Brasil, Paraguay, Argentina, Bolivia, habitando principalmente en los campos
Sitio de recoleccin
Esta especie fue colectada en el Jardin de Plantas Utiles y Medicinales de la Facultad de Ciencias Qumicas.
Especie perenne.
Propiedades y usos
La infusin de las hojas se consume en forma de t como antitusgeno y anticatarral.
Qumica
La corteza contiene cecropina y cido tnico, mientras que las hojas ambana, ambainina, cecropina y cecropinina, cidos araqudicos, behnico, lignocrico, certico, estearico, margrico, nonadecanoico, pentacosanoico, - sitosterol, stigma-4- en3ona, - y - amirina.
EXTRACTO CRUDO METANOLICO TECNICA UTILIZADA DPPH Fe+2/ Ascorbato CCl4 / NaDPH Superxido DPPH FRACCIONES Acetato de etilo Cloroformo RESULTADO +++++ +++ +++++ +++
RESULTADO +++++ +++++
219
Balfourodendron redielianum Engler Sinonimia botnica Esenbeckia riedeliana Helietta multiora Engl. Nombre comn Guatambu Ref: R. Spichiger, L. Stutz de Ortega, 1987. Descripcin de la planta
Arbol de 10 a 20 m de altura, alcanzando 1 m de dimetro. El extremo de las ramitas Es verduzco, puberulento que se vuelve marrn-gris y arrugada longitudinalmente. Hojas opuestas o subopuestas, trifoliadas, ms numerosas en los extremos de las ramitas. Peciolo aplanado en la cara superior, puberulento. Pecilulos pubescentes. Limbos folialares papirceos, estrechamente ovales o estrechamente obovados o estrechamente elpticos, glabros menos el nervio principal que es puberulento por el envs. Inorescencias: panculas alcanzando 10 15 cm de largo, terminales o situadas en las axilas terminales. Flores blancas o blanco amarillenta. Frutos smaras aladas verdes al principio amarillas al secarse, cada ala tiene nervadura bien marcada y forma de disco truncado.
Hbitat
Brasil, Paraguay, Argentina
Sitio de recoleccin
Esta especie fue colectada en la ciudad de Altos, departamento de Cordillera
Floracin setiembre a diciembre, a veces hasta febrero. Fructicacin: junio y julio, a veces de octubre hasta marzo.
Propiedades y usos
La madera se utiliza como material de fabricacin de muebles.

EXTRACTO Fraccin Acetato de Etilo INHIBICIN BETA CAROTENO +++
220
Piper fulvescens DC. Sinonimia botnica Piper regnellii (Miq.) C.DC. Nombre comn yaguarundi Ref: I. Basualdo, N. Soria, 1996 Descripcin de la planta
Arbusto de 2 a 3 m de altura, hoja elptico obovada, peciolada, base subcordada, borde entero. Flores reunidas en espigas. Fruto baya Voucher: M. Ortz 998 (PAR.)
Hbitat
Brasil, Paraguay, Argentina. Habita sitios hmedos y poco soleados.
Sitio de recoleccin
Florece de marzo a diciembre y se reproduce por estacas
Usos
Las hojas se preparan en infusiones o decocciones y se consumen en forma de t como antitusgeno y expectorante

EXTRACTO CRUDO METANOLICO TECNICA UTILIZADA Fe+2/ Ascorbato CCl4 / NaDPH DPPH FRACCIONES Acetato de etilo
RESULTADO ++++ ++++
RESULTADO ++++
221
Euphorbia serpens HBK Sinonimia Botnica Chamaeyse serpens (Kunth) Small Nombres vulgares Tupasy Kamby (Paraguay), yerba meona(Argentina) Ref.: Burkart, A. (1987) Marzocca, A (1957) Descripcin de la planta
Es una hierba anual o bianual, rastrera, sumamente adherida al suelo, posee ltex, con tallos ramicados desde la base, hojas opuestas, cortamente pecioladas, orbicular-ovadas hasta levemente elptico-lanceoladas, obtusas, de mrgenes enteros y oblicuas, redondeadas a subcordadas en la base, de 2-8 mm. de largo por 3-4 mm. de ancho, verde oscuras o rojizas Ciatios axilares, solitarias, ores estaminadas 1-5, blancas El fruto es una cpsula, globosa, glabra, lisa de 1-1,5 mm. de largo con semillas ovoides, lisas y grisceas.
Hbitat
Brasil, Paraguay, Chile y Argentina. Crece en el campo.
Sitio de recoleccin
Esta especie fue colectada en el Departamento Central - Paraguay
Florece en el verano y se reproduce por semilla.
Propiedades y usos
Esta planta es utilizada en la medicina popular como diurtica. Consumida por animales lecheros, ocasiona disminucin de su produccin lctea y da a la leche y a sus subproductos olor y sabor desagradable.

EXTRACTO Fraccin Acetato de Etilo METODO DPPH +++++ INHIBICIN BETA CAROTENO +++++
222
Peltophorum dubium (Sprengel) Taubert Sinonimia botnica Pelthophorum vogelianum Walpers Caesalpinia dubia Sprengel Nombres vulgares yvyra pyta, Ibira pita (Argentina), rbol de Artigas (Uruguay), caa stula (Brasil) Ref Burkart, A. (1952) Lopez, J.A. (1987) Descripcin de la planta
Arbol de 10-25 m de altura de hojas alternas, bipinadas, grandes, peciolo y raquis pubescentes de 12-25 cm de longitud, pinas numerosas de 7-16 pares. Foliolos eliptico-oblongo. Inorescencia en racimo, reunidos en grandes panojas terminales, ores amarillas, ptalos libres, estambres 10, libres. El fruto es una vaina indeshiscente, plana, coricea, de contorno fusiforme. Semillas 1-3 en posicin longitudinal ovaloblongas de 1 cm de longitud
Hbitat
Sur de Brasil, Paraguay, Argentina y Sur de Uruguay. Crece en el bosque
Sitio de recoleccin
Esta especie fue colectada en la ciudad de Altos, departamento de Cordillera. Paraguay
orece de noviembre - mayo y fructica de abril diciembre y se reproducen por semillas.
Propiedades y usos
La madera es utilizada como material de construccin de viviendas, especialmente en techos-

EXTRACTO Fraccin Acetato de Etilo Crudo Metanlico Fraccin Acuosa METODO DPPH +++++ +++++ +++++ INHIBICIN BETA CAROTENO
+++
223
Tabebuia heptaphylla (Vell.) Toledo Sinonimia botnica Tabebuia avellanedae var paulensis Toledo Tabebuia ipe (Mart.ex K. Schum) Standl. Tabebuia eximia (Miq.) Sandwith Tecoma eximia Miq. Nombres vulgares lapacho colorado, tajy Ref. Burkart, A. (1987), Lopez, J.A. (1987), C. Desmarchelier, F.Witting (2000) Descripcin de la planta
Arbol de hasta 25 m de altura, de hojas caducas, palmaticompuestas, 5-7 folioladas, ovadas, glabras. Flores con la corola rosada. El fruto es una cpsula cilndrica.
Hbitat
Brasil, Paraguay, N y NE de Argentina,crece en bosques y es cultivada como ornamental.
Sitio de recoleccin
Esta especie fue colectada en Yvy Yau, Departamento de Pedro Juan Caballero Paraguay
Florece de mayo-julio y fructica de agosto-octubre y se reproduce por semilla.
Propiedades y usos
Las especies del gnero Tabebuia son utilizadas en el tratamiento de desrdenes urinarios, hepticos, respiratorios, ebres y reumatismo, en especial la corteza. En la corteza se identicaron algunas naftoquinonas, como el lapachol y varias lapachonas con actividad antibitica, analgsica, inmunomoduladora y antineoplsica. La madera es utilizada como material de construccin civil.

EXTRACTO Fraccin Acetato de Etilo Crudo Metanlico Fraccin Cloroformo INHIBICIN BETA CAROTENO +++ ++++ +++
224
Plantas Mediterrneas
Jos Luis Ros
Jose.L.Rios@uv.es Departament de Farmacologia, Facultat de Farmcia, Universitat de Valncia, Espaa
Helichrysum italicum (Roth.) G. Don ASTERACEAE Perpetua, sol de oro, siempreviva, helicriso Sinonimia botnica No tiene Ref.: Peris, J.B.; Stbing, G.; Romo A., 2001, Plantas Medicinales de la Pennsula Ibrica e Islas Baleares. Ediciones Jaguar: Madrid, pag. 190. Tutin, T.G..; Heywood, V.H.; Burges, N.A.; Moore, D.M.; Valentine, D.H.; Walters, S.M.; Webb, D.A., 1976. Flora Europea. Cambridge University Press: Cambridge, vol. IV, pag. 128-131. Descripcin de la planta
Pequeo arbusto de 20 cm a 30 cm de altura, leosa, sericeo-pilosa, canescente, de color gris blanquecino y olor fuerte caracterstico. Tallos erectos recubiertos de hojas lineares o espatulado-lineares, de hasta 4 mm de anchura, distribuidas regularmente a lo largo del tallo, de color blanco y tomentoso. Brcteas involucrales aplicadas e imbricadas regularmente, coriceas, las externas 3 a 5 veces ms cortas que las internas. El involucro es inicialmente cilindrico-ovoide de 2 mm a 4 mm de anchura y nalmente ovoide. Las ores amarillas estn dispuestas en inorescencia corimbiforme terminal compacta, formada por 25 a 30 ores. Voucher: Departamento Farmacologa, Universidad de Valencia, DF-01 (Espaa).
Hbitat
Camto sufruticoso frecuente en el rea mediterrnea. Crece en suelos secos formando parte de matorrales aclarados desarrollados en campos pedregosos abandonados y fondos de ramblas con abundancia de cascajos y cantos rodados sueltos. Puede vivir en los pisos de vegetacin Termo, Meso y Supramediterrneo, a cualquier altitud.
Sitio de recoleccin
Esta especie fue colectada en Chiva (Valencia, Espaa) en Julio de 1997.
225
Florece entre los meses de julio y octubre. No se tienen datos de fructicacin. En su ambiente natural se multiplica por semillas.
Propiedades y usos
Expectorante, antitusiva, colertica, antiinamatoria y antialrgica.

EXTRACTO CRUDO METANLICO Inhibicin de la peroxidacin TCNICA UTILIZADA lpidica de microsomas de rata: No Enzimtica Sistema Fe2+ / ascorbato Enzimtica Sistema Cl4C / NADPH Actividad captadora de radical libre: DPHH Anin Superxido Hidroxilo TCNICA UTILIZADA Quenching radical DPPH Sistema hipoxantina/XO/NBT Sistema Fe3+ - EDTA /H2O2/ascorbato
RESULTADO ++ ++ RESULTADO ND +++ +
226
DESCRIPCIN DE LAS PLANTAS / PLANTAS MEDITERRNEAS
Inula viscosa (L.) Aiton ASTERACEAE Olivarda, hierba mosquera, hierba pulguera Sinonimia botnica Dittrichia viscosa Greuter. Cupularia viscosa G. et G. Ref.: Font-Quer, P., 1982. Plantas Medicinales. El Dioscrides Renovado,Labor, Barcelona, pag. 788-790. Peris, J.B.; Stbing, G.; Romo A., 2001, Plantas Medicinales de la Pennsula Ibrica e Islas Baleares. Ediciones Jaguar: Madrid, pag. 185. Tutin, T.G..; Heywood, V.H.; Burges, N.A.; Moore, D.M.; Valentine, D.H.; Walters, S.M.; Webb, D.A., 1976. Flora Europea. Cambridge University Press: Cambridge, vol. IV, pag. 133-137. Descripcin de la planta
Planta herbcea perenne. Tallos leosos en la base, vscida, densamente glandulosa, de 40 a 130 cm de altura. Hojas inferiores de 30-70 mm a 2-30 mm, lineares a rectangular-lanceoladas, agudas y levemente denticuladas; las superiores son ssiles y semiamplexicaules. Captulos medianos e involucro de 6 mm a 8 mm. Las brcteas externas tienen de 1-2 0,5-0,7 mm, lineares-lanceoladas, agudas y erectas, las internas de 6-8 0,6-0,8 mm. Las lgulas miden de 10 mm a 12 mm notoriamente exceden al involucro. Aquenios vellosos. Voucher: Departamento Farmacologa, Universidad de Valencia, DF-05 (Espaa).
Hbitat
Crece en campos no cultivados, y prevalece sobre todo en tierras removidas y alteradas, desmontes y terraplenes, antiguos cultivos abandonados, ramblas ribazos y ruinas, con anidad por cierta proximidad humana. Habita en la mayor parte de la Pennsula e Islas Baleares, pero escasea o se pierde hacia el norte y noroeste. Se remonta hasta los 1200 m en Andaluca.
Sitio de recoleccin
Esta especie fue colectada en Torrent (Valencia, Espaa) en octubre de 1996.
Florece a partir de agosto, hasta otoo. No se tienen datos de fructicacin. En su ambiente natural se multiplica por semillas.
Propiedades y usos
Antipaldica, enfermedades de vas urinarias, vulneraria.

RESULTADO +++ ++ RESULTADO ND ++++ +
227
Phagnalon rupestre (L.) DC. ASTERACEAE Sinonimia botnica Phagnalon tenorii C. Presl Ref.: Mateo, G.; Crespo, M.B., 1990. Claves para la Flora Valenciana. Del Cnia al Segura: Valencia, pag. 133. Polunin, O., 1982. Gua de Campo de las Flores de Europa, Omega: Barcelona, pag. 504. Tutin, T.G.; Heywood, V.H.; Burges, N.A.; Moore, D.M.; Valentine, D.H.; Walters, S.M.; Webb, D.A., 1976. Flora Europea. Cambridge University Press: Cambridge, vol. IV, pag. 133.
Subarbusto perenne leoso erecto, mide hasta 30 cm de altura, los tallos y el envs de las hojas estn cubiertos de borra blanca, captulos de 1 cm aproximadamente, largamente pedunculados, solitarios, de color pardo amarillentos y globulares. Brcteas involucrales pardo brillantes, rgidas, secas y estrechamente aplicadas al captulo, las exteriores ovales y las interiores lineares. Hojas oblongo lanceoladas, de color verde, con borra a modo de telaraa por el haz, y blanco tomentosas por el envs, margen ondulado y ligeramente revuelto. Voucher: Departamento Farmacologa, Universidad de Valencia, DF-07 (Espaa).
Hbitat
Camto sufruticoso frecuente en el rea mediterrnea. Crece dispersa por las comarcas litorales y sublitorales de la cuenca mediternea. Se localiza en zonas de mediana a baja altitud, con clima termo y mesomediterrneo. Vive sin problemas en lugares que poseen un ombroclima desde semirido hasta subhmedo, siendo una especie helila que no precisa para su subsistencia de unas caractersticas especiales del suelo.
Sitio de recoleccin
Esta especie fue colectada en Sierra de Corbera (Valencia, Espaa) en junio de 1997.
Florece entre los meses de marzo y junio. No se tienen datos de fructicacin. En su ambiente natural se multiplica por semillas.
Propiedades y usos
Anestsico en odontologa, analgsico y antiasmtico.

EXTRACTO CRUDO METANLICO Inhibicin de la peroxidacin TCNICA UTILIZADA lpidica de microsomas de rata: No Enzimtica Sistema Fe2+ / ascorbato Enzimtica Sistema Cl4C / NADPH Actividad captadora de radical libre: DPHH Anin Superxido Hidroxilo RESULTADO +++ +++
TCNICA UTILIZADA Quenching radical DPPH Sistema hipoxantina/XO/NBT Sistema Fe3+ - EDTA /H2O2/ascorbato
RESULTADO ++++ ++++ ND
228
Scrophularia auriculata L. ssp. pseudoauriculata (Senn.) Bols et Vigo SCROPHULARIACEAE Falsa betnica Sinonimia botnica Scrophularia valentina Rouy Ref.: Peris, J.B.; Stbing, G.; Romo A., 2001, Plantas Medicinales de la Pennsula Ibrica e Islas Baleares. Ediciones Jaguar: Madrid, pag. 318. Tutin, T.G.; Heywood, V.H.; Burges, N.A.; Moore, D.M.; Valentine, D.H.; Walters, S.M.; Webb, D.A., 1976. Flora Europea. Cambridge University Press: Cambridge, vol. IV, pag. 345-350. Descripcin de la planta
Planta herbcea vivaz, perenne, glabra, de 50 cm a 100 cm. Tallo erecto, ramoso, cuadrangular con ngulos agudos, prolongados en expansin alar, de aproximadamente 1 mm de anchura. Hojas de 6 cm a 12 cm de longitud, alternas a lo largo del tallo, pasando de ovaladas a elpticas, pice obtuso y base subcardada hasta claramente cuneadas, margen crenado, a menudo con 1 2 pequeos lbulos basales, peciolo alado. Inorescencias en panculo, con ores ms o menos regulares y pequeas, de menos de 1 cm, rosadas o rojizas. Los pedicelos son aproximadamente igual de largos que las ores, cliz lobulado, redondo y con un ancho borde escamoso. La corola es verdosa, con el labio superior prpura pardusco y los ptalos soldados al menos en su base, en tubos de longitud variada. Los frutos son cpsulas de 4 mm a 6 mm, subglobosa y apiculada. Voucher: Jardn Botnico, Universidad de Valencia, VF06744 (Espaa).
Hbitat
Vive frecuentemente en terrenos encharcados, especialmente en mrgenes de ros, arroyos y acequias.
Sitio de recoleccin
Esta especie fue colectada en Poliny de Xquer (Valencia, Espaa) en mayo de 1996.
Florece entre los meses de marzo y julio. No se tienen datos de fructicacin. En su ambiente natural se multiplica por semillas.
Propiedades y usos
Antiinamatoria, dermatitis, lceras en la piel.

RESULTADO ++ ++ RESULTADO ND + +
229
Haplophyllum hispanicum Spach RUTACEAE Ruda macho Sinonimia botnica Haplophyllum linifolium (L.) G. Don l. Ref.: Peris, J.B.; Stbing, G.; Romo A., 2001, Plantas Medicinales de la Pennsula Ibrica e Islas Baleares. Ediciones Jaguar: Madrid, pag. 577 Suntibus, E.; Schweizerbar, T.; Willkom, M.; Lange, J., 1880, 1880. Prodromus Florae Hispanicae, vol. III, pag. 514. Tutin, T.G.; Heywood, V.H.; Burges, N.A.; Moore, D.M.; Valentine, D.H.; Walters, S.M.; Webb, D.A., 1976. Flora Europea. Cambridge University Press: Cambridge, vol. II, pag. 272-278. Descripcin de la planta
Planta de base leosa con tallos numerosos simples y erectos. Las hojas son ssiles, lanceolada-oblongas, las de las inorescencias son espatulado-lineares a lineares. Las ores en cimas verticiladas, simples o compuestas, de tipo umbeliforme, presentan un peciolo largo y ptalos obtusos, amarillentos y glandulosos. El fruto es una cpsula verrugosa, en cuyo interior hay semillas negras con supercie reticulada rugosa. Voucher: Jardn botnico, Universidad de Valencia, VAL3368 (Espaa).
Hbitat
Endemismo ibero-levantino que habita en matorrales y tomillares degradados (Rosmarino-Ericion y Thymo-Siderition), siendo frecuente en zonas litorales muy trmicas y poco pluviosas (ombroclimas secos y semiridos).
Sitio de recoleccin
Esta especie fue colectada en El Vedat de Torrent (Valencia, Espaa) en Julio de 1994.
Florece entre los meses de junio y septiembre. No se tienen datos de fructicacin. En su ambiente natural se multiplica por semillas.
Propiedades y usos
Irritatante, hiperpigmentacin, vitligo, leucodermias.

EXTRACTO CRUDO METANLICO Inhibicin de la peroxidacin TCNICA UTILIZADA lpidica de microsomas de rata: No Enzimtica Sistema Fe2+ / ascorbato Enzimtica Sistema Cl4C / NADPH
RESULTADO + ++
Actividad captadora de radical libre: DPHH Anin Superxido Hidroxilo
TCNICA UTILIZADA Quenching radical DPPH Sistema hipoxantina/XO/NBT Sistema Fe3+ - EDTA /H2O2/ascorbato
RESULTADO ND + +
230
Referencia +++++ ++++ +++ ++ +
CI50 (g/ml) < 1 g/ml 1 10 10 30 30 100 > 100
Bibliografa
G.R. Schinella, H.A. Tournier, J.M. Prieto, P. Mordujovich de Buschiazzo and J.L. Ros. Antioxidant Activity of Anti-Inammatory Plant Extracts. Life Sci. 70 (9): 10231033, 2002 A. Sala, MC Recio, RM Giner, S Mez, H Tournier, G Schinella, JL Ros. Anti-inammatory and anti-oxidant properties of Helichrysum italicum. J. Pharm. Pharmacol. 54 (3): 365-71, 2002 Sala A, Recio MC, Schinella GR, Mez S, Giner RM, Ros JL. A new dual Inhibitor of the Arachidonate Metabolism Isolated from Helichrysum italicum. Eur. J. Pharmacol. 460 (2-3): 219-226, 2003 Sala A, Recio MC, Schinella GR, Mez S, Giner RM, Cerd-Nicols M, Ros JL. Assessment of the Anti-inammatory Activity and Free Radical Scavenger Activities of Tiliroside. Eur. J. Pharmacol. 461 (1): 53-61, 2003 G.R. Schinella, H.A. Tournier, J.M. Prieto, P. Mordujovich de Buschiazzo and J.L. Ros. Antioxidant Activity of Anti-Inammatory Plant Extracts. Life Sci. 70 (9): 10231033, 2002
231
LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE 41 PLANTAS BOLIVIANAS

Alfredo Rosas Romero, Benjamn Rojano y Gloria Saavedra

Alfredo Rosas-Romero1, Benjamn Rojano2 y Gloria Saavedra3
arrosas@usb.ve 1 Universidad Simn Bolvar, Departamento de Qumica. Apartado 89000. Caracas 1080A. Venezuela. 2 Universidad Nacional de Colombia. Departamento de Qumica. A.A. 3840, Medelln. Colombia. 3 Centro de Tecnologa Agroindustrial, Facultad de Ciencias y Tecnologa, Universidad Mayor de San Simn, PO Box 992, Cochabamba, Bolivia.
Introduccin
La bsqueda de nuevas fuentes de antioxidantes naturales es consecuencia de la demostrada toxicidad de los antioxidantes sintticos y por la demanda industrial de que posean propiedades funcionales apropiadas para su incorporacin a los diversos productos comerciales, como por ejemplo que sean soluble en medios muy dismiles, que tengan una apropiada lipolicidad o hidrolicidad, que sean capaces de incorporarse y actuar en medios de muy diversas polaridades, en espumas, emulsiones y en la variada gama de condiciones industriales. Como consecuencia de tan exigentes requisitos no existe un compuesto panacea que satisfaga ni remotamente- todos los requerimientos industriales. Por esta razn, pensamos que la meta es proveer a la industria de la ms amplia posible gama de fuentes de antioxidantes naturales, de forma que dentro de esa variedad pueda seleccionar el antioxidante ms apropiado para cada aplicacin. En nuestro caso, escogimos trabajar con plantas bolivianas por ser esta una de las reas menos estudiadas de la amazonia occidental, por su formidable diversidad botnica y su muy importante cultura etnobotnica. Un reciente artculo de revisin sumariza este tema (Desmarchelier et al., 2000). Las plantas las recolectamos en diferentes regiones del altiplano boliviano, las identicamos y depositamos un especimen en el Herbario Nacional de la Flora Martn Crdenas, en Cochabamba, Bolivia.
235
Informacin completa sobre las plantas aparece en la seccin Descripcin del Material Vegetal. Cribamos 41 plantas Bolivianas. De cada una de ellas preparamos un extracto metanlico que particionamos secuencialmente con solventes de polaridad creciente. As obtuvimos de cada planta un extracto (EC1), el extracto crudo desgrasado (EC2) y 4 fracciones: una hexnica (FHX), otra clorofmica (FC3), una de acetato de etilo (FAC) y nalmente una fraccin con los compuestos remanentes solubles en agua (FOH). Todos los extractos y las fracciones, seis muestras para cada una de las 41 plantas, fueron evaluados por dos tcnicas distintas. 25 especies aportaron por lo menos una fraccin con resultados altamente prometedores frente a la tcnica de la decoloracin del -caroteno en una emulsin de cido linoleico en agua. 33 plantas arrojaron muy buenos valores frente al ensayo del DPPH. Proponemos el uso simultneo de estas dos tcnicas para trabajos de tamizaje en busca de actividad antioxidante. La tcnica del -caroteno est muy bien relacionada con el fenmeno de la rancidez oxidativa bajo condiciones ambientales normales. Mientras que el ensayo del DPPH est mejor relacionado con los mecanismos in vivo, donde no es la absorcin de oxgeno el parmetro determinante. Finalmente, mediante el proceso de fraccionamiento obtuvimos una amplia gama de extractos y fracciones que cubren, entre ellos, el rango completo de polaridades, condicin que constituye el requisito industrial ms exigente en este campo. Una discusin reciente sobre las tcnicas para medir la capacidad antioxidante, su comparacin crtica y sus limitaciones, puede conseguirse en las siguientes publicaciones (Vandersluis et al., 2000; Arnao et al., 1999, Niki & Noguchi, 2000; Schwarz at al., 2001; Pannala & Rice, 2001; Antolovich et al., 2002; Koleva et al., 2002). Los dems detalles experimentales estn descritos en el captulo de El Diseo Experimental y en Rosas-Romero et al., 1999 y RosasRomero y Saavedra, 2003.
Resultados
Preparamos un extracto metanlico de cada planta, eliminamos el solvente a presin reducida, (produciendo EC1). Disolvimos EC1 en
236
la mnima cantidad de metanol, y lo disolvimos en agua. La solucin acuosa de EC1 la extrajimos secuencialmente con hexano para obtener la fraccin FHX, luego con cloroformo (FC3), acetato de etilo (FAC) y qued remanente una solucin acuosa (FOH). Al EC1 despus de extraerlo con hexano, lo llamamos EC2. As, para cada planta obtuvimos un extracto crudo y 5 fracciones. A todas estas muestras, 246 en total, les medimos la actividad antioxidante de acuerdo a dos tcnicas, la decoloracin del -caroteno y la del DPPH (2,2-di(4-ter-octilfenil)-1-picrilhydrazilo). Hemos seleccionado esas dos tcnicas para nuestro trabajo de cribado de la actividad antioxidantes en especies vegetales, porque requieren pequeas cantidades de muestra, arrojan resultados que son reproducibles y nos brindan informacin sobre la actividad antioxidante, desde dos puntos de vista distintos. La tcnica del -caroteno est muy bien correlacionada con el fenmeno global de la rancidez en grasas y aceites al trabajar a una temperatura cercana a la ambiente, con cido linoleico como sustrato, en una emulsin acuosa saturada con oxgeno; el mecanismo que se mide con esta tcnica es la formacin de hidroperxidos del cido graso, por el ataque del oxgeno al metileno situado entre los dos doble enlaces, en presencia de suciente cantidad de oxgeno para que no sea limitante. El medio de reaccin tambin contiene -caroteno, el cual perder su tpico color anaranjado mediante una reaccin acoplada con la oxidacin del linoleico, esta disminucin de la absorbancia la medimos espectrofotomtricamente a 497 nm y es la variable que relacionamos con el poder antioxidante. Le asignamos 100% de poder antioxidante a la inhibicin de la oxidacin del cido linoleico ocasionada por una solucin patrn de BHA puricado, que corremos como control en cada caso, y las dems muestras las expresamos como porcentajes de ese 100%. Ntese que esta tcnica mide explcitamente la actividad antioxidante como la disminucin de la velocidad de oxidacin de un sustrato el cido linoleico- en condiciones ambientes. Por su parte, la tcnica del DPPH est relacionada con la capacidad de la muestra para entrampar los radicales libres generados por el DPPH, en un ambiente altamente polar, a temperatura ambiente, en
237
ausencia de un lpido oxidable bajo las condiciones de trabajo, esto es, la tcnica del DPPH simula un sistema donde los radicales libres, y no la absorcin de oxgeno ni la reaccin de un sustrato oxidable, son los responsables de la oxidacin, sistema este ms bien parecido a las oxidaciones va radicales libres in vivo. A 550 nm medimos la disminucin de la absorbancia provocada por la desaparicin de los radicales del DPPH, y los resultados los representamos con el IC50, esto es, la concentracin requerida, en g/mL, para reaccionar con el 50% de los radicales producidos por el DPPH. De all que para que consideremos un extracto o fraccin como promisorio, no ser necesario obtener buenos resultados en ambas tcnicas. Buenos resultados con el -caroteno signica una buena capacidad para inhibir el fenmeno global de la rancidez oxidativa en grasas y aceites; pero la misma muestra puede arrojar pobres resultados con el DPPH, y resultados inversos tambin son comunes en la literatura (Brand-Williams et al, 1995). Nosotros proponemos el uso simultneo de estas dos tcnicas para los trabajos de monitoreo de la actividad antioxidante en fuentes naturales, porque de esa manera se obtiene una mejor informacin sobre la potencialidad de los extractos o fracciones que se estudien, y sobre su eventual aplicacin industrial; ya que la primera nos habla del poder antioxidante frente a los procesos de rancidez oxidativa, y con el DPPH identicamos los extractos o fracciones que tienen una alta capacidad para inhibir la accin de los radicales libres. El uso simultneo de estas dos tcnicas tambin contribuira a enfrentar el problema ocasionado por el uso, por los diferentes grupos involucrados con este tipo de trabajo, de una amplia variedad de tcnicas para medir la actividad antioxidante, con la consiguiente dicultad en el momento de comparar los resultados, tal como est claramente documentado en la literatura del rea (Arnao et al., 1999; Niki y Noguchi, 2000; Antolovich et al., 2002; y Koleva et al., 2002). En la TABLA 1 recopilamos todos los resultados de la evaluacin de los diversos extractos y fracciones segn las dos tcnicas. Ciento cuarenta y tres muestras, extractos o fracciones, resultaron activas a una de las dos tcnicas (de un total de 246 muestras).
238
239
Tcnica de la decoloracin del beta caroteno

Como no estamos trabajando con compuestos puros sino con extractos crudos y sus fracciones, hemos establecido que una muestra arroja buenos resultados cuando su actividad es mayor o muy cercana a 50% de la que presenta una solucin de la misma concentracin en peso, de BHA puro, al que le asignamos 100% de inhibicin. As, los mejores antioxidantes son aquellos con los mayores porcentajes de inhibicin de la oxidacin de linoleico, esto es, los que tienen mayores valores del % de actividad. En la TABLA 2 presentamos los resultados obtenidos para cada una de las muestras estudiadas, los valores que consideramos potencialmente interesantes, los hemos resaltado en negrita. 25 de las plantas produjeron al menos una fraccin con un alto valor de actividad antioxidante frente a la tcnica del caroteno. 45 fracciones o extractos resultaron activos.
240
241
Extractos Crudos (EC1)

El extracto crudo metanlico (EC1) dio muy buenos resultados en 8 de las plantas, ver TABLA 3. Esto es interesante porque nos indica la posibilidad de obtener buenos antioxidantes de inters industrial, con un mnimo de fraccionamiento, lo cual abaratara los costos de produccin, porque para obtener estos productos basta con extraer la parte area de la planta con metanol y eliminar el solvente.
Resaltan los valores de Piper pilirameum (92,0%), Piper peltatum (88,1%) y Mimosa lepidota (87,4%) que mostraron una actividad muy cercana al de una solucin de BHA puro, en las mismas condiciones experimentales. Es importante mantener presente que el extracto crudo EC1 es una mezcla de diversos compuestos, mientras que la solucin de BHA, contiene a este antioxidante comercial en estado puro; de all que un valor entre 95-80% probablemente indique la presencia de antioxidantes, que de estar ellos en estado puro seran bastantes ms potentes que el BHA. Le siguen en importancia, Lantana trifolia (63,3%), Lippia boliviana (62,0%), Mikania butchtienii (58,0%), Lantana magnibracteata (52,7%) y Plazia daphnoides (51,4%).
Extractos Crudos desgrasados (EC2)

Este extracto es el resultado de extraer con hexano, la solucin acuosa del extracto crudo metanlico desolventizado, por ello la
242
llamamos extracto crudo desgrasado. Los compuestos solubles en hexano conforman la fraccin siguiente, la hexnica (FHX). 5 plantas presentaron actividad mayor que 50% frente a esta tcnica, ver TABLA 4. Estas fueron: Piper pilirameum (74,6%), Lantana trifolia (59,2%), Mimosa lepidota (56,3%) y Tagetes maxima (54,3%), Senecio herzogui (51,7%).
Fraccin hexnica (FHX)

Con esta tcnica tambin tiende a cumplirse la tendencia mencionada en la literatura (Mensor et al, 2001), segn lo cual no se conseguir actividad antioxidante (AA) en la fraccin hexnica, TABLA 5. Aunque es cierto que la AA tiende a concentrarse en las fracciones polares, sin embargo, nosotros obtuvimos AA en 4 fracciones hexnicas: las de Lippia boliviana (86,6%), Piper pilirameum (79,6%), Piper peltatum (79,3%) y Mimosa lepidota (49,7%), de hecho el valor de la actividad antioxidante correspondiente a la primera, la Lippia boliviana, est entre los ms altos que obtuvimos en todo el estudio.
243
Fraccin Clorofrmica (FC3)

Esta es la fraccin que contiene los compuestos de polaridad media. 8 plantas resultaron activas, TABLA 6. Croton andinus (76,1%), Lantana trifolia (68,0%), Plazia daphnoides (63,3%), Lantana magnibracteata (62,2%), Ophryosporus heptanthus (59,1%), Mimosa lepidota (56,8%), Chromolaena tunariensie (56,5%) y Helogyne straminaceae (52,6%).
Fraccin de acetato de etilo (FAC)

Para las plantas que trabajamos, esta fraccin, la de los compuestos polares, es donde conseguimos el mayor nmero de muestras con actividad antioxidante. 12 plantas dieron actividad en FAC, TABLA 7. El mejor resultado lo arroj la Piper pilirameum con 88,3% de actividad con respecto al BHA. Tambin se observan buenos resultados en los extractos de Mimosa lepidota (76,0), Lantana trifolia (70,1%), Piper peltatum (68,4%), Lantana camara (64,6%), Tagetes maxima (60,7), Hedyosmun angustifolium (59.5%), Senecio herzogui (58.6%), Baccharis grisebachii (57,0%), Tessaria fastigiata (55,5%), Lantana magnibracteata (52,7%) y Baccharis salicifolia (49,0%).
244
Fraccin acuosa (FOH)

Los compuestos antioxidantes de alta polaridad estn en esta fraccin. 9 de las muestras acuosas resultaron activas, TABLA 8. La mayor actividad correspondi a la Mimosa lepidota con 85,1%. Luego dieron alta AA la Lantana magnibracteata (65,0%). Y les siguen: Croton andinus (59,4%), Piper peltatum (52,8%), Peltophorum dubium (52,4%), Lantana magnibracteata (52,2%), Mikania buchtieni (50,3%), Croton emporiorum (49,2%) y Buddleja tucumanensis (48,0%).
245
Los resultados hasta aqu presentados son muy interesantes porque para satisfacer la demanda industrial de nuevos antioxidantes, es necesario aportar nuevos compuestos que cubran la gama completa de polaridades, entre otras propiedades. Y vemos, como entre las diferentes plantas se cubre el espectro completo de polaridades.
Actividad captadora de radicales libres. Tcnica del DPPH

Los resultados para todas las muestras, empleando esta tcnica los mostramos en la TABLA 9. Debido a que el valor experimental que obtuvimos para el CI50 del BHA es 11.5 g/mL, y por las mismas razones que mencionamos al discutir la tcnica del caroteno, hemos establecido el lmite de 20 g/mL como el mximo valor de CI50 que puede tener una muestra para considerarla interesante para nuestro trabajo, estos valores los resaltamos en negrita en la TABLA 9. Con esta tcnica, los mejores antioxidantes tendrn los ms bajos valores del CI50. Como esperbamos, dado que esta tcnica mide la propiedad menos especca (con respecto al fenmeno de la rancidez) de capturar los radicales libres generados por el DPPH, conseguimos un mayor nmero de muestras con valores aceptables de CI50 (98) que con la tcnica del caroteno (52). 33 plantas resultaron activas, en comparacin con las 25 para el -caroteno Como suponamos, no existe una correspondencia biunvoca entre las dos tcnicas, debido fundamentalmente a que los ensayos miden diferentes causas, diferentes mecanismos de accin de los antioxidantes. Y sa es precisamente la ventaja de usar las dos tcnicas simultneamente.
246
247
Extractos crudos (EC1)

24 extractos crudos presentaron CI50 menores o muy cercanos a 20, TABLA 10. Agrupamos en un primer conjunto a aquellas plantas que dieron valores de CI50 menores que 10 g/mL, aqu encontramos a Plazia daphnoides (1,0), Tagetes maxima (3,9), Mikania buchtienii (4,8), Piper cf. heterophyllum (5,4), Tessaria dodoneafolia (6,5), Senecio herzogui (6,7), Erechtites valerianaefolia (6,8), Piper peltatum (7,0), Tessaria fastigiata (9,6) y Buddleja tucumanensis griseb (9,9). En el rango de 11 a 15 g/mL encotramos a: Mimosa lepidota (10,8), Baccharis grisebachii (12,1), Baccharis salicifolia (12,7), Erechtites hieracifolia (13,1). Y con IC50 entre 16-20 g/mL conseguimos 8 especies: Lantana camara (16,1), Piper aff. pilirameum (16,5), Croton cf. emporiorum (16,9), Mikania psilostachia (16,9), Baccharis pentlandii (18,3), Tagetes multiora (18,5), Gynoxys psilophyla (19,3) y Alonsoa acutifolia (20,3). Todas estas plantas son altamente prometedoras, sobre todo si tomamos en cuenta que se trata de extractos sin ningn procesamiento posterior.
248
Extractos crudos desgrasados (EC2)

21 plantas dieron por debajo del umbral establecido, esto es, con CI50 menores o muy cercanos a 20, TABLA 11. En el grupo con CI50 menores que 10 g/mL encontramos 13 plantas: Tagetes maxima (1,5), Lantana camara (2,0), Mikania buchtienii (2,1), Plazia daphnoides (2,7), Lantana trifolia (3,2), Tessaria fastigiata (4,5), Tessaria dodoneafolia (5,7), Baccharis grisebachii (6,1), Tagetes multiora (6,5), Buddleja tucumanensis (6,5), Senecio herzogui (6,7), Mikania psilostachia (7,7) y Erechtites hieracifolia (8,1). En el rango de 11 a 15 g/mL detectamos 3 plantas: Erechtites valerianaefolia (10,5), Aloysia gratissima (14,6) y Gynoxys psilophyla (15,0). A las que se agregan 5 otras plantas con
249
IC50 entre 16-20 g/mL: Croton cf. emporiorum (15,1), Ophryosporus heptanthus (15,4), Baccharis salicifolia (17,0), Lantana magnibracteata (18,4) y Lippia boliviana (18,9).
Fraccin hexnica (FHX)
Empleando esta tcnica, no conseguimos AA en los extractos hexnicos, lo cual conrma lo publicado por Mensor et al, 2001, quien, de paso, utiliz esta tcnica la del DPPH- en su trabajo.
Fraccin clorofrmica (FC3)

5 especies arrojaron buenos resultados en la fraccin clorofrmica, TABLA 12. Dos con IC50 por debajo de 5 g/mL: Plazia daphnoides (2,1) y Piper peltatum (5,0); y los otros 3; Lantana trifolia (13,0), Tes250
saria dodoneafolia (14,3) y Erechtites valerianaefolia (18,8); estuvieron entre 10 y 20 g/mL.
Extracto de acetato de etilo (FAC)
Todas las especies que mostraron alguna fraccin con actividad frente a esta tcnica, dieron buenos valores en la fraccin de acetato de etilo. Lo que conrma que la actividad se concentra en esta fraccin, que es la de los compuesto polares, TABLA 13. Hay que resaltar el valor obtenido con Lantana camara cuyo CI50 est muy por debajo de 1 g/mL, mientras que por debajo de 5 estn 19 especies: Baccharis grisebachii (1,7), Baccharis salicifolia (3,3), Erechtites valerianaefolia (4,1), Erechtites hieracifolia (4,2), Gynoxys psilophyla (3,5), Mikania buchtieni (0,2), Ophryosporus heptanthus (3,9), Pluchea sagittalis (2,5), Senecio herzogui (1,4), Tagetes multiora (1,9), Tagetes maxima (0,5), Tessaria fastigiata (4,3), Tessaria dodoneafolia (2,4), Euphorbia serpens (2,7), Peltophorum dubium (0,5), Aloysia gratissima (2,6), Lantana magnibracteata (3,6), Buddleja tucumanensis (4,4) y Lantana trifolia (5,0).
Extracto Acuoso (FOH)
251
Con la tcnica del DPPH, se obtuvieron excelentes resultados en la fraccin acuosa. 21 especies arrojaron resultados interesantes como fuentes de antioxidantes muy polares, solubles en agua, TABLA 14. Los mejores candidatos, para proveer este tipo de antioxidantes, fueron la Lantana camara (IC50<1) y la Tagetes maxima (0,8). Y, dos especies dieron CI50 menores que 5: Erechtites valerianaefolia (3,7) y Gynoxys psilophylla (4,3). Con valores de IC50 menores que 10 g/ mL conseguimos otras 8 especies: Tessaria fastigiata (7,1), Tagetes multiora (7,3), Erechtites hieracifolia (7,3), Mikania psilostachia (8,9), Lantana trifolia (8,9), Buddleja tucumanensis (9,2) y mikania buchtienii
252
(9,3). En el rango entre 10 y 15 g/mL conseguimos 5 especies: Tessaria dodoneafolia (10,4), Baccharis platypoda (12,9), Ophryosporus heptanthus (13,0), Plazia daphnoides (13,4) y Aloysia gratissima (14,9). Y, entre 16 y 20 g/mL, aparecen 4 plantas: Baccharis salicifolia (16,6), Lantana magnibracteata (17,3), Croton cf. emporiorum (19,3) y Mimosa lepidota (20,0) Como se ve, tambin para el caso de aplicaciones donde lo determinante sea la inhibicin de la accin de radicales libres, se obtienen muestras que cubren el amplio rango de polaridades.
Otra comparacin
253
Con el n de tratar de obtener mayor informacin sobre las dos tcnicas que estamos empleando para medir la actividad antioxidante, hemos ordenado las plantas de acuerdo a la actividad antioxidante lograda en la fraccin de acetato de etilo, segn cada una de esas tcnicas. En la TABLA 15a, vemos que salvo una excepcin- al ordenarlas de acuerdo a la tcnica del -caroteno, las plantas que dan los mejores valores tambin dan excelentes valores en la tcnica del DPPH. Mientras que eso no sucede al ordenarlas de acuerdo al DPPH, TABLA 15b. En este caso una buena cantidad de plantas que dieron los mayores valores con el DPPH, no dieron resultados satisfactorios con el -caroteno. De hecho, de las 27 plantas que dieron buenos valores para el DPPH, 16 no dieron actividad frente al -caroteno.
254
Similares resultados obtenemos si las ordenamos segn la fraccin acuosa, FOH. Como se ve en la TABLA 16a, alta actividad frente a la tcnica del -caroteno, excluyendo dos casos, coinciden con alta actividad con el DPPH. Pero el inverso no se cumple, TABLA 16b.
255
La comparacin usando el extracto crudo (EC1), la presentamos en la TABLAS 17a y 17b. Es notoria la cantidad de casos en que buenos resultados con el DPPH no implican buenos valores con el -caroteno.
256
257
Finalmente, se repite la situacin al hacer la comparacin con la fraccin clorofrmica, TABLA 18a y TABLA 18b. Estos resultados apoyan la tesis de que las dos tcnicas miden dos aspectos distintos de la actividad antioxidante, lo cual consolida nuestra propuesta de que deben usarse las dos tcnicas simultneamente.
Conclusiones
En nuestra opinin, es muy recomendable utilizar simultneamente estas dos tcnicas en los estudios de tamizaje de plantas en busca la actividad antioxidante, porque se logra una mejor visin de las potenciales aplicaciones de las muestras y sobre sus eventuales campos de aplicacin. Y porque, adems, ayudara a encarar el actual problema que signica el uso de una amplia variedad de tcnicas muy dismiles, lo cual hace difcil la comparacin de los resultados
258
obtenidos por diferentes grupos de investigacin (Arnao et al, 1999; Niki y Noguchi, 2000; Antolovich et al., 2002; Koleva et al., 2002 y Emmons et al., 1999). En el transcurso del trabajo hemos notado como AA desaparece cuando uno progresa en la rutina de aislamiento de los compuestos activos. Esto se explica porque, en la mayora de los casos, la AA no es debida a la accin de un slo compuesto, sino que es la consecuencia de la accin de varios compuestos, actuando mediante mecanismos sinergsticos. Esto apunta hacia la posibilidad y conveniencia de usar comercialmente, sin mayor puricacin, los extractos crudos (EC1 o EC2) que demostraron tener alta AA, una vez hayan aprobado las regulaciones que demanda la industria con respecto a toxicidad y otros parmetros.
Agradecimientos Este trabajo fue conanciado por el Programa Iberoamericano, Ciencia y Tecnologa para el Desarrollo (CYTED), Proyecto IV.11; por el Decanato de Investigaciones y Desarrollo de la Universidad Simn Bolvar y por la Direccin de Investigaciones de la Universidad Nacional de Colombia, sede Medelln (DIME).
Bibliografa
Antolovich M, Prenzler PD, Patsalides E, Mcdonald S & Robards K (2002): Methods for testing antioxidant activity. Analyst 127: 183-198. Arnao MB, Cano A & Acosta M (1999): Methods to measure the antioxidant activity in plant material. A comparative discussion. Free Radical Res 31:S89-S96. Brand-Williams W, Cuvelier ME & Berset C (1995): Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity. Lebennm Wiss Tecnol 28: 25-30. Desmarchelier C, Ciccia G & Coussio J (2000): Recent advances in the search for antioxidant activity in south american plants. In: Atta-ur-Rahman eds, Studies in Natural Producy Chemistry. Elsevier Science B. V., vol. 22, pp. 343-367. Emmons CL, Peterson DM & Paul GL (1999): Antioxidant capacity of oat (Avena sativa L.) extracts. 2. In vitro antioxidant activity and contents of phenolic and tocol antioxidants. J Agric Food Chem 47: 4894-4898.
259
Koleva II, Vanbeek TA, Linssen JPH, Degroot A & Evstatieva LN (2002): Screening of plant extracts for antioxidant activity. A comparative study on 3 testing methods. Phytochem Anal 13: 8-17. Mensor L, Menezes F, Leitao G, Reis A, dos Santos T, Coube C & Leitao S (2001): Screening of brazilian plant extracts for antioxidant activity by the use of DPPH free radical method. Phytother Res 15: 127-130. Niki E & Noguchi N (2000): Evaluation of antioxidant capacity - What capacity is being measured by which method. IUBMB Life 50: 323-329. Pannala AS & Rice EC (2001): Rapid screening method for relative antioxidant activities of avonoids and phenolics. Meth Enzymol 335: 266-272. Rosas-Romero AJ, Rojano B, Hernndez C, Martnez C, Silva J & Herrera J (1999): A novel approach to quantitative structure-property relationships in antioxidants. Ciencia 7: 78-87. Rosas-Romero AJ & Saavedra G (2004): Screening Bolivian Plants for Antioxidant Activity. Pharmaceutical Biology (aceptado para publicacin) Schwarz K, Bertelsen G, Nissen LR, Gardner PT, Heinonen MI, Hopia A, Huynh-Ba T, Lambelet P, McPhail D, Skibsted LH & Tijburg L (2001): Investigation of Plant-Extracts for the Protection of Processed Foods Against Lipid Oxidation - Comparison of Antioxidant Assays Based on Radical Scavenging, Lipid Oxidation and Analysis of the Principal Antioxidant Compounds. Eur Food Res Technol 212: 319-328. Vandersluis AA, Dekker M, Verkerk R & Jongen WMF (2000): An improved, rapid in vitro method to measure antioxidant activity. Application on selected avonoids and apple juice. J Agric Food Chem 48: 4116-4122
260
LA CAPACIDAD ATRAPADORA DE RADICALES LIBRES Y CONTENIDO DE FENOLES DE ALGUNAS FRUTAS TROPICALES COLOMBIANAS
Benjamn Rojano, Francoise Bonavoir, Carlos Andrs Gaviria M, Carlos E Monsalve, Guillermo Arrazola y Alfredo Rosas Romero
CAPACIDAD ATRAPADORA DE RADICALES LIBRES Y CONTENIDO DE FENOLES DE ALGUNAS FRUTAS TROPICALES COLOMBIANAS
Benjamn Rojano* ; Francoise Bonavoir*; Carlos Andrs Gaviria M*; Carlos E Monsalve*, Guillermo Arrazola** y Alfredo Rosas Romero***
* Laboratorio de Ciencia de los Alimentos, Universidad Nacional sede Medelln, Colombia. ** Ingeniera de Alimentos, Universidad de Crdoba, Colombia. ***Laboratorio de Qumica de Alimentos; Universidad Simn Bolvar, Venezuela.
Introduccin
Los antioxidantes pueden provenir de dos fuentes, natural o sinttica. Los antioxidantes sintticos como el BHA (butilhydroxainisol) o el BHT (butilhidroxitolueno) son lo ms utilizados en la industria desde principios del siglo pasado. Pero estos compuestos pueden hacer dao al hgado y favorecer la aparicin de cncer (1-5). Por esto, las investigaciones se orientan hacia la bsqueda de antioxidantes naturales para el consumo humano. Diferentes estudios epidemiolgicos y nutricionales mostraron que las frutas tienen un efecto muy benco sobre la salud en cuanto a la reduccin de enfermedades como los cnceres, las enfermedades cardio-vascularias y neurolgicas. Esto se puede relacionar con los diferentes antioxidantes presente en ellos (6-8). El cido ascrbico ha sido muy estudiado, pero las frutas contienen varios otros antioxidantes como el caroteno, compuestos fenlicos y entre ellos los avonoides que son antioxidantes por excelencia presentes en los tejidos vegetales. Como los antioxidantes en las frutas son numerosos, de familias muy diferentes y de modos de accin diferentes (pueden ser primarios o secundarios), no se puede estudiar cada uno de manera distinta. Por eso se habla de la capacidad antioxidante de las frutas, como un fenmeno completo; es decir, la capacidad de una muestra de fruta para detener (con la accin conjunta de todos sus antioxidantes) los fenmenos de oxidacin y la formacin de los radicales libres. El inters en la capacidad antioxidante de las frutas es reciente y pocas han sido estudiadas. Wang,
263
et al (9-10) en 1996 y en 1999 estudiaron la actividad antioxidante en ciruelas, manzanas, Kiwi, durazno, ciruelas, meln, naranja, uvas blancas entre otras, por el mtodo ORAC. Kahkonen et al (11) en 1999 investig algunas frutas de climas fro, particularmente las bayas rojas como la fresa o la frambuesa y otros como la manzana y las grosellas usando como metodologa para medir la actividad antioxidante la oxidacin de metil linoleato. Kanasawa y Sabakira en el 2000 (12) midi la capacidad antioxidante de bananos en diferentes estados de maduracin, midiendo la absorcin de oxigeno, entre otros. En la siguiente tabla se muestran algunos reportes de estudios de propiedades antioxidantes de frutas.
A pesar de la resaltante biodiversidad que presenta la ora colombiana, nuestras frutas han sido muy poco estudiadas, lo cual es el factor determinante de su escaso aprovechamiento comercial. Nuestro propsito es contribuir al estudio sobre el valor nutricional de las frutas visto como propiedades antioxidantes que podran as tener una mejor valorizacin y un mayor potencial de explotacin. En este trabajo estudiamos 18 frutas de 15 gneros diferentes y de 14 familias
264
CAPACIDAD ATRAPADORA DE RADICALES LIBRESY CONTENIDO DE FENOLES DE ALGUNAS FRUTAS TROPICALES COLOMBIANAS
diferentes con el n de determinar sus propiedades antioxidantes, usando la capacidad que tienen los diferentes extractos para atrapar el radical 2,2 difenil picril hidrazil (DPPH) e investigar que correlacin podra existir entre la capacidad antioxidante de las frutas y su contenido de fenoles, debido a que estos compuestos constituyen los antioxidantes por excelencia en estas fuentes.
Parte experimental
Estudiamos la capacidad antioxidante sobre extractos acuosos de frutas, usando la capacidad atrapadora del radical DPPH,. En efecto, en Colombia las frutas son consumidos en jugos que acompaan cada comida. Esos jugos son el extracto acuoso de toda la parte comestible de la fruta. Estudiamos 18 frutas de 15 gneros diferentes y de 14 familias. Todas son frutas tropicales cultivadas en Colombia:. El maraon (Anacardium occidentale L. de la familia Anacardiaceae); el jobo (Spondias mobin L., Anacardiaceae); la ciruela (Spondias purpurea L., Anacardiaceae); la chirimoya (Annona cherimola L., Annonaceae); la guanbana (Annona muricata L, Annonaceae); el higo (Opuntia cus Indica L., Cactaceae); el tamarindo (Tamarindo indica L., Caesalpiniaceae); la Papaya (Carica papaya L., Caricaceae); el mamey (Mammea americana L., Guttiferae); la guayaba agria (Psidium angulatum, Myrtaceae); la pomarossa (Syzygium jambos, Myrtaceae); la pera de malaca (Syzygium malcasense L., Myrtaceae); el carambolo (Averrhoa carambola L., Oxalidaceae); el boroj (Borojoa patinoi cuatr. Rubiaceae); la badea (Passiora quadrangularis L., Passiorceae); el mamoncillo (Meliccoca bijuga L., Sapindaceae), el zapote (Pouteria Sapota Jacq. Sapotaceae), y el madroo (Rheedia Madruo Guttiferae, Clusiaceae). (ver anexo II: Fotos y presentacin de las frutas estudiados.) Para los fenoles totales y para la capacidad antioxidante, se estudi la parte comestible de la fruta: la pulpa sola, o la pulpa mas la piel o mas las semillas, dependiendo de cada fruta.
Preparacin de los jugos de fruta

Preparamos los jugos con una concentracin en slidos de 10.000 g/L. Para ello necesitamos conocer el porcentaje de humedad de
265
las diferentes frutas, la cual la medimos por destilacin azeotrpica utilizando tolueno como disolvente: Este anlisis lo realizamos por duplicado. A partir del porcentaje de humedad calculamos el peso P de muestra a diluir en 1L de agua para obtener una solucin a 10.000 g/L de slidos. La muestra de fruta la licuamos durante dos minutos en agua desionisada y la llevamos a 250 o 500 mL segn la cantidad de fruta disponible; nalmente la centrifugamos a 3.500 RPM durante 20 minutos a 4C. A los 33 extractos de frutas tropicales, les medimos la capacidad antioxidante usando la metodologa para atrapar el radical 2,2 difenil picril hidrazil (DPPH), a 25 C y una longitud de onda = 517 nm, segn queda descrito en el captulo de Metodologas. Es decir incubamos una solucin metanlica de 20 mg/L de DPPH, en presencia del extracto. La absorbancia la medimos a una longitud de onda de 517 nm y la capacidad para atrapar el radical DPPH, se expresa como % de actividad antioxidante y la expresamos mediante la ecuacin:
Donde AA: Actividad Antioxidante y Abs es la Absorbancia. Tambin determinamos, para los diferentes extractos, el contenido de fenoles totales por el mtodo de Folin Ciocalteau usando una tcnica espectrofotometrica (= 760 nm), con un modelo de regresin lineal y el cido tnico como patrn, tal como est descrito en el captulo Metodologas. Los resultados de la capacidad antioxidante (DPPH) los correlacionamos con el contenido de fenoles.
266
Resultados Capacidad antioxidante y fenoles totales de las frutas

Segn mostramos en la Tabla 1, todas las frutas estudiadas presentaron algn grado de actividad antioxidante, o sea, ninguna de ellas promovi las reacciones tendientes al fenmeno de la rancidez. Ocho (8) de las frutas estudiadas mostraron una alta capacidad antioxidante (>30 %), estas son las primeras ocho frutas en la Tabla 1, donde estn ordenadas de acuerdo a su actividad abtioxidante. Resalta el maraon que tiene una actividad antioxidante muy fuerte (85.6 1. 2%). Le siguen la papaya (58.7 1.0%), la pomarossa, (48.7 1.2%), la ciruela (47.9 1.5%), la guayaba agria (40.0 0.7%), el carambolo (39.9 1.2%), el mamoncillo (35.1 2.0%) y el hobo (29.3 0.9%). Estas 8 frutas cumplen con las condiciones para ser promovidas como alimentos ricos en compuestos antioxidantes naturales, lo cual satisface la meta fundamental del proyecto. El siguiente grupo de ocho frutas, en la Tabla 1, presentan una actividad media (entre 10 y 20%) y deben ser promovidas como tales: la pera de Malaca (19.6 0.6%), la guanbana (19,17 0.5%), el zapote (16.6 1.2%), el madroo (13.49 0,8%), el tamarindo (13.1 0.6%), la Chirimoya (12.9 1.3%), el Mamey (12.7 0.2%) y la badea (12.0 1.9%). Finalmente, el Higo (9.4 0,4%) y el Boroj (7.4 0.5%) demostraron tener una baja actividad.
267
La capacidad atrapadora del DPPH est expresada como % de actividad antioxidante, desviaciones menores del 2%. b El contenido de fenoles est reportado como mg de cido tnico/100g de muestra; errores menores del 3%. c % de humedad media, los errores son menores al 1.1 %.
a
268
T = Toda la fruta. P = La pulpa. P, S = La pulpa y las semillas. P, P = La pulpa y la piel. Todos lo anlisis se realizaron por triplicado.
d
Contenido de fenoles totales

Como mostramos en la Figura 1, el maran, que fue la fruta con la mayor actividad antioxidante, tambin presenta el ms alto contenido de fenoles (1.021,27 21,74 mg/100g), seguido de lejos por el mamoncillo (527.7 1.8% mg/100g), la pomarossa (306.5 7.9 mg/100g ), el tamarindo (275.3 2.2 mg/100g), el hobo (211.2 1.5 mg/100g), la ciruela (210.8 0.8 mg/100g), el carambolo (202.2 3.8 mg/100g), la guanbana (161.3 3.1 mg/100g), el madroo (86.7 1.0 mg/100g), la papaya (61.8 0.1 mg/100g ), el higo (58.4 0.1 mg/100g), el boroj (39.1 3.4 mg/100g), el zapote (27.6 0.4 ) mg/100g, la pera de Malaca (16.8 0.2 mg/100g), el Mamey (14.9 0.2 mg/100g ), la badea (14.0 0.1 mg/100g), la chirimoya (13.6 0.3 mg/100g).)
Figura 1. fenoles totales en las frutas.
269
De todas estas frutas, el maraon es la fruta con mayor actividad antioxidante y con un alto contenido de fenoles. Existen cultivos de esta fruta para la exportacin, pero solo se valoriza su almendra que, tostada, es consumida como aperitivo. La fruta casi no es consumida, porque tiene dos desventajas: el sabor es muy astringente (eso es debido a su contenido alto de fenoles), y debe cocinarse porque crudo es castico. Por esto no se ha podido explotar comercialmente y aprovechar su ventaja en cuanto a benecios para la salud; para lo cual es necesario desarrollar transformaciones tecnologicas que permitan un mayor consumo.
Relacin actividad antioxidante / fenoles totales

Esta relacin fue estudiada primero por una regresin simple actividad antioxidante vs. fenoles totales y daba un coeciente de regresin r, signicativo de 0,747. Pero ste era debido a la fuerte actividad antioxidante del maraon y su alto contenido de fenoles, sin este punto la regresin no es signicativa ( r = 0,461). La relacin entre los compuestos fenlicos y la actividad antioxidante fue estudiada por Kalt & co (13) para la fresa, la frambuesa y dos especies de moras y encontraron un coeciente de 0,80. Pero en este caso, las frutas tenan altos contenidos de antocianinas, que son antioxidantes muy buenos de la familia de los avonoides. Adems la regresin entre el contenido de fenoles y las antocianinas fue igual a r = 0,91, y el coeciente de regresin antocianinas vs. Actividad antioxidante fue r = 0,90. Pero, en nuestro caso, las frutas estudiadas, son muy diferentes entre ellas, mientras que en el caso precedente, todas eran bayas pequeas y de pocos gneros y familias. La ausencia de una correlacin estadsticamente signicativa, puede ser explicada por dos razones. El mtodo de determinacin de fenoles toma en cuenta todos los tipos de fenoles, y la actividad antioxidante de los compuestos fenlicos vara mucho segn los sustituyentes presente en el anillo fenlico, o si el compuesto es mono o polifnolico. Las frutas estudiada pueden tener un alto contenido de fenoles pero tener una pequea capacidad antioxidante, o al contrario, un pequeo contenido de fenoles pero una alta capacidad antioxidante.
270
Muchos de estos frutos tienen alto contenido de vitamina C, como por ejemplo el corombolo. Sawai et al (14) encontraron que la vitamina C reacciona mucho mas rpido con el DPPH que algunos compuestos fenolicos como la catequina, el metilgalato y el tocoferol, de tal manera que se pueden hacer nuevos estudios para encontrar una mejor correlacin, ya sea determinando el contenido de vitamina C y hacer regresiones multiples o usar una tcnica ms especica. Esto no signica necesariamente que la vitamina C tenga una actividad antioxidante ms fuerte que los otros compuestos. El mecanismo molecular de la reaccin entre el DPPH, la vitamina C, y ciertos compuestos fenlicos como la catequina (avonoide) y el metilgalato fue estudiado por Sawai et al (14). Encontr que la vitamina C captura los radicales de DPPH ms rpido que la catequina, el metil-galato o el tocoferol pero que tiene una capacidad atrapadora de DPPH, menos fuerte que la catequina o el tocoferol. En nuestro caso, no sabemos que compuestos fenlicos estn presentes en las frutas pero podemos pensar que con otro mtodo u otras condiciones (por ejemplo un tiempo de contacto ms largo entre la muestra y el DDPH) la contribucin de la vitamina C sera menos relevante. Adems, Sawai et al muestran que la vitamina C, por sus propiedades reductivas permite regenerar la catequina y el - tocoferol oxidado. As hay que tomar en cuenta tambin las interacciones entre los diferentes compuestos antioxidantes. De todas estas frutas, el maraon es la fruta con mayor actividad antioxidante y sobre todo con alto contenido de fenoles. Existen cultivos de esta fruta para la exportacin, pero slo se valora la almendra que, tostada, es consumida como aperitivo. La fruta casi no es consumida, porque tiene la desventaja de un sabor muy astringente (eso es debido a su contenido alto de fenoles). Sin embargo, se pueden buscar diferentes formas alimenticias de presentacin, por ejemplo suplementos alimenticios liolizados que garanticen la estabilidad de sus componentes.
271
Bibliografa
Branen, AL. Toxicology and biochemistry of butylated hydroxy toluene, J. Am. Oil Chem. Soc. 1975, 52, 59-63. Ito, N; Fukushima, S; Hasegawa, A; Shibata, M; Ogiso, T. Carcinogenecity of butylated hydroxyanisole in F344 rats. J. Nalt. Cancer Inst., 1983, 70, 343-347. Ames, BM. Dietary carcigens and anticarcigens oxygen radicals and degenerative diseases. Science, 1989, 221, 1256-1263. Gey, KF. The antioxidant hypothesis of cardiovascular diseases: epidemiology and mechanisms. Biochem. Soc. Trans., 1990, 18, 1041-1045. Willet, CW. Micronutrients and cancer risk. Am. J. Clin. Nutr., 1994, 59, 1625-1655. Acheson, R.M and Williams, D.R.R. Does comsumption of fruits and vegetables protect against stroke? Lancet, 1983, 1191-1193. Verlangieri, AJ; Kapeghian, JC; El Dean, S and Bush, M. Fruits and vegetables consumption and cardiovascular mortality. Med. Hypothess, 1985, 16, 7-15. Dragsted, LO; Srtube, M and Larsen, JC. Cancer protective factors in fruits and vegetables, biochemical and biological background. Pharmacol. Toxicol., 1993, 72, 116-135. Wang, SY and Shan Lin, HS. Antioxidant activity in fruits and leaves of blackberry, rasberry and strawberry varies with cultivars and developmental stage. J. Agric. Food Chem., 2000, 48, 140-146. Wang, H; Cao, G and Prior, RL. Total antioxidant capacity of fruits. J. Agric. Food Chem., 1996, 44, 701-705. Kahkonen, MP; Hopia, AI; Vuoruela, HJ; Rauha, JP; Pihlaja, K; Kujala, TS and Heinonen, M. Antioxidant activity of plants extract containing phenolic compounds. J. Agric. Food Chem., 1999, 47, 3954-3962. Kanazawa, K and Sakakibara, H. High content of dopamine, a strong antioxidant in Cawendish banana., J. Agric. Food Chem., 2000, 48, 147-151. Klat, W; Fornay, CF; Martin, A and Prior, RL. Antioxidant Capacity, Vitamin C, Phenolics, and Anthocyanins after Fresh Storage of Small Fruits. J. Agric. Food Chem., 1999, 47, 4638-4644. Sawai, Y and Moon, JH. NMR Analytical approach to clarify the molecular mechanism of the antioxidative and radical scavenging activities of antioxidants in tea using 1,1 Diphenyl 2 picrilhydrazil. J. Agric. Food Chem., 2000, 48, 6247-6253.
272
ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE EN EXTRACTOS DE NUEVE PLANTAS PARAGUAYAS

Alfredo Rosas Romero y Edelira Velzquez

Alfredo Rosas Romeroa y Edelira Velzquezb
a
Universidad Simon Bolivar. Departamento de Qumica. Apartado 89000. Caracas 1080A. Venezuela. b Facultad de Ciencias Qumicas, Universidad Nacional de Asuncin, Casilla de Correos 1055, Campus Universitario, San Lorenzo, Paraguay
Introduccin
Est bien documentado el efecto de los radicales libres sobre los sistemas biolgicos y del papel que desempean las sustancias naturales en la prevencin y reparacin del dao que aquellos producen (Gordon 1996, Larson 1997). Los efectos nocivos de los radicales libres se hacen particularmente notables sobre los lpidos, produciendo manifestaciones biolgicas y prdida del valor nutricional y comercial de los mismos. Para retardar los efectos de los radicales libres sobre los alimentos elaborados ricos en grasas se vienen empleando ampliamente aditivos sintticos con capacidad para atrapar radicales, tales como butilhidroxianisol (BHA), butilhidroxitolueno (BHT), la terbutil hidroxiquinona(TBHQ) y el galato de propilo. Paralelamente, con la extensin del uso de los mencionados antioxidantes sintticos, se ha producido informacin sobre su toxicidad asociada, particularmente con BHA, en la que se vincula a este aditivo con induccin de la apoptosis (Yu et al, 2000) y del dao oxidativo al ADN (Schilderman et al., 1995) sin que quede claro el impacto de estos procesos en la salud humana. La necesidad de obtener sustancias no txicas con capacidad antioxidante, disponibles para el uso industrial, ha llevado a explorar recursos naturales que demuestren dicha capacidad, y existen varios casos bien documentados con relacin a especies de amplio uso como Rosmarinus ofcinalis ( Schwarz & Ternes, 1992) y Ginkgo biloba (Joyeux et al., 1995), y se dispone de datos sobre la bsqueda
de dicha actividad en vegetales empleados como condimentos o en residuos de alimentos del mismo origen (Kim et al., 1994; Yen & Duh, 1993). En la presente publicacin se comunican los resultados de un tamizaje de la actividad captadora de radicales libres de extractos vegetales y sus fracciones, obtenidos a partir de material proveniente de Paraguay, en el marco del proyecto IV.11Desarrollo de Antioxidantes de Origen Natural e Inters Comercial, del CYTED.
Materiales y metodos Material vegetal

Trabajamos ocho especies vegetales y un residuo de destilacin de esencia vegetal provenientes todos de Paraguay. El material vegetal fue colectado en su habitat natural, debidamente identicado. Depositamos copias en los herbarios de la Facultad de Ciencias Qumicas de la Universidad Nacional de Asuncin
Extractos.
Secamos las plantas al aire a temperatura ambiente, a la sombra, las molimos y extrajimos por maceracin de 30 g de polvo con 600 mL de metanol, a temperatura ambiente, durante 24 h, con agitacin ocasional. Filtramos los extractos y eliminamos el solvente a presin reducida. En el caso del agua residual de la destilacin de esencia de Bulnesia sarmentoi, la eliminamos por liolizacin. Los extractos crudos los sometimos a particin lquido-lquido, suspendindolos en agua y extrayndolos sucesivamente con hexano, cloroformo y acetato de etilo, segn lo descrito anteriormente (Ver Diseo Experimental). De esta manera, para cada planta obtuvimos un extracto crudo (EC), y 4 fracciones, la hexnica (FHX), clorofmica (FC3), la de acetato de etilo (FAC) y una fraccin remanente con los solubles en agua (FOH).
Evaluacin antioxidantes
La evaluacin de la actividad antioxidante de los extractos crudos y las fracciones la realizamos mediante el ensayo de la Actividad Cap276
tadora de Radicales DPPH y el de la Decoloracin del Beta Caroteno, ambos descritos previamente (Ver DISEO EXPERIMENTAL) Para cada tcnica evaluamos un total de 45 muestras, correspondientes a nueve plantas.
Resultados y discusion
Denimos como CI50 a la concentracin, en g/mL, necesaria para atrapar al 50 % de los radicales DPPH. n.a. signica no actividad antioxidante
Por su actividad frente a los radicales DPPH, una medida de la actividad antioxidante total, resaltan el extracto crudo de Peltophorum dubium. Este es un resultado muy relevante, porque tratndose del extracto crudo, apunta a la obtencin de potentes antioxidantes con un mnimo de procesamiento. Peltophorum dubium junto con la Euphorbia serpens se presentan como buenas fuentes de antioxidantes polares por el buen resultado que obtuvimos con sus respectivas fracciones de acetato de etilo
277
(FAC). Los mismo podemos decir de ellas como fuentes de antioxidantes altamente polares (FOH). El extracto crudo (EC) de la Cedrela ssilis y su fraccin en acetato de etilo, tambin mostraron resultados prometedores. Frente a esta tcnica, el IC50 del beta caroteno recristalizado es 11.1 mg/mL.
La inhibicin de la decoloracin del beta caroteno la expresamos como el % de actividad de la muestra relacionada con una solucin patrn de BHA recristalizado, a la cual le adjudicamos el valor de 100%. n.a. signica no actividad antioxidante
De las nueve plantas estudiadas, 4 arrojaron alguna fraccin con actividad superior al 50 %, de acuerdo a la tcnica de la decoloracin del beta caroteno. Este nivel, 50 %, lo hemos establecido en este trabajo como el valor mnimo para que una fuente sea aceptada como interesante para los objetivos de nuestro trabajo. Como antioxidante frente al fenmeno de la rancidez oxidativa, resalta las fraccin de acetato de etilo (FAC) de la Euphorbia serpens,
278
la cual dio tan buenos resultados como la solucin patrn de BHA que empleamos para referir todos los resultados de esta tcnica. adems debemos tener presente que mientras la solucin patrn la preparamos con BHA recristalizado, la de Euphorbia serpens es una fraccin sin ulteriores procesamientos y por ello integrada por diversos compuestos. La Leucaena leucocephala provee una importante fraccin de antioxidantes altamente polares. El extracto crudo de la Tabebuia heptaphylla muestra una interesante actividad, con el agregado de que sus fracciones de cloroformo y de acetato de etilo, tambin son activas. Y, el Peltophorum dubium aparece como una fuente prometedora de antioxidantes my polares.
Bibliograa
Gordon MH (1996): Dietary Antioxidants in Disease Prevention. Nat Prod Reports, 265-273 Kim SY, Kim JH, Kim SK, MJ OH, Jung MY (1994): Antioxidant Activities of Selected Oriental Herb Extracts. J Am Oil Chem Soc 71: 633-640 Larson RA (1997): Naturally Occurring Antioxidants. Lewis Publishers-CRC Press, Boca Raton-New York. Joyeux M, Lobstein A, Anton R, Mortier F (1995): Comparative Antilipoperoxidant, Antinecrotic and Scavenging Properties of terpenes and Biavones from Ginkgo and Some Flavonoids. Planta Medica 61: 126-129 Schwarz K, Ternes W (1992): Antioxidative Constituents of Rosmarinus ofcinalis and Salvia ofcinalis. 2. Isolation of carnosoic acid and formation of other phenolic diterpenes. Zeitschrifst Lebensmittel Untersuch Forschung 195: 99-103 Schilderman PA, Rhijnsburger E, Zwingmann I, Kleinjans JC (1995): Induction of Oxidative DNA Damages and Enhacement of Cell Proliferation in Human Lymphocytes In Vitro by Butilated Hydroxyanisole. Carcinogenesis 16: 507 - 512 Yen G-Ch, Duh P-D (1993): Antioxidative Properties of Methanolic Extracts from Peanut Hulls. J Am Oil Chem Soc 70: 383-386 Yu R, Mandlekar S, Kong AT (2000): Molecular Mechanisms of Butylated Hydroxyanisole-induced Toxicity: induction of apoptosis through direct release of citochrome c. Mol Pharmacol 58: 431-437
279
280
ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE Y CAPTADORA DE RADICALES EN NUEVE ASTERACEAE BOLIVIANAS

Irene Parejo, Francesc Viladomat, Jaume Bastida, Alfredo Rosas Romero, Gloria Saavedra, M. Antonia Murcia, Antonia M. Jimnez, Carles Codina

Irene Parejoa, Francesc Viladomata, Jaume Bastidaa, Alfredo Rosas Romerob, Gloria Saavedrac, M. Antonia Murciad, Antonia M. Jimnezd, Carles Codinaa*
Departament de Productes Naturals, Biologia Vegetal i Edafologia, Facultat de Farmcia, Universitat de Barcelona, Avda. Joan XXIII s/n, 08028 Barcelona, Spain b Departamento de Qumica, Universidad Simn Bolvar, Apartado 89000, Caracas 1080A, Venezuela c Centro de Tecnologa Agroindustrial, Facultad de Ciencias y Tecnologa, Universidad Mayor de San Simn, Cochabamba, Bolivia d Area de Nutricin y Bromatologa, Facultad de Veterinaria y Ciencia y Tecnologa de Alimentos, Campus de Espinardo, 30100 Murcia, Spain
a
Introduccin
El uso de la medicina tradicional est muy extendido, y las plantas todava representan una fuente importante de nuevos compuestos que pueden servir como cabezas de serie para el desarrollo de nuevos frmacos. Recientemente, diversos compuestos antiinamatorios, digestivos, antinecrticos, neuroprotectores y hepatoprotectores han mostrado tener un mecanismo antioxidante y/o de captura de radicales como parte de su actividad (Perry et al., 1999; Lin y Huang, 2002; Repetto y Llesuy, 2002). En la bsqueda continuada de nuevas fuentes de antioxidantes naturales, varias plantas medicinales se han estudiado ampliamente en los ltimos aos por su actividad antioxidante y captadora de radicales (De las Heras et al., 1998; Desmarchelier et al., 2000; Schinella et al., 2002; VanderJagt et al., 2002). El presente trabajo consiste en un estudio preliminar de varias especies bolivianas pertenecientes a la familia Asteraceae para determinar su posible actividad antioxidante y/o captadora de radicales: Baccharis pentlandii, Baccharis platypoda, Chromolaena tunariense, Erechtites hieraciifolius, Mikania psilostachya, Pluchea sagittalis, Tagetes maxima, Tessaria fastigiata y Wulfa baccata. Plantas de esta familia botnica se han utilizado en la medicina tradicional en Sudamrica en el tratamiento de diferentes patologas (Yan et al., 1999; Kadarian et al., 2002). Aunque algunas especies de Asterceas pertenecientes a los gneros Baccharis (Mongelli et al., 1997), Chromolaena (Thang et al., 2001), Mikania (Suyenaga et al., 2002),
283
Pluchea (Sen et al., 2002), Tagetes (De las Heras et al., 1998), y Tessaria (Desmarchelier et al., 2000) se han citado por sus propiedades antiinamatorias y/o antioxidantes, no existe informacin de las especies aqui estudiadas, con la excepcin de Pluchea sagittalis, la cual ha mostrado tener una cierta actividad antiinamatoria (PrezGarca et al., 1996). Hemos estudiado 54 extractos/fracciones de diferente polaridad de las nueve plantas bolivianas indicadas anteriormente para determinar su actividad antioxidante y captadora de radicales. Los tres ensayos que hemos utilizado para evaluar la actividad captadora de radicales son los del DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazil), superxido-azul de nitrotetrazolio (NBT) hipoxantina/xantina oxidasa, y .OH/luminol quimioluminiscencia. Para la evaluacin de la actividad antioxidante y de la estabilidad oxidativa de los extractos y fracciones hemos utilizado los mtodos de decoloracin del -caroteno y del Rancimat, respectivamente. Adems, hemos determinado tambin el contenido de fenoles totales por el mtodo de Folin-Ciocalteu. Los resultados los hemos comparado con los obtenidos por diferentes productos de referencia: quercetina, un antioxidante de origen natural, BHA (butilhidroxianisol), uno de los antioxidantes sintticos ms ampliamente empleado en la industria alimentaria, y tres extractos comerciales de origen natural de reconocida actividad antioxidante: romero, t verde y pepitas de uva.
Material y Mtodos Material vegetal

El material utilizado estuvo constituido en todos los casos por partes areas (tallos, hojas y ores). Sus datos estn incluidos en la Descripcin de las Plantas.
Reactivos
Todos los reactivos utilizados en este trabajo fueron de calidad analtica, y fueron suministrados por la rma comercial Sigma Aldrich (USA), con la excepcin del reactivo de Folin-Ciocalteu, que procedi de Panreac (Espaa).
284
Preparacin y procesamiento de las muestras

Siguiendo el procedimiento metodolgico diseado para el desarrollo del proyecto (Ver Diseo ExperimentaL), consistente en un proceso de extraccin y fraccionamiento secuencial, obtuvimos los siguientes extractos y fracciones: EC1, extracto crudo inicial (metanlico); EC2, extracto crudo desengrasado (resultante del tratamiento del EC1 con hexano); y las fracciones FHX, fraccin hexnica; FC3, fraccin clorofrmica, y FCA, fraccin acetato de etilo, obtenidas por la particin sucesiva del EC1 con dichos solventes. La fraccin acuosa residual se codic como FOH.
Determinaciones analticas
Los mtodos analticos utilizados en el presente trabajo para determinar la actividad antioxidante y captadora de radicales libres, hidroxilo y anin superxido en cada uno de los extractos y fracciones obtenidos se encuentran detallados en el Diseo ExperimentaL. Asimismo, hemos determinado la estabilidad oxidativa de cada uno de ellos por el test de Rancimat, y hemos cuanticado el contenido de fenoles totales por el mtodo de Folin-Ciocalteu, ambos descritos tambin en el Diseo Experimental.
Anlisis estadstico
Todas las extracciones y anlisis las hemos realizado por triplicado, y se han repetido en el caso de presentar un coeciente de variacin superior al 10 %. Los datos se sometieron a un anlisis de la varianza (ANOVA) de una va (test Newman-Keul) para comparar los resultados de los extractos y fracciones de las nueve plantas estudiadas. Los clculos de la capacidad captadora de radicales libres y radicales hidroxilo los hemos efectuado utilizando el valor de la eciencia antiradicalaria (EA = 1000/ CI50). Las diferencias se consideran signicativas a valores de P < 0.05.
Resultados Contenido de fenoles totales

Los valores del contenido total de fenoles de los diferentes extractos/fracciones se muestran en las Figuras 1-6. En general, se observa
285
que las fracciones acetato de etilo son las que presentaron un mayor contenido de fenoles, especialmente las de Tessaria fastigiata, Mikania psilostachya y Tagetes maxima. Los extractos EC2 de cinco de las nueve plantas estudiadas mostraron los segundos valores ms altos de fenoles totales. Sorprendentemente, las fracciones clorofrmicas no mostraron buenos resultados en comparacin con los de un trabajo similar realizado con plantas aromticas y medicinales mediterrneas (Parejo et al., 2002). El mayor contenido fenlico en las fracciones acetato de etilo que en los extractos crudos se debe probablemente a la puricacin y concentracin de fenoles que tiene lugar a lo largo del proceso de fraccionamiento.
Actividad captadora de radicales

La actividad captadora de radicales de los diferentes extractos/fracciones se muestra tambin en las Figuras 1-6. La mejor actividad captadora de radicales libres la present el extracto crudo desengrasado (EC2) de Tagetes maxima (CI50 = 5.6, EA = 178.57), seguido de las fracciones acetato de etilo de esta misma especie y de Mikania psilostachya (CI50 = 9.4 y 8.3, EA = 106.38 y 120.48, respectivamente). Con la excepcin de Tagetes maxima, todas las otras fracciones acetato de etilo mostraron la mayor actividad en comparacin con el resto de extractos y fracciones. Las fracciones acuosas presentaron tambin unos valores relativamente elevados, especialmente la de Tessaria fastigiata (CI50 = 14.63, EA = 68.49), siendo los segundos valores ms altos en cuatro de las nueve plantas estudiadas. En relacin a la actividad captadora de radicales hidroxilo, los mejores resultados se observaron en el extracto crudo desengrasado (EC2) de Mikania psilostachya y de Tagetes maxima, con valores de CI50 de 12.1 (EA = 82.64) y 12.6 (EA = 79.37), respectivamente (Figura 2), los cuales son signicativamente mayores que los de cualquier otro extracto o fraccin. Aparte de estas dos especies, las fracciones ms activas fueron en general las clorofrmicas (en cuatro de nueve fracciones) y las de acetato de etilo (en tres de nueve), aunque los valores de CI50 fueron superiores a 20, siendo algunos
286
ejemplos las fracciones acetato de etilo de Tagetes maxima y Tessaria fastigiata (CI50 = 20.3 y 29.3, EA = 49.26 y 34.13, respectivamente), y la clorofrmica de Chromolaena tunariense (CI50 = 24.8, EA = 40.32). Al igual que en los ensayos de DPPH y quimioluminiscencia, los mayores porcentajes de inhibicin del anin superxido correspondieron, en general, a las fracciones acetato de etilo (en seis de nueve), aunque en Baccharis pentlandii, Erechtites hieraciifolius y Tagetes maxima los valores ms elevados se observaron en los extractos crudos (EC1) (Figura 1). Este ensayo ha mostrado que la especie ms activa es Tagetes maxima, pues tres de los seis extractos/fracciones mostraron unos porcentajes de inhibicin superiores al 95 %. Esta elevada actividad est en coincidencia con una actividad captadora de anin superxido relativamente elevada mostrada tambin por otra especie de Tagetes, concretamente T. pusilla (De las Heras et al., 1998). Aparte de Tagetes maxima, slo el extracto crudo de Baccharis pentlandii di un valor superior al 90 % de inhibicin (93 %).
Actividad antioxidante
La actividad antioxidante determinada por el mtodo de decoloracin del -caroteno tambin fue mayor en las fracciones acetato de etilo (en cinco de las nueve plantas), coincidiendo as con los resultados de otros ensayos de actividad captadora de radicales (Figura 5). Los valores superiores se observaron en las fracciones acetato de etilo de Tagetes maxima y Tessaria fastigiata (con unos porcentajes de inhibicin del 60.6 % y 55.5 %, respectivamente), y en la clorofrmica de Chromolaena tunariense (56.5 % de inhibicin). No se obtuvieron otros valores superiores al 50 % de inhibicin, salvo en el extracto crudo desengrasado (EC2) de Tagetes maxima (54.3 %).
Resultados del Rancimat

El mayor factor de proteccin lo present la fraccin acetato de etilo de Tessaria fastigiata (FP = 1.35), el cual es signicativamente mayor
287
que el de cualquier otro extracto o fraccin analizada (Figuras 1-6). El segundo valor ms elevado se observ en la fraccin acetato de etilo de Pluchea sagittalis (FP = 1.26), una planta que mostr una escasa actividad en los otros ensayos, pero que se utiliza como antiinamatoria en Sudamrica (Prez-Garca et al., 1996). Resultados similares se obtuvieron en el extracto crudo de Chromolaena tunariense (FP = 1.24), y en las fracciones acetato de etilo de Baccharis pentlandii (FP = 1.22), Tagetes maxima (FP = 1.22), y Mikania psilostachya (FP = 1.20). En general, la mejor estabilidad oxidativa la mostraron las fracciones acetato de etilo, con excepcin de Chromolaena tunariense y Erechtites hieraciifolius, en las que los mayores factores de proteccin se observaron en los extractos crudos (EC1).
288
Figura 1 Actividad antioxidante (BC), actividad captadora de radicales libres (DPPH), hidroxilo (QL) y anin superxido (SO), estabilidad oxidativa (FP), y contenido de fenoles totales (CFT) en los extractos crudos (EC1). Ver la seccin de Material y Mtodos para la identicacin de los extractos, fracciones, y productos de referencia. 1 = Baccharis pentlandii, 2 = Baccharis platipoda, 3 = Chromolaena tunariense, 4 = Erechtites hieraciifolius, 5 = Mikania psilostachya, 6 = Pluchea sagittalis, 7 = Tagetes maxima, 8 = Tessaria fastigiata, 9 = Wulfa baccata
289
Figura 2 Actividad antioxidante (BC), actividad captadora de radicales libres (DPPH), hidroxilo (QL) y anin superxido (SO), estabilidad oxidativa (FP), y contenido de fenoles totales (CFT) en los extractos crudos desengrasados (EC2). Ver la seccin de Material y Mtodos para la identicacin de los extractos, fracciones, y productos de referencia. 1 = Baccharis pentlandii, 2 = Baccharis platipoda, 3 = Chromolaena tunariense, 4 = Erechtites hieraciifolius, 5 = Mikania psilostachya, 6 = Pluchea sagittalis, 7 = Tagetes maxima, 8 = Tessaria fastigiata, 9 = Wulfa baccata
290
Figura 3 Actividad antioxidante (BC), actividad captadora de radicales libres (DPPH), hidroxilo (QL) y anin superxido (SO), estabilidad oxidativa (FP), y contenido de fenoles totales (CFT) en las fracciones hexnicas (FHX). Ver la seccin de Material y Mtodos para la identicacin de los extractos, fracciones, y productos de referencia. 1 = Baccharis pentlandii, 2 = Baccharis platipoda, 3 = Chromolaena tunariense, 4 = Erechtites hieraciifolius, 5 = Mikania psilostachya, 6 = Pluchea sagittalis, 7 = Tagetes maxima, 8 = Tessaria fastigiata, 9 = Wulfa baccata
291
Figura 4. Actividad antioxidante (BC), actividad captadora de radicales libres (DPPH), hidroxilo (QL) y anin superxido (SO), estabilidad oxidativa (FP), y contenido de fenoles totales (CFT) en las fracciones clorofrmicas (FC3). Ver la seccin de Material y Mtodos para la identicacin de los extractos, fracciones, y productos de referencia. 1 = Baccharis pentlandii, 2 = Baccharis platipoda, 3 = Chromolaena tunariense, 4 = Erechtites hieraciifolius, 5 = Mikania psilostachya, 6 = Pluchea sagittalis, 7 = Tagetes maxima, 8 = Tessaria fastigiata, 9 = Wulfa baccata
292
Figura 5 Actividad antioxidante (BC), actividad captadora de radicales libres (DPPH), hidroxilo (QL) y anin superxido (SO), estabilidad oxidativa (FP), y contenido de fenoles totales (CFT) en las fracciones acetato de etilo (FAC). Ver la seccin de Material y Mtodos para la identicacin de los extractos, fracciones, y productos de referencia. 1 = Baccharis pentlandii, 2 = Baccharis platipoda, 3 = Chromolaena tunariense, 4 = Erechtites hieraciifolius, 5 = Mikania psilostachya, 6 = Pluchea sagittalis, 7 = Tagetes maxima, 8 = Tessaria fastigiata, 9 = Wulfa baccata
293
Figura 6 Actividad antioxidante (BC), actividad captadora de radicales libres (DPPH), hidroxilo (QL) y anin superxido (SO), estabilidad oxidativa (FP), y contenido de fenoles totales (CFT) en las fracciones acuosas (FOH). Ver la seccin de Material y Mtodos para la identicacin de los extractos, fracciones, y productos de referencia. 1 = Baccharis pentlandii, 2 = Baccharis platipoda, 3 = Chromolaena tunariense, 4 = Erechtites hieraciifolius, 5 = Mikania psilostachya, 6 = Pluchea sagittalis, 7 = Tagetes maxima, 8 = Tessaria fastigiata, 9 = Wulfa baccata
294
Discusin
Entre todos los extractos y fracciones analizadas, las de acetato de etilo mostraron unos valores del contenido total de fenoles y una actividad antioxidante y captadora de radicales bastante notable. En general, los extractos o fracciones con mayor actividad antioxidante y captadora de radicales mostraron tambin unos mayores niveles de fenoles totales, habindose encontrado una cierta correlacin entre dichos parmetros (Tabla 1).
aCFT = contenido de fenoles totales. bQL = Quimioluminiscencia. cSO = Anin superxido. dBC = test del -caroteno. ep < 0.001. f p < 0.05.
As, los mejores coecientes de correlacin tuvieron lugar entre los niveles totales de fenoles y la actividad captadora de radicales libres (con cuatro de las nueve plantas mostrando coecientes de correlacin superiores a 0.94), y entre el contenido de fenoles totales y la actividad antioxidante (con cinco de las nueve plantas mostrando coecientes superiores a 0.90). Considerando simultneamente los cuatro coecientes de correlacin entre el contenido de fenoles totales y los cuatro mtodos empleados para determinar la actividad antioxidante y captadora de radicales, las dos plantas que mos295
traron los mejores resultados fueron Tagetes maxima y Baccharis platipoda, con unos valores promedio de 0.91 y 0.89, respectivamente. En general, las fracciones acetato de etilo mostraron los mayores valores de fenoles totales y la mayor actividad antioxidante y captadora de radicales libres y del anin superxido, mientras que las fracciones clorofrmicas mostraron mejores resultados de actividad captadora de radicales hidroxilo, conrmndose as resultados anteriores obtenidos con otras especies (Parejo et al., 2002). De entre las nueve fracciones acetato de etilo, slo las de Baccharis platipoda y Tessaria fastigiata mostraron los mejores resultados de actividad antioxidante y captadora de radicales y los mayores valores niveles de fenoles totales (Figura 5). Otros resultados destacables son los de Tagetes maxima, cuyo extracto crudo desengrasado (EC2) mostr la mejor actividad captadora de radicales libres e hidroxilo, as como el valor ms elevado del contenido total de fenoles, de entre los nueve extractos de este mismo tipo. Asimismo, de entre las nueve fracciones clorofrmicas, solamente la de Chromolaena tunariense mostr la mejor actividad antioxidante y actividad captadora de radicales hidroxilo (Figura 4). Las fracciones acetato de etilo mostraron una mayor actividad antioxidante y captadora de radicales libres y del anin superxido (Figura 7), en coincidencia con otros trabajos (Mensor et al., 2001; Parejo et al., 2002). Sin embargo, la mejor actividad captadora de radicales hidroxilo la mostraron los extractos crudos desengrasados (EC2), aunque no se observan diferencias signicativas entre ellos y las fracciones acetato de etilo o las clorofrmicas. Tambin el anlisis de Rancimat ha revelado diferencias signicativas entre los niveles estabilidad oxidativa de las fracciones acetato de etilo y el resto de extractos y fracciones analizadas. La actividad captadora de radicales libres y la estabilidad oxidativa de las fracciones acetato de etilo de Mikania psilostachya y Tessaria fastigiata, respectivamente, fueron signicativamente mayores que las del resto de este tipo de fracciones. Asimismo, la actividad captadora de radicales hidroxilo de los extractos crudos desengrasados de Mikania psilostachya y de Tagetes maxima fueron signicativamente
296
Figura 7 Distribucin de las actividades antioxidante y captadora de radicales entre los diferentes extractos y fracciones, separadamente por mtodos (DPPH = radical libre; QL = quimioluminiscencia; SO = anin superxido, BC = -caroteno). Los valores se expresan como eciencia antiradicalaria (EA = 1000/CI50) y porcentajes de inhibicin, y representan los valores promedio de todas las plantas estudiadas (ver la seccin de metodologa para la identicacin de los extractos y fracciones).
mayores que la del resto de extractos EC2. Por ltimo, la actividad antioxidante y captadora del anin superxido de la fraccin de acetato de etilo de Tagetes maxima fue signicativamente mayor que la del resto de fracciones acetato de etilo. El extracto crudo desengrasado de Tagetes maxima mostr una actividad captadora de radicales libres mayor que la de quercetina y que la del extracto de pepitas de uva, el mejor compuesto y extracto de referencia utilizados, respectivamente (Tabla 2). Todas las fracciones acetato de etilo, con excepcin de la de Wulfa baccata, mostraron ser ms activas que BHA y que el extracto de romero, pero solamente las de Mikania psilostachya, Tagetes maxima y Tessaria fastigiata mostraron una actividad captadora de radicales libre mayor que el t verde. Ningn extracto o fraccin present una actividad captadora de radicales hidroxilo mayor que el BHA o la quercetina, pero los extractos crudos desengrasados de Mikania psilostachya y Tagetes maxima mostraron una actividad mayor que la de los tres extractos de referencia. Por su parte, los dos extractos (EC1 y EC2) y la fraccin acetato de etilo de Tagetes maxima, y tambin el extracto crudo (EC1) de Baccharis pentlandii, mostraron una actividad captadora del anin
297
superxido mayor que la de las diferentes substancias y extractos de referencia utilizados en este trabajo.
aValores expresados como EAG/mg extracto. bValores expresados como eciencia antiradicalaria. cValores expresados como porcentaje de inhibicin. dValores expresados como factor de proteccin.
Ninguno de los extractos o fracciones mostr una actividad mayor que las pepitas de uva o la quercetina, con excepcin de la fraccin acetato de etilo de Mikania psilostachya, que result ser ms activa que el extracto de pepitas de uva, pero menos que la quercetina. En cuanto a la actividad antioxidante, tampoco ninguno de los extractos o fracciones obtenidos mostr una actividad antioxidante mayor que la de los compuestos o extractos de referencia empleados, con excepcin de la fraccin acetato de etilo de Tagetes maxima, y la clorofrmica de Chromolaena tunariense, las cuales fueron ms activas que el extracto de romero (Tabla 2). Finalmente, ninguno de los extractos o fracciones obtenidos de las nueve especies estudiadas present una estabilidad oxidativa mayor que la del extracto de romero o la quercetina. Sin embargo, la fraccin acetato de etilo de Tessaria fastigiata, que mostr el mayor contenido de fenols totales, present una estabilidad oxidativa comparable a la de quercetina. Del trabajo realizado con estas nueve especies se puede concluir que Tagetes maxima y Mikania psilostachya, por este orden, pueden considerarse las mejores. Tagetes maxima mostr la mejor actividad captadora de radicales libres y anin superxido, y tambin actividad antioxidante, mientras que Mikania psilostachya present la mejor ac298
tividad captadora de radicales hidroxilo, seguida de Tagetes maxima. Por otra parte, aunque el contenido total de fenoles de la fraccin acetato de etilo de M. psilostachya fue mayor que el de la misma fraccin de T. maxima, considerando la suma de los niveles totales de fenoles determinados en todos los extractos y fracciones, el contenido fenlico de Tagetes maxima (1191 EAG/mg) fue mayor que el de Mikania psilostachya (1102 EAG/mg). Adems, Tagetes maxima mostr el segundo valor de FP en el test de Rancimat, y fue la especie que mostr el mejor coeciente de correlacin entre los diferentes mtodos utilizados (R = 0.91), lo que sugiere que posee buenas propiedades antioxidantes. De los seis extractos/fracciones de Tagetes maxima analizados, el extracto crudo desengrasado (EC2) exhibi muy buenos resultados en todos los ensayos, en la mayora de los casos incluso mejores que los de la fraccin acetato de etilo. Este extracto EC2 tambin present propiedades antioxidantes (actividad captadora de radicales libres y anin superxido) mejores que las de los compuestos y extractos de referencia utilizados. Adems, este extracto se considera especialmente interesante por su posible uso en la industria alimentaria o en cualquier otra aplicacin porque no resulta necesario someterlo a un proceso posterior de fraccionamiento o puricacin. Los buenos resultados mostrados por Mikania psilostachya estn en coincidencia con la actividad antiinamatoria mostrada por otras especies de este gnero, como M. laevigata y M. involucrata (Suyenaga et al., 2002). Aparte de Tagetes maxima y Mikania psilostachya, que se consideran las mejores plantas de las aqu estudiadas, Tessaria fastigiata y Baccharis pentlandii tambin mostraron una buena actividad antioxidante y captadora de radicales, de forma similar a otras especies pertenecientes a estos gneros, en particular, T. integrifolia (Desmarchelier et al., 2000), B. coridifolia (Mongelli et al., 1997) y B. trinervis (De las Heras et al., 1998), que son comnmente utilizadas en la medicina tradicional en Sudamrica. Contrariamente, ningn extracto o fraccin de Pluchea sagittalis mostr una actividad antioxidante signicativa, en contraste con la actividad observada por un extracto acuoso de esta planta y por uno metanlico de P. indica, especies ambas que han mostrado poseer actividad
299
antiinamatoria (Sen and Nag Chaudhuri, 1991; Prez-Garca et al., 1996; Sen et al., 2002). En conclusin, el presente trabajo pone de maniesto que la ora de Bolivia puede constituir una fuente interesante de nuevos extractos vegetales antioxidantes, tales como los de Tagetes maxima y Mikania psilostachya, con una potencial aplicacin en diferentes sectores industriales, como el alimentario, cosmtico, farmacutico, entre otros.
Agradecimientos
Este trabajo ha sido nanciado por la Generalitat de Catalunya (2001SGR00124), y el Decanato de Investigaciones y Desarrollo de la Universidad Simn Bolvar, Venezuela. y se ha realizado en el marco del Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnologa para el Desarrollo (CYTED, proyecto IV.11). Agradecemos a los Sres. Ferran Snchez y Luca Lavelli por su asistencia tcnica, y a los Sres. Antonio Maes (EUROMED, Espaa) y Bernd Weinreich (RAPS, Alemania) por el suministro de extractos de pepitas de uva, y de romero y t verde, respectivamente.
Bibliografa
De las Heras, B., Slowing, K., Bened, J., Carretero, E., Ortega, T., Toledo, C., Bermejo, P., Iglesias, I., Abad, M.J., Gmez-Serranillos, P., Liso, P.A., Villar, A., Chiriboga, X., 1998. Antiinammatory and antioxidant activity of plants used in traditional medicine in Ecuador. Journal of Ethnopharmacology 61, 161-166. Desmarchelier, C., Ciccia, G., Coussio, J., 2002. Recent advances in the search for antioxidant activity in South American plants. In: Atta-ur-Rahman (Ed.), Studies in Natural Products Chemistry, vol. 22. Elsevier, Amsterdam, pp. 343-367. Kadarian, C., Broussalis, A.M., Mio, J., Lpez, P., Gorzalczany, S., Ferraro, G., Acevedo, C., 2002. Hepatoprotective activity of Achyrocline satureioides (Lam) D.C. Pharmacological Research 45, 57-61. Lin, C.C., Huang, P.C., 2002. Antioxidant and hepatoprotective effects of Acathopanax senticosus. Phytotherapy Research 14, 489-494. Mensor, L.L., Menezes, F.S., Leito, G.G., Reis, A.S., dos Santos, T.C., Coube, C.S., Leito, S.G., 2001. Screening of brazilian plant extracts for antioxidant activity by the use of DPPH free radical method. Phytotherapy Research 15, 127-130.
300
Mongelli, E., Desmarchelier, C., Rodrguez Talou, J., Coussio, J., Ciccia, G., 1997. In vitro antioxidant and cytotoxic activity of extracts of Baccharis coridifolia DC. Journal of Ethnopharmacology 58, 157-163. Parejo, I., Viladomat, F., Bastida, J., Rosas-Romero, A., Flerlage, N., Burillo, J., Codina, C., 2002. Comparison between the radical scavenging activity and antioxidant activity of six distilled and nondistilled Mediterranean herbs and aromatic plants. Journal of Agricultural and Food Chemistry 50, 6882-6890. Prez-Garca, F., Marn, E., Caigueral, S., Adzet, T., 1996. Anti-inammatory action of Pluchea sagittalis: involvement of an antioxidant mechanism. Life Sciences 59, 2033-2040. Perry, E.K., Pickering, A.T., Wang, W.W., Houghton, P.J., Perru, N.S., 1999. Medicinal plants and Alzheimers disease: from ethnobotany to phytotherapy. Journal of Pharmacy and Pharmacology 51, 527-534. Repetto, M.G., Llesuy S.F., 2002. Antioxidant properties of natural compounds used in popular medicine for gastric ulcers. Brazilian Journal of Medicine and Biological Research 35, 523-534. Schinella, G.R., Tournier, H.A., Prieto, J.M., Mordujovich de Buschiazzo, P., Ros, J.L., 2002. Antioxidant activity of anti-inammatory plant extracts. Life Sciences 70, 1023-1033. Sen, T., Nag Chaudhuri, A.K., 1991. Antiinammatory evaluation of Pluchea indica root extract. Journal of Ethnopharmacology 33, 135-141. Sen, T., Dhara, A.K., Bhattacharjee, S., Pal, S., Nag Chaudhuri, A.K., 2002. Antioxidant activity of the methanol fraction of Pluchea indica root extract. Phytotherapy Research 16, 331-335. Suyenaga, E.S., Reche, E.,, Farias, F.M., Schapoval, E.E., Chaves, C.G., Henriques, A.T., 2002. Antiinammatory investigation of some species of Mikania. Phytotherapy Research 16, 519-523. Thang, P.T., Patrick, S., Teik, L.S., Yung, C.S., 2001. Anti-oxidant effects of the extracts from the leaves of Chromolaena odorata on human dermal broblasts and epidermal keratinocytes against hydrogen peroxide and hypoxanthine-xanthine oxidase induced damage. Burns 27, 319-327. VanderJagt, T.J., Ghattas, R., Vanderjagt, D.J., Crossey, M., Glew, R.H., 2002. Comparison of the total antioxidant content of 30 widely used medicinal plants of New Mexico. Life Sciences 70, 1035-1040. Yan, X., Suzuki, M., Ohnishi-Kameyama, M., Sada, Y., Nakanishi, T., Nagata, T., 1999. Extraction and identication of antioxidants in the roots of yacon (Smallanthus sonchifolius). Journal of Agricultural and Food Chemistry 47, 4711-4713.
301
302
COMPUESTOS ANTIOXIDANTES DEL HINOJO AMARGO Foeniculum vulgare

Carles Codina, Irene Parejo, Jaume Bastida, Jess Burillo, Francesc Viladomat
COMPUESTOS ANTIOXIDANTES DEL HINOJO AMARGO. Foeniculum vulgare

Carles Codinaa, Irene Parejoa, Jaume Bastidaa, Jess Burillob, Francesc Viladomata
a
Departamento de Productos Naturales, Biologa Vegetal y Edafologa, Facultad de Farmacia, Universidad de Barcelona, Avda. Joan XXIII s/n, 08028 Barcelona, Espaa b Servicio de Investigacin Agroalimentaria, (DGA), Unidad de Recursos Forestales, rea de Aromticas y Medicinales, Apdo. de Correos 727, 50080 Zaragoza, Espaa
Introduccin
De las especies mediterrneas estudiadas en una fase previa de monitoreo de plantas con actividad antioxidante (Parejo et al., 2002), se seleccion el residuo constitudo por el material destilado del hinojo amargo, Foeniculum vulgare (Apiaceae), para el estudio de su composicin qumica. Si bien los aceites esenciales de esta planta se han estudiado ampliamente, apenas se tiene conocimiento de la presencia de otros compuestos no voltiles, tales como cidos fenlicos y avonoides. As, tan slo se ha descrito la presencia de cido clorognico, derivados del cido hidroxibenzoico, glicsidos de avonoides y algunas cumarinas en el hinojo dulce (Schmidtlein and Herrmann, 1975, Murray et al., 1982, Bilia et al., 2000, Soliman et al., 2002), mientras que en el hinojo amargo se han identicado unos pocos aglicones y glicsidos de avonoides (Crowden et al., 1969, Harbone & Saleh, 1971, Kunzemann & Herrmann, 1977, Soliman et al. 2002). En relacin a la actividad antioxidante del hinojo, aunque se han investigado sus aceites esenciales con esta nalidad (Ruberto et al., 2000), no se han efectuado estudios anteriores en extractos polares de esta planta. En el presente trabajo se han identicado 42 compuestos fenlicos distintos, de los cuales 27 no se han descrito con anterioridad en ninguna de las variedades (dulce y amarga) de hinojo.
305
Material y Mtodos Material vegetal

Las plantas de Foeniculum vulgare Mill. var. vulgare (Apiaceae) procedan de cultivos establecidos bajo condiciones agronmicamente controladas, en una parcela exprimental de Cetina (Zaragoza, Espaa). El material vegetal estaba constituido por hojas, tallos y estructuras orales, y fue previamente destilado por arrastre de vapor para la extraccin de los aceites esenciales. La extraccin se llevo a cabo en la nca experimental La Alfranca (Diputacin General de Aragn), a nivel de planta piloto, y siguiendo un protocolo de operacin estandarizado por el Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentacin. Una vez destilado, el material se sec al aire, y se pulveriz en molino.
Extraccin y fraccionamiento bioguiado

1kg de material seco del residuo destilado de hinojo se extrajo por decoccin con agua durante 15 minutos. Los extractos acuosos combinados, una vez enfriados y ltrados, se cromatograaron en columnas de Amberlita empaquetadas con XAD-7 and XAD-16, eluyndose con metanol:agua (1:1), metanol, y nalmente acetona, hasta decoloracin. Despus de concentrar, se obtuvieron 54 g de extracto crudo (EC), el cual se redisolvi en agua, y particion con acetato de etilo, lo que di lugar a una fraccin de acetato de etilo (FAE) y otra acuosa (FA). Una alcuota de esta ltima se disolvi en metanol:agua (1:1) y se fraccion por cromatografa de gel ltracin (Sephadex LH-20), obtenindose 96 fracciones de 10 mL, que fueron monitoreadas por TLC utilizando como revelador una solucin metanlica de DPPH, y agrupadas nalmente en siete fracciones (A - G). Cada una de ellas fue objeto de un nuevo fraccionamiento bioguiado y posterior proceso de puricacin mediante Sephadex LH 20, TLC preparativa y/o HPLC semipreparativa. Todo el proceso de extraccin, fraccionamiento y separacin cromatogrca al que fue sometido el residuo de hinojo est resumido en la Figura 1.
306
COMPUESTO ANTIOXIDANTES DEL HINOJO AMARGO. FOENICULUM VULGARE
Figura 1. Esquema del proceso de extraccin y fraccionamiento bioguiado del residuo de hinojo.
307
Identicacin de los compuestos fenlicos

Una vez aislados y puricados, la identicacin de los distintos compuestos se realiz principalmente por espectroscopa de resonancia magntica nuclear (RMN) mono- y bidemensional. Los espectros de protn (1H-RMN) y de carbono (13C-RMN) se realizaron en un espectrmetro Varian Gemini-300. Tambin se realizaron experimentos bidimensionales (HMBC, HMQC, COSY y NOESY) para la conrmacin de algunas estructuras, los cuales se llevaron a cabo en un espectrmetro Inova 500. Para el anlisis de las muestras, stas se disolvieron en metanol deuterado (CD3OD). Adems de la elucidacin estructural de los compuestos mayoritarios obtenidos en el proceso de aislamiento bioguiado, las diferentes fracciones obtenidas se analizaron por cromatografa lquida acoplada a espectrometra de masas (LC/MS), de acuerdo con la metodologa desarrollada al efecto (Parejo et al., remitido), con la nalidad de identicar el mayor nmero posible de substancias fenlicas presentes en el hinojo.
Determinacin de la actividad antioxidante

El extracto crudo, as como cada una de las fracciones obtenidas y de los compuestos posteriormente aislados, se someti al anlisis de la capacidad captadora de radicales libres por el mtodo del DPPH, radicales hidroxilo por el mtodo de quimioluminiscencia (QL), o del anin superxido (SO), los cuales se describen en la METODOLOGA. El contenido de fenoles totales se expresa como equivalentes de cido glico (EAG) por mg de extracto, la actividad captadora de radicales libres e hidroxilo como concentracin inhibitoria 50 % (CI50), y la actividad captadora del anin superxido como porcentaje de inhibicin.
Anlisis cuantitativo por HPLC

Con la nalidad de poder cuanticar los compuestos fenlicos mayoritarios del hinojo, y ante la ausencia de otros mtodos cuantitativos de determinacin de fenoles en esta planta, se desarroll un mtodo analtico de determinacin cuantitativa por HPLC de diez compuestos
308
fenlicos, el cual se valid para distintos parmetros siguiendo la normativa ICH (Parejo et al., remitido). Las substancias de referencia utilizadas para la validacin del mtodo fueron cido 5-O-cafeoilqunico (cido clorognico), quercetina-3-O-rutinsido (rutina) y cido rosmarnico, obtenidos comercialmente, y cido 1,5-O-dicaffeoilqunico, quercetina-3-O-glucurnido (miquelianina), y eriodictiol-7-O-rutinsido (eriocitrina), aislados previamente en nuestro laboratorio de plantas de hinojo. La deteccin de los compuestos fenlicos se realiz a 330 nm, a excepcin de la eriocitrina, que se determin a 280 nm.
Estudio comparativo de distintas muestras de hinojo

Una vez establecido un mtodo de determinacin cuantitativa por HPLC de los compuestos fenlicos presentes en el hinojo, se procedi a determinar el contenido de fenoles en distintas muestras de hinojo: material destilado, material sin destilar, y frutos, puesto que stos ltimos constituyen la droga que gura en las Farmacopeas Europea, Alemana y Espaola, entre otras. Con los tres tipos de muestras se realiz la comparacin de los fenoles cuanticados por HPLC con el contenido total de fenoles determinado por el mtodo espectrofotomtrico de Folin-Ciocalteu descrito en la seccin Diseo Experimental.
Resultados Fraccionamiento bioguiado

Las fracciones obtenidas durante el proceso de separacin y fraccionamiento cromatogrco del residuo de hinojo fueron objeto de evaluacin de su actividad antirradicalaria. La fraccin acuosa (FA) obtenida en el proceso inicial de extraccin y fraccionamiento exhibi el mayor contenido de fenoles totales (297 EAG/mg), as como la mejor actividad captadora de radicales libres (CI50 = 9.94) y radicales hidroxilo (CI50 = 15.23), aunque la inhibicin del anin superxido (58.63 %) fue inferior a la del extracto crudo (Tabla 1). El proceso posterior de fraccionamiento bioguiado de la fraccin acuosa condujo al aislamiento de seis fracciones activas (la fraccin A no puede considerarse activa), siendo las fracciones F y G las que mostraron
309
una mayor actividad. La fraccin F result ser la ms activa de todas, con un valor de CI50 de 4.58 y un porcentaje de inhibicin del 93.6 % para la actividad captadora de radicales hidroxilo y del anin superxido, respectivamente, as como unos niveles elevados de fenoles totales (368.9 EAG/mg). Sin embargo, la fraccin G mostr la mayor actividad captadora de radicales libres (IC50 = 6.45), mientras que la fraccin D present el mayor contenido de fenoles totales (443.5 EAG/mg) y la mayor actividad captadora de radicales hidroxilo (CI50 = 3.92). Por ltimo, la fraccin E mostr la menor actividad captadora de radicales libres y anin superxido, as como el menor contenido de fenoles totales.
a Valores expresados como EAG/mg extracto b Valores expresados como CI50 (g/mL) c Valores expresados como porcentaje de inhibicin a 50 g/mL
310
Aislamiento y elucidacin estructural

La separacin cromatogrca de las fracciones obtenidas, y su posterior puricacin por TLC y HPLC preparativas, di como resultado el aislamiento de doce compuestos, cinco de los cuales son derivados del cido cinmico, entre los que se encuentran tres ismeros del cido clorognico, concretamente los cidos neoclorognico (c. 3O-cafeoilqunico), criptoclorognico (c. 4-O-cafeoilqunico) y el propio cido clorognico (c. 5-O-cafeoilqunico), el cido rosmarnico, de reconocido valor antioxidante, y el cido 1,5-O-dicafeoilqunico. Los otros siete compuestos fenlicos aislados e identicados qumicamente por RMN fueron tres avonoides monoglicosidados: quercetina-3-O-galactsido (hipersido), quercetina-3-O-glucsido (isoquercitrina) y camferol-3-O-glucsido, tres avonoides diglosidados: quercetina-3-O-rutinsido (rutina), eriodictiol-7-O-rutinsido (eriocitrina) y camferol-3-O-rutinsido, y nalmente la quercetina-3-O-glucurnido (miquelianina). Las estructuras de dichos compuestos se representan en la Figura 2.
Compuestos fenlicos minoritarios

Adems de los doce compuestos aislados y caracterizados qumicamente a lo largo del proceso de fracionamiento bioguiado, el anlisis por LC/MS de cada una de las fracciones inicialmente obtenidas permiti la identicacin de un total de 42 compuestos de naturaleza fenlica, los cuales se presentan agrupados por categoras estructurales en la Tabla 2. La distribucin de dichos compuestos entre las distintas fracciones no fue homognea en cuanto a la naturaleza de sus constituyentes. As, las fracciones A, B y G mostraron contener un slo tipo de compuestos fenlicos: un total de diez ismeros del cido qunico estericado con cidos cafeico, ferlico o cumrico, simultneamente en el caso de las fracciones A y B, y avonoides monoglicosidados en el caso de la fraccin G. Por el contrario, el resto de fracciones (C-F) present una composicin fenlica ms diversa, encontrndose en cada una de ellas compuestos pertenecientes a dos o ms grupos estructurales distintos (Tabla 2). De los 42 compuestos identicados, 27 de ellos se describen por primera vez en el hinojo.
311
Figura 2. Compuestos mayoritarios aislados de Foeniculum vulgare
312
* Compuestos identicados por primera vez en el hinojo
313
Determinacin quantitativa de fenoles

La prueba preliminar para determinar las condiciones ptimas de extraccin de los compuestos fenlicos del hinojo puso de maniesto que el mejor rendimiento de la extraccin se obtena utilizando una mezcla de agua:metanol (80:20), y sonicando a temperatura ambiente (25 C) durante 20 minutos. Una vez establecidos estos parmetros, se desarroll un mtodo analtico para determinar cuantitativamente dichos compuestos por HPLC (Parejo et al., remitido). El mtodo ha permitido la separacin de diez de los constituyentes mayoritarios del hinojo, con una resolucin muy aceptable (Figura 3) y en un tiempo de anlisis de 40 minutos, lo que representa un ahorro de tiempo y de solvente con respecto a otros mtodos de identicacin de fenoles. Adems, el mtodo se ha validado para diversos parmetros (linearidad, precisin, etc.).
Figura 3 Cromatograma HPLC del perl fenlico de una muestra destilada de hinojo. Compuestos: 1, cido neoclorognico; 2, cido clorognico, 3, cido criptoclorognico; 4, cido 1,3-O- dicafeoilqunico; 5, eriocitrina; 6, rutina; 7, miquelianina; 8, cido 1,5-O-dicafeoilqunico; 9, cido 1,4-O-dicafeoilqunico, y 10, cido rosmarnico.
314
Contenido de fenoles en distintas muestras de hinojo

Los tres tipos de material de hinojo analizado mostraron un perl fenlico distinto, tanto a nivel cualitativo como cuantitativo. As, mientras el principal compuesto fenlico del hinojo sin destilar fue el cido clorognico, en el material destilado fue el cido rosmarnico, y en los frutos la miquelianina y el cido 1,3-O-dicafeoilqunico (Tabla 3).
1 Fenoles totales cuanticados por HPLC 2 Fenoles totales determinados por el mtodo de Folin-Ciocalteu 3 Proporcin (%) del contenido fenlico determinado por HPLC con respecto al contenido total de fenoles
315
Adems, el material destilado mostr un contenido de eriocitrina relativamente elevado, avonoide ste que se present solamente en trazas en los otros dos tipos de materiales analizados. En general, el contenido de compuestos fenlicos en el material destilado fue superior al del material sin destilar, mientras que los frutos mostraron los menores niveles de fenoles en los tres tipos de muestras. En el caso del hinojo destilado, el contenido de fenoles determinado por HPLC represent el 60.5 % del contenido total de fenoles determinados por el mtodo de Folin-Ciocalteu, acumulando as un mayor contenido de compuestos activos que el material sin destilar y que los frutos de hinojo, materiales en los que dicho porcentaje fue del 37.7 % y 33.7 %, respectivamente.
Conclusiones
En este trabajo, el fraccionamiento bioguiado del extracto crudo del material de hinojo previamente destilado condujo a la identicacin de siete compuestos con actividad captadora de radicales: los cidos clorognico, rosmarnico y 1,5-di-O-caffeoilqunico, y los avonoides eriocitrina (eriodictiol-7-O-rutinsido), rutina (quercetin-3-O-rutinsido), hipersido (quercetin-3-O-galactsido) y camferol-3-O-rutinsido. A excepcin del cido clorognico, identicado en la variedad dulce de Foeniculum vulgare (Bilia et al., 2000), i del camferol-3-Orutinsido, presente en la variedad amarga del hinojo (Kunzemann et al., 1977), el resto de los productos aislados no se han descrito anteriormente en el hinojo. Por el contrario, el aglicn quercetina y el avonoide camferol-3-O-arabinsido, que se haban descrito en los frutos del hinojo (Kunzemann y Herrmann, 1977), no se han encontrado en este residuo vegetal. La identicacin de estos compuestos en el hinojo pone de maniesto la conexin entre su composicin qumica y su actividad antioxidante. Adems, estos resultados pueden contribuir a la interpretacin de los efectos farmacolgicos de esta planta medicinal, y a dar soporte a la posibilidad de que el hinojo posee efectos protectores para la salud humana. Adems, aparte de su uso en la dieta mediterrnea como una especia o en la medicina popular, el residuo deri316
vado de su destilacin para aceites esenciales constituye una fuente accesible de antioxidantes naturales.
Agradecimientos
Este trabajo ha sido nanciado por el Gobierno de Aragn a travs de las Ayudas a la Experimentacin, del Departamento de Agricultura, y por la Generalitat de Catalunya (referencia 2001SGR - 00124), y se ha realizado en el marco del Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnologa para el Desarrollo (CYTED, Proyecto IV.11). Los autores estn especialmente agradecidos a la Dra. Olga Juregui, de los Servicios Cienticotcnicos de la Universidad de Barcelona, por su asistencia tcnica en la identicacin de los compuestos fenlicos por LC/MS.
Bibliografa
Bilia AR, Fumarola M, Gallori S, Mazzi G, Vincieri FF (2000): Identication by HPLC-DAD and HPLC-MS analyses and quantication of constituents of fennel teas and decoctions. J Agric Food Chem 48, 4734-4738. Chen CP, Yokozawa T, Chung HY (1999): Inhibitory effect of caffeis analogues isolated from Salviae miltiorrhizae radix against 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical. Exper Toxicol Pathol 51, 59-63. Crowden RK, Harbone JB, Heywood VH (1969): Chemosystematics of the Umbelliferae. A general survey. Phytochem 8, 1963-1984. Harbone JB, Saleh NAM (1971): Flavonoid glycoside variation in fennel, Foeniculum vulgare. Phytochem 10, 399-400. Kunzemann J, Herrmann K (1977): Isolation and identication of avon(ol)-Oglycosides in caraway (Carvum carvi L.), fennel (Foeniculum vulgare Mill.), anise (Pimpinella anisum L.), and coriender (Coriandrum sativum L.), and of avon-Cglycosides in anise. I. Phenolics of spices. Zeitschrift fr Lebensmittel-Untercuchung und Forschung 164, 194-200. Murray RDH, Mndez J, Brown SA (1982) The Natural Coumarins. Occurence, Chemistry, Biochemistry. Wiley & Sons, Chichester, U.K. Nakatani N, Kayano S, Kikuzaki H, Sumino K, Katagiri K, Mitani T (2000) Identication, quantitative determination, and antioxidative activities of chlorogenic acid isomers in prune (Prunus domestica L.) J Agric Food Chem 48, 5512-5516. Parejo I, Viladomat F, Bastida J, Rosas-Romero A, Flerlage N, Burillo J, Codina C (2002): Comparison between the radical scavenging activity and antioxidant activity of six distilled and non-distilled Mediterranean herbs and aromatic plants. J Agric Food Chem 50, 6882-6890.
317
Parejo I, Juregui O, Snchez-Rabaneda F, Viladomat F, Bastida J, Codina C (Remitido) Separation and characterisation of phenolic compounds in fennel (Foeniculum vulgare) using liquid chromatography-negative electrospray ionization tandem mass spectrometry. J Agric Food Chem. Parejo I, Viladomat F, Bastida J, Schmeda-Hirschmann G, Burillo J, Codina C (En prensa) Bioguided isolation and identication of the non-volatile antioxidant compounds from fennel (Foeniculum vulgare Mill.) waste. J Agric Food Chem. Parejo I, Viladomat F, Bastida J, Codina C (En prensa) High-performance liquid chromatographic analysis of the main antioxidative phenolic compounds in fennel (Foeniculum vulgare) Anal Chim Acta. Rice-Evans CA, Miller NJ, Paganda G (1996): Structure-antioxidant activity relationships of avonoids and phenolic acids. Free Rad Biol Med 20, 933-956. Ruberto G, Baratta MT, Deans SG, Dorman HJ (2000): Antioxidant and antimicrobial activity of Foeniculum vulgare and Crithmum maritimum essential oils. Planta Medica 66, 687-693. Schmidtlein H, Herrmann K (1975): On the phenolic acids of vegetables. IV. Hydroxycinnamic acids and hydroxybenzoic acids of vegetables and potatoes. Zeitschrift fr Lebensmittel-Untercuchung und Forschung 159, 155-263. Soliman FM, Shehata AH, Khaleel AE, Ezzat SM (2002) An acetylated kaempferol glycoside from owers of Foeniculum vulgare and F. Dulce. Molecules 7, 245-251. Yokozawa T, Dong E, Liu ZW, Shimizu M (1997): Antioxidative activity of avones and avonols in vitro. Phytotherapy Res 11, 446-449.
318
Helichrysum italicum COMO ANTIOXIDANTE Y ANTIINFLAMATORIO

Ros JL Schinella GR, Sala A, Recio MC
Helichrysum italicum COMO ANTIOXIDANTE Y ANTIINFLAMATORIO

Ros JL1 Schinella GR2, Sala A1, Recio MC1
1 2
Departament de Farmacologia, Facultat de Farmcia, Universitat de Valncia, Espaa Ctedra de Farmacologa, Facultad de Ciencias Medicas, Universidad Nacional de La Plata, Argentina.
Introduccin
Helichrysum italicum (Roth) G. Don l (Asteraceae) es un arbusto caracterstico de la regin mediterrnea (Figura 1). Las ores y la sumidad orida se han empleado por sus propiedades antiinamatorias y antialrgicas tanto en medicina tradicional como en toterapia [1]. Se utiliza en forma de infusin o extracto uido para problemas respiratorios con componentes alrgicos o infecciosos, as como en patologas dermatolgicas como psoriasis, eczemas y procesos inamatorios.
Figura 1. Helichrysum italicum (Roth) G. Don l (Asteraceae)
321
Diversos estudios se han realizado sobre sus propiedades antiinfecciosas [2,3] y antiinamatorias [4,5]. Recientemente se ha profundizado en su posible mecanismo de accin, incluyendo el estudio de sus propiedades antioxidantes [6-10].
Estudio de especies antioxidantes

En un cribado previo estudiamos la posible actividad antioxidante de 20 especies antiinamatorias seleccionadas [6]. Analizamos el comportamiento de los extractos hidroalcohlicos, metanlicos o acuosos de las diferentes especies frente a diversos modelos experimentales, como peroxidacin lipdica inducida por Fe2+/ascorbato, CCl4/NADPH, y aminopirina N-desmetilasa en microsomas hepticos de rata, generacin de radical hidroxilo (Fe3+-EDTA/H2O2/ascorbato) y superxido (hipoxantina/xantina oxidasa), y peroxidacin de membranas de eritrocitos de rata. De todos los extractos estudiados (Tabla 1), fue el extracto metanlico de Helichrysum italicum uno de los que mejores resultados dio en diferentes pruebas, con IC50 de 32.0 g/ml (Fe2+/ascorbato), 37.2 g/ml (CCl4/NADPH) y 18.9 g/ml (hipoxantina/xantina oxidasa). Como conclusin, consideramos que la fraccin fenlica, especialmente los avonoides, podran ser los responsables de la actividad antioxidante observada [6]. En un estudio posterior [7], fraccionamos el extracto metanlico y estudiamos la actividad antioxidante y antiinamatoria de los subextractos obtenidos: n-hexano, diclorometano, acetato de etilo y n-butanol. A 100 g/ml los extractos diclorometano, acetato de etilo y n-butanol inhibieron la peroxidacin lipdica inducida por Fe2+/ascorbato alrededor del 95%, y por CCl4/NADPH un 87, 80 y 46%, respectivamente. En una prueba paralela frente al radical 2,2-difenil1-picrilhidrazilo (DPPH), los 3 extractos redujeron el radical en porcentajes comprendidos entre el 89% y el 94%. El extracto hexnico inhibi signicativamente la peroxidacin inducida por CCl4/NADPH (62%) y redujo un 33% el radical DPPH. El estudio paralelo de la actividad antiinamatoria demostr que los subextractos poseen en general una actividad similar al extracto metanlico total, variando la respuesta cuantitativa en funcin del agente irritante. De las pruebas
322
HELICHRYSUM ITALICUM COMO ANTIOXIDANTE Y ANTIINFLAMATORIO
realizadas destaca el efecto frente a la reaccin de hipersensibilidad inducida por glbulos rojos de cordero (SRBC), lo que en parte puede justicar el efecto antialrgico descrito en el empleo de esta planta en la medicina popular [7].
Aislamiento y estudio de los principios activos

A partir de los extractos activos aislamos 6 acetofenonas, 1 derivado del maltol y 3 avonoides (Figura 2) [8-10]. De ellos, los compuestos con mayor inters farmacolgico fueron la 4-hidroxi-3(3-metil-2-butenil) acetofenona, como principio analgsico y antiinamatorio, y los avonoides gnafalina y tilirsido como antioxidantes [9,10].
323
Figura 2. Principales compuestos activos aislados de Helichrysum italicum
De todas las acetofenonas aisladas, el compuesto 4-hidroxi-3(3-metil-2-butenil) acetofenona fue el ms relevante por su actividad farmacolgica, ya que posee propiedades analgsicas perifricas y actividad antiiamatoria en procesos agudos. La acetofenona inhibi ligeramente el edema agudo inducido por TPA (acetato de
324
tetradecanoilforbol) en oreja de ratn (20%), el edema agudo en pata de ratn inducido por carragenina (51, 61 y 66%, a 1, 3 y 5 h, respectivamente), y el edema en pata de ratn inducido por fosfolipasa A2 (PLA2) un 54 y 33% a 30 y 60 min, respectivamente, pero slo tiene un dbil efecto en los procesos crnicos o subcrnicos. Respecto al mecanismo de accin, hemos demostrado que est relacionado con la inhibicin del metabolismo del cido araquidnico, inhibiendo a 100 M un 95% la actividad 5-lipoxigenasa (5-LOX) y un 69% la actividad ciclooxigenasa-1 (COX-1) por un mecanismo no redox [9]. A diferencia de las acetofenonas, los avonoides s poseen actividad antioxidante y antiinamatoria en procesos subcrnicos. De los avonoides aislados, el tilirsido fue el ms activo, inhibiendo la peroxidacin lipdica enzimtica (IC50 = 12.6 M) y no enzimtica (IC50 = 28 M), adems posee propiedades captadoras de radical superxido (IC50 = 21.3 M) y del DPPH (IC50 = 6 M). Este compuesto tambin posee propiedades antiiamatorias: inhibe el edema agudo en pata de ratn inducido por PLA2 (DE50 = 35.6 mg/kg), el edema agudo inducido por TPA (DE50 = 0.36 mg/oreja) y la inamacin subcrnica inducida por aplicacin repetida de TPA (0.5 mg/oreja produce un 50% de reduccin de edema y 88% de reduccin de inltracin leucocitaria). El tilirsido slo tiene un ligero efecto en el edema inducido por serotonina y no afecta la actividad de la enzima 5-LOX. En la Tabla 2 se recopilan los valores ms representativos de la actividad antioxidante del tilirsido, en comparacin con los frmacos de referencia. La pinocembrina fue el nico compuesto que inhibi la reaccin de hipersensibilidad retardada inducida por SRBC y es el compuesto ms potente frente al edema agudo en oreja de ratn inducido por TPA (DE50 = 0.06 mg/oreja), sin embargo en el resto de pruebas in vivo el efecto es claramente inferior al del tilirsido. La gnafalina fue el compuesto ms activo en el edema en pata de ratn inducido por serotonina. La gnafalina y la pinocembrina inhiben la produccin de leucotrieno B4 (LTB4) en neutrlos peritoneales de rata, mientras que el tilirsido no afecta la produccin.
325
Tilirosido y gnafalina inhiben la peroxidacin lipdica de lipoproteinas de baja densidad humanas (LDL) inducida por Cu2+ en el mismo orden que la droga utilizada como referencia, probucol [11]
Otros estudios de inters realizados con Helichrysum italicum

Maffei Facino y colaboradores [5] han demostrado la actividad de extractos de Helichrysum italicum de diferente polaridad obtenidos a partir de la sumidad orida frente al eritema producido por radiacin UVB en humanos y en cobayas, siendo en este caso la fraccin enriquecida en avonoides la responsable de la actividad antiinamatoria. El avonoide gnafalina inhibe la generacin de tromboxano B2 (TXB2) y de LTB4, la generacin de radical superxido y la peroxidacin lipdica [11]. Diversos avonoides aislados de Helichrysum italicum por otros investigadores tienen propiedades captadoras de radicales libres [12]. Asimismo, hemos mostrado que el triterpeno tetracclico cido urslico, aislado a partir del extracto clorofrmico de Helichrysum italicum, es activo en diferentes modelos experimentales de inamacin agudos [13] y crnicos [14], e inhibe selectivamente la biosntesis de prostaglandinas (PGs) mediadas por COX-2 [15]. Diversas acetofenonas estructuralmente relacionadas con las aisladas de Helichrysum italicum inhiben el edema inducido por carragenina, la quimiotaxis e inltracin de neutrlos y la agregacin plaquetaria inducida por cido araquidnico, mediante la reduccin
326
de la formacin de LTB4 y PGB2 [16], y poseen actividad antialrgica y antiinamatoria especca de vas areas [17,18].
Conclusiones
Como conclusin se puede justicar el efecto antioxidante y antiinamatorio de la especie Helichrysum italicum en virtud de los efectos observados tanto en los subextractos como en los principios aislados de la especie. Las acetofenonas, son los compuestos responsables de la actividad analgsica y antiinamatoria, aunque en este caso conjuntamente con los avonoides. Respecto al posible mecanismo de accin, la actividad est en parte condicionada por la inhibicin del metabolismo del cido araquidnico (LOX y COX) de algunas acetofenonas y avonoides, y las propiedades antioxidantes de los avonoides.
Bibliografa
Peris JB, Stbing G, Vanaclocha B. Fitoterapia Aplicada, M.I.C.O.F.: Valencia, 1995, pag. 470-471. Recio MC. Estudio de la actividad antimicrobiana de plantas medicinales mediterrneas y aislamiento del principio activo de Helichrysum stoechas (L.) Moench. Tesis doctoral, Facultat de Farmcia, Universitat de Valncia, 1988. Iniesta-Sanmartn E, Toms-Barbern FA, Guirado A, Toms-Lorente F. (1990) Antibacterial avonoids from Helichrysum picardii and H. Italicum. Planta Med. 56: 648-649. Mez S, Alcaraz MJ, Pay M, Ros JL, Hancke JL. (1990) Selected extracts from medicinal plants as anti-inammatory agents. Planta Med. 56: A68. Maffei Facino R, Carini M, Mariani M, Cipriani C. (1988) Anti-erythematous and photoprotective activities in guinea pigs and in man of topically applied avonoids from Helichrysum italicum G. Don. Acta Ther. 14: 323-345. Schinella GR, Tournier HA, Prieto JM, Mordujovich de Buschiazzo P, Ros JL. (2002) Antioxidant activity of anti-inammatory plant extracts. Life Sci. 70: 1023-1033. Sala A, Recio MC, Giner RM, Mez S, Tournier H, Schinella G, Ros JL. (2002) Anti-inammatory and anti-oxidant properties of Helichrysum italicum. J. Pharm. Pharmacol. 54: 365-371. Sala A, Recio MC, Giner RM, Mez S, Ros JL. (2001) New acetophenone glucosides isolated from extracts of Helichrysum italicum with anti-inammatory activity. J. Nat. Prod. 64: 1360-1362.
327
Sala A, Recio MC, Schinella G, Mez S, Giner RM, Ros JL. (2003) A new dual inhibitor of arachidonate metabolism isolated from Helichrysum italicum. Eur. J. Pharmacol. 460: 219-226. Sala A, Recio MC, Schinella G, Mez S, Giner RM, Cerd-Nicols M, Ros JL. (2003) Assessment of the anti-inammatory activity and free radical scavenger activity of tiliroside. Eur. J. Pharmacol. 461: 53-61. Tournier HA, de Buschiazzo PM, Mez S, Ros JL, Schinella GR. Antioxidant activity of avonoids of Helichrysum italicum on human LDL. 38th Annual Meeting of the Argentine Society for Biochemistry and Molecular Biology Research. Villa Carlos Paz, Argentina, 5-9 November 2002. Biocell 2002; 26 (suppl. III): 76. De la Puerta R, Forder RA, Hoult JRS. (1999) Inhibition of leukocyte eicosanoid generation and radical scavenging activity by gnaphaliin, a lipophilic avonol isolated from Helichrysum picardii. Planta Med. 65: 507-511.13.13. Maffei Facino R, Carini M, Franzoi L, Pirola O, Bosisio E. (1990) Phytochemical characterization and radical scavenger activity of avonoids from Helichrysum italicum G. Don (Compositae). : 709-721. Recio MC, Giner R, Terencio MC, Sanz MJ, Ros JL. (1991) Anti-inammatory activity of Helichrysum stoechas. Planta Med. 57: A56. Mez S, Recio MC, Giner R, Ros JL. (1997) Effects of selected triterpenoids on chronic dermal inammation. Eur. J. Pharm. 334: 103-105. Ringbom T, Segura L, Noreen Y, Perera P, Bohlin L. (1998) Ursolic acid from Plantago major, a selective inhibitor of cyclooxygenase-2 catalyzed prostaglandin biosynthesis. J. Nat. Prod. 61: 1212-1215. Favier L, Tonn C, Guerreiro E, Rotelli A, Pelzer L. (1998) Anti-inammatory activity of acetophenones from Ophyosporus axilliorus. Planta Med. 64: 657-659. Stuppner H, Reinisch O, Wiedermann CJ, Wagner H. Acetophenones- compounds from plant origin with inhibitory effects on neutrophil in vitro respiration burst activity. Phytomedicine 1995, 4, 283-286. Dorsch W, Mller AA, Christoffel V, Stuppner H, Antus S, Gottsegen A, Wagner H. (1994) Anthiasmatic acetophenones. An in vivo study on structure activity relationship. Phytomedicine 1: 47-54. Sala A. 2001. Principios antiinamatorios de Helichrysum italicum (Roth) G. Don. Tesis Doctoral, Universitat de Valncia.
328
Phagnalon rupestre COMO ANTIOXIDANTE Y ANTIALRGICO

Ros JL, Schinella GR, Gngora L, Mez S, Giner RM
Phagnalon rupestre COMO ANTIOXIDANTE Y ANTIALRGICO

Ros JL1, Schinella GR2, Gngora L1, Mez S1, Giner RM1
Departament de Farmacologia, Facultat de Farmcia, Universitat de Valncia, Espaa 2 Ctedra de Farmacologa, Facultad de Ciencias Medicas, Universidad Nacional de La Plata, Argentina.
1
Introduccin
Phagnalon rupestre (L.) DC. (Asteraceae) es un subarbusto perenne que se localiza en comarcas litorales y sublitorales de la regin mediterrnea (Figura 1). La sumidad orida y la planta entera se utilizan por sus propiedades antiinamatorias y antialrgicas en medicina tradicional. Adems se ha descrito su empleo como anestsico para aliviar el dolor de muelas, como analgsico en cefaleas y como antiasmtico [1-3]. No existen muchos trabajos experimentales realizados sobre los potenciales efectos farmacolgicos. Se han estudiado las propiedades antimicrobianas de los extractos acuosos y etanlicos [3], y actividad anestsica del aceite esencial obtenido de la planta [4]. Existen tambin referencias farmacolgicas sobre compuestos aislados en esta especie, como las propiedades antioxidantes y antiinamatorias de los avonoides, propiedades antiinamatorias de triterpenos, esteroles y otros compuestos, detectados Figura 1. Phagnalon rupestre (L.) en esta especie.
DC. (Asteraceae)
331
Estudio previo del extracto

En un primer estudio [4], estudiamos la actividad del extracto metablico frente a diversos agentes que producen hipersensibilidad retardada, como 2,4-dinitro-1-uorobenceno (DNFB) y hemates de cordero (SRBC). Cuando el extracto metablico de Phagnalon rupestre se administr tpicamente despus de desencadenar la reaccin de hipersensibilidad con DNFB, la infamacin se redujo un 42% y un 39%, a las 24 h (desencadenamiento de la reaccin) y 96 h (proceso inamatorio debido a la misma), respectivamente. En el caso de la hipersensibilidad retardada inducida por SRBC, la reaccin se redujo un 32% a las 18 h. A continuacin fraccionamos el extracto metanlico total y estudiamos la inhibidora de la reaccin de hipersensibilidad inducida por DNFB de los subextractos obtenidos: n-hexano, diclorometano, acetato de etilo y n-butanol. A 0.5 mg/oreja el extracto acetato de etilo fue el ms activo, inhibiendo el edema causado por la reaccin de hipersensibilidad un 55% tanto a las 24 como a las 96 h.
Aislamiento y estudio de los principios activos

A partir de los extractos activos aislamos 4 derivados de la hidroquinona, 4 esteres cafeoil-qunicos, 1 lignano, 1 acetofenona y 1 avonoide (Figura 2) [1,5-8]. De ellos, los compuestos con mayor inters farmacolgico fueron el avonoide y los derivados de la hidroquinona, los cuales redujeron la inamacin durante la induccin (2 h) y en la fase tarda (96 h). El avonoide redujo el edema un 49% y un 79%, respectivamente, mientras que los derivados de la hidroquinona ms activos lo hicieron sobre un 40-45% y un 70-75%, respectivamente [5].
332
PHAGNALON RUPESTRE COMO ANTIOXIDANTE Y ANTIALRGICO
Figura 2. Principales compuestos activos aislados de Phagnalon rupestre
Inhibiciones enzimticas de los principios de Phagnalon rupestre

A continuacin estudiamos la actividad inhibidora de 3 prenilhidroquinonas y 4 steres del cido cafeico aislados del extracto activo de Phagnalon rupestre. Las enzimas seleccionadas han sido elastasa, mieloperoxidasa (MPO), 5-lipoxigenasa (5-LOX) y xantina oxidasa (XO). De los 7 compuestos estudiados 5 inhibieron la liberacin de elastasa, 5 la actividad MPO, ninguno la actividad 5-LOX y 4 la XO. Los compuestos
333
ms activos han sido los derivados del cido cafeico, especialmente el metil ester del cido 3,5-di-O-cafeoilqunico, cuya CI50 fue de 8.9 M (liberacin de elastasa), 60 M (actividad MPO) [7]. El metil ster del cido 4,5-di-O-cafeoilqunico fue el mas potente inhibidor de XO con una CI50= 3.6 M, el estudio cintico demostr que la inhibicin es de tipo competitiva (Ki = 0.24 M) estos valores estn en el mismo rango que la droga de referencia, allopurinol [8].
Actividad antioxidante de los principios de Phagnalon rupestre

El metil ester del cido 3,5-di-O-cafeoilqunico tambin fue el ms activo como inhibidor de la produccin de radical superxido en leucocitos humanos, con una CI50 de 31.7 M. En el resto de las tcnicas ensayadas los derivados del cido cafeico fueron los ms activos, mientras que los derivados prenilhidroquinona no actuaron en ninguno de los protocolos estudiados, salvo el 1-O-(4-O-cafeoil)--glucopiranosil-1,4-dihidroxi-2-(3,3-dimetilalil)benceno, el cual lleva un grupo cafeoilo, lo que demuestra la actividad de este grupo funcional. En la tabla 1 se recopilan los valores de inhibicin de los compuestos ms activos en las diferentes tcnicas ensayadas.
Actividad antioxidante: CI50 (M) de los principios aislados de Phagnalon rupestre en diferentes modelos experimentales. Compuesto 1 [1-O-(4-O-cafeoil)-glucopiranosil-1,4-dihidroxi-2-(3,3-dimetilalil)benceno], compuesto 2 [metil ester del cido 3,5-di-O-cafeoilqunico, compuesto 3 [metil ester del cido 4,5-di-Ocafeoilqunico], compuesto 4 [cido 3,5-di-O-cafeoilqunico], compuesto 5 [cido 3,5-di-O-cafeoilqunico]
334
PHAGNALON RUPESTRE COMO ANTIOXIDANTE Y ANTIALRGICO
Conclusiones
A la vista de los resultados se puede conrmar que la fraccin activa de los compuestos estudiados es el radical cafeoil, presente en las molculas activas. Los derivados prenilhidroquinnicos sin el radical cafeoil son inactivos en los modelos experimentales ensayados. Los estudios de inhibiciones enzimticas realizados tambin conrman esta caractersticas estructural. Sin embargo, estos compuesto si han sido activos en los modelos de hipersensibilidad retardada inducida por DNFB y SRBC. Como conclusiones generales se puede postular que Phagnalon rupestre tiene propiedades antiinatorias y antialrgicas, cuyos principios responsables son los derivados hidroquinnicos, avonoides y cafeoil-quinatos. Adems, esta especie tiene propiedades antioxidantes, lo cual justica en parte la actividad sobre determinadas enzimas. Los responsables de esta actividad son los derivados del cido cafeico.
Bibliografa
Gngora LJ. 2002. Compuestos fenlicos de Phagnalon rupestre activos en hipersensibilidad y liberacin de mediadores inamatorios. Tesis Doctoral. Universitat de Valncia. Friedman J, Yaniv Z, Dafni A, Palewitch D. 1986. A preliminary classication of the healing potential of medicinal plants, based on a rational analysis of an ethnopharmacological eld survey among Bedouins in the Negev desert, Israel. J Ethnopharmacol 16: 275-287. Ali-Shtayeh MS, Yaghmour RM, Faidi YR, Salem K, Al-Nuri MA. 1998. Antimicrobial activity of 20 plants used in folkloric medicine in the Palestinian area. J Ethnopharmacol 60: 265-271. Ghelardini C, Galeotti N, Mazzanti G. 2001. Local anaesthetic of monoterpenes and phenylpropanes of essential oils. Planta Med 67: 564-566. Gngora L, Giner RM, Mez S, Recio MC, Ros JL. 2002. Phagnalon rupestre as a source of compounds active on contact dermatitis. Planta Med 68: 558-561. Gngora L, Mez S, Giner RM, Recio MC, Gray AI, Ros JL. 2002. Phenolic glycosides from Phagnalon rupestre. Phytochemistry 59: 857-860. Gngora L, Giner RM, Mez S, Recio MC, Schinella G, Ros JL. 2002. Effects of caffeoyl conjugates of isoprenyl-hydroquinone glucoside and quinic acid on leukocyte function. Life Sci 71: 2995-3004. Gngora L, Giner RM, Mez S, Recio MC, Schinella G, Ros JL. 2003. Inhibition of xanthine oxidase by phenolic conjugates of methylated quinic acid. Planta Med 69: 396-401.
335
336
PODER ANTIOXIDANTE DE LOS ESTILBENOS. Relaciones, Actividad, Estructura y Mecanismos

Alejandro Fernndez Arteaga
PODER ANTIOXIDANTE DE LOS ESTILBENOS. Relaciones, Actividad, Estructura y Mecanismos

Alejandro Fernndez Arteaga
Departamento de Ingeniera Qumica, Facultad de Ciencias, Universidad de Granada, Avda. Fuentenueva s/n. 18071, Granada. Espaa
Introduccin
Se presenta una revisin de las propiedades antioxidantes de los compuestos naturales presentes en los extractos del rizoma de una especie vegetal denominada Rheum undulatum L., conocido como ruibarbo o rhubarb, que se encuentra fundamentalmente en Asia Central y que es conocida desde la antigedad y ha sido empleada en la medicina tradicional de Japn, China y Corea, entre otros paises. Los compuestos ms abundantes descritos en ruibarbo1 son del grupo de los estilbenos. Los estilbenos son un grupo de compuestos polifenlicos, que rene unas 200 estructuras2-9 (dentro de las 8000 estructuras que conguran el grupo de los polifenoles), siendo la forma molecular ms extendida en la naturaleza el resveratrol10. Otros compuestos de este grupo son las viniferinas y las toalexinas estilbnicas.
Componentes qumicos del rizoma de r. Undulatum.

Del rizoma seco de R. undulatum sometido a extraccin con metanol a temperatura ambiente y mediante separaciones primero en columna cromatogrca en fase reversa y posteriormente en silica gel normal se aislaron distintos compuestos que se identicaron por RMN-1H y 13C. Las estructuras se muestran en la Figura-11. Adems para aportar ms evidencias acerca de la relacin entre estructura y actividad en el atrapamiento de radicales, se prepararon por va sinttica los siguientes compuestos (Fig 1), a partir de los naturales que fueron aislados de los extractos.
339
Figura-1: estructuras de los compuestos aislados.
La isorrapontigenina (5) se obtuvo por hidrlisis enzimtica a partir de 4. Los dihidroxiestilbenos (1a, 2a, 6a, 7a, 9a y 12a) se obtuvieron por hidrogenacin cataltica en presencia de paladio-carbono de 1, 2, 6, 7, 9 y trans-estilbeno (12). Los derivados completamente metilados (1b, 2b, 6b y 9b) fueron preparados por metilacin con yoduro de metilo en medio bsico a partir de los sustratos 1, 2, 6 y 9. Finalmente, se prepararon los derivados parcialmente metilados (1c y 2c) por metilacin controlada de 1b y 2b.
Estudio de las actividades antioxidantes Actividad de atrapamiento de O2- y de radicales DPPH
El radical DPPH, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, que es estable y muestra una absorcin a 517 nm, ha sido empleado como adecuada herramienta para el ensayo de atrapamiento de radicales, siendo este ensayo independiente de cualquier actividad enzimtica. Cuando este compuesto acepta un electrn o radical de hidrgeno se convierte en un compuesto ms estable y, por consiguiente, la absorcin desaparece. Por otro lado, se us el sistema xantina-xantina oxidasa para la generacin de O2-, que se detecta por la reduccin del NBT (nitroazul de tetrazolio). Las actividades de atrapamiento del radical DPPH y del O2- se examinaron para los constituyentes qumicos del rizoma del R. undulatum y sus derivados y se compa340
PODER ANTIOXIDANTE DE LOS ESTILBENOS. RELACIONES, ACTIVIDAD, ESTRUCTURA Y MECANISMOS
a: Glc: -D-glucopiranosil.
341
raron lo resultados con los de un compuesto de referencia, -tocoferol, que mostr actividad de atrapamiento para el radical DPPH, pero mostr poca actividad para el O2-. De acuerdo con estudios previos, donde el cido glico mostr una potente actividad de atrapamiento de radicales11,12, los resultados descritos indican que el sustituyente 6-galoil es esencial para mostrar la actividad antioxidante. As dos estilbenos con un sustituyente galoilo [raponticinas 2-O-galoato (10) y 6-O-galoato (11)] mostraron una actividad similar pero ms potente que la raponticina (1). Entre los estilbenos sin sustituyente galoilo, el compuesto 7, con cuatro grupos hidroxilo, mostr la actividad ms potente, y la desoxirraponticina (3) mostr la menor actividad. Por otra parte, como se muestra en la Tabla-1, los derivados de dihidroxiestilbeno (1a, 2a, 6a, 7a and 9a) mantuvieron la actividad de atrapamiento para el radical DPPH, pero sus actividades para el O2se redujeron. Como el trans-estilbeno (12) y su dihidroderivado (12a) as como los estilbenos metilados (1b, 2b, 2c, 6b y 9b), no presentan actividad, considerando los resultados para 7, parece claro que las funciones hidroxilo fenlicas de los estilbenos son esenciales para la actividad de atrapamiento de radicales. Paralelamente se examinaron las actividades de inhibicin de la xantina oxidasa para claricar si sus efectos se deben al atrapamiento de O2- o la inhibicin de xantina oxidasa. Como resultado, los compuestos 1c, 6 y 8 mostraron la inhibicin ms fuerte de xantina oxidasa. Estos hallazgos indicaron que la inhibicin de formazan por 1c, 6 y 8 se debi a sus inhibiciones para la xantina oxidasa. De acuerdo a sus requerimientos estructurales para la inhibicin enzimtica, los grupos 3-hidroxi y 4-metoxi son importantes para la actividad.
Actividad antioxidante de estilbenos sobre la peroxidacin lipdica para el sistema de la membrana de eritrocito
Como aparece en la Tabla-2, la mayora de los constituyentes estilbnicos (1-11), excepto 3, mostraron inhibicin de la peroxidacin lipdica de la membrana de eritrocito por hidroperxido de tert-butilo.1
342
a: Concentracin requerida para la reduccin al 50% del radical DPPH 40 mM. b: Valores entre parntesis representan la reduccin o la inhibicin en % a 30 mM. c: Valores entre parntesis representan la reduccin o la inhibicin en % a 40 mM. d: Valores entre parntesis representan la reduccin o la inhibicin en % a 100 mM.
343
a: Valores entre parntesis representan la reduccin o la inhibicin en % a 100 mM.
En otros trabajos est bien documentado que varios estilbenos, incluido 7 y resveratrol (9), mostraron actividad antioxidante de atrapamiento de radicales DPPH, peroxidacin lipdica de LDL inducida por Cu2+ y formacin inducida por TPA de radicales libres en clulas HL-6013-14.
Relacin estructura-actividad.
De los resultados expuestos en las Tablas 1 y 2 se pueden extraer algunas evidencias sobre la relacin estructura-actividad: Los grupos hidroxilo fenlicos de los estilbenos son esenciales para mostrar la actividad. El sustituyente galoilo aumenta la actividad. El sustituyente glucsido en estilbenos reduce la actividad. Los dihidroxiestilbeno derivados mantienen la actividad para el radical DPPH, pero maniestan actividad dbil para el O2-. Adems, varios estilbenos con los grupos 3-hidroxilo y 4-metoxilo inhibieron la xantina oxidasa.
344
Por lo que respecta a los estilbenos, que son polifenoles, su actividad antioxidante es ms potente que la de monofenoles15. En este sentido la presencia de grupos hidroxilo fenlicos es responsable del aumento de la actividad antioxidante. Esto se pone de maniesto al comprobar el aumento de actividad cuando est presente el sustituyente galoilo, lo que concuerda con la actividad observada para el cido glico de manera independiente. Tambin se pone de maniesto la importancia de la presencia de sustituyentes metoxilo, que aumenta la actividad antioxidante, aunque el efecto sea menor que en el caso de grupos hidroxilo16. En general, los estilbenos y todo el conjunto de los polifenoles, de acuerdo a su estructura particular, pueden actuar como antioxidantes donantes de hidrgeno y tambin como agentes quelantes de iones metlicos, previniendo la formacin, catalizada por metales, de especies radicales iniciadoras. La sustitucin dihidroxilo en orto en el anillo es importante para estabilizar el radical libre formado as como para la actividad quelante de metales17. Finalmente, otros factores que inuyen o pueden inuir en el mecanismo de inhibicin de procesos de oxidacin por parte de los estilbenos son la energa de de disociacin del enlace O-H, los efectos de deslocalizacin por resonancia del radical fenilo y los impedimentos estricos derivados de sustituyentes hidrogenados muy voluminosos en los anillos aromticos15.
Mecanismos de la accin antioxidante de los derivados de trans-estilbeno: resveratrol, pinosilvina y 4-hidroxiestilbeno

Usando radiolisis de pulso, se han estudiado en profundidad las reacciones elementales de radicales oxidantes tales como OH, N3 y Tl2+ con tres derivados del trans-estilbeno (4-hidroxi, 3,5-dihidroxi y 3,5,4-trihidroxiestilbeno)18. En funcin de las condiciones de reaccin (pH, radical oxidante), los radicales hidroxiciclohexadienil y fenoxil obtenidos a partir de los tres polifenoles pudieron ser identicados en los espectros de absorcin UV-visible.
345
La concentracin de los radicales hidroxiciclohexadienil se ve disminuida por la eliminacin de agua u OH- formndose radicales fenoxilo de un modo retardado. Para el 3,5-dihidroxiestilbeno se encontr que sus radicales fenoxilos eran mesomricos con las formas radicalarias ceto sobre carbono, las cuales podran explicar sus sensibilidad hacia el oxgeno. De la comparacin del espectro y las propiedades cinticas de los derivados del trans-resveratrol (trans-3,5,4-trihidroxiestilbeno) y sus anlogos, se podra concluir que en disolucin neutra y en disolucin cida el grupo para-hidroxilo del trans-resveratrol es ms reactivo que sus grupos meta-hidroxilo, mientras que la reactividad de los grupos meta-hidroxilo aumenta en disolucin alcalina. Este hecho posibilita al trans-resveratrol el atrapamiento efectivo de radicales libres en el rango de pH entre 2 y 12.
Reacciones
La radiolisis del agua es un mtodo til para la generacin de especies reactivas, entre las que se encuentra el radical hidroxilo, OH. Tambin se generan otros radicales pero se emplea oxido nitroso para eliminar dichas especies y estudiar la reaccin nicamente bajo la presencia del OH.19 Al ser una especie altamente reactiva, oxidante y electroflica el radical hidroxilo reacciona con los compuestos aromticos preferen346
temente via adicin al anillo aromtico. En el caso del fenol, el OH se adiciona al anillo aromtico formando radicales dihidroxiciclohexadienilo los cuales seguidamente eliminan agua para dar lugar a los radicales fenoxilo mediante la reaccin: ArOH + OH ArOH(OH) ArO + H2O Como el resveratrol y sus anlogos pertenecen a los compuestos polifenlicos se puede asumir que se comportan de manera similar a los fenoles cuando reaccionan con el OH. El radical azida es un fuerte oxidante y puede ser generado por la oxidacin con OH del ion azida, N3-, en disolucin saturada en oxido nitroso, N2O, segn la reaccin20: OH + N3- OH- + N3 En contraste con los radicales hidroxilo que reaccionan siguiendo diferentes caminos, el radical azida reacciona mayoritariamente via transferencia electrnica y, de hecho, la reaccin entre N3 y el fenol da lugar al radical fenoxilo. En disolucin alcalina (los fenoles estn presentes como aniones fenoxido), se forman directamente los radicales fenoxilo: ArO- + N3 ArO + N3En disoluciones ligeramente cidas, sin embargo, los radicales fenoxilo se producen va un radical catinico intermedio y no-visible, ya que los polifenoles estn presentes en su forma neutra. Esta reaccin es casi dos ordenes de magnitud ms lenta que en el caso de la disolucin alcalina: ArOH + N3 [ArOH+] ArO + H+ + N3-
347
La reaccin del fenol con el ion Tl2+ es un camino eciente para identicar al radical fenoxilo21. Los iones Tl2+ son obtenidos por la oxidacin de Tl+ con OH en disolucin cida: Tl+ + OH Tl2+ + H2O Una vez obtenidos reaccionan rpidamente oxidando al fenol para producir radicales fenoxilo: ArOH + Tl2+ [ArOH+] ArO + H+ + Tl+
Mecanismos de reaccin A) Trans-4-hidroxiestilbeno

Como el 4-hidroxiestilbeno posee slo un grupo hidroxilo determinar su mecanismo es relativamente simple. En disolucin neutra la reaccin entre el OH y el fenol genera el radical dihidroxiciclohexadienilo, el cual seguidamente elimina agua dando lugar al radical fenoxilo. La velocidad de la eliminacin del agua aumenta en disolucin cida o bsica. Como el resveratrol y sus anlogos pertenecen a los compuestos polifenlicos se puede asumir que se comportan de manera similar a los fenoles cuando reaccionan con el OH. Como el ataque del OH sobre el anillo aromtico representa sustitucin electroflica aromtica, el OH atacar preferentemente las posiciones del anillo activadas por el grupo hidroxilo fenlico, que es un grupo electrn-donante. As el OH entrara en orto o en para en relacin con el grupo hidroxilo fenlico. Como la posicin para est ocupada en el 4-hidroxiestilbeno, el ataque se producir en orto y el radical dihidroxilo debera tener la estructura mostrada en el mecanismo de reaccin que se mostrar seguidamente. Considerando los hechos anteriores, y a la vista de los espectros UV-visible de la reaccin con OH y la conrmacin con los resultantes para la reaccin con Tl2+ se ha propuesto el siguiente mecanismo para la reaccin del 4-hidroxiestilbeno y el OH en disolucin neutra o ligeramente cida:
348
En disolucin alcalina, donde el 4-hidroxiestilbeno se encuentra como anin fenxido, se forma tambin el radical fenoxilo a travs de un intermedio dihidroxilado, pero la eliminacin del agua es mucho ms rpida. Se puede aplicar el mismo mecanismo para la reaccin con el N3 en medio fuertemente alcalino. Finalmente se tiene en cuenta la velocidad de desaparicin del radical fenoxilo, que se desarrolla segn la reaccin: 2ArO productos no radicalarios, y que es 3 veces menor que en el caso del radical derivado del fenol, lo que indica la mayor estabilidad del radical fenoxilo de los 4-hidroxiestilbenos.
B) Trans-3,5-dihidroxiestilbeno
Debido a la presencia de un grupo hidroxilo fenlico adicional, el 3,5dihidroxiestilbeno ofrece ms posibilidades para el ataque del OH que el 4-hidroxiestilbeno, as que pueden ocurrir varias reacciones o seguir varios caminos. Por otro lado la estructura bsica del 3,5dihidroxiestilbeno recuerda la estructura del resorcinol (1,3-dihidroxibenceno) y se puede asumir que mostrarn similar comportamiento respecto al OH. Los espectros denotan la presencia de un radical fenoxilo deslocalizado a travs de formas mesomricas, varias con grupo cetnico. Considerando estos datos y que la reaccin se lleva a cabo en medio ligeramente cido se formula el siguiente mecanismo para la reaccin:
349
Para la determinacin de la estructura del radical intermedio trihidroxiciclohexadienilo se ha tenido en cuenta el efecto orto y para dirigente del grupo hidroxilo fenlico. Este mecanismo tambin puede hacerse extensivo a la reaccin con el N3.
C) Trans-resveratrol
Debido a que la estructura del resveratrol (3,5,4-trihidroxiestilbeno) comprende las estructuras del 4-hidroxiestilbeno y del 3,5-dihidroxiestilbeno, se puede considerar que el resveratrol muestra un comportamiento en reaccin similar a sus anlogos. En la reaccin con el OH se fue haciendo un seguimiento espectroscpico y comparando los espectros con los de la reaccin de 4-hidroxiestilbeno y 3,5-dihidroxiestilbeno. Se observa que en una primera zona el espectro del resveratrol se asemeja al del 4-hidroxiestilbeno mientras que en la otra zona a mayores longitudes de onda, de absorcin, se asemeja al de ambos derivados. Para claricar este resultado se recurri a la reaccin con el Tl2+ comprobando que las especies resultantes coinciden con las obtenidas para el 4-hidroxiestilbeno. Se puede concluir que el OH reacciona con las posiciones activadas por los grupos hidroxilo en para y meta del resveratrol, aun350
que la contribucin de los productos resultantes del ataque en la posicin activada por el grupo hidroxilo en meta es menor que los resultantes del ataque en posiciones activadas por el grupo hidroxilo en para. A valores elevados de pH el comportamiento se invierte y aumenta la reactividad de las posiciones activadas por el grupo hidroxilo en meta.
Para el estudio del mecanismo de reaccin a diferentes pHs se estudi la reaccin con el radical azida, N3, observndose una gran actividad para todo el rango de pH desde 2 hasta 12. De los resultados obtenidos surge el siguiente mecanismo:
351
352
Bibliografa
Antioxidant constituents from rhubarb: Structural requirements of stilbenes for the activity and structures of two new anthraquinone glucosides; Matsuda H.; Morikawa T.; Toguchida I.; et al. Bioorgan Med Chem 2001, 9 (1), 41-50. Postharvest UV-C-irradiated grapes as a potential source for producing stilbeneenriched red wines; Cantos E.; Espin J.C.; Fernandez M.J.; et al. J Agr Food Chem 2003, 51 (5), 1208-1214. Three new trimeric stilbenes from Gnetum gnemon; Iliya I.; Ali Z.; Tanaka T.; et al. Chem Pharm Bull 2003, 51 (1), 85-88. Four dimeric stilbenes in stem lianas of Gnetum africanum; Iliya I.; Tanaka T.; Iinuma M.; et al. Heterocycles 2002, 57 (8), 1507-1512. Dietary antioxidant in disease prevention, Gordon M.H.; Natural Product Reports 1996, 13 (4), 265-273. A survey of phenolic compounds in Spanish wines of different geographical origin; Pea-Neira A.; Hernandez T.; Garcia-Vallejo C.; et al. Eur Food Res Technol 2000, 210 (6), 445-448. Isolation, identication, and antioxidant activity of three stilbene glucosides newly extracted from Vitis vinifera cell cultures; Teguo P.W.; Fauconneau B.; Defeux G.; et al. J Nat Prod 1998, 61 (5), 655-657. Proanthocyanidin glycosides and related polyphenols from cacao liquor and their antioxidant effects; Hatanoa T.; Miyatakea H.; Natsumeb M.; Osakabeb N.; Takizawab T.; Itoa H.; Yoshidaa T.; Phytochemistry 2002, 59, 749758. A comparison of the anticarcinogenic properties of four red wine polyphenols; Soleas GJ, Grass L, Josephy PD, et al. Clin Biochem 2002, 35 (2), 119-124. Handbook of antioxidants; Cadenas,E., Packer, L.; Marcel Dekker-New York, 1996; ISBN: 082479298X. Nogaki, A.; Satoh, K.; Iwasaka, K.; Takano, H.; Takahama, M.; Ida, Y.; Sakagami, H. Anticancer Res. 1998, 18, 3487. Ohsugi, M.; Fan, W.; Hase, K.; Xiong, Q.; Tezuka, Y.; Komatsu, K.; Namba, T.; Saitoh, T.; Tazawa, K.; Kadata, S. J. Ethnopharmacol. 1999, 67, 111. Lee, S. K.; Mbwambo, Z. H.; Chung, H.; Luyengi, L.; Gmez, E. J. C.; Mehta, R. G.; Kinghorn, A. D.; Pezzuto, J. M. Combinatorial Chemistry & High Troughput Screening 1998, 1, 35. Teguo, P. W.; Fauconneau, B.; Defeux, G.; Huguet, F.; Vrcauteren, J.; Mrillon, J. J. Nat. Prod. 1998, 61, 655. Free radical scavening capacity and inhibition of lipid oxidation of wines, grape juices and related polyphenolic constituents, Snchez-Moreno C.; Larrauri J.A.; SauraCalixto F.; Food Research International 1999, 32, 407-412. Study of low-density lipoprotein oxidizability indexes to measure the antioxidant activity of dietary polyphenols; Sanchez-Moreno C.; Jimenez-Escrig A.; SauraCalixto F. Nutr Res 2000, 20 (7), 941-953.
353
Polyphenolic avonols as scavengers of aqueous phase radicals and as chain-breaking antioxidant; Salah N.; Miller N.J.; Paganga G.; Tijburg L.; Bolwell G.P.; Rice-Evans C. Archives of Biochemistry and Biophysics 1995, 322 (2), 339-346. Elementary reactions of the antioxidant action of trasns-stilbene derivatives: resveratrol, pinosylvin and 4-hydroxystilbene; Stojanovic S.; Brede O. Phys. Chem. Chem. Phys., 2002, 4, 757-764. Fendler, E. J. and Fendler, J. H.; Progress in Physical Organic Chemistry, ed. A. Streitwieser and R. W. Taft, Interscience, New York, 1970, vol. 7, p. 242. Alfassi, Z. B. and Schuler, R. H. J. Phys. Chem., 1985, 89, 33593363. ONeill, P. and Steenken, S. Ber. Bunsen-Ges. Phys. Chem., 1977, 81, 550556.
354
FITOQUMICA de Ophryosporus Heptanthus

Alejandro F. Barrero, Pilar Arteaga, M. Mar Herrador, Jess F. Arteaga y Alfredo Rosas-Romero
FITOQUMICA de Ophryosporus Heptanthus

Alejandro F. Barrero1, Pilar Arteaga1, M. Mar Herrador1, Jess F. Arteaga1 y Alfredo Rosas-Romero2
Departamento de Qumica Orgnica, Facultad de Ciencias, Universidad de Granada, Campus de Fuentenueva s/n, 18071 Granada, Espaa. 2 Universidad Simn Bolvar, Departamento de Qumica, Apartado 89000, Caracas 1080A, Venezuela.
1
Introduccin
El gnero Ophryosporus (Fam. Compositae) consta de unas cuarenta especies que se desarrollan en Sudamrica. Algunas de ellas se han estudiado toqumicamente rindiendo una gran variedad de compuestos, como son acetofenonas, tremetonas, cromenos, sesquiterpenos, diterpenos, avanonas y avonas (Bohlmann et al, 1984; Ferracini et al, 1989; Zdero et al, 1990; Sigstad et al, 1992; Sigstad et al, 1993; Sigstad et al, 1996; Favier et al, 1997; De Lampasona et al, 1997; Favier et al, 1998). Nosotros hemos realizado el estudio toqumico de Ophryosporus heptanthus (Wedd.) H. Rob. & King, planta recolectada en las proximidades de Cochabamba (Colombia). En este estudio hemos identicado tres nuevos diterpenos ent-labdancos 8, 11 y 14, la tremetona 2 se describe por primera vez como producto natural y los metabolitos conocidos 1, 3-7, 9, 10, 12 y 13. En un trabajo previo (Ferracini et al, 1989) se ha efectuado un estudio toqumico de Ophryosporus heptanthus recolectada a 3-5 Km al sur de Tarata (Bolivia), aislndose los diterpenos ent-labdnicos 5, 9, 10 y 13, el cromeno precocene II, 1, y la avona sakuranetin, 7, del extracto diclorometnico de sus hojas. El trabajo de recoleccin fue realizado por la Lic. Gloria Saavedra, del Centro de Tecnologa Agroindustrial. Facultad de Ciencias y Tecnologa, Universidad Mayor de San Simn, Cochabamba, Bolivia.
357
Metodos y resultados
Las partes areas secas y pulverizadas de Ophryosporus heptanthus (1989.6 g) se han extrado a temperatura ambiente durante 5 das con t-butilmetil, obtenindose 165.3 g de extracto. Posteriormente, la planta fue nuevamente extrada a temperatura ambiente durante dos meses con MeOH. Este ltimo extracto fue fraccionado con tbutilmetil ter, EtOAc y n-BuOH, obtenindose 71.7 g de fraccin etrea, 10.5 g de fraccin de acetato de etilo y 32.3 g de fraccin butanlica. 25 g de extracto etreo se han cromatograado en columna de silicagel, eluyendo con mezclas de hexano-t-butilmetil ter-acetato de etilo de polaridad creciente, obtenindose 16 fracciones. Despus de sucesivas cromatografas en columna de silicagel, y usando como eluyentes mezclas de hexano-t-butilmetil ter de polaridad creciente, se han identicado los siguientes compuestos, mediante tcnicas de RMN: precocene II, 1 (Ferracini et al, 1989), 5-acetoxi-4,6-dimetoxitremetona, 2 , 4,5-bis(3-metil-2-butenil)-4-hidroxiacetofenona, 3 (Bohlmann et al, 1973), 5,6-dimetoxitremetona, 4 (Bohlmann et al, 1979), 15-acetoxi-3-hidroxi-ent-labda-7,13E-dieno, 5 (Ferracini et al, 1989), 4,5-dimetoxisalicilaldhido, 6, sakuranetin, 7 (Ferracini et al, 1989), 15-acetoxi-2-hidroxi-ent-labda-8(17),13E-dieno, 8, 15acetoxi-2-hidroxi-ent-labda-7,13E-dieno, 9 (Ferracini et al, 1989), 15-acetoxi-2,3-hidroxi-ent-labda-7,13E-dieno, 10 (Ferracini et al, 1989), 2,15-dihidroxi-ent-labda-7,13E-dieno, 11, 2,15-dihidroxient-labda-8(17),13E-dieno, 12 (Bohlmann et al, 1984), 2,15-dihidroxi-ent-labda-7,13E-dieno, 13 (Ferracini et al, 1989) y 15-acetoxi2,3,7-trihidroxi-ent-labda-8(17),13E-dieno, 14. La actividad antioxidante se ha determinado mediante la tcnica de decoloracin de -caroteno (Rosas-Romero et al, 1999), usando como patrn BHA y la tcnica de DPPH (Brand-Williams et al, 1995), mostrndose los resultados en la tabla 1.
358
FITOQUMICA DE OPHRYOSPORUS HEPTANTHUS
359
Tcnica DPPH. bTcnica de decoloracin de -caroteno. cExtracto etereo. Extracto etanlico-Fraccin de acetato de etilo. eExtracto etanlico-Fraccin butanlica
a d
Bibliograa
Brand-Williams W, Cuvelier M E, Berset C (1995): Use of free radical method to evaluate antioxidant activity. Lebennm Wiss Tecnol 28: 25-30. Bohlmann F, Zdero C, Franke H (1973): ber die inhaltsstoffe der gattung Gerbera. Chem Ber 106: 382-387. Bohlmann F, Knoll K-H (1979): Ein neues norsesquiterpen und andere inhaltsstoffe aus Ligularia-Arten. Phytochemistry 18: 877-878. Bohlmann F, Wallmeyer M, King R M, Robinson H (1984): 2-Oxo-labda-8(17),13dien-15-ol from Ophryosporus chilca. Phytochemistry 23: 1513-1514. Ferracini V L, Roewer I, Gao F, Mabry T J (1989): Ent-labdane diterpenoids, tremetone and chrmene derivatives and avonoids from Ophryosporus heptanthus. Phytochemistry 28: 1463-1465. De Lampasona M E P, Cataln C A N, Gedris T E, Herz W (1997): Benzofurans, benzofuran dimers and other constituents from Ophryosporus charua. Phytochemistry 46: 1077-1080.
360
FITOQUMICA DE OPHRYOSPORUS HEPTANTHUS
Favier L S, Nieto M, Giordano O S, Tonn C E (1997): Diterpenoids and avonoids from Ophryosporus charrua. Phytochemistry 45: 1469-1474. Favier L S, Tonn C, Guerreiro E, Rotelli A, Pelzer L (1998): Anti-inammatory activity of acetophenones from Ophryosporus axilliorus. Planta Med 64: 657-659. Rosas-Romero A J, Rojano B, Hernndez C, Martnez C, Silva J, Herrera J (1999): A novel approach to quantitative structure-property relationships is antioxidants. Ciencia 7: 78-87. Sigstad E, Cataln C A N, Daz J G, Herz W (1992): Sesquiterpene lactones, chromans and other constituents of Ophryosporus piquerioides. J Nat Prod 55: 11551156. Sigstad E, Cataln C A N, Daz J G, Herz W (1993): Diprenylated derivatives of phydroxyacetophenone from Ophryosporus macrodon. Phytochemistry 33: 165-169. Sigstad E, Cataln C A N, Daz J G, Herz W (1996): Chromanones, benzofurans and other constituents from Ophryosporus lorentzii. Phytochemistry 42: 1443-1445. Zedero C, Bohlmann F, Niemeyer, H M (1990): Seco-labdanes and other constituents from Ophryosporus oribundus. Phytochemistry 29: 3247-3253
361
DOMESTICACIN Y EXPLOTACIN de la Salvia Canariensis

Javier G. Luis, Luca S. Andrs, Joaqun G. Marrero
DOMESTICACIN Y EXPLOTACIN de la Salvia Canariensis

Javier G. Luis, Luca S. Andrs, Joaqun G. Marrero
Antecedentes
En los pases en vas de desarrollo el uso de las plantas medicinales representa una alternativa importante, en algunos casos nica, a la atencin primaria de la salud. Adems el cultivo y comercializacin de dichas plantas representa una fuente importante de ingresos y disminuye la dependencia de medicamentos importados. Salvia canariensis L. es una planta xerla, endmica del Archipilago Canario, que vive frecuentemente en la zona inferior, aunque no es raro que suba hasta los 1000 m y an ms en la isla de Gran Canaria (Ceballos y Ortuo, 1951; Pitard y Pronst, 1909). Esta especie, que se encuentra espordicamente en colonias ms o menos extensas y a veces en grandes masas, est ampliamente distribuida por todo el Archipilago, a excepcin de la isla de Lanzarote. Nuestro objetivo nal es tratar de rentabilizar como un recurso econmico para Canarias la especie endmica Salvia canariensis va la domesticacin y cultivo de la misma para su explotacin industrial en su vertiente doble de aceites esenciales, para la industria de la perfumera y de sustancias de alto valor aadido como antioxidantes, para la industria cosmtica , farmacutica de nutricientes. Para la obtencin de estos principios activos nos proponemos dos rutas. Una es la separacin optimizada directamente de la parte area de la planta. Y, la otra va es la obtencin de estos principios activos por rutas sencillas de sntesis o semisntesis. Con lo cual apuntamos a contribuir como ejemplo metodolgico de para la domesticacin y
365
aprovechamiento comercial de las especies vegetales promisorias de las regiones implicadas en el Proyecto CYTED IV.11, como fuentes de nuevos compuestos antioxidantes.
Adaptacin
La adaptacin a cultivo de la especie silvestre se realiz plantando esquejes en hileras con separacin de 1 metro y espaciado entre hileras tambin de 1 metro. El progreso del cultivo, que requiri poco riego, se sigui durante dos aos en los que la planta alcanz unos dos metros de altura.
Fitoqumica
El estudio toqumico de la parte area de S. canariensis, dio como resultado el aislamiento y caracterizacin de los diterpenos: galdosol (1) (Gonzlez et al., 1973), salviol (2) y arucatriol (3) (Gonzlez et al., 1975).
Posteriormente y del extracto etanlico de las ores de la misma especie, recolectadas en el mes de Agosto, se obtuvieron, adems del galdosol (1), los diterpenos rosmanol (4) (Gonzlez et al., 1985) y canariquinona (5) (Gonzlez et al., 1989a).
366
DOMESTICACIN Y ESPLOTACIN DE LA SALVIA CANARIENSIS
Tambin de las ores de S. canariensis pero recolectadas esta vez en el mes de Marzo, caracterizamos adems de galdosol (1), salviol (2), rosmanol (4) y canariquinona (5), los diterpenos aromticos: cido carnsico (6), carnosol (7), metilster del cido 7-oxo-carnsico (8), metilster del cido 6-oxo-7-hidroxicarnsico (9), metilster del cido 6-oxo-7-hidroxicarnsico (10), carnosato de rosmanoilo (11), dimetilter metilster del cido 6,7-didehidrocarnsico (12) (Gonzlez et al., 1987), 7-etoxi-rosmanol (13), 7-metoxi-rosmanol (14), rosmaquinona (15) (Gonzlez et al., 1989b) y cido 11-acetoxi-carnsico (16) (Gonzlez et al., 1989b).
Estos estudios, ponen de maniesto una marcada diferencia en la composicin qumica de las ores de esta especie, segn la poca del ao en la que se hace la recoleccin de la planta. As, el componente mayoritario de las ores recolectadas en el mes de Marzo, result ser el cido carnsico (6), cuya presencia no fue detectada en las ores recolectadas en el mes de Agosto. Este hecho seala al cido carnsico (6) como el precursor de los otros diterpenos aromticos con un mayor grado de oxidacin en el anillo B.
367
Se llevaron a cabo pruebas de actividad antioxidante de dos lactonas diterpnicas de la serie del abietatrieno, carnosol (7) y rosmanol (4) que se aislaron de Salvia canariensis.
La viabilidad celular se determin espectrofotomtricamente por reduccin de MTT a azul de formaban. La apoptosis celular se midi por microscopa de uorescencia contando ncleos celulares que presentaban la fragmentacin tpica de clulas apoptticas.
368
Usando clulas PC12 (Feocromocitoma de rata) se observ que a bajas concentraciones (30M) ambos compuestos, (7) con mayor potencia que (4), contrarrestan los efectos citotxicos de dos inductores de la peroxidacin de lpidos de membrana: THB (hidroperxido de tert-butilo) y CUH (hidroperxido de cumeno) usados a la concentracin de 300M (Figura 5) . Adems, en este modelo neuronal, el tratamiento con ambos compuestos contrarresta de forma dosisdependiente la induccin de apoptosis (muerte celular programada) por la protena -amiloide (AP) (Figuras 6 y 7).
Figura 5 Los antioxidantes (4) y (7) revierten de forma similar los efectos deletreos del hidroperxido de cumeno (CUH) sobre la viabilidad celular
CUH 30 M CUH 100M (7) (4)
+ +
+ +
+ +
+ +
369
Figura 6 Los compuestos (4) y (7) revierten de forma similar la apoptosis inducida por hidroperxido de tert-butilo (THB) en clulas PC12 de rata.
THB 100 M THB 300 M (7) (4)
+ +
+ +
+ +
+ +
Puesto que la acumulacin de AP, que induce la generacin de RLO en neuronas, se considera responsable del dao del sistema nervioso central que caracteriza la enfermedad de Alzheimer, estos resultados demuestran un potencial teraputico importante para estos compuestos. Los compuestos (4) y (7) son capaces de contrarrestar de forma mucho ms ecaz que otros antioxidantes naturales y sintticos la apoptosis inducida por perxidos lipdicos en clulas neuronales de rata PC12 (Feocromocitoma de rata). Los dos compuestos contrarrestan el efecto deletreo de la protena -amiloide, que induce estrs oxidativo neuronal y que juega un papel importante en la enferme370
Figura 7.- El compuesto (7) (30 M) previene de forma ms efectiva que otros antioxidantes naturales (Vitamina E) y sintticos (PDTC, SHA y N-acetilcisteina) la apoptosis inducida por la protena -amiloide.
-AP 10 M (7) 25 M Vitamina E 100 M PDTC 100 M SHA 200 M N-acetilcisteina 200M
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
dad de Alzheimer, con lo que ambos presentan un potencial teraputico interesante. Los diterpenos aislados por nuestro grupo de trabajo, de varias especies de Salvia, fueron sometidos a estudios de actividad antimicrobiana frente a bacterias Gram (+) y Gram (-) y frente a levaduras; actividad citotxica frente a dos lneas celulares (HeLa y Hep-2); actividad antivrica y actividad antioxidante. Por otro lado el rosmanol (4) y el carnosol (7) mostraron ser potentes antioxidantes (Mederos et al., 1997) en estudios de cultivo in
371
vitro de algunas especies de inters econmico, impidiendo la excrecin al medio de cultivo de polifenoles que eran un problema para el crecimiento de los brotes.
Metodologa de la extraccin
Bsqueda de un mtodo rpido y ecaz para el aislamiento, a partir de extractos de S. canariensis L., de carnosol y otros diterpenos con alta capacidad antioxidante. De esta manera pusimos a punto una metodologa sencilla y econmica para la obtencin de estos productos a partir de un extracto acetnico a temperatura ambiente de la parte area (ramas, hojas y ores) de S. canariensis L. cultivada. Por otro lado provocamos la transformacin completa del cido carnsico (6) en carnosol (7) directamente en el extracto acetnico de la planta, de acuerdo con el Esquema 6. De esta manera logramos establecer una tcnica ecaz para aumentar el contenido de carnosol (7) en el extracto antes de ser sometido al proceso de obtencin.
Esquema 6
Camino sntetico y de semisntesis

Desde el punto de vista sinttico, el cido carnsico (6) y el carnosol (7) nos parecan los sintones ms apropiados para llevar a cabo una aproximacin a la sntesis parcial de los diferentes diterpenos abietatrinicos aislados del gnero Salvia y que junto con 6 y 7, constituyen la fraccin con potente capacidad antioxidante de S. canariensis El rosmanol (4) lo obtuvimos con buen rendimiento a partir del compuesto (26) tal y como se muestra en el Esquema 7
372
373
Esquema 7
Para la rosmaquinona porponemos el sguiente camino:
Esquema 8
374
Para el hidroxirosmanol:
Esquema 9
Los derivados metoxilado y etoxilado en el carbono C-7 del rosmanol (4). As proponemos le Esquema 10, ara la sntesis del 7-metoxirosmanol (14) y del 7-etoxirosmanol (139) (Tius y Fauq, 1986).
Esquema 10
375
El epirosmanol lo sintetizamos siguiendo el Esquema 11.
Esquema 11
Al emplear el Esquema 12, obtuvimos un compuesto nuevo en la literatura, al que hemos denominado 12,16-epoxicarnosol (30).
Esquema 12
376
La formacin del rosmanol (4), galdosol (1), isorosmanol (21) e isogaldosol (22), la justicamos mediante el Esquema 13, el cual se basa en la participacin del oxgeno en su estado singlete en los procesos biosintticos hacia la formacin de diterpenos abietatrinicos altamente oxidados en los anillos B y C, tal como lo hemos publicado anteriormente (Cella et al., 1975) llevando a la conclusin de la participacin de un intermedio perepxido.
Esquema 13
377
Por su parte el rosmanol (4) y el isorosmanol (21) lo podemos obtener a partir del carnosol (7) segn el Esquema 14.
Esquema 14
378
Agradecimientos
El trabajo de investigacin se ha desarrollado en el contexto del Proyecto IV.11 del CYTED (Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnologa para el Desarrollo), conanciado por el FEDER y fondos del Plan Nacional de I+D. La investigacin se ejecuta conjuntamente entre nuestro grupo del IUBO Antonio Gonzlez de La Universidad de La Laguna (donde se realizan los aspectos analticos, de separacin, reactividad qumica y sntesis) y el Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular de la Facultad de Medicina de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria.
Bibliografa
Ceballos L, Ortuo F (1951):Vegetacin forestal de las Canarias Occidentales, Instituto Forestal de Investigaciones y Experiencias. Madrid, pag. 420. Cella JA, Kelley JA, Kenehan EF (1975): J Org Chem 40, 1860. Gonzlez AG, Fraga BM, Luis JG, Ravelo AG (1973): Experientia, 29, 1471. Gonzlez AG, Fraga BM, Luis JG (1975): An Qum 71, 701. Gonzlez AG, Fraga BM, Luis JG, Herrera JR, Ravelo AG (1985): Phytochem 24,1853. Gonzlez AG, San Andrs L, Luis JG, Herrera JR, Ravelo AG (1989a): Can J Chem 67, 208. Gonzlez AG, Rodrguez CM, Luis JG (1987): Phytochem 26, 1471. Gonzlez AG San Andrs L, Herrera JR, Luis JG, Ravelo AG (1989b): Can J Chem 67, 208. Mederos S, San Andrs L, Luis JG (1997): Acta Societatis Botan Pol 66, 347. Pitard J, Pronst L (1909):Les Isles Canaries, ores del lArchipiel, Ed. Paul Kinckieck, Libraries des Sciences Naturalles. Pars, pag. 307. Tius MA, Fauq AH (1986): J Am Chem Soc 108, 1035.
379
380
DOMESTICACIN Y EXPLOTACIN DE PLANTAS AROMTICAS Y MEDICINALES COMO FUENTE POTENCIAL DE ANTIOXIDANTES

Jess Burillo, Irene Parejo, Francesc Viladomat, Jaume Bastida, Alfredo Rosas Romero, Carles Codina
DOMESTICACIN DE PLANTAS AROMTICAS Y MEDICINALES COMO FUENTE POTENCIAL DE ANTIOXIDANTES

Jess Burilloa, Irene Parejob, Francesc Viladomatb, Jaume Bastidab, Alfredo Rosas-Romeroc, Carles Codinab
a
Servicio de Investigacin Agroalimentaria, (DGA), Unidad de Recursos Forestales, rea de Aromticas y Medicinales, Apdo. de Correos 727, 50080 Zaragoza, Espaa b Departamento de Productos Naturales, Biologa Vegetal y Edafologa, Facultad de Farmacia, Universidad de Barcelona, Avda. Joan XXIII s/n, 08028 Barcelona, Espaa c Departamento de Qumica, Universidad Simn Bolvar, Apartado 89000, Caracas 1080A, Venezuela
Introduccin
Son muchas las plantas medicinales que se han estudiado intensamente en los ltimos aos en bsqueda de antioxidantes naturales (Lugasi et al., 1998; Velioglu et al., 1998; Khknen et al., 1999; Mensor et al., 2001; Singh et al., 2002). Las especias y plantas aromticas, ampliamente distribudas por la regin mediterrnea, tienen un gran inters comercial debido a sus aceites esenciales (Lis-Balchin & Hart, 1999; Burits et al., 2001). Algunas de ellas, por ejemplo, la soja, romero, timo, organo y otras especies de Labiadas, ya se han estudiado en relacin a su actividad antioxidante (Haraguchi et al., 1996; Lagouri & Boskou, 1996; Hidalgo et al., 1998; Wang et al., 1999; Marinova & Yanishlieva, 1997). Por otra parte, en los ltimos aos la bsqueda de antioxidantes naturales se est extendiendo tambin a los residuos agrcolas como una fuente alternativa a los antioxidantes sintticos utilizados en las industrias alimentaria y farmacutica. Algunos de dichos residuos incluyen los restos de la industria olivarera (Capasso et al., 1999; Visioli et al., 1999; Lesagemeessen et al., 2001) y vitcola (Torres & Bobet, 2001), y las pieles de patata (Desotillo et al., 1998). Sin embargo, no existen antecedentes del estudio de la actividad antioxidante en residuos procedentes de plantes utilizadas en la extraccin de aceites esenciales. En la actualidad el cultivo de plantas aromticas y medicinales en Espaa se presenta con posibilidades de rentabilidad para zonas donde
383
los cultivos tradicionales pueden considerarse poco rentables. En Aragn dichas posibilidades se ponen de maniesto en distintas comarcas en las que existe una abundante ora espontnea en plantas aromticas y medicinales, siendo necesario mejorar genticamente dicha ora con especies o variedades seleccionadas, adaptarla a cultivo, y utilizar las tcnicas culturales ms adecuadas para poder contribuir en la mejora global de la rentabilidad agraria, en la jacin social, y en la conservacin del medio natural. Los cultivos experimentales de plantas aromticas y medicinales que se vienen desarrollando desde el Servicio de Investigacin Agroalimentaria (Burillo y Garca-Vallejo, 2003), determinan la importancia que puede suponer la utilizacin de materias primas transformadas de estas plantas para la industria en general (Guilln et al., 1996), contando adems con el valor aadido que se obtendra si del material de desecho (material destilado en este caso) se consiguiera una fuente potencial de antioxidantes de origen natural. Una vez realizados una serie de estudios previos sobre la ora autctona de plantas aromticas y medicinales en Aragn, se inici el cultivo experimental en diferentes comarcas, y se estudiaron las plantas teniendo en cuenta los siguientes objetivos: a) conocer la capacidad de adaptacin agronmica de seis especies o ecotipos seleccionados, con vistas a la planicacin de un cultivo moderno y rentable, b) desarrollar las tcnicas de cultivo ms adecuadas en mecanizacin, marcos de plantacin y recoleccin, c) conocer la potencialidad productiva en rendimiento y calidad de la materia prima obtenida (materia seca y aceite esencial), d) efectuar un estudio econmico del cultivo en base a los parmetros de mercado, y e) evaluar la capacidad antioxidante del material objeto de estudio en sus dos formas: material destilado y material sin destilar.
Material y Mtodos Plantas objeto de estudio

El material vegetal utilizado en el presente estudio estuvo constituido por las especies vegetales que se indican en las pginas
384
DOMESTICACIN Y ESPLOTACIN DE PLANTAS AROMTICAS Y MEDICINALES COMO FUENTE POTENCIAL DE ANTIOXIDANTES
siguientes, las cuales se cultivaron bajo condiciones agronmicas controladas.
Localizacin geogrca de las parcelas experimentalesLos

ensayos experimentales se desarrollaron en dos localidades, Cetina y Alacn, ubicadas, respectivamente, en las comarcas de CALATAYUD (provincia de Zaragoza) y del BAJO ARAGN (provincia de Teruel), ambas representativas de este tipo de cultivos. La experimentacin se llev a cabo en colaboracin con agricultores de las zonas seleccionadas.
Figura 1 Mapa de la localizacin geogrca de las localidades de Cetina (Calatayud, Zaragoza) y Alacn (Bajo Aragn, Teruel) en la Comunidad Autnoma de Aragn
Comarca de Calatayud (Zaragoza)

La Comarca de Calatayud se encuentra situada en el curso alto del ro Jaln, entre la provincia de Guadalajara y las comarcas de Cariena y Daroca, limitando al oeste con la provincia de Soria.
Caractersticas de la parcela de Cetina (Zaragoza)

Parcela de riego por inundacin Altitud de la zona 650 m sobre el nivel del mar Precipitacin media anual 434 mm Temperatura media anual 13.7 C Tipo de suelo de textura franco-arcillo-limosa
385
Especies cultivadas
Estragon Artemisia dracunculus L. Hinojo amargo Foeniculum vulgare Mill. Meliloto Melilotus ofcinalis Lam. Milenrama Achillea millefolium L.
Comarca del Bajo Aragn (Teruel)

La Comarca del Bajo Aragn se localiza en torno a la Sierra de Arcos, en pleno corazn de la provincia turolense.
Caractersticas de la parcela de Alacn (Teruel)

Parcela de secano Altitud de la zona 702 m sobre el nivel del mar Precipitacin media anual 400 mm Temperatura media anual 15 C Tipo de suelo de textura franco-arcillosa
Especies cultivadas
Espliego Lavandula latifolia (L. Fil.) Medikus Lavandn Super Hbrido de Lavandula angustifolia x L. latifolia
386
Espliego Familia botnica

Lamiaceae
Nombre cientco
Lavandula latifolia (L. Fil) Medikus
El Espliego es una planta perenne, de base leosa, con una raz pivotante fuerte, formando una mata de la que surgen numerosas ramas sencillas y erguidas, pudiendo alcanzar ms de 50 centmetros de altura. Las hojas de color verde intenso son lanceoladas. Las ores, de color azul violceo, estn agrupadas en glomrulos, dispuestos en pisos que forman espigas terminales. Las brcteas orales son estrechas, verdes y con un solo nervio dorsal. El cliz es tubuloso. La corola, de 8 a 10 mm de longitud, es tubular. El fruto es un tetraquenio, con cuatro semillas oscuras y brillantes (Muoz, 1987).
Importancia del cultivo

La plantacin del cultivo se debe realizar con material vegetal seleccionado procedente de vivero-semillero (planta en cepelln o a raz desnuda). El Espliego se adapta bien para poder mecanizar tanto las labores de mantenimiento como su recoleccin en suelos calizos de secano. Inicia la produccin al segundo ao de su puesta en cultivo, pudiendo tener un ciclo productivo de ms de seis aos. La oracin se desarrolla en el mes de agosto. El mercado lo que demanda mayoritariamente es el aceite esencial obtenido por destilacin.
387
Estragn Familia botnica

Asteraceae
Nombre cientco
Artemisia dracunculus L.
Es una planta perenne leosa, de tallos erguidos, ramicados, que pueden llegar a medir ms de 1 metro de altura. Las hojas son enteras, lineares o lanceadas, ligeramente dentadas de color verde. Las ores son amarillentas y se hallan agrupadas en captulos, dispuestos en panojas terminales. Las hojas secas tienen sabor picante, algo amargo (Muoz, 1987).

Su cultivo se debe efectuar en zonas con pluviometra por encima de los 600 mm anuales; de lo contrario ser necesario efectuar riegos puntuales al cultivo durante primavera-verano. La plantacin se realiza por divisin vegetativa con pies sanos obtenidos de plantas madre seleccionadas. Tiene una gran plasticidad, tanto en tipos de suelo como en su adaptacin a distintas altitudes, y al tratarse de una planta de porte erguido se puede mecanizar fcilmente. La oracin tiene lugar en el mes de julio, y entra en produccin el primer ao de cultivo, pudiendo tener un ciclo productivo de 6-7 aos. El mercado demanda materia seca (hoja/or).
388
Hinojo amargo Familia botnica

Apiaceae
Nombre cientco
Foeniculum vulgare Mill
Planta perenne, herbcea, de altura variable entre 0.8 y 2 m, lampia, de color glauco y cepa densa; dispone de tallos robustos, lisos, estriados, con hojas envainadoras. Las ores amarillas estn agrupadas en umbelas, de 12 a 30 radios, muy largos y casi iguales. Los frutos son diaquenios, de permetro circular en su corte transversal, de color gris oscuro. Toda la parte area de la planta tiene un olor anisado y un sabor picante y amargo (Muoz, 1987).

Es una especie que en la actualidad est poco seleccionada, y todava se recolecta a nivel espontneo en distintas zonas espaolas. Dado que es una planta que su demanda por parte del mercado va en aumento, es necesario planicar su cultivo mecanizado, contando con material vegetal seleccionado. Aunque su cultivo puede darse en secanos frescos, en zonas con pluviometra menor de 400 mm anuales, es conveniente dar riegos puntuales en verano. Al tener oracin escalonada es necesario ajustar la recoleccin cuando tiene el mayor porcentaje de frutos maduros que suele ser en el mes de septiembre. Se demanda por parte del mercado frutos/semilla y aceite esencial.
389
Lavandn Super Familia botnica

Lamiaceae
Nombre cientco
Hbrido de Lavandula angustifolia x Lavandula latifolia
Forma una mata leosa, perenne, que todos los aos emite brotes o tallos con ores en espiga. Las brotaciones son ramicadas. Las ores son de color azul grisceo, ms parecidas a la Lavanda. El Lavandn Super es una planta hbrida obtenida en laboratorio en Francia. En el Pirineo se puede encontrar en estado natural en las zonas donde conviven el Espliego y la Lavanda.

Al ser una planta hbrida que no produce semilla, su multiplicacin se realiza por estaquilla. Para su puesta en cultivo es necesario contar con estaquillas enraizadas procedentes de plantas madre seleccionadas. Es una planta a la que se le han adaptado una serie de mquinas desde su conguracin como cultivo. Se puede cultivar en terrenos calizos de secanos frescos. Inicia la produccin al segundo ao de su plantacin, y su ciclo productivo puede durar ms de diez aos. El mercado de perfumera y cosmtica demanda principalmente de esta planta su aceite esencial.
390
Meliloto Familia botnica

Fabaceae
Nombre cientco
Melilotus ofcinalis Lam.
Es una planta herbcea, anual o bianual, lampia, con hojas compuestas, trifoliadas, que recuerdan a la de la alfalfa, ligeramente dentadas, con estpulas lanceoladas. Las ores son pequeas, amarillas, olorosas y agrupadas en racimos delgados, que arrancan de la axila de las hojas superiores y son ms largos que ellas. El fruto es una legumbre pequea, de unos 3 mm, ovoidea, de color verde-amarillenta, con arrugas transversales, que contiene una o dos semillas redondeadas. Florece en verano. La planta tiene un sabor ligeramente amargo y al secarse desprende un intenso olor a cumarina (Muoz, 1987).

Dado el poder germinativo de la semilla, que puede llegar al 85% en condiciones ptimas, y teniendo en cuenta que su cultivo puede considerarse anual, lo interesante es efectuar siembra directa con mquina de precisin, manteniendo un marco de plantacin que permita realizar labores de bina al cultivo, y poder calcular el nmero de plantas por ha. Se adapta bien a distintos tipos de suelo y altitudes, aunque requiere terrenos de secano fresco, o en zonas ridas riegos de apoyo en primavera-verano. La demanda por parte del mercado de esta planta es de materia seca hoja y or.
391
Milenrama Familia botnica

Asteraceae
Nombre cientco
Achillea millefolium L.
Planta herbcea, perenne, con tallo subterrneo, o rizoma. El tallo areo es simple, erecto, algo velloso y de 50 a 80 cm de altura. Las hojas son dentadas, doblemente divididas en foliolos lineales, que a su vez se dividen en otro plano, dando al follaje un aspecto rizado. La inorescencia es un corimbo de cabezuelas, formada por ores de color blanco o rosado. Los frutos son aquenios. La planta desprende un olor canforceo (Muoz, 1987).

La puesta en cultivo de esta planta se puede realizar por semilla, divisin vegetativa o rizomas. Es conveniente disponer de plntulas obtenidas en vivero-semillero para poder realizar la plantacin. Se puede adaptar a distintos tipos de suelo de secanos frescos; si el cultivo se realiza en zonas de menos de 400 mm de pluviometra, ser necesario dar riegos puntuales en primavera-verano. Entra en produccin el primer ao de cultivo. La oracin tiene lugar durante el mes de junio, aunque puede seguir dando ores durante todo el verano y principio de otoo. Su ciclo productivo puede llegar a ser de 4 aos o ms. El mercado demanda materia seca de las sumidades oridas.
Diseo experimental del ensayo agronmico

A continuacin se describen los ensayos agronmicos realizados en las respectivas parcelas experimentales de Cetina y Alacn.
392
Ensayo de Cetina (Zaragoza)

La plantacin se realiz en el mes de octubre de 1999 y la densidad de plantacin fue de 20.000 plantas/ha. Puntualmente se realizaron riegos de apoyo por inundacin, debido a que durante el perodo de primavera-verano existe una cierta escasez de lluvias en la zona. El diseo utilizado en la parcela de estudio fue el de bloques al azar con tres repeticiones, y el modelo estadstico aplicado fue el del factorial triple: bloque-especie-ao, considerando en todos los casos factores jos. El marco de plantacin fue de 1m de separacin de las x 0.50 m de planta a planta (0.50 m2/planta).
Ensayo deAlacn (Teruel)

Las muestras estudiadas corresponden al nal del ciclo productivo de las especies o ecotipos ensayados en secano. El diseo utilizado en la parcela de estudio fue el de bloques al azar con tres repeticiones, y el modelo estadstico aplicado fue el del factorial triple: bloque-especie-ao, considerando en todos los casos factores jos. El marco de plantacin fue de 1.50 m x 0.70m (1.05 m2/planta), es decir, una densidad de plantacin de 9.600 plantas/ha.
Las variables controladas para cada especie fueron las siguientes:

Produccin anual de biomasa pesada en campo Estudio fenolgico de la planta en el momento de la recoleccin. Porcentaje de marras (% para cada especie) Produccin anual y rendimiento de materia seca Rendimiento y produccin de aceite esencial
Recoleccin y tratamiento del material vegetal

Las muestras se recolectaron cuando las plantas se encontraban en el estadio fenolgico de oracin.
393
Una parte del material vegetal recolectado se someti a un proceso de secado a la sombra, bajo corriente de aire, durante un perodo de 7 das. El resto del material se destin a la obtencin de aceites esenciales por arrastre de vapor a escala de planta piloto y por hidrodestilacin en laboratorio por el mtodo Clavenger acogido a Farmacopea Europea. Todo el proceso se realiz en la Finca Experimental La Alfranca, de la Diputacin General de Aragn.
Procesamiento de las muestras

Siguiendo el procedimiento metodolgico diseado para el desarrollo del proyecto (ver Diseo Experimental), consistente en un proceso de extraccin y fraccionamiento secuencial, obtuvimos los siguientes extractos y fracciones: EC1, extracto crudo inicial (metanlico); EC2, extracto crudo desengrasado (resultante del tratamiento del EC1 con hexano); y las fracciones FHX, fraccin hexnica; FC3, fraccin clorofrmica, y FCA, fraccin acetato de etilo, obtenidas por la particin sucesiva del EC1 con dichos solventes. La fraccin acuosa residual se codic como FOH.
Anlisis de la capacidad antioxidante

En cada muestra se determin el contenido de fenoles totales (CFT), la capacidad captadora de radicales libres (por el mtodo del DPPH), radicales hidroxilo (por el mtodo de quimioluminiscencia) y del anin superxido (por el sistema superxido-azul de nitrotetrazolio hipoxantina/xantina oxidasa), as como la actividad antioxidante (por el mtodo de decoloracin del -caroteno), segn los procedimientos analticos descritos en la Diseo Experimental. Las actividades antioxidante y captadora de radicales determinadas en cada una de las muestras estudiadas se compararon con las de diferentes productos de referencia, la quercetina (Q), un antioxidante de origen natural, el butilhidroxianisol (BHA), uno de los antioxidantes sintticos ms ampliamente utilizados en la industria alimentaria, y tres extractos comerciales de origen natural con elevada actividad antioxidante: romero (R), t verde (TV) y pepitas de uva (PU). Todos los anlisis (extracciones y fraccionamientos) re realizaron por triplicado, y los resultados se sometieron a un anlisis multifacto394
rial de ANOVA para la comparacin de los resultados correspondientes al material destilado y sin destilar, a los extractos y fracciones, as como a las seis plantas estudiadas. Las diferencias se consideraron signicativas para valores de P<0.05.
Resultados y discusin A) Datos de produccin

Los resultados productivos de las plantas estudiadas (Tablas 1-6, Figuras 2-5) hay que encuadrarlos en los dos sistemas de cultivo descritos: secano y regado eventual.
Parcela de secano
a) Espliego: Las muestras de Espliego corresponden al nal del ciclo productivo de la parcela experimental de Alacn. El Espliego empieza a producir al segundo ao de su plantacin. La vida en cultivo del Espliego puede alargarse por encima de los 10 aos, aunque en realidad las producciones de materia vegetal son interesantes los primeros cuatro aos, para descender posteriormente y hacer que la produccin sea muy baja a partir del sptimo ao. El comportamiento productivo del aceite esencial se mantiene en unos parmetros similares. En base a los resultados obtenidos y segn precios del mercado del aceite esencial de Espliego, los seis primeros aos del cultivo se pueden considerar rentables, ya que se estima un rendimiento neto por hectrea y ao de unos 500 euros. La produccin cerealista de la zona es baja, lo cual hace difcil su rentabilidad, ya que se estima en 2200 kg/ha ao. b) Lavandn Super: Al igual que el Espliego, las muestras estudiadas de Lavandn super corresponden al nal del ciclo productivo de la parcela experimental de Alacn. El Lavandn super entra en produccin el segundo ao, va aumentando la produccin hasta llegar a un mximo en el cuarto ao, se mantiene estable hasta el sexto ao, para disminuir a continuacin. El comportamiento de la produccin de aceite esencial es similar a la del rendimiento en materia vegetal. Segn los resultados
395
experimentales obtenidos, el ciclo productivo del Lavandn super se puede considerar rentable durante once aos de cultivo, ya que el rendimiento neto estimado por hectrea y ao es de ms de 600 euros.
Parcela de regado eventual

Las muestras estudiadas de Estragn, Hinojo amargo, Meliloto y Milenrama corresponden a la produccin experimental del ao 2000 en la parcela de Cetina. Los datos obtenidos reejan una buena productividad, aunque es necesario seguir con la experimentacin durante ms tiempo, ya que la produccin de un slo ao no determina la rentabilidad que puede suponer el ciclo completo del cultivo de estas plantas.
Espliego (Lavandula latifolia)

Se representan los datos de un ciclo productivo de 5 aos. poca de recoleccin del cultivo: agosto Estadio fenolgico en el momento de la recoleccin: plena oracin Porcentaje de marras al nal del ciclo: 46.9 %
Tabla 1. Resultados de productividad de Espliego.

DATOS PRODUCTIVOS
Mat. Vegetal Produc. Acumulada kgrs Aceite esencial Produc. Acumulada litros Mat. Vegetal Media/anual kgrs/ha Aceite esencial Media/anual litros/ha
14092
107.4
2818
21.48
Rendimiento en aceite esencial (%): 0.760 L
Lavandn Super (Lavandula angustifolia x L. latifolia)

Se representan los datos de un ciclo productivo de 10 aos. poca de recoleccin del cultivo: julio.
396
Estadio fenolgico en el momento de la recoleccin: plena oracin. Porcentaje de marras al nal del ciclo: 16.9%.
Tabla 2. Resultados de productividad de Lavandn Super.

DATOS PRODUCTIVOS
Mat. Vegetal Produc. Acumulada kgrs Aceite esencial Produc. Acumulada litros Mat. Vegetal Media/anual kgrs/ha Aceite esencial Media/anual litros/ha
35512
543.29
3551
54.30
Estragn (Artemisia dracunculus)

Fecha de recoleccin: 06/07/2000. Estadio fenolgico en el momento de la recoleccin: plena oracin. Porcentaje de marras: 0%.
Tabla 3. Resultados de productividad de Estragn.

DATOS PRODUCTIVOS - AO 2000 Bloque I II III Media Materia vegetal (kg/Ha) 45000 44545 31818 40454 Rendimiento Materia seca de materia (kg/Ha) seca (%) 13892 13751 9822 12488 30.87 30.87 30.87 30.87 Produccin aceite esencial (L/Ha) 43.65 43.21 30.86 39.24

397
Fecha de recoleccin: 17/09/2000 Estadio fenolgico en el momento de la recoleccin: 60-65 % en semilla, y resto de la planta en or Porcentaje de marras: 1.3 % de media
Tabla 4. Resultados de productividad de Hinojo amargo.

DATOS PRODUCTIVOS - AO 2000 Bloque I II III Media Materia vegetal (kg/Ha) 10000 12727 22273 15000 Materia seca (kg/Ha) 2375 3023 5290 3563 Rendimiento de materia seca (%) 23.75 23.75 23.75 23.75 Produccin aceite esencial (L/Ha) 21.37 27.21 47.61 32.06
Meliloto (Melilotus ofcinalis)

Fecha de recoleccin: 25/07/2000. Estadio fenolgico en el momento de la recoleccin: plena oracin. Porcentaje de marras: 0.2%
Tabla 5. Resultados de productividad de Meliloto.

DATOS PRODUCTIVOS - AO 2000 Bloque I II III Media Materia vegetal (kg/Ha) 29204 30454 35000 31553 Materia seca Rendimiento de Produccin aceite (kg/Ha) materia seca (%) esencial (L/Ha) 10864 11329 13020 11738 37.2 37.2 37.2 37.2 19.57 20.40 23.45 21.14
398
Figura 2 Datos relativos a la produccin de Estragn (MV = materia vegetal fresca; MS = materia seca; AE = aceite esencial). Hinojo amargo (Foeniculum vulgare)
Milenrama (Achillea millefolium)

Fecha de recoleccin: 23/06/2000 Estadio fenolgico en el momento de la recoleccin: plena oracin. Porcentaje de marras: 0 %
Tabla 6. Resultados de productividad de Milenrama.

DATOS PRODUCTIVOS - AO 2000 Bloque I II III Media Materia vegetal Materia seca Rendimiento de (kg/Ha) (kg/Ha) materia seca (%) 33727 31636 28409 31257 9686 9086 8159 8977 28.72 28.72 28.72 28.72 Produccin aceite esencial (L/Ha) 35.08 32.90 29.55 32.51

399
Figura 3 Datos relativos a la produccin de Hinojo (MV = materia vegetal fresca; MS = materia seca; AE = aceite esencial).
B) la actividad antioxidante y captadora de radicales

Los resultados del contenido de fenoles totales, de la capacidad captadora de radicales, y de la actividad antioxidante del material destilado y sin destilar, se muestra separadamente para cada una de las especies estudiadas en las Figuras 6-11. Los valores se expresan como eciencia antiradicalaria (EA = 1000 x CI50), equivalentes de cido glico (EAG) por mg de extracto seco, y porcentaje de inhibicin. Las actividades antioxidante y captadora de radicales determinadas en cada una de las muestras estudiadas se compar con las de diferentes productos de referencia, la quercetina (Q), un antioxidante de origen natural, el butilhidroxianisol (BHA), uno de los antioxidantes sintticos ms ampliamente utilizados en la industria alimentaria, y tres extractos comerciales de origen natural con elevada actividad antioxidante: romero (R), t verde (TV) y pepitas de uva (PU).
400
Figura 4 Datos relativos a la produccin de Meliloto (MV = materia vegetal fresca; MS = materia seca; AE = aceite esencial).
Contenido de fenoles totales

En general, las fracciones de acetato de etilo y los clorofrmicas son las que contienen una mayor cantidad de fenoles totales, tanto en las muestras destiladas como en las sin destilar, siendo estos valores signicativamente diferentes de los observados en el resto de fracciones y extractos. Son de destacar, por su contenido de fenoles totales, las fracciones de acetato de etilo de las muestras destiladas de Meliloto (722.93 EAG/mg) y de Hinojo (549.06 EAG/mg) y de la muestra sin destilar de Lavandn Super (473.14 EAG/mg), as como las clorofrmicas de la muestra sin destilar de Meliloto (520.75 EAG/mg) y la destilada de Estragn (451.93 EAG/mg).
Actividad captadora de radicales

La mayor capacidad captadora de radicales libres se observa en las fracciones de acetato de etilo, principalmente en la muestra no destilada de Lavandn Super (EA = 197.62) y en la destilada de Meliloto (EA = 191.57), pero tambin en la fraccin clorofrmica de Estragn
401
Figura 5 Datos relativos a la produccin de Milenrama (MV = materia vegetal fresca; MS = materia seca; AE = aceite esencial).
(EA = 111.98). Por su parte, las fracciones ms activas en cuanto a la actividad captadora de radicales hidroxilo son las clorofrmicas de la muestra no destilada de Lavandn Super (EA = 222.22) y de la destilada de Hinojo (EA = 202.02). Por ltimo, la mayor inhibicin del anin superxido se ha observado en las fracciones clorofrmicas de la muestra sin destilar de Estragn (98.52 %) y destilada de Espliego (91.66 %), y en las fracciones de acetato de etilo de las muestras destiladas de Estragn (92.12 %) y Hinojo (89.03 %). Sorprendentemente, el extracto crudo (EC1) de la muestra destilada de Estragn ha mostrado tambin una gran actividad captadora del anin superxido (98.20 %).
La tcnica basada en la decoloracin del -caroteno est muy bien relacionada con el fenmeno de rancidez en grasas y aceites, ya que trabaja cercana a la temperatura ambiente, con una emulsin de ci402
Figura 6 Actividad antioxidante (BC) y captadora de radicales libres (DPPH), hidroxilo (QL) y anin superxido (SO), y contenido de fenoles totales (CFT) en material destilado (D) y sin destilar (SD) de Espliego (Lavandula latifolia). Ver la seccin de Material y Mtodos para la identicacin de los extractos, fracciones, y productos de referencia.
403
Figura 7 Actividad antioxidante (BC) y captadora de radicales libres (DPPH), hidroxilo (QL) y anin superxido (SO), y contenido de fenoles totales (CFT) en material destilado (D) y sin destilar (SD) de Estragn (Artemisia dracunculus). Ver la seccin de Material y Mtodos para la identicacin de los extractos, fracciones, y productos de referencia.
404
Figura 8 Actividad antioxidante (BC) y captadora de radicales libres (DPPH), hidroxilo (QL) y anin superxido (SO), y contenido de fenoles totales (CFT) en material destilado (D) y sin destilar (SD) de Hinojo (Foeniculum vulgare). Ver la seccin de Material y Mtodos para la identicacin de los extractos, fracciones, y productos de referencia.
405
Figura 9 Actividad antioxidante (BC) y captadora de radicales libres (DPPH), hidroxilo (QL) y anin superxido (SO), y contenido de fenoles totales (CFT) en material destilado (D) y sin destilar (SD) de Lavandn Super (Lavandula angustifolia x L. latifolia). Ver la seccin de Material y Mtodos para la identicacin de los extractos, fracciones, y productos de referencia.
406
Figura 10 Actividad antioxidante (BC) y captadora de radicales libres (DPPH), hidroxilo (QL) y anin superxido (SO), y contenido de fenoles totales (CFT) en material destilado (D) y sin destilar (SD) de Meliloto (Melilotus ofcinalis). Ver la seccin de Material y Mtodos para la identicacin de los extractos, fracciones, y productos de referencia.
407
Figura 11 Actividad antioxidante (BC) y captadora de radicales libres (DPPH), hidroxilo (QL) y anin superxido (SO), y contenido de fenoles totales (CFT) en material destilado (D) y sin destilar (SD) de Milenrama (Achillea millefolium). Ver la seccin de Material y Mtodos para la identicacin de los extractos, fracciones, y productos de referencia.
408
do linoleico en agua, donde la cantidad de oxgeno no es limitante; mientras que otras tcnicas, como por ejemplo la del DPPH, estn relacionadas especcamente con la captura de ciertos radicales libres, generados en este caso por el DPPH, en un ambiente altamente polar, a temperatura ambiente, en ausencia de un sustrato lipdico oxidable. De esa manera, para que un extracto o sustrato sea considerado como interesante, no es necesario que produzca buenos resultados en ambas tcnicas, ya que buenos resultados con la tcnica del -aroteno signica una alta capacidad para inhibir el proceso global de la rancidez de los sustratos lipdicos en presencia de abundante oxgeno, mientras que la misma muestra puede dar bajos resultados con el DPPH, lo cual signica meramente que su actividad antioxidante no estara basada en la inhibicin de la accin de radicales libres tipo DPPH. Situaciones contrarias tambin son frecuentes. Por esa razn nosotros proponemos incluir estas dos tcnicas para los trabajos de monitoreo de la actividad antioxidante en fuentes naturales, porque de esa manera se obtiene una mejor informacin sobre la potencialidad de los extractos o fracciones objeto de estudio, y sobre su eventual aplicacin industrial. Establecemos una inhibicin del 40 % en la tcnica del beta-caroteno como el valor mnimo de actividad que debe tener una muestra para que la consideremos promisoria como potencial fuente de antioxidante; hacemos esto para tomar en cuenta que todas nuestras muestras son mezclas de una muy variada gama de compuestos, mientras que el BHA, que determina el 100 % de actividad, es un compuesto puro. Es interesante notar que todas las plantas estudiadas, arrojaron por lo menos una fraccin o extracto con actividad mayor que 40 %, y que lo valores de inters se encuentran siempre en el material destilado. Los mejores resultados los obtuvimos con el material destilado de Espliego, donde todas las fracciones dieron actividades superiores al 40 %. Y, lo ms relevante, EC1, EC2, FHX y FAC dieron valores mayores que el 80 %, lo cual lo hace una fuente muy importante de compuestos de diferentes polaridades, muy activos frente al fenmeno de la rancidez oxidativa. Llama la atencin que la fraccin
409
hexnica del Espliego haya dado una elevada actividad antioxidante (94.29 %), lo cual no ha sido un resultado frecuente en la ejecucin del proyecto; pero que se repite en Lippia boliviana (86.6 %), Piper pilirameum (79.6 %) y Piper peltatum (79.3 %). En el caso del Hinojo, a excepcin de la fraccin clorofrmica del material destilado, todas las otras dieron valores promisorios de la actividad antioxidante. La Milenrama es una buena fuente de antioxidantes fuertemente polares, pues su fraccin acuosa result activa; mientras que tanto el Meliloto como el Estragn, ofrecen una actividad antioxidante interesante en las fracciones de acetato de etilo. El Estragn tambin present actividad antioxidante en la fraccin acuosa.
Comentarios generales sobre los resultados obtenidos

Al someter los niveles de fenoles totales y la actividad captadora de radicales al anlisis de regresin se observa que, independientemente del tipo de material (destilado y no destilado), los mayores coecientes de correlacin se observan entre el contenido de fenoles totales y la actividad captadora de radicales libres (DPPH). En general, el contenido total de fenoles muestra una correlacin mejor con el material destilado en el ensayo de quimioluminiscencia (radicales hidroxilo), y con el material sin destilar en el ensayo del DPPH. Tambin en trminos generales, aunque con algunas excepciones puntuales, las fracciones de acetato de etilo muestran la mayor actividad c1aptadora de radicales libres y mayores valores de fenoles totales, mientras que las fracciones clorofrmicas presentan la mejor actividad captadora de radicales hidroxilo, as como niveles de fenoles totales bastante apreciables. No se obtuvieron diferencias estadsticamente signicativas entre el contenido de fenoles totales del material destilado y el del mismo material sin destilar. Tampoco conseguimos diferencias signicativas entre las actividades antioxidante y captadora de radicales (esta ltima determinada por los tres mtodos empleados) del material destilado y del material sin destilar. Por ltimo, el material destilado ofrece una mejor correlacin entre el contenido de fenoles totales y la actividad captadora de radicales (en el ensayo del DPPH y del anin
410
superxido) que el material sin destilar; sin embargo, esta correlacin es mejor en el caso del material sin destilar en el caso de la actividad captadora de radicales hidroxilo, que se correlaciona mejor con el contenido de fenoles totales.
Comparacin con antioxidantes de referencia

La quercetina muestra la mayor actividad captadora de radicales llibres, seguida del extracto de pepitas de uva, mientras que el BHA presenta la mayor actividad antioxidante y actividad captadora de radicales hidroxilo. Los extractos de t verde y de pepitas de uva, as como la quercetina, muestran una actividad captadora del anin superxido bastante similar, superior a la del BHA y del extracto de romero. Algunas de las fracciones clorofrmicas y de acetato de etilo, e incluso algunos extractos crudos, muestran una actividad antioxidante y captadora de radicales bastante elevada, la cual es similar, y en algunos casos incluso superior, a la de los extractos y substancias de referencia. As, las fracciones de acetato de etilo del Lavandn Super sin destilar y del Meliloto destilado muestran una actividad captadora de radicales libres mayor que la quercetina (el mejor producto de referencia) y que el extracto de pepitas de uva. Ningn extracto o fraccin ha mostrado una actividad captadora de radicales hidroxilo mayor que la del BHA. Sin embargo, esta actividad es mayor que la de la quercetina y los tres extractos de referencia en el caso de las fracciones clorofrmicas del Lavandn Super sin destilar y del Hinojo destilado.
Conclusiones
El ciclo productivo y los rendimientos netos por hectrea y ao estimados en el ensayo de ALACN determinan que el Lavandn super, al ser una planta seleccionada, se adapt mejor al cultivo que el Espliego, que aun siendo una de las especies predominantes de la ora autctona de la zona, se comport peor debido a que es necesario seleccionarlo y seguir adoptndolo al cultivo. El material vegetal de Estragn, Hinojo amargo, Meliloto y Milenrama, con el que se obtuvieron las plntulas para realizar la plantacin
411
del ensayo de CETINA, proceda de material comercial seleccionado. La produccin obtenida para cada una de las especies ensayadas en el ao 2000, se puede considerar buena en comparacin con cultivos tradicionales, como los de cereal y maz. En la Tabla 7 se ordenan priorizadas las tres plantas, separadamente por material destilado y sin destilar, que han mostrado los mejores resultados en cada uno de los ensayos efectuados. De la observacin de dicha tabla puede concluirse que resulta bastante difcil decidir cul de las seis especies estudiadas en este trabajo puede considerarse la mejor fuente potencial de antioxidantes, puesto que cada una de ellas presente diferentes propiedades antioxidantes y/o captadora de radicales.
Tabla 7. Ordenacin priorizada de las especies estudiadas en funcin del contenido de fenoles totales, y de la actividad antioxidante y captadora de radicales, y separadamente por material destilado y sin destilar.
Material vegetal No destilado 1 2 3 Destilado 1 2 3 Meliloto Estragn Lavandn super Meliloto Estragn Milenrama Hinojo Lavandn super Milenrama Estragn Espliego Hinojo Espliego Estragn Hinojo Fenoles totales Radicales libres Radicales hidroxilo Anin superxido Estragn Lavandn super Milenrama Actividad antioxidante Lavandn super Meliloto Hinojo
Lavandn super Lavandn super Lavandn super Hinojo Milenrama Milenrama Estragn Meliloto Espliego
As, respecto al material sin destilar, el Lavandn Super parece ser el mejor candidato, ya que muestra el mayor contenido de fenoles totales y mejor actividad antioxidante y captadora de radicales, con excepcin del anin superxido, que fue el segundo mejor resultado. Adems, el Lavandn Super ha mostrado una capacidad captadora de radicales libres y del anin superxido mayor que cualquiera de los
412
compuestos y extractos de referencia, pero su actividad antioxidante no ha sido elevada, aunque similar a la del extracto de romero. Por ltimo, el rendimiento obtenido en la extraccin de este material ha sido bastante bueno, especialmente el de la fraccin clorofrmica, que ha sido el mayor de entre todos los rendimientos de este tipo de fracciones de todas las plantas sin destilar. La seleccin de la mejor especie de entre el material destilado resulta todava ms difcil. As, el Meliloto ha mostrado los mejores resultados en cuanto a la capacidad captadora de radicales libres y al contenido de fenoles totales, valor este ltimo que ha sido superior al de cualquier compuesto y extracto de referencia. Adems, la fraccin de acetato de etilo de esta planta ha proporcionado el mayor rendimiento de entre todas las plantas con respecto a este tipo de fracciones. Por su parte, el Espliego ha mostrado la mayor actividad antioxidante, incluso con una inhibicin del 92 % en el extracto crudo, mientras que el Estragn ha mostrado la mayor capacidad captadora del anin superxido, con un 98 % de inhibicin tambin en el extracto crudo, porcentajes ambos que son superiores a los exhibidos por cualquiera de los estndares utilizados. Finalmente, el Hinojo ha presentado buenos rendimientos, especialmente los dos extractos crudos (EC1 y EC2) tanto en el material destilado como sin destilar, y ha mostrado una actividad antioxidante razonable. En general, el material destilado de estas seis especies mediterrneas ha mostrado contener unos niveles de compuestos fenlicos mayores que los del material sin destilar. Estas substancias fenlicas se concentran principalmente en las fracciones de acetato de etilo y clorofrmicas, las cuales son las que tambin han mostrado la mayor actividad antioxidante y captadora de radicales. Algunos de los extractos o fracciones estudiadas han mostrado una actividad incluso superior a la de compuestos o extractos de reconocido valor antioxidante. Estos resultados refuerzan la posibilidad de que estas plantas, las cuales se utilizan comnmente en la dieta mediterrnea como condimentos o decocciones, puedan contribuir positivamente en la proteccin de la salud humana. Alguno de los residuos resultantes de la destilacin de estas plantas para sus aceites esenciales puede cons413
tituir una fuente fcilmente accesible de nuevos compuestos antioxidantes, especialmente en el caso del Espliego y del Estragn, ya que sus extractos crudos han mostrado una elevada actividad antioxidante y captadora del anin superxido, respectivamente, no siendo necesario llevar a cabo ningn proceso posterior de fraccionamiento.
Agradecimientos
Este trabajo ha sido nanciado por el Gobierno de Aragn a travs de las Ayudas a la Experimentacin, del Departamento de Agricultura, por el Decanato de Investigaciones y Desarrollo de la Universidad Simn Bolvar, Venezuela, y por la Generalitat de Catalunya (referencia 2001SGR - 00124), y se ha realizado en el marco del Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnologa para el Desarrollo (CYTED, proyecto IV.11) . Los autores estn agradecidos a los Sres. Ferran Snchez y Luca Lavelli por su asistencia tcnica, y a los Sres. Antonio Maes (EUROMED, Espaa) y Bernd Weinreich (RAPS, Alemania) por el suministro de extractos de pepitas de uva, y de romero y t verde, respectivamente.
Bibliografa
Burillo J and Garca-Vallejo MC (2003): Investigacin y Experimentacin de Plantas Aromticas y Medicinales en Aragn. Cultivo, Transformacin y Analtica. Gobierno de Aragn. Dpto. de Agricultura. Direccin General de Tecnologa Agraria. Zaragoza, Espaa. Burits M, Asres K and Bucar F (2001): The antioxidant activity of the essential oils of Artemisia afra, Artemisia abyssinica and Juniperus procera. Phytother Res 15, 103-108. Capasso R, Evidente A, Avolio S and Solla F (1999): A highly convenient synthesis of hydroxytyrosol and its recovery from agricultural waste-waters. J Agric Food Chem 47, 1745-1748. Desotillo DR, Hadley M and Wolfhall C (1998): Potato peel extract a nonmutagenic antioxidant with potential antimicrobial activity. J Food Sci 63, 907-910. Guilln MD and Burillo J (1996) Characterisation of the essential oils of some cultivated aromatic plants of industrial interest. J Sci Food Agric 70, 359-363. Haraguchi H, Saito T, Ishikawa H, Date H, Kataoka S, Tamura Y (1996): Antiperoxidative components in Thymus vulgaris. Planta Med 62, 217-221.
414
Hidalgo PJ, Ubera JL, Tena MT, Valcrcel M (1998): Determination of the carnosic acid content in wild and cultivated Rosmarinus ofcinalis. J Agric Food Chem 46, 2624-2627. Khknen MP, Hopia A, Vuorela HJ, Rauha JP, Pihlaja K, Kujala TS and Heinonen M (1999): Antioxidant activity of plant extracts containing phenolic compounds. J Agric Food Chem 47, 3954-3962. Lagouri V, Boskou D. (1996) Nutrient antioxidants in oregano. Int J Food Sci 47, 439-497. Lesagemeessen L, Navarro D, Maunier S, Sigoillot JC, Lorquin J, Delattre M, Simon JL, Asther M and Labat M. (2001) Simple phenolic content in olive oil residues as a function extraction systems. Food Chem 75, 501-507. Lis-Balchin M and Hart S (1999): Studies on the mode action of essential oil Lavander (Lavandula angustifolia P. Miller). Phytother Res 13, 540-542. Lugasi A, Dworschk E and Kry A (1998): Antioxidant and free radical scavengigng properties of squeezed juice from black radish (Raphanus sativa L. var. niger) root. Phytother Res 12, 502-506. Marinova EM and Yanishlieva NV (1997): Antioxidative antivity of extracts from selected species of the family lamiaceae in sunower oil. Food Chem 58, 245-248. Mensor LL, Menezes FS, Leito GG, Reis AS, Dos santos TC, Coube CS and Leito SG. (2001) Screening of brazilian plant extracts for antioxidant activity by the use of DPPH. Free Rad Meth Phytother Res 15, 127-130. Muoz F (1987) Plantas Medicinales y Aromticas. Estudio, Cultivo y Procesado. Mundi Prensa. Madrid. Parejo I, Viladomat F, Bastida J, Rosas-Romero AJ, Flerlage N, Burillo J and Codina C (2002): Comparison between the radical scavenging activity and antioxidant activity of six distilled and non-distilled Mediterranean herbs and aromatic plants. J Agric Food Chem 50, 6882-6890. Singh RP, Murthy KNC, Jayaprakasha GK (2002): Studies on the antioxidant activity of promegranate (Punica granatum) peel and seed extracts using in vitro models. J Agric Food Chem 50, 81-86. Torres JL and Bobet R (2001): New avanol derivetes from grapes (Vitis vinifera) by products antioxidant aminoethylthio-avan-3-ol conjugates froma polymeric waste fraction used as source of avanols. J Agric Food Chem 49, 4627-4634. Velioglu YS, Mazza G, Gao L and Oomah BD (1998): Antioxidant activity and total phenolics in selacted fruits, vegetables, and grain products. J Agric Food Chem 46, 4113-4117. Visioli F, Romani A, Mulinacci N, Zarini S, Conte D, Vincieri FF and Galli C (1999): Antioxidant and other biological-activities of oil mill waste-waters. J Agric Food Chem 47, 3397-3401. Wang M. Shao Y, Li J, Zhu N, Rangarajan M, La Voie EJ and Ho C (1999): Antioxidative phenolic glycosides from sage (Salvia ofcinalis). J Nat Prod 62, 454-456.
415
416

LIBRO Nuevas Fuentes de Antioxidantes Naturals

Загружено:

Сведения о документе

Авторское право

Доступные форматы

Поделиться этим документом

Поделиться или встроить документ

Параметры публикации

Этот документ был вам полезен?

Это неприемлемый материал?

Авторское право:

Доступные форматы

LIBRO Nuevas Fuentes de Antioxidantes Naturals

Загружено:

Авторское право:

Доступные форматы

PORTADA INTERNA DEL LIBRO

Programa de Cooperacin Iberoamericano Ciencia y Tecnologa para el Desarrollo (CYTED) www.cyted.org

FUENTES NOVELES DE ANTIOXIDANTES

FUENTES NOVELES DE ANTIOXIDANTES

Fuentes de compuestos polifenlicos con actividad antioxidante

NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES

FUENTES NOVELES DE ANTIOXIDANTES

NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES

FUENTES NOVELES DE ANTIOXIDANTES

NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES

FUENTES NOVELES DE ANTIOXIDANTES

NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES

FUENTES NOVELES DE ANTIOXIDANTES

NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES

Fuentes de vitaminas y anlogos con actividad antioxidante

FUENTES NOVELES DE ANTIOXIDANTES

NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES

FUENTES NOVELES DE ANTIOXIDANTES

NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES

FUENTES NOVELES DE ANTIOXIDANTES

MERCADO Y TECNOLOGAS DE EXTRACCIN

MERCADO Y TECNOLOGAS DE EXTRACCIN

NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES

MERCADO Y TECNOLOGAS DE EXTRACCIN

NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES

MERCADO Y TECNOLOGAS DE EXTRACCIN

NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES

MERCADO Y TECNOLOGAS DE EXTRACCIN

NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES

Situacin comercial de los tofrmacos

MERCADO Y TECNOLOGAS DE EXTRACCIN

NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES

MERCADO Y TECNOLOGAS DE EXTRACCIN

Tendencias y futuro de los antioxidantes derivados de plantas

NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES

MERCADO Y TECNOLOGAS DE EXTRACCIN

NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES

MERCADO Y TECNOLOGAS DE EXTRACCIN

NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES

MERCADO Y TECNOLOGAS DE EXTRACCIN

NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES

MERCADO Y TECNOLOGAS DE EXTRACCIN

NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES

MERCADO Y TECNOLOGAS DE EXTRACCIN

Optimizacin del proceso de extraccin

NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES

MERCADO Y TECNOLOGAS DE EXTRACCIN

NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES

MERCADO Y TECNOLOGAS DE EXTRACCIN

LA AUTOXIDACIN Y LA RANCIDEZ. Teora

LA AUTOXIDACIN Y LA RANCIDEZ OXIDATIVA. Teora

NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES

LA AUTOXIDACIN Y LA RANCIDEZ. TEORA

NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES

LA AUTOXIDACIN Y LA RANCIDEZ. TEORA

NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES

RO. + ROO. + H2O

Formacin de productos secundarios

LA AUTOXIDACIN Y LA RANCIDEZ. TEORA

NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES

LA AUTOXIDACIN Y LA RANCIDEZ. TEORA

Modelo cintico de la autoxidacin

NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES

De acuerdo con el mecanismo aceptado para la autoxidacin: