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Adopte: 7 septembre 2009

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PROJET DE LIGNE DIRECTRICE DE L'OCDE POUR LES ESSAIS DE PRODUITS CHIMIQUES

tudes de cancrognse

INTRODUCTION 1. Les Lignes directrices de l'OCDE pour les essais de produits chimiques (LD) sont priodiquement revues la lumire des progrs scientifiques, des nouvelles pratiques d'valuation ainsi que de considrations relatives au bien-tre animal. La Ligne directrice initiale sur les tudes de cancrogense (LD 451) a t adopte en 1981. Sa rvision a t juge ncessaire afin de tenir compte des volutions rcentes dans le domaine du bien-tre animal, ainsi que des nouvelles exigences rglementaires (1) (2) (3) (4) (5). La mise jour de la LD 451 a t effectue en parallle avec la rvision des LD 452 (tudes de toxicit chronique) et 453 (tudes combines de toxicit chronique et de cancrogense) dans le but d'obtenir des informations additionnelles partir des animaux utiliss dans ltude, et de fournir des prcisions concernant le choix des doses. La prsente Ligne directrice vise les essais portant sur une large gamme de produits chimiques, dont des pesticides et des produits chimiques industriels. Il convient toutefois de noter que certains aspects et certaines dispositions peuvent diffrer pour les produits pharmaceutiques (voir la Confrence internationale sur l'harmonisation, thme S1B: valuation de la cancrognicit des produits pharmaceutiques). 2. La plupart des tudes de cancrogense tant menes sur des espces de rongeurs, la prsente Ligne directrice est destine sappliquer principalement des tudes ralises avec ces espces. S'il s'avrait ncessaire de mener de telles tudes avec des non-rongeurs, il conviendrait d'appliquer, moyennant des modifications appropries, les principes et procdures dcrits dans la prsente Ligne directrice et dans la LD 409 - Toxicit orale doses rptes - non-rongeurs : 90 jours (6). Des informations complmentaires peuvent aussi tre trouves dans le Document d'orientation de l'OCDE No. 116 sur llaboration et la conduite des tudes de toxicit chronique et de cancrogense (7). 3. Les trois principales voies d'administration utilises dans les tudes de cancrogense sont la voie orale, la voie cutane et l'inhalation. Le choix de la voie d'administration dpend des caractristiques physiques et chimiques de la substance dessai et de la voie d'exposition prdominante chez lhomme. Des informations complmentaires sur le choix de la voie d'exposition sont fournies dans le Document d'orientation No. 116 (7). 4. La prsente Ligne directrice porte principalement sur l'exposition par voie orale, la voie la plus communment utilise dans les tudes de cancrogense. Bien que des tudes de cancrogense utilisant lexposition par voie cutane ou par inhalation puissent aussi tre ncessaires pour valuer le risque pour la sant humaine et/ou exiges en vertu de certains rgimes rglementaires, ces deux voies d'exposition ncessitent des dispositifs techniques d'une grande complexit. De telles tudes devront tre conues au cas par cas, encore que la prsente Ligne directrice, qui porte sur la caractrisation et l'valuation de la cancrognicit par voie orale, puisse fournir les bases d'un protocole d'tude par voie cutane ou linhalation, notamment en ce qui concerne les recommandations relatives aux dures de traitement, aux paramtres cliniques et pathologiques, etc. Il existe des documents d'orientation de l'OCDE sur l'administration exprimentale de substances par voie cutane (7) et par inhalation (7) (8).
OCDE, (2009). L'OCDE autorise l'utilisation de ce contenu pour usage personnel, dans un but non commercial sans autorisation pralable, sous rserve de mention de la source. Toute utilisation but commercial doit faire l'objet d'une autorisation crite pralable de l'OCDE.

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Les LD 412 (9) et 413 (10), ainsi que le Document d'orientation de lOCDE sur l'essai de toxicit aigu par inhalation (8), sont tout particulirement consults lors de la conception d'tudes long terme portant sur une exposition par inhalation. La LD 410 (11) est consulte dans le cas d'un essai portant sur la voie cutane. 5. L'tude de cancrogense donne des lments d'information sur les risques pour la sant susceptibles de dcouler d'une exposition rpte pendant une priode pouvant couvrir la vie entire de l'espce considre. L'tude fournit des informations sur les effets toxiques de la substance, y compris sur son pouvoir cancrogne, et peut indiquer les organes cibles et la possibilit daccumulation dans ces organes. Elle peut aussi donner une estimation de la dose sans effet nocif observ pour ce qui est des effets toxiques et, dans le cas des substances cancrognes non gnotoxiques, des rponses tumorales. Cette estimation permet dtablir les critres de scurit concernant l'exposition humaine. De plus, il convient daccorder une attention particulire lobservation clinique des animaux afin dobtenir le plus dinformations possibles. 6. Les objectifs des tudes de cancrogense couvertes par la prsente Ligne directrice pour les essais sont les suivants : Identification des proprits cancrognes d'un produit chimique susceptibles d'augmenter les risques de noplasmes, la frquence de survenue de noplasmes malins ou la diminution du temps ncessaire leur apparition, par rapport aux groupes tmoins concurrents; Identification d'un ou de plusieurs organes cibles de la cancrogense; Identification du temps d'apparition des noplasmes; Caractrisation de la relation entre la dose administre et la rponse tumorale; Identification du niveau de dose sans effet nocif observ (DSENO) ou du point de dpart pour ltablissement d'une dose de rfrence (DR); Extrapolation des effets cancrognes aux niveaux dexposition humaine correspondant de faibles doses; Obtention de donnes permettant de vrifier les hypothses concernant le mode d'action (2) (7) (12) (13) (14) (15). REMARQUES PRLIMINAIRES 7. Pour caractriser et valuer la cancrognicit potentielle d'un produit chimique, le laboratoire charg de ltude prend en compte toutes les informations disponibles sur la substance dessai avant de raliser l'tude, afin de pouvoir orienter celle-ci de manire tester plus efficacement le potentiel cancrogne de la substance, et faire le moins possible appel aux animaux. La connaissance du mode d'action d'un agent cancrogne suspect et sa prise en compte (2) (7) (12) (13) (14) (15) sont particulirement importantes puisque la conception optimale de l'essai peut diffrer selon que la substance est ou n'est pas un agent cancrogne gnotoxique connu ou suspect. Des informations complmentaires sur certains aspects du mode d'action peuvent tre trouves dans le Document d'orientation No. 116 (7). 8. Les informations utiles pour concevoir ltude sont notamment: l'identit, la structure chimique et les proprits physico-chimiques de la substance dessai ; les rsultats de toutes les tudes de toxicit in vitro ou in vivo menes et notamment des essais de gnotoxicit; l'utilisation (les utilisations) prvue(s) et le potentiel d'exposition humaine; les donnes (Q)SAR disponibles et les donnes toxicologiques (par exemple mutagnicit, gnotoxicit et pouvoir cancrogne) relatives aux
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substances structurellement apparentes; les donnes toxicocintiques disponibles (dose unique et doses rptes, si ces donnes existent) et les rsultats d'autres tudes doses rptes. La caractrisation du pouvoir cancrogne est effectue aprs obtention des premiers rsultats d'essais de toxicit doses rptes mens sur 28 jours et/ou 90 jours. Les essais d'initiation-promotion de cancers court terme peuvent aussi livrer des informations utiles. Il convient denvisager ladoption dune approche par tapes pour ltude exprimentale de la cancrogense entreprise dans le cadre de l'valuation globale des effets nocifs potentiels d'un produit chimique (16) (17) (18) (19). 9. Les mthodes statistiques les plus appropries pour l'analyse des rsultats, compte tenu du plan exprimental et des objectifs de ltude, sont identifies avant le dbut de l'tude. Il convient notamment de dterminer si les statistiques doivent prendre en compte l'ajustement en fonction de la survie, l'analyse des risques de tumeurs cumules lis la dure de survie, l'analyse du temps ncessaire l'apparition d'une tumeur et l'analyse effectue en cas de mort prmature des animaux d'un ou de plusieurs groupes. On trouvera des indications concernant les analyses statistiques appropries, ainsi que des rfrences cls des mthodes statistiques reconnues au plan international, dans le Document d'orientation No. 116 (7), ainsi que dans le Document d'orientation No. 35 sur l'analyse et l'valuation des tudes de toxicit chronique et de cancrogense (20). 10. Lors de la ralisation d'une tude de cancrogense, il est recommand de toujours suivre les principes et considrations noncs dans le Document d'orientation No. 19 de l'OCDE sur la reconnaissance, l'valuation et l'utilisation des signes cliniques comme effets observs thiquement acceptables dans les exprimentations animales menes des fins d'valuation de la scurit (21). Le paragraphe 62 de ce document, en particulier, stipule ce qui suit : Dans les tudes comportant l'administration de doses rptes, lorsqu'un animal prsente des signes cliniques progressifs de dtrioration de son tat, une dcision deuthanasier ou non l'animal est prise en connaissance de cause. Cette dcision met en balance des facteurs tels que la valeur des informations pouvant tre obtenues en maintenant l'animal dans l'tude dune part, et ltat gnral de celui-ci dautre part. Si la dcision est prise de poursuivre l'essai sur cet animal, la frquence des observations est augmente selon les besoins. Il est aussi possible, sans toutefois nuire l'objectif de l'essai, dinterrompre l'administration de la substance dessai pour soulager la douleur ou la dtresse de lanimal, ou de rduire la dose teste. 11. On trouvera des informations dtailles et une discussion sur les principes dterminant le choix des doses pour les tudes de toxicit chronique et de cancrogense dans le Document d'orientation No. 116 (7), ainsi que dans deux publications de l'Institut international des sciences de la vie (22) (23). La stratgie de base pour le choix des doses dpend du ou des principaux objectifs de l'tude (paragraphe 6). En choisissant des niveaux de doses appropris, il convient de trouver un quilibre entre, d'une part, l'identification des dangers et, d'autre part, la caractrisation des rponses aux faibles doses et leur pertinence. Cet quilibre est particulirement ncessaire dans le cas o une tude combine de toxicit chronique et de cancrogense (LD 453) est mene (paragraphe 12). 12. Il convient dexaminer lopportunit de raliser une tude combine de toxicit chronique et de cancrogense (LD 453) plutt que de raliser sparment une tude de toxicit chronique (LD 452) et une tude de cancrogense (LD 451). L'essai combin permet une meilleure efficacit en temps et en cots par rapport la conduite de deux essais spars, et ne compromet pas la qualit des donnes de la phase chronique ou de la phase de cancrogense. Lors de la ralisation d'une tude combine (LD 453), il convient toutefois de respecter les principes dterminant le choix de la dose (paragraphes 11 et 22 25) et il est galement reconnu que certains cadres rglementaires peuvent imposer la conduite d'tudes spares.

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13. Les dfinitions utilises dans le contexte de la prsente Ligne directrice figurent dans le document d'orientation No. 116 (7). PRINCIPE DE L'ESSAI 14. La substance dessai est administre quotidiennement diffrents groupes d'animaux, pendant la plus grande partie de leur vie, des doses progressives et habituellement par la voie orale. Les essais par inhalation ou par la voie cutane peuvent aussi tre appropris. Les animaux sont observs attentivement pendant la priode d'administration afin de dceler d'ventuels signes de toxicit et le dveloppement de lsions noplasiques. Les animaux qui meurent ou sont sacrifis en cours d'essai sont autopsis et, au terme de l'essai, les animaux survivants sont sacrifis et autopsis. DESCRIPTION DE LA MTHODE Choix des espces animales 15. La prsente Ligne directrice traite principalement de la caractrisation et de l'valuation de la cancrognicit chez les rongeurs (paragraphe 2). Le recours des espces autres que des rongeurs peut tre envisag si les donnes disponibles laissent escompter une meilleure prdiction des effets de la substance sur la sant humaine. Dans ce cas, le choix de l'espce est justifi. L'espce de rongeur prfre est le rat, mais dautres rongeurs comme la souris peuvent tre utiliss. Bien que le recours la souris dans les tudes de cancrogense puisse ne prsenter qu'un intrt limit (24) (25) (26), certains programmes rglementaires actuels exigent tout de mme la conduite d'essais de cancrogense sur la souris. Les rats et les souris sont les modles exprimentaux choisis de prfrence, en raison de leur dure de vie relativement courte, de leur utilisation frquente dans les tudes pharmacologiques et toxicologiques, de leur sensibilit l'induction de tumeurs et de la disponibilit de souches suffisamment caractrises. Ces caractristiques permettent d'obtenir une grande quantit d'informations sur la physiologie et la pathologie de ces animaux. Des informations additionnelles sur le choix des espces et des souches sont disponibles dans le Document d'orientation No. 116 (7). 16. Il convient d'employer des animaux adultes sains, de souches communment utilises dans les laboratoires. L'tude de cancrogense sera effectue de prfrence sur des animaux de mme souche et de mme provenance que ceux utiliss dans ltude (les tudes) de toxicit prliminaire(s) de plus courte dure. Si toutefois ces animaux sont rputs ne pas rpondre aux critres de survie gnralement admis dans les tudes long terme [voir le Document d'orientation No. 116 (7)], il convient denvisager d'utiliser une souche d'un animal dont le taux de survie permette de raliser une tude long terme. Les femelles sont nullipares et non gravides. Conditions dhbergement et dalimentation 17. Les animaux peuvent tre logs individuellement ou runis dans des cages en petits groupes du mme sexe, lhbergement individuel n'tant envisager que dans des cas scientifiquement justifis (27) (28) (29). Les cages sont places de faon telle que l'influence ventuelle de leur disposition sur les rsultats de l'tude soit rduite au minimum. La temprature du local des animaux dexprience est de 22 C ( 3 C). L'humidit relative est d'au moins 30 % et nexcde pas de prfrence 70 % en dehors des moments o le local est nettoy, l'idal tant qu'elle soit comprise entre 50 et 60 %. L'clairage est artificiel, alternant 12 heures de lumire et 12 heures dobscurit. Le rgime alimentaire peut tre un rgime classique de laboratoire avec eau potable satit. Il satisfait tous les besoins nutritionnels de l'espce tudie, et la teneur en contaminants alimentaires susceptibles d'influer sur les rsultats de l'essai (rsidus de pesticides, polluants organiques persistants, phyto-strognes, mtaux
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lourds et mycotoxines, par exemple) est aussi faible que possible. Des donnes analytiques sur les teneurs en nutriments et en contaminants alimentaires sont recueillies rgulirement, au moins au dbut de l'tude et lors des changements de lots; ces donnes figurent dans le rapport final. Des donnes analytiques sur l'eau de boisson utilise lors de l'tude sont de mme fournies. Le choix du rgime alimentaire peut tre influenc par la ncessit d'assurer un mlange convenable de la substance dessai et de satisfaire les besoins nutritionnels des animaux lorsque la substance est administre dans la nourriture. Prparation des animaux 18. Il convient d'utiliser des animaux sains, acclimats aux conditions de laboratoire depuis au moins 7 jours et n'ayant jamais t soumis auparavant des protocoles exprimentaux. Dans le cas des rongeurs, l'administration de la substance commence ds que possible aprs le sevrage et l'acclimatation, et de prfrence avant l'ge de 8 semaines. Lespce, la souche, la provenance, le sexe, le poids et lge des animaux dexprience sont prciss. Au dbut de l'tude, la variation de poids des animaux de chaque sexe est minimale et nexcde pas 20 % du poids moyen de tous les animaux tudis, et ce pour chaque sexe sparment. Les animaux sont affects de manire alatoire aux diffrents groupes (tmoins et traits). Aprs la randomisation, les poids moyens des groupes de chaque sexe ne prsentent pas de diffrences significatives. En cas de diffrences statistiquement significatives, la phase de randomisation est rpte dans la mesure du possible. Chaque animal reoit un numro d'identification unique et en est marqu de manire permanente par tatouage, implant de micropuce ou toute autre mthode approprie. PROTOCOLE Nombre et sexe des animaux 19. Il convient dutiliser des animaux des deux sexes. Leur nombre est suffisant pour permettre une valuation biologique et statistique complte. Chaque groupe de dose, de mme que chaque groupe tmoin correspondant, comprend au moins 50 animaux de chaque sexe. Selon le but de l'tude, il est possible d'augmenter la puissance statistique des principales estimations en rpartissant les animaux de manire diffrencie entre les groupes de doses, avec plus de 50 animaux dans les groupes faibles doses pour estimer par exemple la cancrognicit aux faibles doses. Il convient toutefois de noter qu'une augmentation modre de la taille d'un groupe entranera une augmentation relativement faible de la puissance statistique de l'tude. On trouvera des donnes complmentaires sur la conception statistique de l'tude, et sur le choix de niveaux de doses permettant d'optimiser la puissance statistique, dans le Document d'orientation No. 116 (7). Sacrifices en cours d'tude et groupes satellites (sentinelles) 20. Ltude peut prvoir le sacrifice danimaux en cours d'tude, par exemple 12 mois, afin de recueillir des donnes sur la progression des altrations noplasiques et des donnes mcanistiques, si cela est scientifiquement justifi. Si lon dispose dj de ces donnes, obtenues antrieurement lors d'tudes de toxicit doses rptes sur la substance dessai, les sacrifices en cours d'tude peuvent ne pas tre scientifiquement justifis. Sils sont nanmoins inclus dans l'tude, les groupes danimaux traits destins tre sacrifis en cours dtude comptent normalement 10 animaux de chaque sexe, et le nombre total d'animaux utiliss dans l'tude est augment du nombre d'animaux que lon prvoit de sacrifier avant lachvement de l'tude. Un groupe supplmentaire d'animaux sentinelles (gnralement 5 animaux de chaque sexe) peut tre inclus si ncessaire pour le suivi de l'tat pathologique au cours de l'tude (30). Des informations complmentaires figurent dans le Document d'orientation No. 116 (7). 5
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Groupes de dose et dosage

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21. Le Document d'orientation No. 116 (7) donne des indications sur tous les aspects du choix des doses et des carts entre les doses. Il convient dutiliser au moins trois doses et un groupe tmoin. Les niveaux de doses seront gnralement bass sur les rsultats d'tudes plus court terme doses rptes, ou d'tudes prliminaires de dtermination des concentrations, et prennent en compte toutes les donnes toxicologiques et toxicocintiques existantes relatives la substance teste ou aux matires apparentes. 22. moins de contraintes dues la nature physico-chimique ou aux effets biologiques de la substance dessai, le niveau de dose le plus lev est choisi de manire permettre d'identifier les principaux organes cibles et les effets toxiques de la substance tout en vitant la souffrance, une toxicit svre ou une forte morbidit ou ltalit chez les animaux tests. Compte tenu des facteurs mentionns au paragraphe 23 ci-dessous, la plus forte dose est normalement choisie pour provoquer une manifestation de toxicit, par exemple un ralentissement de la prise de poids corporel (d'environ 10 %). Toutefois, en fonction des objectifs de l'tude (voir paragraphe 6), on pourra choisir un niveau de dose maximal plus faible que la dose qui provoque des signes de toxicit, par exemple une dose entranant un effet ngatif proccupant mais dont limpact sur lesprance de vie ou le poids corporel reste faible. 23. Les niveaux de doses et les intervalles entre les doses peuvent tre choisis de manire pouvoir tablir une relation dose-rponse et, selon le mode d'action de la substance tester, une DSENO ou tout autre rsultat escompt de l'tude, notamment une DR (voir paragraphe 25) au plus bas niveau de dose. Les facteurs prendre en compte dans le choix des faibles doses sont notamment la pente attendue de la courbe dose-rponse, les doses qui provoquent des changements mtaboliques importants ou qui modifient notablement le mode daction toxique, le niveau auquel on peut prvoir un seuil, ou celui auquel on peut prvoir de fixer un point de dpart pour une extrapolation aux faibles doses. 24. Les intervalles entre les doses dpendront des caractristiques de la substance dessai, et ne peuvent donc pas tre prescrits dans la prsente Ligne directrice, mais des intervalles correspondant un facteur 2 ou 4 sont souvent les plus appropris entre les doses dcroissantes, et l'inclusion d'un quatrime groupe dessai est souvent prfrable la fixation de trs grands intervalles (correspondant par exemple un facteur de plus de 6 10) entre les doses. En gnral, les facteurs suprieurs 10 sont vits, et leur utilisation est justifie. 25. Comme le prcise le Document d'orientation No. 116 (7), les facteurs prendre en compte dans le choix des doses sont notamment les suivants : Non-linarits ou points d'inflexion connus ou supposs de la courbe dose-rponse ; Toxicocintique et gammes de doses auxquelles l'induction mtabolique, la saturation ou la non-linarit entre les doses internes et externes surviennent ou non ; Lsions prcurseurs, marqueurs d'effets ou indicateurs du droulement de processus biologiques cls sous-jacents ; Aspects principaux (ou prsums) du mode d'action, par exemple doses auxquelles une cytotoxicit commence se manifester, les dosages hormonaux sont modifis, les mcanismes homostatiques sont dpasss, etc. ; 6

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rgions de la courbe dose-rponse ncessitant une estimation particulirement prcise, par exemple dans le domaine de la DR prvue ou d'un seuil prsum ; prise en compte des niveaux prvus d'exposition humaine.

26. Le groupe tmoin sera un groupe non trait ou un groupe recevant le vhicule si la substance est administre dans un vhicule. Exception faite de ladministration de la substance dessai, les animaux du groupe sont traits de la mme manire que ceux des groupes dessai. Si un vhicule est employ, on administrera au groupe tmoin le plus grand volume de vhicule utilis pour les groupes traits. Si la substance dessai est incorpore aux aliments et entrane une diminution sensible de la prise de nourriture lie une moindre apptence de celle-ci, il pourra tre utile dutiliser un groupe tmoin supplmentaire nourri en parallle, qui constituerait un tmoin plus appropri. Prparation des doses et administration de la substance dessai 27. La substance tester est normalement administre par voie orale, soit dans la nourriture ou l'eau de boisson, soit par gavage. Des informations complmentaires sur les voies et mthodes d'administration figurent dans le Document d'orientation No. 116 (7). La voie et le mode d'administration dpendent de la finalit de l'tude, des proprits physico-chimiques de la substance dessai, de sa biodisponibilit ainsi que de la voie et du mode prdominants d'exposition humaine. Il convient de justifier le choix de la voie et du mode d'administration. Dans lintrt des animaux, le gavage oral nest normalement choisi que pour les substances pour lesquelles cette voie et ce mode d'administration correspondent une voie d'exposition potentielle raisonnable chez l'homme (produits pharmaceutiques, par exemple). Dans le cas des produits chimiques alimentaires ou environnementaux, notamment les pesticides, l'administration se fait dordinaire via le rgime alimentaire ou l'eau de boisson. Toutefois, dans certains contextes, tels que lexposition professionnelle, l'administration par d'autres voies peut tre plus approprie. 28. Si ncessaire, la substance dessai est dissoute ou mise en suspension dans un vhicule appropri. Il convient de prendre en compte les caractristiques suivantes du vhicule et des autres additifs, sil y a lieu: effets sur l'absorption, la rpartition, le mtabolisme ou la rtention de la substance dessai; effets sur les proprits chimiques de la substance dessai susceptibles de modifier sa toxicit; et effets sur la consommation d'aliments ou d'eau, ou sur ltat nutritionnel des animaux. Il est recommand, dans la mesure du possible, d'envisager en premier lieu une solution ou une suspension aqueuse, puis celle dune solution ou dune mulsion dans une huile (par exemple huile de mas), et en dernier lieu celle dune solution dans d'autres vhicules. Les caractristiques de toxicit des vhicules autres que l'eau sont connues. Il convient de disposer de donnes sur la stabilit de la substance dessai et sur l'homognit des solutions ou rations contenant les diffrentes doses (selon les cas) dans les conditions d'administration (nourriture, par exemple). 29. Il importe de veiller ce que les quantits de substances administres dans les aliments ou l'eau de boisson n'interfrent pas avec la nutrition ou l'quilibre hydrique. Dans les tudes de toxicit long terme faisant intervenir une administration par voie alimentaire, la concentration du produit chimique dans les aliments ne dpasse pas normalement 5 % de la ration totale, afin dviter les dsquilibres nutritionnels. Si la substance dessai est incorpore la nourriture, on peut utiliser soit une concentration alimentaire constante (mg/kg d'aliment ou ppm) soit un niveau de dose constant par rapport au poids corporel de l'animal (mg/kg de poids corporel), calcul sur une base hebdomadaire. La solution choisie est spcifie. 30. En cas d'administration par voie orale, les animaux reoivent une dose quotidienne de la substance dessai ( raison de 7 jours par semaine) et ce normalement pendant une priode de 24 mois 7
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pour les rongeurs (voir aussi le paragraphe 32). Tout autre rgime de dosage, par exemple une administration 5 jours par semaine, fait lobjet dune justification. En cas d'administration par voie cutane, les animaux reoivent normalement le traitement pendant au moins 6 heures par jour, 7 jours par semaine, comme le spcifie la LD 410 (11), et ce pendant une priode de 24 mois. L'exposition par inhalation est ralise pendant 6 heures par jour, 7 jours par semaine, mais il est possible, si cela se justifie, de limiter lexposition 5 jours par semaine. La priode d'exposition est normalement de 24 mois. Si des espces de rongeurs autres que le rat sont exposes nez seul , il est possible dajuster la dure maximale dexposition en fonction du stress propre ces espces. Le choix d'une dure d'exposition infrieure 6 heures par jour devra tre justifi. Voir aussi ce sujet la LD 412 (9). 31. Lorsque la substance dessai est administre aux animaux par gavage, l'opration est pratique aux mmes moments de la journe au moyen d'une sonde gastrique ou d'une canule d'intubation approprie. Normalement, une dose unique sera administre une fois par jour mais lorsque, par exemple, le compos chimique est un irritant local, il pourra tre envisag de maintenir la dose journalire en la fractionnant (deux fois par jour). Le volume maximal de liquide pouvant tre administr en une fois dpend de la taille de l'animal d'exprience. Le volume est maintenu aussi faible que possible et nexcde pas normalement 1 ml/100 g de poids corporel pour les rongeurs (31). Il convient de minimiser la variabilit du volume test en ajustant la concentration pour obtenir un volume constant tous les niveaux de doses. Les substances potentiellement corrosives ou irritantes sont l'exception et leur dilution permettra d'viter tout effet local svre. Lessai nest donc pas men des concentrations susceptibles d'tre corrosives ou irritantes pour le tube digestif. Dure de l'tude 32. La dure de l'tude sera normalement de 24 mois pour les rongeurs, ce qui correspond la majeure partie de la dure de vie normale des animaux utiliss. Elle pourra tre allonge ou raccourcie selon la dure de vie de la souche de l'espce animale utilise, mais cette dcision fait lobjet dune justification. Pour certaines souches particulires de souris, par exemple AKR/J, C3H/J ou C57BL/6J, une dure de 18 mois peut tre plus approprie. On trouvera ci-aprs des informations sur la dure, la clture de l'tude et la survie ; d'autres considrations, relatives notamment l'acceptabilit d'une tude de cancrogense estime ngative du fait de la survie des animaux, figurent dans le Document d'orientation No. 116 (7). La clture de l'tude est envisage lorsque le nombre de survivants des groupes soumis aux plus faibles doses ou du groupe tmoin tombe en dessous de 25 pour cent. La clture de l'tude nest pas dclenche par la mort prmature des animaux du seul groupe ayant reu la dose la plus leve. La survie des animaux est prise en considration sparment pour chaque sexe. L'tude nest pas prolonge au-del du point o les donnes pouvant tre tires de l'tude ne sont plus suffisantes pour permettre une valuation statistiquement valable.

OBSERVATIONS 33. Un examen de la morbidit ou de la mortalit est effectu quotidiennement chez tous les animaux, gnralement en dbut et en fin de journe, fins de semaine et jours fris compris. Une recherche de signes spcifiques significatifs sur le plan toxicologique devra aussi tre effectue une fois par jour en tenant compte du moment o l'on prvoit que les effets des diffrentes doses atteindront leur intensit maximale aprs administration par gavage. Une attention particulire est
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accorde au dveloppement de tumeurs, et le moment dapparition, la localisation, les dimensions, laspect et la progression de chaque tumeur nettement visible ou palpable sont consigns. Poids corporel, consommation de nourriture et d'eau, et efficacit alimentaire 34. Tous les animaux sont pess au dbut du traitement, au moins une fois par semaine pendant les 13 premires semaines, puis au moins une fois par mois. La consommation de nourriture et lefficacit alimentaire sont aussi mesures au moins une fois par semaine pendant les 13 premires semaines, puis au moins une fois par mois. Lorsque la substance est administre dans leau de boisson, la consommation d'eau est aussi mesure au moins une fois par semaine pendant les 13 premires semaines, puis au moins une fois par mois. Il peut galement tre utile de mesurer la consommation deau dans les tudes o la prise deau est modifie. Hmatologie, biochimie clinique et autres mesures 35. Afin d'obtenir le plus possible d'informations de l'tude, surtout en ce qui concerne le mode d'action de la substance, il peut tre utile deffectuer des prlvements sanguins afin de procder des analyses hmatologiques et de biochimie clinique, mais la dcision appartient au directeur de l'tude. Des analyses d'urine peuvent tre aussi appropries. On trouvera des informations complmentaires sur l'intrt de tels prlvements pour une tude de cancrogense dans le Document d'orientation No. 116 (7). Sil y a lieu, des prlvements sanguins en vue d'analyses hmatologiques et de chimie clinique et des analyses d'urines peuvent tre effectus dans le cadre de sacrifices raliss en cours d'tude (paragraphe 20) et la fin de l'tude sur un minimum de 10 animaux de chaque sexe par groupe. Les chantillons de sang sont prlevs en un point dtermin, par exemple par ponction cardiaque ou au niveau du sinus rtro-orbital sous anesthsie, et seront conservs si ncessaire dans des conditions appropries. Des talements sanguins peuvent aussi tre prpars en vue d'un examen, notamment si la moelle osseuse semble tre l'organe cible, bien que lutilit d'un tel examen pour l'valuation du potentiel cancrogne/oncogne ait t mise en question (32). PATHOLOGIE Autopsie macroscopique 36. Tous les animaux de ltude l'exception des sentinelles et autres animaux satellites (voir paragraphe 20) font lobjet dune autopsie macroscopique complte et dtaille, comprenant un examen attentif de la surface externe du corps et de tous les orifices ainsi que des cavits crnienne, thoracique et abdominale et de leurs contenus. Lautopsie des sentinelles et autres animaux satellites peut devoir tre effectue au cas-par-cas, la discrtion du directeur de l'tude. La pese des organes ne fait normalement pas partie d'une tude de cancrogense car les changements lis l'ge ou, dans des phases plus avances, au dveloppement de tumeurs rendent superflues les donnes relatives au poids des organes. Ces donnes peuvent toutefois prsenter un grand intrt pour les valuations fondes sur le poids de la preuve, notamment en ce qui concerne le mode d'action. Si ces donnes font partie d'une tude satellite, elles ne sont pas collectes au-del d'un an aprs le dbut de l'tude. 37. Les tissus suivants sont conservs dans le milieu de fixation le plus appropri, la fois pour le type de tissu et pour lexamen histopathologique prvu (33) (lexamen des tissus indiqus entre crochets est facultatif) : toutes les lsions ganglions macroscopiques lymphatiques 9 muscle squelettique rein
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(superficiels et profonds) aorte glande coagulante nerf priphrique [bulbe olfactif] glande de Harder [voies respiratoires suprieures dont nez, cornets et sinus paranasaux] ccum glande lacrymale il (dont rtine) (exorbitale) cerveau (segments glande mammaire sophage d'encphale, de cervelet (obligatoire pour les et de bulbe femelles et, si visible rachidien/pont) la dissection, aussi pour les mles) cur glande salivaire ovaire col utrin glande surrnale pancras clon hypophyse parathyrode [dents] ilon Peau duodnum jjunum poumon pididyme [langue] prostate estomac (pr-estomac, moelle pinire rate estomac glandulaire) (niveaux cervical, msothoracique et lombaire) [fmur avec segment de moelle rectum articulation] osseuse et/ou moelle osseuse frachement ponctionne foie

[sternum] testicule

thymus thyrode

trache [uretre] [urtre] utrus (col inclus) vagin vsicule biliaire (pour les espces autres que le rat) vsicule sminale

vessie urinaire

Dans le cas des organes allant par paires, par exemple les reins ou les glandes surrnales, les deux organes sont prservs. Les observations, notamment cliniques, peuvent amener examiner d'autres tissus. Tous les organes considrs comme des organes cibles potentiels du fait des proprits connues de la substance dessai sont aussi conservs. Dans les tudes portant sur une administration par la voie cutane, il y a lieu de conserver les organes figurant sur la liste tablie pour la voie orale, et de procder un prlvement et une conservation spcifiques de la peau provenant du site d'application. Dans les tudes par inhalation, la liste des tissus des voies respiratoires conservs et examins est conforme aux recommandations des LD 412 (9) et 413 (10). Pour les autres organes et tissus (outre les tissus des voies respiratoires spcifiquement conservs), il convient d'examiner les organes de la liste tablie pour la voie orale. Histopathologie 38. Des informations sont disponibles sur les meilleures pratiques en matire de conduite des tudes de pathologie toxicologique (33). Au minimum, les examens devront porter sur les tissus suivants :
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Tous les tissus prlevs dans le groupe dose leve et le groupe tmoin; Tous les tissus prlevs sur les animaux morts ou sacrifis au cours de l'tude; Tous les tissus prsentant des anomalies macroscopiques, notamment des tumeurs; Lorsque des altrations histopathologiques dues au traitement sont observes dans le groupe dose leve, ces mmes tissus sont examins chez tous les animaux de tous les autres groupes de doses; Dans le cas des organes allant par paires, comme les reins ou les glandes surrnales, les deux organes sont examins.

RSULTATS ET RAPPORT Donnes 39. Des donnes sont recueillies pour chaque animal sur tous les paramtres valus. En outre, toutes les donnes sont rsumes sous forme de tableaux synoptiques indiquant, pour chaque groupe exprimental, le nombre d'animaux au dbut de l'essai, le nombre d'animaux trouvs morts au cours de l'essai ou euthanasis, le moment de la mort ou du sacrifice, le nombre d'animaux prsentant des signes de toxicit, la description des signes de toxicit observs ainsi que le moment de lapparition, la dure et la gravit de tous les effets toxiques observs, le nombre d'animaux prsentant des lsions, les types de lsions et le pourcentage d'animaux prsentant chaque type de lsion. Les tableaux synoptiques prsentent les moyennes et les carts-types (pour les donnes recueillies en continu) pour les animaux prsentant des effets toxiques ou des lsions, ainsi qu'une cotation des lsions. 40. Les donnes de contrle historiques peuvent faciliter linterprtation des rsultats de ltude, par exemple lorsque les donnes provenant des tmoins concurrents semblent diverger de manire significative de donnes rcentes obtenues sur des animaux tmoins issus de la mme installation dessai/colonie dlevage. Si elles sont values, les donnes de contrle historiques manent du mme laboratoire et portent sur des animaux du mme ge et de la mme souche, produits dans les cinq ans prcdant l'tude en question. 41. Si possible, les rsultats numriques devront tre valus l'aide d'une mthode statistique approprie et largement reconnue. Les mthodes statistiques et les donnes analyser sont choisies au moment de la conception de l'tude (paragraphe 9). Ce choix permet doprer des ajustements en fonction de la survie, si ncessaire. Rapport d'essai 42. Le rapport d'essai mentionne les informations suivantes:

Substance dessai: tat physique, puret et proprits physico-chimiques; donnes d'identification; provenance de la substance; numro de lot; certificat d'analyse chimique;.

Vhicule (le cas chant): justification du choix du vhicule (s'il est autre que l'eau); 11
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Animaux dexprience:

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espce/souche utilise et justification du choix fait; nombre, ge et sexe des animaux au dbut de l'essai; provenance, conditions d'encagement, rgime alimentaire, etc.; poids de chaque animal au dbut de l'essai;

Conditions exprimentales: justification de la voie d'administration et du choix des doses; le cas chant, mthodes statistiques utilises pour analyser les donnes; dtails concernant la formulation de la substance dessai ou son incorporation dans les aliments ; donnes analytiques sur la concentration obtenue, la stabilit et l'homognit de la prparation; voie d'administration et dtails concernant l'administration de la substance dessai; pour les tudes par inhalation, mention de la voie d'entre (nez seul ou corps entier); doses relles (mg/kg de poids corporel/jour) et, le cas chant, facteur de conversion en dose relle de la concentration de la substance dessai (en mg/kg ou en ppm) dans les aliments ou l'eau de boisson; dtails concernant la qualit de lalimentation et de leau de boisson; Rsultats (Les rsultats comprendront des donnes gnrales sous forme de tableaux synoptiques et des donnes propres chaque animal) Rsultats gnraux Rsultats cliniques Signes de toxicit; Incidence (et, si elle est value, svrit) de toute anomalie observe; Nature, svrit et dure des observations cliniques (transitoires ou permanentes); Donnes sur la survie; Poids corporel/variations du poids corporel; Prise d'aliments, calculs de l'efficacit alimentaire, si effectus, et prise d'eau, le cas chant; Donnes toxicocintiques (si disponibles); Opthalmoscopie (si disponible); Hmatologie (si disponible); Chimie clinique (si disponible);

Donnes relatives aux autopsies

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Poids corporel lissue de lessai; Poids des organes et leur rapport au poids corporel, le cas chant; Rsultats dautopsie; incidence et svrit des anomalies; 12

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Histopathologie Observations deffets histopathologiques non noplasiques; Observations deffets histopathologiques noplasiques; Corrlation entre les observations macroscopiques et microscopiques; Description dtaille de tous les rsultats histopathologiques lis au traitement et chelle d'valuation de la svrit; Rapport sur lanalyse ventuelle des lames par des pairs;

Traitement statistique des rsultats, le cas chant; Discussion des rsultats, notamment: Conclusions Examen de toutes les approches de modlisation; Relations dose-rponse; Donnes de contrle historiques; Examen de toutes les informations concernant le mode d'action; Dtermination des DR, DSENO et DMENO (dose minimale avec effet nocif observ); Applicabilit des rsultats l'tre humain;

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