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Adopte: 7 septembre 2009

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PROJET DE LIGNE DIRECTRICE DE LOCDE POUR LES ESSAIS DE PRODUITS CHIMIQUES

tudes de toxicit chronique INTRODUCTION 1. Les Lignes directrices de lOCDE pour les essais de produits chimiques (LD) sont priodiquement revues la lumire des progrs scientifiques, des nouvelles pratiques dvaluation ainsi que de considrations relatives au bien-tre animal. La LD 452 initiale a t adopte en 1981. Sa rvision a t juge ncessaire afin de tenir compte des volutions rcentes dans le domaine du bientre animal, ainsi que des nouvelles exigences rglementaires (1) (2) (3) (4). La mise jour de la LD 452 a t effectue en parallle avec la rvision des LD 451 (tudes de cancrogense) et 453 (tudes combines de toxicit chronique et de cancrogense), dans le but dobtenir des informations additionnelles partir des animaux utiliss dans ltude, et de fournir des prcisions concernant le choix des doses. La prsente Ligne directrice vise les essais portant sur une large gamme de produits chimiques, dont des pesticides et des produits chimiques industriels. 2. La plupart des tudes de toxicit chronique tant menes sur des espces de rongeurs, la prsente Ligne directrice est destine sappliquer principalement des tudes ralises avec ces espces. Sil savrait ncessaire de mener de telles tudes avec des non-rongeurs, les principes et procdures dcrits dans la prsente Ligne directrice et dans la LD 409, Toxicit orale doses rptes non-rongeurs : 90 jours (5) pourront aussi tre appliqus, moyennant des modifications appropries, comme indiqu dans le Document dorientation de lOCDE No. 116 sur llaboration et la conduite des tudes de toxicit chronique et de cancrogense (6). 3. Les trois principales voies dadministration utilises dans les tudes de toxicit chronique sont la voie orale, la voie cutane et linhalation. Le choix de la voie dadministration dpend des caractristiques physiques et chimiques de la substance dessai, et de la voie dexposition prdominante chez lhomme. Des informations complmentaires sur le choix de la voie dexposition sont fournies dans le Document dorientation No. 116 (6). 4. La prsente Ligne directrice porte essentiellement sur lexposition par voie orale, la voie la plus communment utilise dans les tudes de toxicit chronique. Bien que des tudes de toxicit chronique long terme utilisant lexposition par voie cutane ou par inhalation puissent aussi tre ncessaires pour valuer le risque pour la sant humaine et/ou exiges en vertu de certains rgimes rglementaires, ces deux voies dexposition ncessitent des dispositifs techniques d'une grande complexit. De telles tudes devront tre conues au cas par cas, encore que la prsente Ligne directrice, qui porte sur la caractrisation et lvaluation de la toxicit chronique par voie orale, puisse fournir les bases dun protocole dtude par voie cutane et/ou linhalation, notamment en ce qui concerne les recommandations relatives aux dures de traitement, aux paramtres cliniques et pathologiques, etc. Il existe des documents dorientation de lOCDE sur ladministration exprimentale de substances par inhalation (6) (7) et par voie cutane (6). Les LD 412 (8) et 413 (9), ainsi que le Document dorientation de lOCDE sur les essais de toxicit aigu par inhalation (7), sont tout particulirement consults lors de la conception d'tudes plus long terme portant sur une exposition par inhalation. La LD 410 (10) est consulte dans le cas d'un essai par voie cutane.
OCDE, (2009). L'OCDE autorise l'utilisation de ce contenu pour usage personnel, dans un but non commercial sans autorisation pralable, sous rserve de mention de la source. Toute utilisation but commercial doit faire l'objet d'une autorisation crite pralable de l'OCDE.

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5. Ltude de toxicit chronique donne des lments dinformation sur les risques pour la sant susceptibles de dcouler dune exposition rpte sur une portion considrable de la dure de vie des espces employes. Ltude fournit des informations sur les effets toxiques de la substance, et indiquera les organes cibles et la possibilit daccumulation dans ces organes. Elle peut aussi donner une estimation de la dose sans effet nocif observ, qui permet dtablir les critres de scurit concernant lexposition humaine. De plus, il convient daccorder une attention particulire lobservation clinique des animaux afin dobtenir le plus dinformations possibles. 6. Les objectifs des tudes couvertes par la prsente Ligne directrice pour les essais sont les suivants: Identification de la toxicit chronique dune substance ; Identification des organes cibles ; Caractrisation de la relation dose-effet ; Identification dun niveau de dose sans effet nocif observ (DSENO) ou du point de dpart pour ltablissement dune dose de rfrence (DR) ; Prvision des effets de toxicit chronique aux niveaux reprsentatifs de lexposition humaine ; Obtention de donnes permettant de vrifier les hypothses concernant le mode daction (6). REMARQUES PRLIMINAIRES 7. Lors de lvaluation des caractristiques toxicologiques dun produit chimique, le laboratoire charg de ltude prend en compte toutes les informations disponibles sur la substance dessai avant de raliser ltude, afin de pouvoir orienter celle-ci de manire tester plus efficacement le potentiel de toxicit chronique, et fair e le moins possible appel aux animaux. Les informations utiles pour concevoir ltude sont notamment: lidentit, la structure chimique et les proprits physico-chimiques de la substance dessai; les informations ventuelles sur son mode daction; les rsultats dventuelles tudes de toxicit in vitro ou in vivo; lutilisation (les utilisations) prvue(s) et le potentiel dexposition humaine; les donnes Q(SAR) disponibles et les donnes toxicologiques relatives aux substances structurellement apparentes; les donnes toxicocintiques disponibles (dose unique et doses rptes, si ces donnes existent) et les rsultats dautres tudes doses rptes. La dtermination de la toxicit chronique nest effectue quaprs obtention des premiers rsultats dessais de toxicit doses rptes sur 28 jours et/ou 90 jours. Il convient denvisager ladoption dune approche par tapes pour les essais de toxicit chronique entrepris dans le cadre de lvaluation globale des effets nocifs potentiels dun produit chimique particulier (11) (12) (13) (14). 8. Les mthodes statistiques les plus appropries pour lanalyse des rsultats, compte tenu du plan exprimental et des objectifs de ltude, sont identifies avant le dbut de l'tude. Il convient notamment de dterminer si les statistiques doivent prendre en compte lajustement en fonction de la survie et lanalyse effectue en cas de mort prmature des animaux d'un ou plusieurs groupes. On trouvera des indications concernant les analyses statistiques appropries, ainsi que des rfrences cls des mthodes statistiques reconnues au plan international, dans le Document dorientation No. 116 (7) ainsi que dans le Document dorientation No. 35 sur lanalyse et lvaluation des tudes de toxicit chronique et de cancrogense (15). 9. Lors de la ralisation dune tude de toxicit chronique, il est recommand de toujours suivre les principes et considrations noncs dans le Document dorientation No. 19 de lOCDE sur la reconnaissance, lvaluation et lutilisation des signes cliniques en tant queffets mesurs thiquement acceptables dans les exprimentations animales menes des fins d'valuation de la scurit (16). Le paragraphe 62 de ce document, en particulier, stipule ce qui suit : Dans les tudes comportant ladministration de doses rptes, lorsquun animal prsente des signes cliniques progressifs de
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dtrioration de son tat, une dcision deuthanasier ou non l'animal est prise en connaissance de cause. Cette dcision met en balance des facteurs tels que la valeur des informations pouvant tre obtenues en maintenant lanimal dans ltude dune part, et ltat gnral de celui-ci dautre part. Si la dcision est prise de poursuivre l'essai sur cet animal, la frquence des observations est augmente selon les besoins. Il est aussi possible, sans toutefois nuire lobjectif de lessai, dinterrompre ladministration de la substance dessai pour soulager la douleur ou la dtresse de lanimal, ou de rduire la dose teste. 10. On trouvera des informations dtailles et une discussion sur les principes dterminant le choix des doses pour les tudes de toxicit chronique et de cancrogense dans le Document d'orientation No. 116 (6) ainsi que dans deux publications de lInstitut international des sciences de la vie (17) (18). La stratgie de base pour le choix des doses dpend du ou des objectifs principaux de ltude (paragraphe 6). En choisissant des niveaux de dose appropris, il convient de trouver un quilibre entre, dune part, lidentification des dangers et, dautre part, la caractrisation des rponses aux faibles doses et leur pertinence. Cet quilibre est particulirement ncessaire dans le cas o une tude combine de toxicit chronique et de cancrogense (LD 453) est mene (paragraphe 11). 11. Il convient dexaminer lopportunit de raliser une tude combine de toxicit chronique et de cancrogense (LD 453), plutt que de raliser sparment une tude de toxicit chronique (LD 452) et une tude de cancrogense (LD 451). Lessai combin permet une meilleure efficacit en temps et en cots, par rapport la conduite de deux essais spars, et ne compromet pas la qualit des donnes de la phase chronique ou de la phase de cancrogense. Toutefois, les principes dterminant le choix de la dose (paragraphes 9 et 20-25) sont respects rigoureusement lors de la ralisation dune tude combine de toxicit chronique et de cancrogense (LD 453); il est reconnu galement que certains cadres rglementaires peuvent imposer la conduite dtudes spares. 12. Les dfinitions utilises dans le contexte de la prsente Ligne directrice figurent dans le Document dorientation No. 116 (6). PRINCIPE DE LESSAI 13. La substance dessai est administre quotidiennement plusieurs groupes danimaux dexprience des doses progressives, en gnral pendant une priode de 12 mois, bien que des dures plus longues ou plus courtes puissent aussi tre choisies, en fonction des exigences rglementaires (voir paragraphe 33). Cette dure est assez longue pour permettre aux effets de toxicit cumule de se manifester, tout en vitant les effets perturbateurs des changements lis au vieillissement. Les dviations par rapport une dure dexposition de 12 mois sont justifies, surtout dans le cas de dures plus courtes. La substance dessai est normalement administre par voie orale, mais la voie inhalatoire ou la voie cutane peut aussi tre approprie. Un ou plusieurs sacrifices en cours d'tude peuvent aussi tre prvus, par exemple 3 et 6 mois, auquel cas des groupes d'animaux supplmentaires pourront tre enrls (voir paragraphe 19). Au cours de la priode dadministration, les animaux sont examins soigneusement afin de dceler tout signe de toxicit. Les animaux qui meurent ou qui sont sacrifis en cours dessai sont autopsis et, au terme de lessai, les animaux survivants sont sacrifis et autopsis. DESCRIPTION DE LA MTHODE Choix des espces animales 14. La prsente Ligne directrice traite principalement de la caractrisation et de lvaluation de la toxicit chronique chez les rongeurs (voir paragraphe 2), bien que certains rgimes rglementaires puissent exiger la ralisation dtudes similaires chez des non-rongeurs. Dans ce cas, le choix de 3
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lespce est justifi. Sil savrait ncessaire de raliser des tudes de toxicit chronique avec des nonrongeurs, le plan et la conduite de ltude devraient tre conformes aux principes dcrits dans la prsente Ligne directrice ainsi que dans la LD 409, Toxicit orale doses rptes non-rongeurs : 90 jours (5). Des informations additionnelles sur le choix des espces et des souches sont disponibles dans le Document dorientation No. 116 (6). 15. Cette Ligne directrice se rapporte essentiellement au rat, mais dautres espces de rongeurs, comme la souris, peuvent tre utilises. Les rats et les souris sont les modles exprimentaux choisis de prfrence, en raison de leur courte dure de vie, de leur utilisation frquente dans les tudes pharmacologiques et toxicologiques, de leur sensibilit linduction de tumeurs, et de la disponibilit de souches suffisamment caractrises. Ces caractristiques permettent dobtenir une grande quantit dinformations sur la physiologie et la pathologie de ces animaux. Il convient demployer de jeunes animaux adultes sains, de souches communment utilises dans les laboratoires. Ltude de toxicit chronique sera effectue de prfrence sur des animaux de mme souche et de mme provenance que ceux utiliss dans ltude (les tudes) de toxicit prliminaire(s) de plus courte dure. Les femelles sont nullipares et non gravides. Conditions dhbergement et dalimentation 16. Les animaux peuvent tre logs individuellement ou runis dans des cages en petits groupes du mme sexe, lhbergement individuel ntant envisager que dans des cas scientifiquement justifis (19) (20) (21). Les cages sont places de faon telle que linfluence ventuelle de leur disposition sur les rsultats soit rduite au minimum. La temprature du local des animaux dexprience est de 22C ( 3C). L'humidit relative est d'au moins 30 % et nexcde pas de prfrence 70 % en dehors des moments o le local est nettoy, l'idal tant qu'elle soit comprise entre 50 et 60 %. Lclairage est artificiel, alternant 12 heures de lumire et 12 heures dobscurit. Le rgime alimentaire peut tre un rgime classique de laboratoire, avec eau potable satit. Il satisfait tous les besoins nutritionnels de lespce tudie, et la teneur en contaminants alimentaires susceptibles dinfluer sur les rsultats de lessai (rsidus de pesticides, polluants organiques persistants, phyto-strognes, mtaux lourds et mycotoxines, par exemple) est aussi faible que possible. Des donnes analytiques sur les teneurs en nutriments et en contaminants alimentaires sont recueillies rgulirement, au moins au dbut de ltude et lors des changements de lots; ces donnes figurent dans le rapport final. Des donnes analytiques sur leau de boisson utilise dans le cadre de ltude sont de mme fournies. Le choix du rgime alimentaire peut tre influenc par la ncessit dassurer un mlange convenable de la substance dessai, et de satisfaire les besoins nutritionnels des animaux lorsque la substance dessai est administre dans la nourriture. Prparation des animaux 17. Il convient dutiliser des animaux sains, acclimats aux conditions de laboratoire depuis au moins 7 jours, et nayant jamais t soumis auparavant des protocoles exprimentaux. Dans le cas des rongeurs, ladministration de la substance commence ds que possible aprs le sevrage et lacclimatation, et de prfrence avant lge de 8 semaines. Lespce, la souche, la provenance, le sexe, le poids et lge des animaux dexprience sont prciss. Au dbut de ltude, la variation de poids des animaux de chaque sexe est minimale, et nexcde pas 20% du poids moyen de tous les animaux tudis, et ce pour chaque sexe sparment. Les animaux sont affects de manire alatoire aux diffrents groupes (tmoins et traits). Aprs la randomisation, les poids moyens des groupes de chaque sexe ne prsentent pas de diffrences significatives. En cas de diffrences statistiquement significatives, la phase de randomisation est rpte dans la mesure du possible. Chaque animal reoit
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un numro didentification unique et en est marqu de manire permanente par tatouage, implant de micro-puce ou toute autre mthode approprie. PROTOCOLE Nombre et sexe des animaux 18. Il convient dutiliser des animaux des deux sexes. Leur nombre est suffisant pour qu la fin de ltude, chaque groupe contienne un nombre de sujets permettant deffectuer une valuation statistique et biologique complte. Pour les rongeurs, il convient normalement demployer au moins 20 animaux de chaque sexe chaque niveau de dose, tandis que pour les non-rongeurs, un minimum de 4 animaux de chaque sexe par groupe est recommand. Dans les tudes utilisant des souris, il peut tre ncessaire de prvoir des animaux supplmentaires dans chaque groupe de dose pour pouvoir effectuer tous les examens hmatologiques requis. Sacrifices en cours dtude, groupes satellites et animaux sentinelles 19. Ltude peut prvoir le sacrifice danimaux en cours dtude (au moins 10 animaux de chaque sexe par groupe), par exemple 6 mois, afin de recueillir des donnes sur la progression des changements toxicologiques et des informations mcanistiques, si cela est scientifiquement justifi. Si lon dispose dj de ces donnes, obtenues antrieurement lors d'tudes de toxicit doses rptes sur la substance dessai, les sacrifices en cours d'tude peuvent ne pas tre scientifiquement justifis. Des groupes satellites peuvent galement tre constitus, afin de contrler la rversibilit des ventuelles altrations toxicologiques induites par le produit chimique tudi. En gnral, ces investigations portent uniquement sur les doses maximales de ltude et sur le groupe tmoin. Un groupe supplmentaire danimaux sentinelles (gnralement 5 animaux de chaque sexe) peut tre inclus si ncessaire pour le suivi de l'tat pathologique au cours de ltude (22). Si des sacrifices en cours dtude ou linclusion de groupes sentinelles ou satellites sont prvus, le nombre danimaux utiliss dans ltude est augment du nombre danimaux que lon prvoit de sacrifier avant lachvement de ltude. Ces animaux sont normalement sujets aux mmes observations que ceux soumis la phase de toxicit chronique de ltude principale, notamment en ce qui concerne le poids corporel, la prise daliments et deau, les mesures hmatologiques et de biochimie clinique et les examens pathologiques. Toutefois, des dispositions peuvent aussi tre prises (dans les groupes d'animaux sacrifis en cours d'tude) pour limiter ces observations des mesures essentielles spcifiques telles que la neurotoxicit ou limmunotoxicit. Groupes de dose et dosage 20. Le Document dorientation No. 116 (6), donne des indications sur tous les aspects du choix des doses et des carts entre les doses. Il convient dutiliser au moins trois doses et un groupe tmoin, sauf si un essai limite est pratiqu (voir paragraphe 27). Les niveaux de doses seront gnralement bass sur les rsultats dtudes plus court terme doses rptes, ou dtudes prliminaires de dtermination des concentrations, et prennent en compte toutes les donnes toxicologiques et toxicocintiques existantes relatives la substance teste ou aux matires apparentes. 21. moins de contraintes dues la nature physico-chimique ou aux effets biologiques de la substance dessai, le niveau de dose le plus lev est choisi de manire permettre didentifier les principaux organes cibles et les effets toxiques de la substance, tout en vitant la souffrance, une toxicit svre ou une forte morbidit ou ltalit chez les animaux tests. Compte tenu des facteurs prsents au paragraphe 22 ci-dessous, le niveau de dose le plus lev est choisi pour provoquer une 5
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manifestation de toxicit, par exemple un ralentissement de la prise de poids corporel (denviron 10 %). 22. Toutefois, en fonction des objectifs de ltude (voir paragraphe 6), on pourra choisir un niveau de dose maximal plus faible que la dose qui provoque des signes de toxicit; par exemple une dose entranant un effet indsirable proccupant, mais dont limpact sur lesprance de vie ou le poids corporel reste faible. La dose maximale ne dpasse pas 1 000 mg/kg de poids corporel (dose limite, voir paragraphe 27). 23. Les niveaux de dose et les intervalles entre les doses peuvent tre choisis de manire pouvoir tablir une relation dose-rponse et une DSENO ou tout autre rsultat escompt de ltude, notamment une DR (voir paragraphe 25) au plus bas niveau de dose. Les facteurs prendre en compte dans le choix des faibles doses sont notamment la pente attendue de la courbe dose-rponse, les doses qui provoquent des changements mtaboliques importants ou qui modifient notablement le mode daction toxique, le niveau auquel on peut prvoir un seuil, ou celui auquel on peut prvoir de fixer un point de dpart pour une extrapolation aux faibles doses. 24. Les intervalles entre les doses dpendront des caractristiques de la substance dessai, et ne peuvent donc pas tre prescrits dans la prsente Ligne directrice, mais des intervalles correspondant un facteur 2 ou 4 sont souvent les plus appropris entre les doses dcroissantes, et linclusion dun quatrime groupe dessai est souvent prfrable la fixation de trs grands intervalles (correspondant par exemple un facteur de plus de 6 10) entre les doses. En gnral, les facteurs suprieurs 10 sont vits, et leur utilisation fait lobjet dune justification. 25. Comme le prcise le Document dorientation No. 116 (6), les facteurs prendre en compte dans le choix des doses sont notamment les suivants : Non-linarits ou points dinflexion connus ou supposs de la courbe dose-rponse; Toxicocintique et gammes de doses auxquelles linduction mtabolique, la saturation ou la non-linarit entre des doses externes et internes surviennent ou non; Lsions prcurseurs, marqueurs deffets ou indicateurs du droulement de processus biologiques cls sous-jacents; Aspects principaux (ou prsums) du mode daction, par exemple doses auxquelles une cytotoxicit commence se manifester, les dosages hormonaux sont perturbs, les mcanismes homostatiques sont dpasss, etc.; Rgions de la courbe dose-rponse ncessitant une estimation particulirement prcise, par exemple dans le domaine de la DR prvue ou d'un seuil prsum; Prise en compte des niveaux prvus dexposition humaine.

26. Le groupe tmoin est un groupe non-trait ou un groupe recevant le vhicule si la substance est administre dans un vhicule. Exception faite de ladministration de la substance dessai, les animaux du groupe tmoin sont traits de la mme manire que ceux des groupes dessai. Si un vhicule est employ, on administrera au groupe tmoin le plus grand volume de vhicule utilis pour les groupes traits. Si la substance dessai est incorpore aux aliments et entrane une diminution sensible de la prise de nourriture lie une moindre apptence de celle-ci, il pourra tre utile dutiliser un groupe tmoin supplmentaire nourri en parallle, qui constituerait un tmoin plus appropri.
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27. Sil est possible danticiper, en se basant sur les rsultats dtudes prliminaires, quun essai dose unique, quivalant au moins 1 000 mg/kg poids corporel/jour, ralis en suivant les procdures dcrites pour la prsente tude, ne produira probablement pas deffets indsirables, et si la toxicit est improbable compte tenu des donnes disponibles sur les substances structurellement apparentes, on peut considrer quune tude complte trois niveaux de dose nest pas indispensable. Une limite de 1 000 mg/kg poids corporel/jour peut sappliquer sauf si lexposition humaine indique quil est ncessaire de recourir un niveau de dose plus lev. Prparation des doses et administration de la substance dessai 28. La substance tester est normalement administre par voie orale, soit dans la nourriture ou leau de boisson, soit par gavage. Des informations complmentaires sur les voies et mthodes dadministration figurent dans le Document dorientation No. 116 (6). La voie et le mode dadministration dpendent de la finalit de ltude, des proprits physico-chimiques de la substance dessai, de sa biodisponibilit, ainsi que de la voie et du mode prdominants dexposition humaine. Il convient de justifier le choix de la voie et du mode d'administration. Dans lintrt des animaux, le gavage oral nest normalement choisi que pour les substances pour lesquelles cette voie et ce mode d'administration correspondent une voie d'exposition potentielle raisonnable chez l'homme (produits pharmaceutiques, par exemple). Dans le cas des produits chimiques alimentaires ou environnementaux, notamment les pesticides, ladministration se fait dordinaire via le rgime alimentaire ou leau de boisson. Toutefois, dans certains contextes, tels que lexposition professionnelle, ladministration par dautres voies peut tre plus approprie. 29. Si ncessaire, la substance dessai est dissoute ou mise en suspension dans un vhicule appropri. Il convient de prendre en compte les caractristiques suivantes du vhicule et des autres additifs, sil y a lieu: effets sur labsorption, la rpartition, le mtabolisme ou la rtention de la substance dessai; effets sur les proprits chimiques de la substance dessai susceptibles de modifier sa toxicit ; et effets sur la prise daliments ou deau, ou sur ltat nutritionnel des animaux. Il est recommand, chaque fois que les circonstances le permettent, denvisager en premier lieu lutilisation dune solution ou dune suspension aqueuse, puis celle dune solution ou dune mulsion dans une huile (par exemple huile de mas), et en dernier lieu celle dune solution dans dautres vhicules. Les caractristiques de toxicit des vhicules autres que l'eau sont connues. Il convient de disposer dinformations sur la stabilit de la substance dessai et sur lhomognit des solutions ou rations contenant les diffrentes doses (selon les cas) dans les conditions dadministration (nourriture, par exemple). 30. Il importe de veiller ce que les quantits de substances administres dans les aliments ou l'eau de boisson n'interfrent pas avec la nutrition ou avec lquilibre hydrique. Dans les tudes de toxicit long terme faisant intervenir une administration par voie alimentaire, la concentration du produit chimique dans les aliments ne dpasse pas normalement 5 % de la ration totale, afin dviter les dsquilibres nutritionnels. Si la substance dessai est incorpore la nourriture, on peut utiliser soit une concentration alimentaire constante (mg/kg daliment ou ppm), soit un niveau de dose constant par rapport au poids corporel de lanimal (mg/kg de poids corporel), calcul sur une base hebdomadaire. La solution choisie est spcifie. 31. En cas dadministration par voie orale, les animaux reoivent une dose quotidienne de la substance dessai ( raison de sept jours par semaine), et ce normalement pendant une priode de 12 mois (voir galement le paragraphe 33) encore quune dure plus longue puisse tre requise selon les prescriptions rglementaires. Tout autre rgime de dosage, par exemple une administration cinq jours par semaine, fait lobjet dune justification. En cas dadministration par voie cutane, les animaux reoivent normalement le traitement pendant au moins 6 heures par jour, 7 jours par semaine, comme 7
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le prcise la LD 410 (11), et ce pendant une priode de 12 mois. Lexposition par inhalation est ralise pendant 6 heures par jour, 7 jours par semaine, mais il est possible, si cela se justifie, de limiter lexposition 5 jours par semaine. La priode dexposition est normalement de 12 mois. Si des espces de rongeurs autres que le rat sont exposes nez seul , il est possible dajuster la dure maximale dexposition en fonction du stress propre ces espces. Le choix dune dure dexposition infrieure 6 heures par jour devra tre justifi. Voir galement la LD 412 (8). 32. Lorsque la substance dessai est administre aux animaux par gavage, l'opration est pratique aux mmes moments de la journe au moyen d'une sonde gastrique ou d'une canule d'intubation approprie. Normalement, une dose unique sera administre une fois par jour mais lorsque, par exemple, le compos chimique est un irritant local, il pourra tre envisag de maintenir la dose quotidienne en la fractionnant (deux fois par jour). Le volume maximal de liquide pouvant tre administr en une fois dpend de la taille de lanimal dexprience. Le volume est maintenu aussi faible que possible et ne dpasse pas normalement 1 ml/100 g de poids corporel pour les rongeurs (23). Il convient de minimiser la variabilit du volume test en ajustant la concentration pour obtenir un volume constant tous les niveaux de doses. Les substances potentiellement corrosives ou irritantes sont lexception et leur dilution permet d'viter tout effet local svre. Il convient dviter les concentrations dessai susceptibles dtre corrosives ou irritantes pour le tube digestif. Dure de ltude 33. Bien que la prsente Ligne directrice concerne principalement des essais de toxicit chronique dune dure de 12 mois, le plan de l'tude permet une application de dure plus courte (6 9 mois par exemple) ou plus longue (18 24 mois), pour rpondre aux exigences de rgimes rglementaires particuliers ou obtenir des donnes mcanistiques spcifiques. Les dviations par rapport une dure dexposition de 12 mois font lobjet de justifications, surtout dans le cas de dures plus courtes. Les groupes satellites inclus pour contrler la rversibilit des ventuelles altrations toxicologiques induites par le produit chimique test sont maintenus sans traitement, pendant une priode d'au moins 4 semaines et d'au plus un tiers de la dure totale de l'tude, aprs la cessation de l'exposition. Le Document dorientation No. 116 (6) fournit des indications supplmentaires, notamment en ce qui concerne la survie des animaux dexprience. OBSERVATIONS 34. Tous les animaux sont soumis un examen quotidien, gnralement en dbut et en fin de journe, fins de semaine et jours fris compris, pour dterminer la morbidit et la mortalit. Des observations cliniques sont effectues au moins une fois par jour, de prfrence au(x) mme(s) moment(s) de la journe, en tenant compte du moment o l'on prvoit que les effets des diffrentes doses atteindront leur intensit maximale aprs administration par gavage. 35. Tous les animaux font lobjet dobservations cliniques dtailles au moins une fois avant la premire exposition (pour permettre des comparaisons intra-individuelles), la fin de la premire semaine de ltude, et une fois par mois ensuite. Les observations respectent un protocole qui rduit au minimum les variations entre observateurs, et les rend indpendantes du groupe test. Ces observations sont effectues hors de la cage o sont logs les animaux, de prfrence dans une enceinte normalise et heures fixes. Elles sont soigneusement consignes, de prfrence en utilisant un systme de cotation explicitement dfini par le laboratoire qui ralise lessai. Les conditions d'observation demeurent aussi constantes que possible. Les observations portent notamment porter sur les symptmes suivants (sans que cette liste soit exhaustive): modifications de ltat de la peau, de la fourrure, des yeux et des muqueuses, apparition de scrtions et dexcrtions, et ractions neurovgtatives (par exemple, scrtion de larmes, horripilation, variation du diamtre pupillaire,
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respiration anormale). Il convient galement de consigner les changements dans la dmarche, la posture et les ractions la manipulation, ainsi que la prsence de mouvements cloniques ou toniques et les comportements strotyps (par exemple, toilettage excessif, parcours circulaires rptitifs) ou bizarres (par exemple, automutilation, marche reculons) (24). 36. Avant la premire administration de la substance dessai, tous les animaux font lobjet dun examen ophtalmologique effectu laide dun ophtalmoscope ou de autre appareil appropri. lissue de ltude, cet examen est ralis de prfrence sur tous les animaux, mais au moins sur ceux du groupe traits la dose la plus leve et du groupe tmoin. Si des altrations oculaires lies au traitement sont dtectes, tous les animaux sont examins. Si lanalyse structurale ou dautres donnes suggrent une toxicit oculaire, il faut augmenter la frquence des examens oculaires. 37. Dans le cas de substances ayant prsent un potentiel d'induction d'effets neurotoxiques lors d'essais antrieurs de toxicit doses rptes sur 28 jours et/ou 90 jours, une vrification de la ractivit sensorielle diffrents types de stimuli (24) (stimuli auditifs, visuels ou proprioceptifs, par exemple) (25) (26) (27), et une valuation de la force de prhension (28) ainsi que de lactivit motrice (29) pourront tre menes en option. Elles seront ralises avant le dbut de ltude et tous les 3 mois par la suite, jusqu 12 mois inclusivement, ainsi qu la fin de ltude (si celle-ci dure plus de 12 mois). On trouvera dans les rfrences bibliographiques susmentionnes une description plus dtaille des modes opratoires. Toutefois, dautres modes opratoires que ceux figurant dans ces rfrences sont galement utilisables. 38. Dans le cas de substances ayant prsent un potentiel d'induction d'effets immunotoxiques lors d'essais antrieurs de toxicit doses rptes sur 28 jours et/ou 90 jours, d'autres examens sur cet effet peuvent tre mens en option la fin de l'tude. Poids corporel, prise daliments et deau, et efficacit nutritionnelle 39. Tous les animaux sont pess au dbut du traitement, au moins une fois par semaine pendant les 13 premires semaines, puis au moins une fois par mois. La prise daliments et lefficacit alimentaire sont aussi mesures au moins une fois par semaine pendant les 13 premires semaines, puis au moins une fois par mois. Lorsque la substance est administre dans leau de boisson, la prise d'eau est mesure au moins une fois par semaine pendant les 13 premires semaines, puis au moins une fois par mois. Il peut galement tre utile de mesurer la prise deau dans les tudes o celle-ci est modifie. Hmatologie et biochimie clinique 40. Dans les tudes faisant intervenir des rongeurs, des examens hmatologiques sont effectus sur au moins 10 mles et 10 femelles de chaque groupe, 3, 6 et 12 mois, ainsi qu la fin de ltude (si celle-ci dure plus de 12 mois), en utilisant les mmes animaux tout au long de ltude. Si des souris sont utilises, il peut tre ncessaire de constituer des groupes satellites afin de pouvoir effectuer tous les examens hmatologiques requis (voir paragraphe 18). Dans les tudes faisant intervenir des nonrongeurs, les chantillons seront prlevs sur un plus petit nombre danimaux (par exemple, 4 animaux de chaque sexe par groupe dans les tudes chez le chien) des stades intermdiaires et la fin de ltude, de la mme manire que chez les rongeurs. Il ne sera pas ncessaire deffectuer des examens 3 mois, chez les rongeurs comme chez les autres animaux, si aucun effet sur les paramtres hmatologiques na t observ lors dune tude antrieure mene sur 90 jours des niveaux de doses comparables. Les chantillons de sang sont prlevs en un point dtermin, par exemple par ponction cardiaque ou au niveau du sinus rtro-orbitaire, sous anesthsie. 9
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41. Les investigations portent sur les paramtres suivants (30): numration leucocytaire totale et diffrentielle, numration rythrocytaire et plaquettaire, concentration dhmoglobine, hmatocrite (volume cellulaire sanguin aprs centrifugation), volume corpusculaire moyen (VCM), hmoglobine corpusculaire moyenne (HCM), concentration dhmoglobine corpusculaire moyenne (CHCM), temps de prothrombine et temps de thromboplastine partielle active. Dautres paramtres hmatologiques tels que les corps de Heinz et autres anomalies morphologiques rythrocytaires ou la mthmoglobine peuvent tre tudis si ncessaire en fonction de la toxicit de la substance. Dans lensemble, il convient dadapter l'approche suivie l'effet observ et/ou attendu dune substance donne. Si la substance exerce un effet sur le systme hmatopotique, des numrations rticulocytaires et une cytologie mdullaire peuvent galement tre indiques mais nont pas tre pratiques de manire systmatique. 42. Des analyses de biochimie clinique visant tudier les principaux effets toxiques sur les tissus, et en particulier sur le rein et le foie, sont effectues partir dchantillons de sang prlevs sur au moins 10 mles et 10 femelles de chaque groupe, des intervalles de temps semblables ceux spcifis pour les examens hmatologiques, et en utilisant les mmes animaux tout au long de ltude. Si des souris sont utilises, il peut tre ncessaire de constituer des groupes satellites afin de pouvoir effectuer toutes les analyses de biochimie clinique ncessaires. Dans les tudes faisant intervenir des non-rongeurs, les chantillons seront prlevs sur un plus petit nombre danimaux (par exemple, 4 animaux de chaque sexe par groupe dans les tudes chez le chien) des stades intermdiaires et la fin de ltude, de la mme manire que chez les rongeurs. Il ne sera pas ncessaire deffectuer des examens 3 mois, chez les rongeurs comme chez les autres animaux, si aucun effet sur les paramtres de biochimie clinique n'a t observ lors d'une tude antrieure mene sur 90 jours des niveaux de doses comparables. Il est recommand de faire jener les animaux ( lexception des souris) pendant la nuit qui prcde la prise de sang1. Les investigations portent sur les paramtres suivants (30): glucose, ure (azote urique), cratinine, protines totales, albumine, calcium, sodium, potassium, cholestrol total, au moins deux enzymes rvlatrices des effets hpatocellulaires (alanine aminotransfrase, aspartate aminotransfrase, glutamate dshydrognase, acides biliaires totaux) (31) et au moins deux enzymes rvlatrices des effets hpatobiliaires (phosphatase alcaline, gamma-glutamyl transfrase, 5nuclotidase, bilirubine totale, acides biliaires totaux) (31). Dautres paramtres de chimie clinique, tels que les triglycrides jeun, des hormones spcifiques et la cholinestrase peuvent tre mesurs si ncessaire en fonction en fonction de la toxicit de la substance. Dans lensemble, il convient d'adapter l'approche suivie l'effet observ et/ou attendu dune substance donne. 43. Des analyses durine sont effectues partir dchantillons prlevs sur au moins 10 mles et 10 femelles de chaque groupe, des intervalles de temps semblables ceux spcifis pour les examens hmatologiques et de chimie clinique. Il ne sera pas ncessaire deffectuer des dosages 3 mois si les analyses durine pratiques dans le cadre dune tude antrieure mene sur 90 jours des niveaux de doses comparables nont rvl aucun effet. La liste suivante de paramtres tudier fait partie dune recommandation dexperts relative aux tudes de pathologie clinique (30): aspect, volume, osmolalit ou poids spcifique, pH, protines totales et glucose. Dautres mesures, notamment la recherche de corps ctoniques, durobilinogne, de bilirubine et de sang occulte, peuvent aussi tre ralises.
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Pour un certain nombre de dosages effectus sur le srum ou le plasma, et plus particulirement pour le dosage du glucose, il est prfrable de faire jener les animaux durant la nuit qui prcde la prise de sang. En labsence de jene, la variabilit des rsultats est en effet plus grande, et risque de masquer des effets plus subtils ainsi que de rendre linterprtation plus difficile. En revanche, le jene peut modifier le mtabolisme gnral des animaux et, en particulier dans les tudes dalimentation, perturber lexposition quotidienne la substance dessai. Tous les animaux sont valus dans le mme tat physiologique, et il sera donc prfrable de programmer les valuations dtailles ou neurologiques pour un autre jour que celui des prlvements de biochimie clinique.

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L'tude d'autres paramtres peut aussi s'avrer ncessaire pour largir les recherches sur l'effet ou les effets observs. 44. On considre gnralement que dans les tudes portant sur des chiens, il convient de dterminer les variables hmatologiques et de biochimie clinique de base avant le dbut du traitement, mais que ce nest pas indispensable dans les tudes portant sur des rongeurs (30). Toutefois, si lon ne dispose pas de donnes historiques de base appropries (voir paragraphe 50), il convient denvisager d'en obtenir. Pathologie Autopsie macroscopique 45. Tous les animaux de ltude font normalement lobjet dune autopsie macroscopique complte et dtaille, comprenant un examen attentif de la surface externe du corps et de tous les orifices ainsi que des cavits crnienne, thoracique et abdominale et de leur contenu. Toutefois, des dispositions peuvent aussi tre prises (dans les groupes d'animaux sacrifis en cours d'tude ou les groupes satellites) pour limiter ces observations des mesures essentielles telles que la neurotoxicit ou limmunotoxicit (voir paragraphe 19). Il nest pas ncessaire que ces animaux fassent lobjet dune autopsie, ni des procdures ultrieures dcrites dans les paragraphes qui suivent. Lautopsie des animaux sentinelles peut devoir tre effectue au cas-par-cas, la discrtion du directeur dtude. 46. Il convient de dterminer le poids des organes de tous les animaux hormis ceux mentionns dans la dernire partie du paragraphe 45. Les glandes surrnales, le cerveau, les pididymes, le cur, les reins, le foie, les ovaires, la rate, les testicules, la thyrode (pese aprs fixation, avec les glandes parathyrodes) et lutrus de tous les animaux (except ceux trouvs moribonds et/ou ayant t sacrifis en cours dtude) sont dbarrasss, le cas chant, de tout tissu adhrent et pess ltat frais ds que possible aprs la dissection, pour prvenir la dessiccation. Dans les tudes chez la souris, la pese des glandes surrnales est facultative. 47. Les tissus suivants sont conservs dans le milieu de fixation le plus appropri, la fois pour le type de tissu et pour lexamen histopathologique prvu (32) (lexamen des tissus indiqus entre crochets est facultatif) :
toutes les macroscopiques aorte [bulbe olfactif] lsions ganglions lymphatiques (superficiels et profonds) glande coagulante glande de Harder muscle squelettique nerf priphrique [voies respiratoires suprieures dont nez, cornets et sinus paranasaux] il (dont rtine) sophage rein [sternum] testicule

ccum cerveau (segments d'encphale, de cervelet et de bulbe rachidien/pont) cur col utrin clon

glande lacrymale (exorbitale) glande mammaire (obligatoire pour les femelles et, si visible la dissection, aussi pour les mles) glande salivaire glande surrnale hypophyse

thymus thyrode

ovaire pancras parathyrode

trache [uretre] [urtre] OCDE, (2009)

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[dents] duodnum pididyme estomac (pr-estomac, estomac glandulaire) [fmur avec articulation]

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ilon jjunum [langue] moelle pinire (niveaux cervical, msothoracique et lombaire) segment de moelle osseuse et/ou moelle osseuse frachement ponctionne

Peau poumon prostate rate

utrus (col inclus) vagin vsicule biliaire (pour les espces autres que le rat) vsicule sminale

rectum

vessie urinaire

foie

Dans le cas des organes allant par paires, par exemple les reins ou les glandes surrnales, les deux organes sont prservs. Les observations, notamment cliniques, peuvent amener examiner dautres tissus. Tous les organes considrs comme des organes cibles potentiels du fait des proprits connues de la substance dessai sont aussi conservs. Dans les tudes portant sur une administration par la voie cutane, il y a lieu de conserver les organes figurant sur la liste tablie pour la voie orale, et de procder un prlvement et une conservation spcifiques de la peau provenant du site d'application. Pour les tudes par inhalation, la liste des tissus des voies respiratoires conservs et examins est conforme aux recommandations des LD 412 (8) et 413 (9). Pour les autres organes et tissus (outre les tissus de lappareil respiratoire spcifiquement conservs), il convient dexaminer les organes de la liste tablie pour la voie orale. Histopathologie 48. Des informations sont disponibles sur les meilleures pratiques en matire de conduite des tudes de pathologie toxicologique (32). Au minimum, les examens histopathologiques devront porter sur les tissus suivants : Tous les tissus prlevs dans le groupe dose leve et le groupe tmoin; Tous les tissus prlevs sur les animaux morts ou sacrifis au cours de ltude; Tous les tissus prsentant des anomalies macroscopiques; Tissus des organes cibles, ou tissus prsentant des altrations dues au traitement dans le groupe dose leve, prlevs sur tous les animaux de tous les autres groupes de doses; Dans le cas des organes allant par paires, comme les reins ou les glandes surrnales, les deux organes sont examins.

RSULTATS ET RAPPORT Rsultats 49. Des donnes sont recueillies pour chaque animal sur tous les paramtres valus. En outre, toutes les donnes sont rsumes sous forme de tableaux synoptiques indiquant, pour chaque groupe exprimental, le nombre d'animaux au dbut de l'essai, le nombre d'animaux trouvs morts au cours de l'essai ou euthanasis, le moment de la mort ou du sacrifice, le nombre d'animaux prsentant des signes de toxicit, la description des signes de toxicit observs, ainsi que le moment de lapparition, la dure et la gravit de tous les effets toxiques observs, le nombre d'animaux prsentant des lsions, les types de lsions et le pourcentage d'animaux prsentant chaque type de lsion. Les tableaux
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rcapitulatifs prsentent les moyennes et les carts types (pour les donnes recueillies en continu) pour les animaux prsentant des effets toxiques ou des lsions, ainsi quune cotation des lsions. 50. Les donnes de contrle historiques peuvent faciliter linterprtation des rsultats de ltude, par exemple lorsque les donnes provenant des tmoins concurrents semblent diverger de manire significative de donnes rcentes obtenues sur des animaux tmoins issus de la mme installation dessai/colonie dlevage. Si elles sont values, les donnes de contrle historiques manent du mme laboratoire et porter sur des animaux du mme ge et de la mme souche, produits dans les cinq ans prcdant ltude en question. 51. Si possible, les rsultats numriques devront tre valus laide dune mthode statistique approprie et largement reconnue. Les mthodes statistiques et les donnes analyser sont choisies au moment de la conception de ltude (paragraphe 8). Ce choix permet doprer des ajustements en fonction de la survie, si ncessaire. RAPPORT DESSAI 52. Le rapport dessai mentionne les informations suivantes:

Substance dessai :

tat physique, puret et proprits physico-chimiques; donnes d'identification; provenance de la substance; numro de lot; certificat danalyse chimique;
Vhicule (le cas chant):

justification du choix de vhicule (sil est autre que leau);

Animaux dexprience:

espce/souche utilise et justification du choix opr; nombre, ge et sexe des animaux au dbut de lessai; provenance, conditions dencagement, rgime alimentaire, etc.; poids de chaque animal au dbut de lessai;

Conditions exprimentales:

justification de la voie dadministration et du choix des doses; le cas chant, mthodes statistiques utilises pour analyser les donnes; dtails concernant la formulation de la substance dessai ou son incorporation dans les aliments; donnes analytiques sur la concentration obtenue, la stabilit et lhomognit de la prparation; voie dadministration et dtails concernant ladministration de la substance dessai;
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pour les tudes par inhalation, mention de la voie dentre (nez seul ou corps entier); doses relles (mg/kg de poids corporel/jour) et, le cas chant, facteur de conversion en dose relle de la concentration de la substance dessai (en mg/kg ou en ppm) dans les aliments ou l'eau de boisson; dtails concernant la qualit de lalimentation et de leau de boisson;
Rsultats (Les rsultats comprendront des donnes gnrales sous forme de tableaux synoptiques et des donnes propres chaque animal):

donnes sur la survie; poids corporel/variations du poids corporel; prise daliments, calculs de lefficacit alimentaire, si effectus, et prise deau, le cas chant; rponse toxique par sexe et dose, y compris signes de toxicit; nature, incidence (et, si elle est value, svrit), et dure des observations cliniques (transitoires ou permanentes); examen ophtalmologique; examens hmatologiques; preuves de biochimie clinique; examens durine; rsultats des recherches de neurotoxicit ou dimmunotoxicit; poids corporel lissue de lessai ; poids des organes (et leur rapport au poids corporel, le cas chant); rsultats dautopsie; description dtaille de tous les rsultats histopathologiques lis au traitement; donnes relatives labsorption, le cas chant;

Traitement statistiques des rsultats, le cas chant Discussion des rsultats, notamment :

relations dose-rponse; examen de toutes les informations concernant le mode daction; examen de toutes les approches de modlisation; dtermination des DR, DSENO et DMENO (dose minimale avec effet nocif observ); donnes de contrle historiques; applicabilit des rsultats ltre humain;
Conclusions

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