MANUAL DE DIAGNSTICO PARA LA IDENTIFICACIN DE LARVAS DE NEMATODOS GASTROINTESTINALES EN RUMIANTES.

CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIN DISCIPLINARIA EN PARASITOLOGA VETERINARIA PUBLICACIN ESPECIAL No. 2 DICIEMBRE 2011

MANUAL DE DIAGNSTICO PARA LA IDENTIFICACIN DE LARVAS DE NEMATODOS GASTROINTESTINALES EN RUMIANTES.

Autores: M en C Enrique Libano Hernndez Dra. Mara Eugenia Lpez Arellano Dr. Pedro Mendoza de Gives M en C Liliana Aguilar Marcelino

INSTITUTO NACIONAL DE INVESTIGACIONES FORESTALES AGRCOLA Y PECUARIAS CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIN DISCIPLINARIA EN PARASITOLOGA VETERINARIA JIUTEPEC, MORELOS, MXICO Diciembre 2011

No esta permitida la reproduccin total o parcial de este libro, ni la transmisin en ninguna forma o por cualquier medio, ya sea electrnico, mecnico, por fotocopia, por registro o por otros mtodos, sin el permiso previo y por escrito a la Institucin. La informacin contenida en cada uno de los captulos es responsabilidad del autor.

Primera edicin 2011 Impreso en Mxico Esta obra se termin de imprimir En Diciembre del 2011 Revisores de la publicacin: Manuel Fernndez Ruvalcaba Zeferino Sotero Garca Vzquez

ISBN:

978-607-425-694-9

Publicacin Especial No. 2, Diciembre de 2011 INSTITUTO NACIONAL DE INVESTIGACIN FORESTALES, AGRCOLA Y PECUARIAS Av. Progreso #5 Col. Barrio de Santa Catarina, Coyoacn C.P 04010 Mexico D.F. Telfono:(55) 3871 8700 Correo electrnico:liebano.enrique@inifap.gob.mx

INTRODUCCIN Las enfermedades parasitarias son uno de los principales problemas que repercuten en la productividad de la ganadera nacional. Dentro de esta, las nematodosis gastrointestinales causan graves prdidas por el retraso de crecimiento, desnutricin, baja conversin alimenticia y en algunos casos la muerte de los animales ms afectados; adems de los gastos derivados de los tratamientos con drogas qumicas antihelmnticas. Estas nematodosis generan un gran impacto negativo en la salud animal en la mayor parte del mundo principalmente en zonas tropicales y subtropicales en donde adquieren relevancia; sin embargo, las regiones templadas y humedas no escapan a los estragos de estas enfermedades. Personal cientfico del Centro Nacional de Investigacin Disciplinaria en Parasitologa Veterinaria (CENID-PAVET) del INIFAP, se ha especializado a lo largo de muchos aos en diferentes tcnicas para la identificacin de los diferentes estadios infectantes de nematodos gastroentericos que afectan a los animales. El problema de estas parasitosis se desencadena con la entrada de las fases infectantes de los parsitos en los animales por va oral en el momento de estar pastoreando y alimentndose del pasto contaminado con los parsitos. Este es el inicio de todo un proceso infeccioso en los animales provocando un severo deterioro en la salud y como consecuencia en la produccin. El presente manual pretende de manera general y sencilla mostrar las principales caractersticas morfolgicas y morfomtricas de los estadios infectantes de los parsitos con fines de diagnstico taxonmico y va dirigido a estudiantes, tcnicos de laboratorio en Parasitologa y profesionistas. La informacin vertida en el presente manual servir para identificar los gneros y especies de los principales nematodos parsitos del ganado y que a su vez tendr un valor de importancia para poder establecer criterios para implementar medidas de control y estrategias de prevencin de estas importantes enfermedades parasitarias del ganado.

INDICE

Tema Introduccin Parasitosis gastroentricas causadas por nematodos a rumiantes Tcnicas de coprocultivo para la obtencin de los diferentes estadios de nematodos gastroentricos. Tcnica para la obtencin de larvas infectantes de nematodos gastroentricos a partir de pasto. Tcnica de migracin larvaria.............. Tcnica de gradientes de densidad con sacarosa para la limpieza de larvas infectantes (L3) de nematodos gastroentricos Tcnica para la eliminacin de la vaina del tercer estadio de nematodos gastroentricos Caractersticas morfolgicas de larvas infectantes (L3) de nematodos gastroentricos, nematodos de vida libre y fitonematodos.. Caractersticas morfolgicas de los diferentes estadios exgenos de Haemonchus contortus ... Caractersticas morfolgicas de las extremidades anterior, media y posterior de los diferentes gneros de larvas infectantes (L3) de nematodos gastroentricos de rumiantes. Informacin adicional sobre larvas infectantes (L 3) de nematodos gastroentricos... Caractersticas morfomtricas de los diferentes gneros de larvas infectantes (L3) de nematodos gastroentricos. Literatura recomendada...

Pgina

1 3 9 11 14 16 17 24

29 29 34 44

PARASITOSIS GASTROINTESTINALES CAUSADAS POR NEMATODOS A RUMIANTES Las parasitosis gastroentricas en bovinos y ovinos poseen gran importancia debido a su carcter cosmopolita, ocasionando grandes prdidas econmicas que pueden ser directas como la muerte de los animales jvenes o indirectas que se manifiestan clnicamente por diarreas persistentes, anemia y desnutricin, dando como resultado retraso en el crecimiento de los animales jvenes, as como una baja produccin de carne y leche en animales adultos (Hamito, 2011). Estos nematodos tienen afinidad por determinadas porciones del tracto digestivo, parasitando principalmente al abomaso: Haemonchus contortus, H. placei, Mecistocirrus digitatus, Trichostrongylus axei, T. colubriformis, T. longispicularis, Teladorsagia/Ostertagia circumcincta, O. trifurcata y O. lyrata. En el intestino delgado: Nematodirus spathiger, N. fillicolis, N. helvetianus, N. battus, Strongyloides papillosus, Bunostomum trigonocephalum, B. phlebotomum, Cooperia oncophora, C. pectinata, Trichostrongylus spp, y Toxocara vitulorum, y en intestino grueso: Chabertia ovina, Oesophagostomum columbianum, O. venulosum, O. radiatum, Trichuris ovis, T. globulosa, Skrjabinema ovis y Agriostomum vryburgi (Gaba, 2006, Valcrcel Sancho et al., 2009). ASPECTOS EPDEMIOLGICOS Estos vermes se presentan con frecuencia en aqullas regiones que por su altitud, temperatura, pluviosidad y humedad les proporcionan las condiciones favorables para su desarrollo. El ciclo biolgico de estos parsitos es directo y la infeccin de los rumiantes se lleva a cabo mediante la ingestin de larvas infectantes (L3), que son ingeridas junto con la pastura. Esta fase de desarrollo es considerada como el eslabn ms importante en la cadena evolutiva y tiene la facultad de adaptarse a diversas condiciones ambientales y su hbitat es el suelo, tallos y hojas de los pastos donde pastorea el ganado (Paddock, 2011). Las (L3) de los nematodos gastrointestinales poseen diferentes tropismos que determinan su actividad en la pradera, por ejemplo: tienen un fototropismo negativo a la luz intensa, por lo que migran a la base de las plantas durante las horas de mayor intensidad de luz solar, permaneciendo quietas durante ese tiempo; por el contrario, cuando la luz solar es poca, como ocurre al amanecer y al atardecer, las larvas se desplazan con mayor facilidad hacia la punta de los pastos, lo que representa un fototropismo positivo a la luz tenue. Aunado a este ltimo tropismo, las larvas tambin presentan un hidrotropismo positivo, provocando ambos una migracin vertical en busca de la luz tenue y la pelcula de humedad (Rodrguez-Vivas y Cob-Calera, 2005). Estas larvas pasan gran parte de su ciclo biolgico en el pasto y dependiendo de las condiciones ambientales para su sobrevivencia, las podemos encontrar ya sea en el excremento, emergiendo de los huevos de los nematodos o en los pastos donde 1

se desarrollan las fases preparasticas (L1, L2 y L3). Esta ltima, es la fase que encontramos contaminando los potreros; aunque tambin las podemos encontrar sumergidas en la tierra, invernando hasta que las condiciones ambientales le sean favorables (Leyte-Browning, 2006) (Fig. 1).

Figura 1. Ciclo biolgico de Haemonchus contortus Ciclo Biolgico Los huevos de nematodos gastrointestinales son expulsados del organismo de los animales parasitados junto con las heces y de esta manera son depositados sobre el pasto y el suelo del potrero. Cuando las condiciones ambientales de humedad y temperatura, principalmente, son adecuadas, en 1-2 das se desarrolla el embrin del parsito dentro del huevo, de donde eclosiona una larva de primer estadio (L1). Transcurrido un tiempo y despus de un breve perodo de inmovilidad o letargo (algunas horas) las larvas sufren una primera muda y cambian su envoltura, transformndose en larvas de segundo estadio (L2). Estas larvas se alimentan a partir de detritus y de elementos contenidos en la materia fecal; incluyendo a algunas bacterias, granos de polen, esporas de hongos y agua. Despus de 2-3 das, las L2 sufren una nueva muda convirtindose en larvas de tercer estadio o larvas infectantes (L3). Estas conservan la envoltura de las L2 la cual sirve de proteccin contra los factores externos como frio, calor y sequedad. La vaina que recubre a la L3 provoca que esta no pueda alimentarse; ni defecar, por lo que para poder realizar sus funciones vitales requiere de consumir algunas reservas contenidas en las clulas intestinales. Estas larvas son muy activas pudiendo ascender por los tallos y migrar hacia las hojas del pasto (Lewandowski, 2011). 2

Una vez que las larvas son ingeridas con el pasto penetran a la mucosa del abomaso donde sufren dos mudas ms, convirtindose en larvas del cuarto (L4) y quinto estadio (L5) y finalmente en los nematodos maduros que presentan formas sexuales caractersticas de hembras y machos (West Central Veterinary Services, 2011). Conocer el comportamiento de los nematodos gastrointestinales tanto dentro de los animales, como en sus fases de vida libre en la pradera es indispensable para poder determinar el o los mtodos diagnsticos precisos con lo que se logra establecer las medidas de control y prevencin adecuadas para minimizar los efectos en la salud de los animales y reducir el impacto econmico en la produccin. Para lograr un diagnstico adecuado de las parasitosis gastrointestinales del ganado se han establecido tcnicas coproparasitoscpicas que son consideradas como valiosas herramientas de diagnstico (Valcrcel-Sancho et al., 2009; Lpez-Arellano et al., 2010) y que se abordan a continuacin: TCNICAS DE COPROCULTIVO PARA LA OBTENCIN DE LOS DIFERENTES ESTADIOS DE NEMATODOS GASTROENTRICOS Pocos veterinarios en nuestro pas pueden con base cientfica, contestar algunas preguntas. Por ejemplo, Cules nematodos predominan en determinada rea?, Por cunto tiempo stos parsitos prevalecen en nuestra granja?, Cuales son los de mayor importancia econmica?, Cuntas veces se debe desparasitar por ao?, A qu animales se debe desparasitar?, Puede servir la rotacin de potreros como una medida de control?. Estas preguntas llevan a la necesidad de establecer criterios basados principalmente en aspectos epidemiolgicos de la zona bajo estudio, el tipo y edad de los animales, manejo del rebao o hato, tipo de pasto y suplementacin alimenticia y principalmente es necesario establecer un diagnstico parasitolgico preciso, no solo del ganado; sino de la pradera (Lpez-Arellano et al., 2010). Dentro de los mtodos de diagnstico parasitolgico destacan las tcnicas coprolgicas. Estas tcnicas abarcan todos los conocimientos referentes al estudio fsico, qumico y parasitolgico de la materia fecal (Thienpont et al., 1986). El anlisis del excremento de rumiantes debe realizarse bajo un concepto amplio de diagnstico parasitolgico y no solamente con base en la cantidad de huevos de nematodos gastroentricos. La tcnica de McMaster es una til herramienta diagnstica que nos permite estimar de manera semi-cuantitativa el nmero la cantidad de huevos que los parsitos eliminan por g de heces; no obstante, esta informacin es muy limitada, sobre todo si tomamos en cuenta que la mayora de los huevos de los nematodos gastrointestinales, son muy similares y no es posible diferenciar un gnero o especie de otro (Vadlejch et al., 2011). Por tal motivo, es necesario extender este anlisis a otras tcnicas complementarias, como la elaboracin de cultivos fecales para la obtencin de la L3 que son factibles de ser identificadas

utilizando claves morfomtricas diseadas para este fin (Van Wyk et al., 2003). Cuando se realiza la identificacin coproparasitoscpica mediante las tcnicas cuantitativas cualitativas, se pueden distinguir con cierta facilidad los huevos de los siguientes gneros de nematodos gastrointestinales: Toxocara spp, Nematodirus spp., Strongyloides spp., Trichuris spp., Toxocara vitulorum y Moniezia spp. Sin embargo, es difcil diferenciar los huevos de un grupo de gneros de nematodos incluyendo a Haemonchus spp, Mecistocirrus digitatus, Trichostrongylus spp., Ostertagia spp, Cooperia spp, Chabertia spp., Oesophagostomum spp., y Bunostomum spp., ya que presentan una morfologa muy similar (Fig. 2).

Figura 2. Morfologa de huevos de nematodos gastrointestinales. Si bien la identificacin del nmero de huevos de nematodos gastrointestinales eliminados por g de heces es un parmetro muy importante para tener al menos una idea del grado de parasitismo en los animales; el poder identificar los gneros de nematodos que afectan al rebao, nos permite establecer medidas adecuadas para prevenir y controlar estas enfermedades parasitarias.

Para poder identificar gneros (y en algunos casos hasta especies) de L3 de nematodos gastrointestinales de rumiantes, es necesario obtenerlas a partir de la elaboracin de cultivos fecales. FINALIDAD DE LOS CULTIVOS LARVARIOS La elaboracin de cultivos fecales permite una maduracin de los huevos de los parsitos con el desarrollo embrionario y finalmente la formacin y eclosin de L1, misma que continua con su desarrollo in situ hasta convertirse finalmente en L3 (Karki, 2008). La utilizacin de la tcnica de coprocultivo permite obtener la L3 de los nematodos gastrointestinales de rumiantes para diferentes finalidades que se citan a continuacin: 1- Identificacin genrica y especfica de parsitos. La identificacin de parsitos hasta gnero y especie no es posible hacer en todos los casos por observacin directa de los huevos en el microscopio. Las L3, poseen caractersticas bien definidas que permiten diferenciarlas entre otros gneros y especies (Libano, 2010). La otra manera de conocer con exactitud los gneros y especies de nematodos que se encuentran parasitando a los animales del rebao es solamente mediante la realizacin del examen post-mrtem (Vzquez y Bautista, 2010). 2.- Precisin en el diagnstico. Esta condicin es de suma importancia para poder determinar criterios en el establecimiento de tratamientos especficos y medidas de control y prevencin; adems de tener un valor adicional en pruebas de eficacia antihelmntica (Muoz, 2003, Lpez-Arellano et al., 2010). 3- Produccin de larvas infectantes. De gran utilidad especialmente en estudios experimentales (Technical paper no.17, 2011). 4- Produccin de material antignico. A partir de antgenos obtenidos de los parsitos. Este material tiene un valor muy importante especialmente en estudios inmunolgicos (Bautista, 2005). 5- Estudios in vitro de sustancias larvicidas. De gran importancia en la bio-evaluacin de compuestos qumicos antihelmnticos (Fader, 2008); as como de compuestos naturales (Ademola and Eloff, 2011). 6- Estudios epidemiolgicos. Ejemplo: En estudios de comportamiento de fases exgenas de parsitos y de diferentes parmetros ambientales sobre el desarrollo larvario (Qamar et al., 2011). 5

ELABORACIN Y MANTENIMIENTO DE CULTIVOS LARVARIOS Para la obtencin del material fecal se recomienda que la colecta de heces se realice de manera directa por extraccin rectal; procurando no tomar muestras del suelo, para evitar la contaminacin con larvas de vida libre (Fig. 3).

Figura 3. Aspecto de la extraccin rectal de heces de un ovino. En caso de utilizar heces de ovino y/o caprino, es recomendable que la muestra sea tomada directamente del recto de los animales (Snchez, 2010). Se recomienda que en la preparacin de los cultivos fecales, las heces sean mezcladas con algn sustrato como por ejemplo, aserrn, unicel o hule espuma, que facilitan la aireacin y oxigenacin y desarrollo de los huevos El aire penetra a travs de la cara externa de los huevos y la cutcula de las larvas. Los requerimientos de oxgeno son altos para la muda, pero son bajos para las L3. La humedad es indispensable para el metabolismo de las formas parasitarias principalmente para mantener hidratada la cubierta externa de los huevos y la cutcula de las larvas. El nivel ptimo de humedad relativa que se ha observado para un buen desarrollo de los huevos es entre el 80 y 90 %. La temperatura ptima para la eclosin larvaria es de 26 a 28C. El pH juega un papel importante. Las heces tienen un nivel ptimo para el desarrollo larvario que va de 6.5 a 7.5 (Libano, 2010). Para lograr la identificacin de los gneros de nematodos gastroentricos involucrados se recurre a tcnicas de coprocultivo con el objeto de obtener e identificar las L3 que por su morfologa pueden ser claramente distinguidas. Se han diseado diversos mtodos y variantes de cultivos fecales. Por ejemplo la Tcnica de cultivo en frasco, en donde se puede utilizar como sustrato: aserrn estril, hule espuma o bien partculas de unicel que se describe a continuacin: TCNICA DE COPROCULTIVO EN FRASCO: Esta tcnica coproparasitoscpica es ampliamente utilizada por muchos laboratorios 6

de parasitologa animal y consiste en lo siguiente: Se requiere de colectar 10 gramos de heces directamente del recto de animales positivos a huevos de nematodos gastroentricos. Esta tcnica como se mencion, tiene como finalidad lograr evolucionar los huevos de los nematodos gastrointestinales en las heces hasta obtener L3. Esta tcnica sirve de apoyo en el diagnstico para poder establecer con precisin qu tipo de gneros de nematodos estn presentes en un rebao bajo estudio y adicionalmente sirve para establecer cuales son los gneros y especies de parsitos que predominan en el rebao. Adicionalmente, esta tcnica tiene un valor muy importante en investigacin cuando se pretende llevar a cabo trabajos experimentales en los que se requiera contar con una poblacin muy grande de nematodos (Beltrn, 1984) (Fig. 4). Materiales

Frascos de vidrio con ancho de boca de 7 cm. La altura del frasco puede variar. Se recomienda que solo se depositen heces ocupando hasta el primer cuarto del frasco, con el fin de que el espacio restante permita una buena oxigenacin. Tela gasa para ser utilizada a manera de tapa del frasco. Este material permite una buena aereacin y oxigenacin del cultivo; adems de impedir que las moscas y otros insectos penetren al cultivo y depositen sus huevos contaminando los cultivos. Cucharas de plstico o aluminio de 15 cm Nistatina (Micostatin) en polvo para evitar el crecimiento de hongos. Goteros. Cajas de Petri de 4 cm. Pizeta con agua.

Procedimiento: De las muestras fecales procesadas por la tcnica de McMaster que hayan resultado positivas a huevos de nematodos gastroentricos, se seleccionarn y se mezclarn con agua destilada, para hacer un homogenizado hasta conformar una masa hmeda. La cantidad de humedad debe estar balanceada de manera que no est ni muy lquida, ni muy seca y de esta forma se colocar en el fondo del frasco, evitando ensuciar las paredes del mismo. Se debe espolvorear sobre la superficie de la materia fecal una pequea capa de Nistatina comercial por una sola ocasin (como ejemplo puede usarse Micostatin a la concentracin indicada por el fabricante). Posteriormente, el frasco deber ser cubierto con una tapa, sin cerrarlo hermticamente o bien se puede cubrir con una gasa para que haya mayor oxigenacin. El frasco se dejar incubando a temperatura ambiente, y dependiendo de las condiciones de 7

temperatura del lugar donde se lleva a cabo este procedimiento se reflejar en el tiempo de evolucin de los nematodos. En caso de condiciones optimas de temperatura (18-25C) el ciclo evolutivo se acortar y en aproximadamente 7 das, obtendremos la L3. En cambio si el clima es fri (4-18 C) el ciclo se extender hasta 15-21das para obtener la L3 (Tarazona, 1986). Es importante que la humedad de los cultivos sea verificada diariamente. Se recomienda que cada dos das (si lo amerita) los frascos sean hidratados con agua simple y se debern destapar por un periodo aproximado de 30 minutos para lograr una mejor oxigenacin de los huevos. Transcurrido el tiempo estimado para obtener las L3, se proceder a agregar unas gotas de agua destilada, deslizndolas sobre una de las paredes del frasco; el cual se hace girar sobre su propio eje en dos o tres ocasiones. Este paso debe hacerse lenta y cuidadosamente para que el agua humedezca completamente toda la pared del frasco. El lquido se colectar en una caja de Petri para su observacin al microscopio estereoscpico, y de esta manera poder verificar si realmente las larvas han alcanzado su estadio infectante (Fig.4). Para verificar que las larvas han alcanzado su estadio de L3, es importante conocer las caractersticas generales de este estadio, as como las diferencias con los estadios previos (L1 y L2). Estos estadios a diferencia de la L3, no poseen vaina y poseen boca y se alimentan de detritos vegetales y protozoarios. Su esfago es rabditiforme, tienen contenido granular y posee un poro anal. Las L3 tienen vaina, por lo tanto ya no se alimentan, su sobrevivencia depende de sus reservas alimenticias y a las condiciones ambientales, el esfago es filariforme, presenta clulas a lo largo de su intestino las cuales varan en forma, triangulares, hexagonales y pentagonales as como en nmero de 8, 16, 24, y 32; dependiendo del gnero y especie que se trate (Bowman, 2004) (Figs. 16,17). En caso de corroborar que las larvas obtenidas han alcanzado su tercer estadio evolutivo del parsito, se proceder a realizar la tcnica del Embudo de Baermann para la extraccin de las larvas de los cultivos. Posteriormente las larvas sern concentradas y sometidas a la tcnica de Centrifugacin diferencial por gradientes de sacarosa al 40% para su limpieza (Fig. 7). Cuando se desea obtener larvas infectantes desenvainadas para fines de bio-evaluaciones, se proceder a exponerlas a hipoclorito de sodio al 6% con el que se lograr separar las vainas de larvas (Figs. 7, 8). Para lograr contar con una poblacin muy grande de larvas se recomienda que los cultivos se lleven a cabo en palanganas de plstico y se requiere adquirir fragmentos de hule espuma. Se puede utilizar una palangana de plstico de 40 cm ancho y el procedimiento es muy similar al llevado a cabo en los frascos. Solo que en esta tcnica se utilizan como sustrato trozos de hule espuma. Algo muy importante es que cuando se vaya a realizar un experimento que utilicen larvas frescas, recin obtenidas de los cultivos, limpias y activas (Libano, 2004) (Fig. 4). 8

Los coprocultivos deben tener una humedad adecuada; por lo que no deben deshidratarse, aunque tampoco es recomendable que tengan un exceso de humedad y deben mantenerse frescas.

Procesamiento de muestras fecales en gasa

Concentracin de larvas

Figura 4. Tcnica de coprocultivo en frasco

TCNICA PARA LA OBTENCIN DE LARVAS INFECTANTES DE NEMATODOS GASTROENTRICOS A PARTIR DE PASTO La obtencin e identificacin de L3 de nematodos gastroentricos en los pastos, tiene por objeto el estudio estadstico y cintico de la contaminacin de las praderas, lo cual es de gran importancia en la epidemiologa de las parasitosis. La identificacin y cuantificacin larvaria se lleva a cabo en el laboratorio, utilizando muestras de pasto provenientes de las praderas a estudiar. El principio general para la extraccin de las larvas contenidas en los pastos, se basa en el tamao y peso de las mismas. Tomando en cuenta este principio, se enuncia como mtodo general lo siguiente: 9

En primer lugar se procede a realizar el lavado de las muestras de pasto y posteriormente se realiza el filtrado o tamizado del sedimento conteniendo a las larvas. Adems de este mtodo, se pueden considerar otros dos mtodos alternativos, como es la concentracin de larvas por flotacin con una solucin densa, y por otro lado se puede llevar a cabo una combinacin de los mtodos de flotacin y sedimentacin (Euzby, 1981). En la actualidad pocos son los trabajos relacionados con las tcnicas para la extraccin de larvas presentes en los pastos, citndose entre otros a Burger (1981), Bairden and Armour, (1981) Morales, (2001), Achi, (2003), Amaradasa et al., (2010). La mayora de estos investigadores se basan adems del principio general mencionado por Euzby (1981), en la tcnica propuesta por Baermann, (1917), tambin conocida como migracin larvaria (Fig. 5). Tambin se ha propuesto el uso de algunas sustancias qumicas, como por ejemplo la formalina en diferentes diluciones en la obtencin de larvas de nematodos gastroentricos, lo que provoca la muerte de los nematodos de vida libre y fitonematodos, mientras que las L3 de nematodos gastroentricos continan vivas, pero con movimientos ms lentos. Para poder establecer una metodologa adecuada para la obtencin de L3 de nematodos gastrointestinales en el pasto, es importante tomar en cuenta el comportamiento de estos estadios en la pradera, como se ha mencionado previamente.

Figura 5. L3 presentes en los potreros 10

En nuestro pas, pocos son los laboratorios que realizan estudios de diagnstico parasitolgico a travs de la contaminacin del pasto con L3 de nematodos gastrointestinales. En el laboratorio de Helmintologa del Centro Nacional de Investigaciones Disciplinarias en Parasitologa Veterinaria (CENID-PAVET) del INIFAP, se utiliza la tcnica de migracin larvaria para determinar la contaminacin con larvas de nematodos gastrointestinales a nivel de potrero. TCNICA DE MIGRACIN LARVARIA (Libano, 1985) Material

Cubeta de plstico de 6 lts Gasa de algodn Copas de plstico de 500 mL Caja de Petri de 10 cm de dimetro Pipeta Pasteur con tapn de hule Manguera de hule ltex Portaobjetos y cubreobjetos Solucin de tintura de yodo Microscopio estereoscpico y microscopio compuesto

Mtodo 1.- Se colocan de 100 a 500 g de pasto cortado en pequeos trozos sobre gasa de 40x40 cm, se unen las cuatro puntas de sta, se anudan con un cordel y se introducen en una cubeta inclinada que contenga agua tibia (25 C). La cantidad de agua ser la suficiente para cubrir el paquete de gasa conteniendo la muestra. Se recomienda evitar que esta toque el fondo de la cubeta, para lo cual se sujeta con cordn de camo delgado y cinta maskin-tape en uno de los bordes de la cubeta. 2.- La muestra se deja reposar durante 24 h. 3.- Despus de transcurrido ese tiempo, se retira la muestra suavemente para no agitar el sedimento, y se decanta el sobrenadante por sifonado con una manguera de hule ltex. 4.- El sedimento que qued en la cubeta, se colecta en una copa de plstico y se deja reposar durante 3 h. 5.- Despus de ese tiempo, el sobrenadante se decanta de la copa por sifonado utilizando una manguera de hule ltex. 6.- Este ltimo, se pasa a una caja de Petri y se observa al microscopio estereoscpico con el objetivo de 16x y 40x (Fig. 6). 11

Pasto conteniendo gotas de roci

Muestreo de pasto

Pesaje de la muestra de pasto

Tcnica de migracin larvaria

Quitando sobrenadante

Sedimento con larvas

Larvas a travs del Microscopio

Obtencin de larvas L3

Inmovilizacin de larvas

Figura 6 Metodologa para obtencin de larvas infectantes de nematodos gastrointestinales de rumiantes a partir de muestras de pasto. 12

Aspectos importantes a considerar para hacer un muestreo de pasto: El muestreo de pasto se debe de llevar a cabo principalmente al amanecer cuando hay abundancia de roci como es de 5-6 a. m. o bien al atardecer entre las 18 y las 20 horas. Recomendaciones para llevar a cabo el muestreo: 1.- Antes de llevar a cabo el muestreo, se debe considerar en primer lugar las dimensiones, la forma y lo accidentado del potrero a muestrear. 2.- Tipo de pasto. Talla, grosor, tipo de crecimiento. 3.- Definir la cantidad de muestra se va a recolectar. Se recomienda que las muestras sean de preferencia del mismo tamao. 4.- Establecer la forma de muestreo. Existen varias tcnicas. Muestreo en zig zag, lanzando un aro, o bien los animales siempre que se desplazan van defecando y uno puede tomar la muestra a su alrededor. La condicin principal es que sea aleatorio para asegurar su validez. Otros aspectos a considerar en los muestreos. Al realizar el muestreo de pasto es importante tener en cuenta que en el potrero encontraremos larvas infectantes de zoonematodos; as como de nematodos de vida libre. Por lo que es importante conocer las principales diferencias morfolgicas que existen entre estas (Cuadro 1). Esto nos evitar una perdida intil de tiempo en estar pescando nematodos que no son de nuestro inters. Es importante aclarar que los nematodos de vida libre al igual que los fitonematodos, son muy importantes para diagnstico de plagas agrcolas que llegan a ocasionar grandes prdidas en la produccin agrcola. Es importante considerar que en las larvas de zoonematodos, los estadios L1 y L2 son muy parecidos ya que ambos poseen esfago rabditiforme, lo cual les permite alimentarse. Estos estadios carecen de vaina y contienen grnulos alimenticios. En los fitonematodos en estos estadios hay diferenciacin de sexo, en los que se puede observar la ubicacin del aparato vulvar en las hembras. Este, vara encontrndose en el ltimo tercio de su cuerpo cuando estas son jvenes y se aprecia una hendidura muy tenue; no as cuando estas ya son adultas en donde se aprecia con claridad sus labios vulvares. En cuanto al macho, estos siempre son ms pequeos y presentan un par de espculas las cuales siempre se encuentran en el ltimo tercio de la larva (Foreyt, 2001) (Fig. 16). 13

Por otra parte, en las larvas de vida libre se puede apreciar que su cauda es muy variable dependiendo del gnero que se trate. Las hay de cola corta mediana y larga. Por el contrario las L3 poseen vaina larval la cual las protege y las hace ms resistentes a las condiciones adversas del medio ambiente (humedad, temperatura y precipitacin). El esfago es filariforme. Estas larvas ya no se alimentan y su sobrevivencia depende de sus reservas alimenticias. Poseen clulas a lo largo de su celoma que varan en forma y nmero (Figs. 915). TCNICA DE GRADIENTES DE DENSIDAD CON SACAROSA PARA LA LIMPIEZA DE LARVAS INFECTANTES (L3) DE NEMATODOS GASTROENTRICOS Al obtener el sedimento conteniendo larvas de nematodos gastrointestinales resultado de la tcnica del Embudo de Baermann de heces de cultivos fecales, es comn que junto con las larvas, hayan sedimentado tambin una gran cantidad de detritus, impurezas y materiales diversos contenidos en las heces. Para obtener una suspensin de larvas de nematodos libre de estas impurezas, se puede recurrir al mtodo de filtracin, utilizando papel para limpiar los objetivos del microscopio Optical Lens paper (Thomas Scientific, USA), colocados en un aparato de Baermann con agua de la llave. Las larvas en movimiento descendern pasando a travs del Optical Lens paper y sedimentarn hasta la base del tubo de ensaye. Las impurezas y materiales residuales de los cultivos fecales quedarn atrapados en el tejido del papel de microscopio. Es importante recalcar que el grado de pureza de la suspensin larval depender del propsito para el cual las larvas son requeridas. En ocasiones, por la naturaleza del experimento no se requiere contar con larvas estrictamente purificadas y libres de contaminantes. Generalmente, se recomienda utilizar larvas muy limpias y libres de contaminantes. Para tal efecto, adems del proceso de filtracin, se recomienda utilizar un procedimiento de separacin de las partculas en suspensin utilizando gradientes de densidad con sacarosa. Con la finalidad de eliminar el sobrenadante, el material resultante de la tcnica de filtracin se transfiere a tubos de plstico de 50 ml y se deja reposar en el refrigerador a 4C durante 1 h. De esta forma se procede a limpiar el sedimento. Las L3 sern sometidas a gradientes de densidad y centrifugacin con sacarosa al 40% a 3500 rpm a 4C durante 5 min (Libano, 2010). Para llevar a cabo esta tcnica, se utilizan dos tubos de ensaye de 15 cm en donde se agregan 8 mL de sacarosa al 40% y despus se agrega lentamente el sedimento conteniendo 2 mL de larvas. Este paso se deber llevar a cabo cuidadosamente utilizando de preferencia una pipeta automtica o una pipeta Pasteur, deslizando la suspensin larval por las paredes del tubo de ensaye. Posteriormente, 14

los tubos son centrifugados a 3500 rpm durante 5 min. Este proceso, permitir que la mayor cantidad de contaminantes y residuos de materiales provenientes de los cultivos fecales sean sedimentados en el fondo del tubo. Transcurrido el tiempo de centrifugacin, se observar la formacin de un anillo (de color blanco) en la superficie de la suspensin, que corresponder a un paquete de las larvas limpias concentradas. Con la ayuda de una pipeta de 200 L se procede a recolectarlas para inmediatamente depositarlas en tubos de 10 mL para llevar a cabo tres lavados con agua destilada; esto se realiza con la finalidad de eliminar el exceso de sacarosa y evitar un desequilibrio osmtico y muerte de las larvas (Libano, 2010). Para tal efecto, se utiliza una centrifuga convencional y se centrifuga a 3500 rpm, durante 3 minutos y as poder utilizarlas para las diferentes pruebas experimentales que se realizan en el laboratorio de Helmintologa del CENID-PAVET-INIFAP y en otros laboratorios de control biolgico, inmunolgico, biologa molecular, epidemiologa y ecologa (Kennedy, 2001) (Fig. 7).

Figura 7. Aspecto de la formacin de un anillo blanquecino en el sobrenadante de un tubo sometido a centrifugacin por gradientes de densidad con sacarosa para limpiar larvas infectantes de Haemonchus contortus.

15

TCNICA PARA LA ELIMINACIN DE LA VAINA DEL TERCER ESTADIO LARVAL DE NEMATODOS GASTROINTESTINALES En algunos experimentos de laboratorio donde se requiere trabajar con estadios evolutivos histiotrficos; as como para la criopreservacin de L3 en nitrgeno lquido y para la evaluacin de compuestos qumicos o naturales contra los parsitos, es necesario lograr la eliminacin de vaina de queratina que las protege. Para lograr la eliminacin de la vaina de las L3 es necesario realizar el procedimiento que se describe a continuacin (Libano et al., 1996, Reyes-Girn, 2008): Una vez que las larvas fueron lavadas con sacarosa al 40%, se procede a retirar la vaina de ellas de manera artificial para dar paso al siguiente estadio larval (L4). Se toman 3 mL de hipoclorito de sodio al 6%, para realizar una serie de diluciones dobles seriadas quedando las concentraciones finales de 3,1.5, 0.750, 0.375 y 0.187%. Antes de la realizacin de cada desenvaine es necesario tomar una muestra (gota) de larvas y confrontarla con la solucin con hipoclorito de sodio para verificar el tiempo requerido para el desenvaine, ya que incluso en ellas cada organismo responde de manera distinta ante este estimulo, el tiempo promedio que se requiere para esta operacin es de aproximadamente entre 5 y10 minutos. Despus de este perodo de desenvaine rpidamente se hacen tres lavados con agua destilada y se centrifugaron a 3,500 rpm durante tres minutos; despus del ltimo lavado se desecha el sobrenadante y las larvas son recuperadas en el botn formado en el sedimento (Fig. 8).

Figura 8. Aspecto de larvas infectantes expuestas al hipoclorito de sodio desprendindose de su vaina. 16

Cuadro 1. Caractersticas morfolgicas de larvas de nematodos gastroentricos y de nematodos de vida libre y fitonematodos.

Nematodos de vida libre y/o nematodos fitoparsitos 1.- Las larvas miden de 500 a 1,200 m de 1.- Las larvas miden 500m y los adultos longitud total. hasta 1,000m 2.- Ausencia de estilete y algunos gneros 2.- Los adultos pueden o no presentar presentan estructuras tpicas, por ejemplo: estilete en la cavidad bucal. el gnero Cooperia spp. presenta en la regin anterior un par de cuerpos refrigentes y el gnero Mecistocirrus digitatus presenta un par de manchas oscuras debajo de la cavidad oral. 3.-Los estadios L1 y L2 presentan esfago 3.- Esfago rabditiforme presente en todos rabditiforme y las L3 presentan un esfago los estadios. filariforme. 4.- Presentan clulas intestinales a lo largo 4.- Larvas y adultos presentan contenido de su celoma pudiendo ser triangulares, granular a lo largo de su celoma. pentagonales o hexagonales. Las clulas pueden encontrarse en diferentes nmeros 8, 16, 24 y 32 clulas. 5.- Las larvas infectantes poseen vaina. 5.- Las larvas de vida libre no poseen vaina. 6.- Ausencia de aparato vulvar. 6.- Las hembras adultas presentan en el ltimo tercio de su cuerpo una vulva con labios vulgares aparentes; los machos presentan un par de espculas y bursa copulatriz.
De la Jara F.A., Sern B.F., 1980.

Larvas de nematodos gastrointestinales

17

Figura 9 A. Fotografa al microscopio compuesto de una hembra de vida libre o de un fitonematodo mostrando las principales caractersticas morfolgicas. a) aparato vulvar, b) poro anal, c) esfago rabditiforme, d) ausencia de vaina.

18

Figura 10 B. (a, b, c y d). Aspecto de diferentes formas del aparato vulvar de larvas de vida libre o de un fitonematodo (Panagrellus redivivus).

19

Figura 11 A. Fotografa al microscopio compuesto mostrando las caractersticas morfolgicas de un macho de vida libre o de un fitonematodo. a) espculas, b) esfago, rabditiforme, c) ausencia de vaina . 20

Figura 12 B. (a, b, c, d). Aspecto del extremo posterior un nematodo (macho) de vida libre o fitonematodo, mostrando en la parte final un par de espculas.

21

Figura 13 C. Aspecto del extremo anterior de diferentes nematodos (larvas de vida libre o fitonematodos) mostrando distintas formas de esfagos bulbosos y su aparato rabditiforme.

Figura 14 D. Aspecto del extremo anterior de diferentes nematodos (larvas de vida libre o fitonematodos) mostrando distintas formas de cavidad bucal con presencia o ausencia de estilete.

22

Figura 15 E. Aspecto de la extremidad posterior de larvas de vida libre o fitonematodos mostrando los diferentes tipos de caudas. 23

Figura 16. Caractersticas morfolgicas de los diferentes estadios de Haemonchus contortus. (L1) a) ausencia de vaina, b) contenido granular a lo largo de su celoma, (L2) c) formacin de clulas, d) esfago rabditiforme, e) cavidad oral, f) esfago filariforme, g) larvas infectantes (L3) con clulas a lo largo de su celoma, h) vaina que envuelve a la larva, i) punta de la cola de la vaina.

24

Figura 17. Fotografas de diversos estadios del nematodo Haemonchus contortus. (A) cavidad oral (j), (B) esfago rabditiforme (l), (presentes en L1 y L2). (C) extremidad posterior de una larva sin vaina (L1 y L2); m) punta de la cola sin vaina, n) poro anal, (D) punta de la cola de la larva (o), vaina larval (p). (E) aspecto de una larva infectante, presencia de clulas Intestinales (q), vaina (r). 25

Figura 18. Aspecto de una larva infectante de Haemonchus contortus mostrando sus caractersticas morfomtricas. 26

CARACTERISTICAS MORFOLOGICAS DE LARVAS INFECTANTES DE NEMATODOS GASTROINTESTINALES: 1.- Longitud total (de la cavidad bucal a la punta de la cola de la vaina). 2.- Longitud del cuerpo de la larva (de la cavidad bucal a la punta de la cola de larva). 3.- Longitud del esfago (de la cavidad bucal al comienzo del intestino). 4.- Longitud de la cola de la larva (del ano a la punta de la cola de la larva). 5.- Longitud de la cola de la vaina (del ano a la punta de la cola de la vaina). 6.-. Ancho del cuerpo de la larva (medicin tomada al inicio del intestino). A continuacin se menciona la clasificacin de L3 de gneros de nematodos gastrointestinales de acuerdo a lo largo de la cola de la vaina), formando tres grupos (Niec, 1968, Libano, 2011): Larvas con cola de vaina corta: Trichostrongylus (axei, colubriformis y vitrinus) y Teladorsagia/Ostertagia (circumcincta y ostertagi). Larvas con cola mediana: Haemonchus (contortus y placei), Cooperia (oncophora, punctata y spp) y Mecistocirrus digitatus. Larvas con cola de vaina larga: Nematodirus (spathiger, battus, fillicolis, helvetianus), Oesophagostomum (radiatum y venulosum), Chabertia ovina. Adems de los grupos anteriormente mencionados, se considera las L3 de Strongyloides papillosus y Bunostomum spp por separado debido a que son las ms pequeas en longitud (Fig. 18). Otro parmetro que se utiliza para identificar la L3 es el tamao. Para lo cual, existen tablas basadas en las medidas morfomtricas (Cuadro 2).

27

Cuadro 2. Medidas en m de larvas infectantes de nematodos gastrointestinales en rumiantes de Mxico

TAMAO EN DE LARVAS INFECTANTES DE NEMATODOS GASTROINTESTINALES EN RUMIANTES DE MXICO
Gneros LT de L3 (a) (f) (g) (h) M Strongyloides Strongyloides Bunostomum Bunostomum * + * + M X LE (b) (f) (g) (h) M M X AC (c) (f) (g) (h) M _ _ _ _ 19 _ _ _ _ 22 _ _ 15 _ _ _ 26 M _ _ 23 _ 31 20 _ _ 23 24 19 21 19 _ 27 27 30 30 X 13 15 _ 19 21 _ 21 21 _ _ 19 27 _ _ 28 -APCV (d) (f) (g) (h) M 67 80 M 91 96 X 70 85 PCV (e) (f) (g) (h) M 67 73 M 91 95 X 76 83 313 57 28 28 63 48 56 55 27 69 58

480 607 535 158 265 202 357 583 490 150 254 220 516 849 801 146 202 182 464 655 552 67 158 100 575 813 633 150 178 148 583 749 677 146 166 150 824 923 875 128 168 158 674 821 729 136 170 56

325 377 351 138 258 190 67 67 107 107 85 85

218 357 67 19 19 55 31 47 42 19 50 43 114 166 79 258 215 79 39 39 70 71 63 65 51 87 87

Trichostrongylus * Trichostrongylus + Teladorsagia Teladorsagia Cooperia Cooperia Mecistocirrus Haemonchus Haemonchus Chabertia * + * + * * + *

100 147 127 99 128 111

710 932 758 150 176 155 700 920 810 130 162 150 615 782 696 146 178 159 516 774 668 119 158 136 476 742 573 115 146 128 732 944 783 154 179 158 714 893 834 142 178 165 690 905 820 131 174 160 1016 1148 1082175 252 195 900 1500 1200170 210 143

103 142 121 94 79 83 95 178 178 226 258 294 140 120 119 93

158 131 145 110 258 216 227 237 278 230 331 293 406 370

198 147 202 172 198 151 268 265 278 249

Oesophagostom. * Oesophagostom.+ Nematodirus Nematodirus * +

Longitud total de la L3, b) Longitud del esfago, c) Ancho del cuerpo, d) Longitud del ano a la punta de la cola de la larva, e) Longitud de la punta de la cola de la larva a la punta de la cola de la vaina, f) Mnima, g) Mxima, h) Media, (*) Cepa de origen bovino, (+) Cepa de origen ovino y caprino.

28

Figura 18. Caractersticas morfolgicas de la extremidad anterior, media y posterior de los diferentes gneros de L3 de nematodos gastrointestinales de rumiantes. INFORMACIN ADICIONAL SOBRE LARVAS INFECTANTES (L3) DE NEMATODOS GASTROENTRICOS A. Larva infectante de Strongyloides papillosus Esta larva evoluciona de acuerdo a las condiciones principalmente de temperatura y humedad. Bajo condiciones adversas, sta especie permanece en forma de vida libre. Sin embargo, cuando las condiciones son favorables, evolucionan para infectar al hospedero. Existen varias especies de nematodos de este gnero que afectan a distintos hospederos: S. papillosus afecta a ovinos, caprinos, bovinos, bfalos y conejos; S. ransomi a cerdos; 29

S. stercolaris al hombre, perros y gatos; S. westeri a caballo y asno; S. fuelleborni al hombre y y primates; S. rati a ratas y S. avium a aves (Organizacin Panamericana de la Salud, 2003). La evolucin del huevo a L3 a temperatura entre 10 y 15 C, ocurre en un lapso aproximado de 7 a 8 das. Las larvas de este gnero son de las ms pequeas, no poseen vaina, el esfago es muy largo, ocupa aproximadamente 1/3 del total de la larva y es de color claro. El intestino es bastante corto, formado por clulas mal diferenciadas con oscuras granulaciones. La cola larval termina trifurcada (vista de costado parece bifurcado). Como este gnero parasita sobre todo a los animales jvenes, se piensa que su va de entrada adems de la oral y la cutnea es principalmente a travs de la lactancia de una madre infectada a sus cros. Las infecciones ocasionadas por el gnero Strongyloides spp. son de suma importancia, ya que las diferentes especies de ste gnero pueden parasitar prcticamente toda clase de animales domsticos y solo la especie Strongyloides stercolaris, puede infectar al hombre (Fig. 19). B. Larva infectante de Bunostomum trigonocephalum Es la larva ms pequea de todas las larvas de este grupo. Su cubierta est provista de una vaina protectora. Las larvas de este gnero adems de penetrar por va oral lo hacen por la piel. Existen varios gneros: B. trigonocephalum (ovinos y caprinos), B. phlebotomum (bovinos). La extremidad anterior es redondeada, la cavidad bucal es pequea y tiene forma de cono o embudo con engrosamiento. El intestino est bordeado por diecisis clulas intestinales, las cuales miden 33 x 6 m, pocas veces bien diferenciadas, con su respectivo ncleo y primordium genital, el cual sta situado de 240 a 295 m del extremo anterior de la larva. En la extremidad posterior, la punta de la cola de la larva es obtusa y mide de 55 a 68 m de largo, adems la cola de la vaina larval se proyecta a una distancia de 85 a 150 m del extremo de la larva. En condiciones de temperatura ptima (22-24 C) las larvas infectantes se logran desarrollar en tan solo de 6 a 7 das. Esta larva es hematfaga, las larvas de ste gnero no pueden completar su crecimiento durante la fase pre-parastica si la temperatura desciende a menos de 15 C. La va de entrada puede ser oral o a travs de la piel, pero se ha demostrado experimentalmente, que la va percutnea es ms eficaz para ste gnero. El perodo de latencia es de 4.5 a 8 semanas, dependiendo de la resistencia del hospedero (Mehlnorn, 2001) (Fig.20). C.- Larva infectante de Trichostrongylus colubriformis La larva infectante es activa, entra al hospedero nicamente por la boca, y puede parasitar al equino, ganado vacuno y ovejas. Existen varios gneros T. colubriformis (rumiantes, hombre y cerdo), T. vitrinus (rumiantes), T. axei (rumiantes y equinos), T. capricola (ovinos y caprinos), T. probolurus (rumiantes y camellos), T. rugatus (ovinos y caprinos), T. falculatus (ovinos y caprinos), T. leroux (rumiantes) y T. tenuis (aves domstica).

30

Es una larva robusta, provista de vaina de tamao pequeo que pertenece al grupo de colas cortas (Niec, 1968). La extremidad anterior es redondeada y presenta una cavidad bucal. El intestino est bordeado por 16 clulas intestinales de forma rectangular o triangular. En la extremidad posterior, la punta de la cola de la larva acaba en diferentes formas o tubrculos, dependiendo de la especie de que se trate. La cola de la vaina es corta, cnica y aguda. La forma pre-parastica, tiene poca resistencia a las temperaturas bajas y es poco probable que sobreviva hasta la primavera en lugares donde el invierno es fro y largo; sin embargo, en zonas templadas y hmedas soportan el invierno. A temperatura ptima (24-26 C) las larvas infectantes se desarrollan entre 7 y 8 das (Fig. 21). Ch.- Larva infectante de Ostertagia/Teladorsagia spp. Es una larva delgada, provista de vaina de tamao pequeo y de cola corta. Existen varias especies: O. ostertagi (bovinos), O. circumcincta (ovinos y caprinos) y O. trifurcata: (ovinos y caprinos). La extremidad anterior es redondeada, el intestino est conformado por 16 clulas de forma triangular. En la extremidad posterior, la punta de la cola de la larva es redondeada con una pequea incisin en la parte ventral de la larva. La cola de la vaina larval es alargada, puntiaguda con una desviacin caracterstica. Las formas pre-parasticas de ste gnero, resisten ms las temperaturas bajas que la mayor parte de los otros gneros de la familia Trichostrongylidae, por lo que las parasitosis por Ostertagia/Teladorsagia predominan en zonas fras. En temperaturas de 22-24 C las L3 se desarrollan en 6 das (Fig. 22). D.- Larva infectante de Cooperia spp. Es una larva delgada, provista de vaina, pertenece al grupo de cola mediana, la extremidad anterior es redondeada, su cavidad bucal tiene forma de pera o globular. Existen varios gneros: C. curticei (ovinos y caprinos), C. oncophora (bovinos), C. punctata (bovinos) y C. pectinata (bovinos). La cavidad bucal comienza en la faringe, posee una cinta fibrinosa con dos puntos refringentes o una lnea que es considerada caracterstica de ste gnero. Posee 16 clulas intestinales y en la extremidad posterior, la punta de la cola de la larva es redondeada. La cola de la vaina larval es ligeramente ondulada. Las fases pre-parasticas de este gnero son las menos resistentes a las temperaturas bajas y a la desecacin, por lo que muy pocas sobreviven despus del invierno. En el cultivo, las L3 se desarrollan en 7 das a temperatura de 22-24 C. La baja temperatura ambiental y la falta de lluvias, provocan un decremento en la infeccin por Cooperia spp., pudiendo sobrevivir sobre las pasturas los estadios libres de ste parsito durante el invierno, aunque puede haber un incremento de la infeccin en animales susceptibles durante esta poca. En Australia se ha establecido que las L3 de Cooperia spp., persisten viables sobre la pastura por 24 semanas durante el verano y el otoo, que es cuando hay mayor precipitacin pluvial (Rosenberg, 1975) (Fig. 23).

31

E.- Larva infectante de Mecistocirrus digitatus En la clave de identificacin larvaria existente no se hace mencin a esta larva, salvo a una excepcin hecha por quien al parecer es el nico autor que incluye a esta especie en su clave de identificacin larvaria. Algunos autores han descrito la morfologa de esta especie, incluyendo a Fernando, (1965); Garca, (1984) Es una larva delgada, provista de vaina, pertenece al grupo de vaina corta. En una observacin ms detallada la extremidad anterior es redondeada, su esfago es filariforme. Presenta en la extremidad anterior dos estructuras en forma arrionada, situadas paralelamente y de color caf obscuro. Es evidente la presencia de estriaciones cuticulares ms marcadas en la regin cervical, se observan tambin 16 clulas intestinales de forma pentagonal provistas de un gran ncleo, as como posibles grnulos alimenticios de gran tamao y de aspecto transparente dentro del intestino. En la extremidad posterior, la punta de la cola de la larva acaba en forma redondeada y la cola de la vaina es corta, cnica aguda (Fig. 24). F.- Larva infectante de Haemonchus contortus La larva de este gnero requiere de una temperatura ms elevada que las de Ostertagia spp, para llegar a su fase de (L3). H. contortus lo encontramos: ovinos y caprinos. H. similis: rumiantes. H. placei: bovinos, H. longistipes: ovinos, cabras, camellos. Todas las especies de Haemonchus succionan sangre para alimentarse (Jacquiet, 1997). Es una larva delgada, provista de vaina de tamao medio y de cola mediana. En una observacin ms detallada, la extremidad anterior es redondeada, su cavidad bucal es de forma globular y el esfago es filariforme. El intestino est bordeado por 16 clulas intestinales con su respectivo ncleo y un primodium genital, siendo las primeras clulas cortas y triangulares y las ltimas alargadas y de forma ms pentagonal; cabe destacar que la primera clula es pequea e irregular y la ltima no se encuentra alineada a sus clulas contigua si no que termina en forma individual. En la extremidad posterior, la punta de la cola de la larva acaba en forma cnica y la cola de la vaina, se va adelgazando hasta finalizar en punta fina, adems presenta una torcedura o fractura inmediatamente despus de la terminacin de la punta de la larva, asemejando a una bayoneta(Urquhart, 2001)(Fig. 25). G.- Larva infectante de Chabertia ovina Esta larva pertenece a la familia trichostrongyloidea. Es una larva provista de vaina delgada, es de tamao grande, morfolgicamente es muy parecida a la de Oesophagostomum. El intestino sta bordeada por 28 a 32 clulas de forma rectangular. Pertenece al grupo de cola grande (Niec, 1968). En una observacin mas detallada, en la extremidad anterior, la cavidad bucal entra al esfago a travs de una armadura esofgica, la punta de la cola de la larva es roma, siendo la cola de la vaina muy delgada en su extremo posterior. (Quiroz, 2002). La resistencia de los huevos principalmente a la desecacin e 32

influencias externas, es grande. La mayor parte de los ovinos estn infectados con Chabertia ovina, pero la enfermedad pocas veces es aparente. La chabertiasis se manifiesta como una enteritis intensa, a veces de consecuencia fatal, que afecta a un grupo de animales. En el ganado bovino nunca se encuentran manifestaciones clnicas. Las larvas infectantes se cultivan a temperatura de 22-24 C en seis das. El periodo prepatente es de 25 das (Fig. 26).

H.- Larva infectante de Oesophagostomum columbianum

Es una larva bastante ancha, provista de una vaina gruesa y floja que forma ondulaciones muy visibles. Existen varios gneros: O. columbianum: ovinos, caprinos y camellos, O. venulosum: ovinos y caprinos, O. radiatum: bovinos y bfalo. Es una larva bastante ancha, provista de una vaina gruesa y floja que forma ondulaciones muy visibles. Pertenece al grupo de las llamadas de cola grande, la extremidad anterior es redondeada, su cavidad bucal recta, de paredes engrosadas y el esfago filariforme en el estado infectante o L3. El intestino est bordeado por una cantidad de clulas intestinales caractersticas para cada especie, que pueden ser en nmero de 16, 24 32. En la extremidad posterior, la punta de la cola de la larva termina en forma cnica y la cola de la vaina se va adelgazando hasta finalizar en una punta fina, en forma de ltigo. Esta larvas se cultivan a temperaturas de 22 a 24 C en 7-8 das, son poco resistentes al calor y a la accin de la luz solar. En cuanto a su efecto sobre el hospedero, las larvas infectivas se refugian en la pared Intestinal, formandose en el hospedero ndulos del tamao de una abeja, conocidos como granulomas, estos impiden el funcionamiento del intestino alternando con la absorcin de lquidos, el resultado es una diarrea negra y mal oliente. La supervivencia de las larvas en el suelo hmedo es de 3 meses, siendo la temperatura ptima para su desarrollo de 30 C. Los huevos no resisten la desecacin, pero en cambio cada hembra adulta puede poner alrededor de 12,000 huevos al da (Lapage, 1983). La supervivencia de las L3 requiere de una humedad de 100% (Soulby. 1987) (Fig. 27). J.- Larva infectante de Nematodirus spathiger Las especies de ste gnero poseen resistencia a los cambios climticos extremos mucho mayor al resto de los trichostrongylidos Existen varios gneros: N. fillicolis: ovinos y caprinos, N. spathiger: ovinos y caprinos, N. battus: bovinos: ovinos y camellos. Su capacidad de sobrevivir bajo condiciones de congelamiento es muy grande; tambin soportan la desecacin durante varios meses. Este gnero se desarrolla entre 24 y 48 C. Es una larva robusta, provista de vaina de tamao grande, la extremidad anterior es redondeada, la cavidad bucal esta en forma de tubo recto y el esfago es filariforme. El intestino est bordeado por 8 grandes clulas bien delimitadas por un material denso y granular; con su respectivo ncleo. En la extremidad posterior, la punta de la cola de la larva es caracterstica para cada especie. La cola de la vaina larval es bastante larga en forma de ltigo. Nematodirus 33

puede resistir uno o dos aos en las praderas. El gnero Nematodirus se diferencia en que la larva L1, no abandona el huevo formndose la L3 infectante en 15 a 30 das segn especie a temperatura de 24-28 C. La humedad de los pastos reduce su existencia pero puede soportar la congelacin (Johnstone, 1998) (Fig. 28).

Fig.19. Caractersticas morfomtricas de larvas infectantes de Strongyloides spp. 34

Figura 20. Caractersticas morfomtricas de la larva infectante de Bunostomum spp.

35

Figura. 21. Caractersticas morfomtricas de la larva infectante de Trichostrongylus spp.

36

Figura. 22. Caractersticas morfomtricas de la larva infectante de Teladorsagia.

37

Figura. 23. Caractersticas morfomtricas de la larva infectante de Cooperia spp.

38

39

Figura. 24. Caractersticas morfomtricas de la larva infectante de Mecistocirrus digitatus.

Figura. 25. Caractersticas morfomtricas de la larva infectante de Haemonchus spp.

40

Figura. 26. Caractersticas morfomtricas de la larva infectante de Chabertia

41

Figura. 27. Caractersticas morfomtricas de la larva infectante de Osophagostomum spp.

42

Figura. 28. Caractersticas morfomtricas de la larva infectante de Nematodirus spp.

43

LITERATURA RECOMENDADA 1. Achi YL, Zinsstag J, Yeo N, Dea V, Dorchies PH, 2003. Epidmiologie des Helminthiases des moutons et des chvres dans la rgion des savanes du Nord de la cote de' Ivoire. Revue Med Vet 154;179-188. 2. Ademola OI, Eloff NJ, 2011. Anthelmintic efficacy of cashew (Anarcadium occidentale L.) on in vitro susceptibility of the ova and larvae of Haemonchus contortus. Afr J Biotechnol 47; 9700-9705. 3. Amaradasa BS, Lane AR, Manage A, 2010. Vertical migration of Haemonchus contortus infective larvae on Cynodon dactylon and Paspalum notatum pastures in response to climatic conditions. Vet Parasitol 170; 78-87. 4. Baermann G, 1917. Eine eifache Methode Zur Auffindung von Anklyo stomum (Nematoden) larven in Erdproben. Geneesk. Tijdschr Ned Indie 57; 131-137. 5. Bairde K, Duncan JL, Armour J. A technique for the recovery of infective trichostrongyle larvae from soil. In: Nansen P, Jorgensen RJ, Souslby EJL editors. Current Topics in Veterinary Medicine and Animal Science, Epidemiology and control of Nematodiasis in cattle.1srt ed. Brussels, Luxembourg. Martinus Nijhoff Publishers; 1981:31-42. 6. Bautista GR, 2005. Papel de los receptores tipo toll en la inmunidad innata y su implicacin en Medicina Veterinaria. Vet Mx 36; 453-468. 7. Beltrn SJL. Valoracin de seis tcnicas de coprocultivo para la obtencin de la larva infectante de Haemonchus contortus. (tesis de licenciatura). Mxico, Estado de Mxico. Universidad Nacional Autnoma de Mxico, 1984. 8. Bowman D, Lynn CR, Mark LE. Parasitologa para veterinarios. 8a. edicin. Madrid Espaa, Elsevier, UK, 2004. 9. Burger HJ,. Experiences with our techniques for the recovery of nematode larvae from herbage. In: Nansen P, Jorgensen RJ, Soulsby EJL editors. Current Topics in Veterinary Medicine and Animal Science, epidemiology and control of Nematodiasis in cattle. 1srt edition. Brussels, Luxembourg. Martine Nijoft Publishers: 198125-30. 10. De la Jara, AF, Zern FV. Manual de prcticas de Nematologa Agrcola. Instituto Politcnico Nacional. Escuela de Ciencias Biolgicas Departamento de Parasitologa. DF, Mxico;1980 44

11. Euzby J, 1981. Diagnostic experimental des helminthoses Animal (Animaux domestiques. Animaux de laboratorio. Primates). Travaux practiques d`Helminthologie Veterinaire. Livre 1: Generalites Diagnostic ante-mortem. Paris, France. Informations Techniques des Services Vtrinaries Minister del Agriculture: 154-158. 12. Fader OW, 2008. Endoparasitosis bovina en una invernada pastoril intensiva. http://www.engormix.com/MA-ganaderia-carne/sanidad/articulos/endoparasitosisbovina-invernada-pastoril-t2182/165-p 0.htm. Acceso el 22 de Diciembre de 2011 13. Fernando, S.T., 1965. Morphology, systematics, and geographic distribution of Mecistocirrus digitatus, a Trichostongylid parasite of ruminants. J Parasitol 51:149-155. 14. Foreyt, W.J., Foreyt, B. Veterinary Parasitology Reference Manual. 5th edition. WileyBlackwell. Edinburg, U K: 2001. 15. Gaba S, Chadoeuf J, Monestiez P, Sauve C, Cortet J, Cabaret J. 2006. Estimation of abomasum strongyle nematode infections in sheep at necropsy: tentative proposals for a simplified technique. Vet Parasitol 140:105-113. 16. Garca MA, Meja RA, 1984. Contribucin al estudio morfolgico del tercer estadio larvario (L3) del nematodo abomasal Mecistocirrus digitatus resumen. Memorias de la Reunin de Investigacin Pecuaria en Mxico D.F. pp. 304-309 S.A.R.H. Universidad Nacional Autnoma de Mxico. 17. Hamito D, 2011. Prevention of lamb and kid mortality. Ethiopia Sheep and Goat Productivity Improvement Program (ESGPIP). Technical Bulletin No. 46. 18. Jacquiet P, Cabaret J, Cheikh J, Thiam, E, 1997. Identification of Haemonchus species in domestic ruminants based on morphometrics of spicules. Parasitol Res 83; 82-86. 19. Johnstone C, 1998. Parsitos y enfermedades parasitarias de los animales domsticos. University of Pennsylvania. 20. Karki K, 2008. SOP for Identification Techniques for parasite assays in Faecal samples. Central Veterinary Laboratory. Tripureswor, Khatmandu, Nepal. Available: http://es.scribd.com/doc/3777768/SOP-for-Identification-Techniques-forParasite-Assays-In. 21. Kennedy MW, Harnett W, 2001. Parasitic nematodes: Molecular Biology, Biochemistry, and Immunology. CABI, Wallingford, United Kingdom.

45

22. Lewandowski R, 2011. Tips to keep in mind for small ruminant pasture management. Farm and Dairy. Available: http://www.farmanddairy.com/columns/tips-to-keep-in-mind-forsmall-ruminant-pasture-management/25492.html. 23. Leyte-Browning L. 2006. Haemonchus contortus (Barber Pole Worm) Infestation in Goats. Alabama Cooperative Extention System. UNP-78. Alabama A & M and Auburn Universities. Available: http://www.aces.edu/pubs/docs/U/UNP-0078/UNP-0078.pdf. 24. Libano HE, Meja R. Modificacin a la tcnica de migracin larvaria para la obtencin de larvas de nematodos gastroentricos en forrajes. (tesis de licenciatura). Universidad Nacional Autnoma de Mxico, 1985 25. Libano-Hernndez E, Lpez-Arellano ME, Vzquez-Prats VM, Mendoza-de-Gives P. 1996. Cryopreservation of infective larvae of Haemonchus contortus. Rev Lat-Amer Microbiol 38; 111-114. 26. Libano HE. Identificacin morfomtrica de larvas infectantes de nematodos gastrointestinales y pulmonares en rumiantes domsticos de Mxico. Vzquez-Prats VM editor. En: Diagnstico y control de los nematodos gastrointestinales de los rumiantes en Mxico. Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agrcolas y Pecuarias, Mor, Mxico: 2004; 28-29. 27. Libano HE. Cultivo e identificacin larvaria de nematodos del tracto gastroentrico. Bautista GCR y Lpez AME, editores. Diagnstico de enfermedades parasitarias selectas de rumiantes. 1rst. Ed. INIFAP, DF, Mx.: 2010; 43-85. 28. Lpez-Arellano, ME, Mendoza-de-Gives, P, Aguilar Marcelino, L. Libano Hernndez, E.. Buenas Prcticas de Manejo de Antihelmnticos para el Control de Parsitos en Rumiantes. Lpez AME, Mendoza GP, Aguilar ML, Libano HE editores. 1rst. Ed. INIFAP, DF, Mx.: 2010. 29. Mehlnorn H, Armstrong PM, 2001. Encyclopedic reference of Parasitology. Biology, Structure, Function. 2nd edition. Springer-Verlag, Berlin Heidelberg, New York, USA: 2001. 30. Morales GA, 2001. Dinmica de los niveles de infeccin por estrongildos digestivos en bovinos a pastoreo. Parasitol 25:115-120. 46

31. Muoz FJ, Angulo CF, Ramrez BR,. Farmacologa y teraputica de parasitosis internas en bovinos. 1 edicin. DF Mx. :2003. 32. Niec R. Cultivo e identificacin de larvas infectantes de nematodes gastrointestinales de los bovinos y ovinos. Instituto Nacional de Tecnologa Agropecuaria. Buenos Aires, Argentina:1968 33. Organizacin Panamericana de la Salud, 2003. Zoonosis y enfermedades transmisibles comunes al hombre y los animales: parasitosis. 3rd. ed. OPS, Washington, D.C., USA. (Publicacin Cientfica y Tcnica No. 580). 413. 34. Paddock R. 2011. Haemonchus contortus in sheep and goats: An insidious killer . Fall 2011 Newsletter. Fall 2011 Newsletter. Indiana Animal Disease Diagnostic Laboratory. Purdue University. Available: http://www.addl.purdue.edu/Newsletters/2011/Fall/Haemonchus.aspx 35. Qamar F.M, Maqbool A., Kahan S.M., Ahmad, N., Muneer, A.M., 2011. Epidemiology of Haemonchosis in sheep and goats under different managemental conditions. Vet World, 2; 413-417. 36. Quiroz H. Parasitologa y enfermedades parasitarias de animales domsticos. Mxico: Noriega editores. Ed Limusa: 2002; 441-513. 37. Reyes-Girn EA. Diagnstico de Gastroenteritis Verminosa por la Tcnica de Stoll en ovejas de la Aldea Xejuyup del Municipio de San Andrs Sajcabaja, El Quich. (tesis de licenciatura). Guatemala, Universidad de San Carlos de. Guatemala; 2008.. 38. Rodrguez-Vivas RI, Cob-Calera AA. Tcnicas Diagnsticas en Parasitologa Veterinaria. 2 edicin. Universidad Autnoma de Yucatn;2005. 49. Rosenberg NJ, 1975. Micrometeorological factors involved in development and survival of free living stages of sheep nematodes. Int J Biometrica 3: 174-183. 40. Snchez AA. Coprologa diagnstica de helmintos y protozoarios del aparato digestivo. Bautista GCR, Lpez-Arellano ME editores. En: Diagnostico de enfermedades parasitarias selectas de rumiantes. INIFAP ed. DF Mxico: 2010; 26-42. 41.Soulsby EJL, 1987. Parasitologa y enfermedades parasitarias de los animales domsticos. Interamericana,ed. 7a edicin. D. F. Mxico. 42.Tarazona JM, 1986. A method for the interpretation of parasite egg count in faeces of sheep. Vet. Parasitol 22: 113-119. 43.Technical paper no.17 2011. Anna Bassett Animal Welfare Approved. Available: http://www.animalwelfareapproved.org/wp-content/uploads/2011/11/TAFS-17-Age-ofweaning-lambs.pdf. 47

44. Thienpont D, Rochette F, Vanparijs OFJ. Diagnstico de las helmintiasis por medio del exmen coprolgico. 2a edicin. Janssen Research Foundation eds., Beerse, Belgium: 1986. 45. Urquhart GM. Parasitologa Veterinaria. Editorial Acribia, Zaragoza. Espaa: 2001. 46. J, Petrtl M, Zaichenko I, adkov Z, Jankovsk I, Langrov I, Moravec M, 2011. Which McMaster egg counting technique is the most reliable? Parasitol Res 109:1387-1394. 47. Valcrcel-Sancho F, Rojo-Vzquez FA, Olmeda-Garca AS, Arribas-Novillo B, MrquezSopea L, Fernando-Pat N. Atlas de Parasitologa Ovina. Editorial Servet,. Zaragoza, Espaa: 2009 48. Van Wyk J, Cabaret J, Michael LM, 2003. Morphological identification of nematode larvae of small ruminants and cattle simplified. Vet Parasitol 119: 277-306. 49. Vzquez PV, Bautista GR. Necropsia e identificacin de helmintos del tracto gastroentricos de rumiantes. Bautista GCR, Lpez AME eds. Diagnstico de enfermedades parasitarias selectas de rumiantes. INIFAP ed. DF, Mxico: 2010; 86-126 50. West Central Veterinary Services, 2011. Internal Parasites in Goats. Available: http://westcentralvet.com/documents/WCVS_goatparasites.pdf.

48

Grupo Garlong Impresores, S.A. de C.V. Plaza del rbol #7 Col Doctor Ortiz Tirado Deleg. Iztapalapa C.P 09020, Mxico DF. Esta publicacin se imprimi en Diciembre de 2011 Numero de ejemplares, 250 Jiutepec, Morelos