1.

Drojdiile ca ageni biotehnologici

Introducere
Microorganismele incluznd bacteriile, drojdiile, fungii filamentoi i algele unicelulare au fost folosite n culturi submerse pentru obinerea diferitelor produse printre care i biomasa proteic. De la nceputurile produciei pe scar larg de penicilin, streptomicin i de alte antibiotice i pn la conversia steroizilor de ctre o varietate de microorganisme, s-au dezvoltat i o serie de ec ipamente pentru culturile submerse dintre care, mai utilizate sunt dou tipuri! bioreactorul cu agitare mecanic, cu diferite variante de agitatoare i sisteme de spargere a spumei, fermentatorul airlift care poate fi considerat un ibrid ntre fermentatorul clasic cu agitare mecanic i tipul cu draft al fermentatorului airlift. "actorii limitativi ai dezvoltrii celulare n astfel de ec ipamente de fermentaie sunt transferul de cldur i transferul de mas, ultimul influennd folosirea nutrienilor, n special a o#igenului de ctre celule precum i cantitatea produilor de metabolism. $n jurul acestui subiect s-a dezvoltat o bogat literatur de specialitate, care descrie efectul acestor factori asupra dezvoltrii culturilor submerse microbiene, cu punerea n eviden a factorului limitativ pentru producia de mas celular i de metabolii primari sau secundari. %&' $n Figura 1 sunt prezentate principalele aplicaii industriale tradiionale i moderne ale drojdiilor bazate pe e#ploatarea dezvoltrii drojdiilor i pe procesele metabolice specifice acestora la nivel industrial %('.

&&

Figura 1. )iote nologii tradiionale i moderne bazate pe drojdii.

*ccentul este pus pe relaia dintre fiziologia celulelor de drojdie i biote nologie pe de o parte i *D+ recombinant i te nologiile de fermentaie pe de alt parte. ,rivitor la drojdiile non Saccharomyces, creterea importanei lor industriale este n particular datorat produciei masive de substane i preparate biofarmaceutice. De asemenea a fost evideniat importana drojdiilor ca modele e#perimentale n studiile fundamentale ale tiinelor biomedicale %-'.

1.1. Aspecte privind biologia drojdiilor

Drojdiile sunt benefice pentru omenire, deoarece n cea mai mare msur sunt utilizate pentru producerea de alimente, vin, bere, substane bioterapeutice i produse farmaceutice. $n prezent au fost recunoscute apro#imativ apte sute de specii de drojdie. Deoarece drojdiile sunt adesea utilizate n biote nologia tradiional i modern, descoperirea de noi specii este legat i de noile te nologii. ,entru descrierea domeniului drojdiilor au fost utilizate mai multe definiii. $n conformitate cu .uilliermond /&0&(1 i 2odder /&0341 %&&' drojdiile sunt fungi unicelulari cu reproducere prin nmugurire ori fisiune. $n acest sens, s-a recunoscut c drojdiile sunt fungi unicelulari adevrai, dar n realitate, majoritatea speciilor de drojdii sunt dimorfice i produc pseudo ife i ife, pe lng dezvoltarea unicelular. 5imilar, majoritatea fungilor ifali sunt dimorfici i, n mod uzual, acetia au fost denumii 6east 7 li8e. 9dentificarea, numirea i plasarea drojdiilor n propiul lor cadru evolutiv sunt importante pentru multe domenii ale tiinei care includ agricultura, medicina, tiinele biologice, biote nologia, industria alimentar. 9nvestigaii comparative care includ morfologia, fiziologia, genetica, bioc imia, ecologia i genetica molecular, au mbogit ta#onomia drojdiilor. ,rima perioad n sistematica drojdiilor care se situeaz pn la nivelul anilor &0:4, este caracterizat prin studii aprofundate de morfologie, fiziologie nutriional comparat i genetic convenional. 9niial pentru utilizri ta#onomice se foloseau teste care se refereau la numrul atomilor de carbon asimilai i la folosirea compuilor azotului. ;ic8erman /&0<&1 a e#tins aceste cercetri i astzi apro#imativ un numr de 60 de teste sunt utilizate curent i ele includ fermentaia i asimilarea compuilor carbonului, asimilarea compuilor azotului, cerinele n vitamine, rezistena la cycloheximide, necesiti de temperatur

&(

Drojdiile ca ageni biotehnologici

5tudiile genetice relev prezena diferitelor stadii se#uale. =iclul se#ual la ascomicete poate fi aplontic, diplontic ori diplo aplontic. 5peciile de drojdii pot fi omotalice, eterotalice, sau o combinaie a acestora. %&4' * doua perioad n sistematica drojdiilor este considerat de la &0:4 pn n prezent, i este caracterizat printr-o aprofundare a studiului caracterelor morfologice datorit introducerii microscopiei electronice, a aplicrii criteriilor bioc imice i a introducerii studiilor de genetic molecular. Microscopia cu transmisie de electroni a relevat diferene ntre drojdiile ascomicete i bazidiomicete. Drojdiile ascomicete au pereii celulari transpareni la electroni i conin n majoritate - glucani, ptura e#tern fiind format din manani. Drojdiile bazidiomicete au pereii celulari cu o structur lamelar netransparent la electroni i formai n majoritate din - glucani. "ormarea mugurelui este de asemenea diferit la cele dou grupuri de drojdii. Drojdiile ascomicete prezint o nmugurire oloblastic, care const n participarea ntregului perete celular, la formarea noului perete, a mugurelui pe cnd la drojdiile bazidiomicete care au o nmugurire enteroblastic, particip numai stratul interior al peretelui celular. >ltrastructura septului arat diferene importante ntre cele dou clase de drojdii. 5eptul la majoritatea ascomicetelor are unul sau mai muli micropori. 5eptul simplu are un singur por central, pe lng unii perei despritori de la unele bazidiomicete, care au o structur de tip dolipor, la care porul central este flancat de o membran perforat numit parentezom. ,entru diferenieri ta#onomice au fost utilizate caracteristici bioc imice, compoziia n glucide a pereilor celulari i capsulelor, spectrul de rezisten magnetic a pereilor celulari, numrul unitilor izoprenice din coenzima ?, citocromii, compoziia n acizi grai i paternul izoenzimelor. %&(' 9ntroducerea studiilor *D+, furnizeaz n principal, un parametru obiectiv n estimarea distanelor evolutive din punct de vedere ta#onomic. Diferitele metode utilizate ofer soluii la diferite niveluri ta#onomice. @aloarea ta#onomic a compoziiei n baze a *D+ /molA .B=1 este n special caracteristic ta#onomic de specie. Culpinile fenotipice care difer au un procent mai mare de ( 7 -A n compoziia bazelor, sunt considerate specii diferite. 2imitele n compoziia de baze a *D+, difer pentru drojdiile ascomicete i bazidiomicete. =ele mai multe drojdii ascomicete au procentul molar de guanin i citozin /molA .B=1 mai mic de <4, pe cnd majoritatea bazidiomicetelor au acest procent peste <4 /Tabelul 11.
&-

Tabelul 1. Distribuia molA .B= la diferite ascomicete i bazidiomicete Mol% G+ (< 7 (4 -4 7 -D -< 7 -0 D4 7 DD D< 7 D0 <4 7 <D << 7 <0 :4 7 :D :< - :0 !rocentajul la drojdiile asco"icete 4,3< &D,< (E -(,< &: <,< ( 4,3< !rocentajul la drojdiile ba#idio"icete & & &4 -< -& &E D

5tudiile de ibridare a *D+ au fost utilizate pentru determinarea similaritilor ntre specii. Metodele utilizate n aceste studii se refer la analiza spectrofotometric a formrii eteroduple#ului i la cele fluorometrice i colorimetrice. %&-' Ce nicile electroforetice utilizate n sistematica drojdiilor au creat posibilitatea realizrii de studii la nivelul cromozomilor individuali. Multe specii de drojdii au o variaie considerabil ca numr i dimensiune a *D+ cromozomal. 1.1.1. Aspecte de genetic$ "olecular$ 9ngineria genetic, sau n sens strict te nologia *D+ recombinant a revoluionat rapid cteva domenii de baz n genetic i biologia aplicat. $n ultimii ani drojdia Saccharomyces cerevisiae a fost utilizat ca model e#perimental pe care s-a studiat e#presia genelor din eucariotele superioare. $n Figura % sunt prezentate sc ematic procedeele de baz n te nologia *D+ recombinant la drojdii. 2a tulpinile de drojdii industriale aspectele de genetic molecular se refer la alegerea vectorilor, promotorilor, la selecia mar8erilor i la semnalele de secreie. *plicaiile biote nologice sunt dependente de clonarea genelor eteroloage pentru drojdii, izolate din *D+ viral, procariote sau eucariote.

&D

Drojdiile ca ageni biotehnologici

Figura %. ,rocedeele de baz n ingineria genetic la drojdii.

+umeroi vectori plasmidiali au fost construii pentru transformarea genetic a celulelor de drojdie /Tabelul %1. $n general pentru o transformare ct mai eficient a celulelor de drojdie, vectorii trebuie s conin! secvene de plasmide bacteriene /! coli1, care servesc la producerea clonrii i amplificrii i care permit ca *D+ s se insereze n celula gazdF secven /*G51 care se replic autonomF secven centromeric /=H+1 pentru stabilitatea segregrii mitoticeF mar8eri selectai corespunztor i avantajosF unul sau cteva situsuri pentru enzimele de restricie, care permit inserarea *D+ eterolog. %D'

Tabelul %. @ectori plasmidiali pentru transformarea celulelor de drojdie

&<

Tipuri de vector ,lasmide de integrare

&'e"ple ,lasmid integrativ de drojdie /Ilp1 ,lasmid replicativ de drojdie /IGp1

,lasmide de replicare independent

,lasmid epizomal de drojdie /IHp1 ,lasmidele centromerice de drojdie /I=p1 ,lasmid linear de drojdie /I2p1 =romozomi artificiali de drojdie /I*=s1

,lasmide specializate

,lasmid de e#presie /IKp1 ,lasmide Liller ,lasmide de dezintegrare /IDp1

aracteristici "recvene sczute de integrare n loci cromozomali prin recombinare omoloag. Ilps sunt integrate n copii singulare, iar transformanii sunt stabili, c iar n absena presiunii selective. "recvene nalte de transformare /<44 7 (444 de transformani per g *D+1 datorit elementelor *G5 care menin replicarea e#tracromozomal. ,lasmidele sunt instabile pe timpul dezvoltrii drojdiei datorit segregrii asimetrice n diviziunea celular. Irps sunt utilizate rar. *cestea sunt derivate din plasmidele de ( m din Saccharomyces cerevisiae cu origine n secvenele de replicare. Ieps sunt relativ stabile, susinute e#tracromozomal de <4 7 &44 copii per celul. 9ncluderea secvenelor centromerice /=H+1 funcionale de drojdie, conduce la segregarea stabil n mitoz. ,lasmidele sunt susinute de & 7 - copiiJcelul i sunt stabile n diviziunea celulelor. *cestea sunt plasmide cromozomale artificiale care conin secvene telomerice pentru susinerea stagiului linear =romozomi artificiali, lineari liberi sunt foarte stabili /conin secvene =H+1. 5unt utilizai pentru receptarea de inserii libere de *D+, n analizele genomului uman, bogate n te nici fizice curente =onine promotor transcripional i secvene terminale, de care genele eteroloage se pot lega. De asemenea, conin secvene pentru modificarea i secreia proteinelor e#terne p.L2& i ( din "luyveromyces lactis sunt plasmide Liller lineare, care pot fi dezvoltate ca vectori de clonare >tilizate pentru pierderea total a secvenei de vectori bacterieni.

,romotorii sunt utilizai ca vectori de clonare n drojdii pentru mrirea transcripiei genelor de interes. 5ecvenele promotor care deriv din drojdii sunt / omoloage1 sau eteroloage. =ei mai frecveni promotori constitutivi de drojdie sunt genele glicolitice care conduc la o e#presie transcripional nalt. Hnzimele glicolitice din celule de drojdie fermentate pot fi ntre & 7 <A din totalul proteinei solubile, astfel c promotorii *DM, ,.L i H+N sunt cel mai remarcabili n mrirea activitii transcripionale a genelor eteroloage. Geglarea promotorilor este n primul rnd facilitat de dezvoltarea celulei de drojdie n absena e#presiei genei eteroloage. ,e de alt parte, creterea biomasei poate fi temporar
&:

Drojdiile ca ageni biotehnologici

separat din e#presia genei care controleaz disponibilitatea pentru anumii nutrieni /galactaza n cazul .*2&, fosfatul n cazul ,MN<, metionina n cazul MHC(< sauu ionii de cupru n cazul =>,&1 /Tabelul (1. Tabelul (. Geglarea fiziologic a promotorilor transcripionali n drojdii !ro"otor .*2& ,MN< *DM( M"a& M"& =>,& MH2& MHC(< Mibrid ,.LJ*GH Mibrid =I=J.GH ,.L sau C,5Ja ( generator M5H *NK& MNK& )eglare *i#iologic$ Gepresat de glucoz, indus de galactoz Gepresat de nalte i indus de sczute niveluri de fosfat anorganic Gepresat de glucoz, derepresat natural ctre sfritul dezvoltrii pe glucoz *ctiv n celule M*Ca, inactiv n celule M*C sau aJ 9ndus de iftul de temperatur sczut 9ndus de ionii de =u 9ndus de galactoz, represat de glucoz Gepresat de metionin 9ndus de di idrotestosteron 9ndus de deo#icorticosteron 9ndus de siftul de temperatur sczut 9ndus de ocul de cldur /-04=1 Gepresat de glicerol, indus de metanol /n #ichia pastoris$ Gepresat de glicerol, indus de metanol /%ansenula polymorpha1 5ifturile de temperatur pot fi, de asemenea, utilizate pentru reglarea e#presiei genelor eteroloage n drojdie. %<' $n mod particular activitatea transcripional puternic a genelor eteroloage poate fi gsit n drojdiile metilotrofe %ansenula polymorpha i #ichia pastoris. %:' >n alt aspect de genetic molecular relevat cu succes de te nologia *D+ recombinant este selecia mar8erilor corespunztori care sunt utilizai la izolarea i identificarea celulelor transformante /Tabelul +1. Tabelul +. 5elecia mar8erilor genetici utilizai n te nologia *D+ recombinant la drojdii.

&3

Tipul de "ar,er

Gena 2H>( CG,& M952I5( >G**DH( *miloglucozidaz - 2actanaz =>,& .D&EG C>+G L92L& =(-4 5MG& 5"* M6gromicin
G

aracteristici .ene cu mutaii au#otrofice complementare pentru biosinteza aminoacizilor .ene cu au#otrofie complementar pentru nucleotide .ene care confer activitate enzimatic Gezisten la cupru. Gezisten la antibiotic aminoglicozidic. Gezisten la Cunicamicin. 9munitate la to#ina Liller. Mar8er cromogenic. Gezisten la metil sulfometuran. =odific formiat de idrogenaza /celule care se dezvolt n :mM formalde id1.

Gecesiv

Dominant

Metotre#atG =loramfenicolG DiuzonG OeocinG =anavaninG Mar8erii recesivi sunt gene care sunt complementare la o mutaie au#otrofic specific n tulpina de drojdie gazd.Mar8erii specifici dominani sunt necesari pentru selecia transformanilor tulpinilor industriale de Saccharomyces cerevisiae. Hlementele moleculare implicate direct n secreia de proteine sunt secvenele semnal ale captului + 7 terminal din proteina destinat e#creiei. *ceste peptide semnal /formate din apro#imativ &< 7 -4 aminoacizi1 care sunt ndeprtate de proteazele specifice, sunt codificate de ctre drojdii /native1 sau de gene strine eteroloage, care sunt inserate n jonciunea dintre partea final a celui de-al <P i -P promotor /Tabelul -1. Tabelul -. 5ecvenele semnal utilizate pentru secreia proteinelor eteroloage din drojdii. Tip Momoloage Gena secvenei se"nal 5>=( aracteristici =odific invertaza periplasmic
&E

.ene

care

confer

rezisten

la

medicamente

Drojdiile ca ageni biotehnologici

,MN< Co#in Liller - factor MH2& Meteroloage M5* Genin de &ucor pusillus 2izozim de pui ,rolactin de bovine .astrin uman

=odific

fosfataza

acid

periplasmic

din

"luyveromyces lactis ,repro-Mfa& leader este cel mai frecvent utilizat =odific melobioza i secreia de glicoprotein =odific serumalbumina uman /M5* prepro a fost utilizat n #ichia pastoris1

=ele mai utilizate secvene semnal n Saccharomyces cerevisiae sunt cele derivate din invertaz /codificat de 5>=(1, fosfataz acid /,MN<1 i - factor /M"a&1. 5pecificitatea e#opepdidazelor LHK( i 5CH&- este pentru secvenele de pe + 7 terminal ale punctului de sciziune /Figura (1 - factor leader a fost folosit cu succes direct n secreia numeroilor ageni terapeutici umani %3'.

Figura (. =ompoziia i procesarea - factor leader n Saccharomyces cerevisiae

,rocesul post 7 translaional i modificarea proteinelor recombinante de drojdie sunt importante aspecte moleculare, care necesit o atenie deosebit n special n ceea ce privete producerea de proteine terapeutice umane. ,rimul pas n procesul post 7 translaional este ndeprtarea iniiatorului de metionin din proteina astfel sintetizat de ctre metionilaminopeptidaza, care este un proces comun eucariotelor superioare. Modificrile

&0

c imice pe care drojdiile le elimin odat cu proteinele

eteroloage includ! glicozilarea,

fosforilarea, acetilarea, metilarea, meristilarea i izoprenilarea %D, E'. 5inteza i totodat modificarea proteinelor eteroloage produse de ctre drojdii, sufer mai nti o degradare proteolitic intracelular, naintea purificrii lor. $n Saccharomyces cerevisiae asemenea proteoliz poate fi unispecific i asociat cu vacuole sau poate fi specific i cuplat cu sistemul ubiQuitin %D, 0'.

1.%. Integritatea .i "eninerea geno"ului "itocondrial

9nstabilitatea genomului mitocondrial /*D+mt1 este o problem general de la drojdii pn la organismul uman. Nricum, controlul lui genetic nu este foarte bine cunoscut, cu e#cepia de la drojdia Saccharomyces cerevisiae. De la descoperirea, acum <4 de ani, a unor mutante petit de ctre Hp russi i colaboratori, s-a artat c mai mult de &44 de gene nucleare influeneaz direct sau indirect soarta r oB din *D+ mitocondrial %&D'. +u este surprinztor c mutaiile genelor implicate n metabolismul *D+mt /replicare, reparare, recombinare1 pot cauza o pierdere complet a *D+mt /GMN 4 petit1 iJsau conduc la formele reduse ale acestui genom. Nricum, cele mai multe pierderi ale funciei de mutaie, care mresc instabilitatea *D+mt la drojdii, se comport indirect prin implicarea n controlul diferitelor funcii genetice, cum ar fi translaia mitocondrial, sinteza *C,, omeostazia "e, metabolismul acizilor grai, morfologia mitocondriilor. $n puine cazuri s-a artat c suprae#primarea genelor mrete nivelurile mutantelor petit. Mutaiile la alte gene sunt letale, n absena unui *D+mt funcional, ceea ce transform aceste drojdii petit pozitive n forme petit negative i celulele petit nu pot fi recuperate n aceste conte#te genetice. Multe dintre aceste date sunt e#plicate numai dac una dintre ele presupune c pstrarea genomului r o B depinde de o structur asemntoare centromerului, indispensabil pentru meninerea *D+mt r oB iJsau a funciei subunitilor de sintez a *C, codificate mitocondrial, n special *C,:.

1.(. $ile MA! / ,ina#ei la drojdia Saccharomyces cerevisiae

>n set de - protein 7 8inaze, cunoscute ca M*,L /protein 8inaza mitogen activat1, este ntlnit n mod curent ca parte a cilor de semnalizare n celulele eucariote. *proape dou decenii de e#periene n domeniul geneticii i bioc imiei, plus completarea recent a rii genetice a Saccharomyces cerevisiae au adus la iveal doar < seturi M*,L funcionale i distincte la aceast drojdie %&<'.
(4

Drojdiile ca ageni biotehnologici

=onjugarea se#ual, creterea celular i adaptarea la stres, de e#emplu, toate acestea necesit rspunsurile celulare mediate de M*,L. N principal funcie a acestor seturi pare a fi e#presia genelor, ca rspuns la semnalele e#tracelulare sau ca parte a proceselor de dezvoltare specifice. 5eturile M*,L deseori par a regla ciclul celular i invers. $n ciuda succesului erei ingineriei genetice, n descoperirea acestor ci e#ist nc multe lipsuri importante despre mecanismele moleculare ale activrii acestor cascade, a modului cum aceste cascade regleaz funciile celulei. De e#emplu, comparaia cilor de semnalizare specifice diferitelor drojdii a scos la iveal o varietate foarte mare a diferitelor tipuri de proteine semnalizatoare, a cror funcie activeaz M*,L. Cotui modul de activare de ctre aceste proteine a M*,L, rmne neclar. Rtim, de asemenea, c toate cile M*,L ale drojdiei se regleaz reciproc i interacioneaz cu alte ci de semnalizare pentru a produce un model de e#primare coordonat a genelor, dar mecanismul molecular al acestuia este foarte puin cunoscut.

1.+. !rionii din Saccharomyces cerevisiae .i Podospora sp.

5tudiile genetice au artat c ( elemente genetice non 7 mendeliene la Saccharomyces cerevisiae, numite />GH-1 i /,591 sunt prionii lui >re(p i respectiv 5up-<p. />GH-1 face ca celula s se prerepreseze pentru catabolismul azotului, n timp ce /,591 ridic eficiena supresorului *G+ts. *ceeai abordare a dus la identificarea elementului non 7 mendelian /Met-s1 al fungului filamentos #odospora anserina, ca prion al proteinei et 7 s. "orma prionic a proteinei et-s este cerut pentru incompatibilitatea eterocarionului, o funcie normal a fungului, ceea ce sugereaz c alte funcii celulare normale pot fi controlate de prioni. />GH-1 i /,591 implic o autopropagare i agregarea >re(p i 5up-<p. 'n vitro >re(p i 5up-<p, formeaz amiloida, o structur filamentoas, cu o pat birefrigent verde caracteristic, pus n eviden cu Gou de =ongo. Depozitele amiloidice sunt de o importan mare pentru viitorul descoperirii unui leac mpotriva bolii *lz eimer, a transmiterii encefalopatiei spongiforme i a multor altor boli %&:'.

1.-. Ingineria "etabolic$ la drojdii

Saccharomyces cerevisiae este cel mai intens studiat microorganism eucariot, care ajut la cunoaterea biologiei celulei eucariote i, implicit, a biologiei umane. @reme de cteva secole Saccharomyces cerevisiae a fost ntrebuinat n producerea de alimente i buturi alcoolice, iar azi acest microorganism este folosit n numeroase procese
(&

din cadrul industriei farmaceutice. Saccharomyces cerevisiae este un organism cu care se lucreaz uor, deoarece este nepatogen, i datorit multitudinii de aplicaii aprute de-a lungul timpului n obinerea de produse consumabile, ca etanolul sau drojdia, a fost clasificat ca organism .G*5 /generall6 regarded as seif S organism considerat sigur, neto#ic1. De asemenea, fermentaia i procesele te nologice de producie la scar larg cu Saccharomyces cerevisiae fac ca acest organism sa fie atractiv, la ndemn, pentru cteva scopuri biote nologice, aa cum va fi ilustrat n continuare. >n alt motiv important pentru a justifica utilizarea microorganismului Saccharomyces cerevisiae n cadrul biote nologiei l reprezint susceptibilitile sale la modificrile genetice prin te nologia *D+ recombinant, care a fost mai departe nlesnite de accesul la secvena genomic complet a Saccharomyces cerevisiae, publicat n &00: %&:'. $mbuntirea tulpinilor de drojdie de bere s-a bazat n mod tradiional prin mutagenez la ntmplare i pe ncrucirile genetice a dou tulpini, urmate de screening, n funcie de calitile de interes ale mutantelor. Dezvoltrile recente ale unor metode sofisticate n domeniul te nologiei *D+ recombinant au permis s se manipuleze o anumit cale de interes i de aici s se mbunteasc celula printr-o abordare mai direct. Cotui, acum este posibil s se introduc anumite perturbri genetice n sensul de a modifica puterea de iniiere a unei anumite gene, de a induce deleii asupra genelor sau de a introduce gene ntregi n celul %&E'. $mbuntirile propietilor celulare obinute prin combinarea analizelor teoretice bazate pe informaiile de bioc imie i pe aplicaiile ingineriei genetice, au fost oferite de ingineria metabolic %&<'. *ceast abordare const n mare n dou aspecte importante! &. partea analitic$ a ingineriei metabolice, care se ocup cu studiul celulelor pentru identificarea tintelor cele mai potrivite i (. ingineria genetic$ a celulelor care se ocup de obinerea unor celule cu modificrile genetice dorite. >n mod de a grupa diversele inte pentru ingineria metabolic ar cuprinde! e#tensia categoriei substratuluiF mbuntiri ale productivitii i produciei /profitului1F mbuntirea performanei procesului biote nologicF mbuntirea propietilor celulare.

((

Drojdiile ca ageni biotehnologici

1.-.1. 0oi concepte asupra ingineriei "etabolice Dup cum s-a menionat i n introducere, ingineria metabolic implic o abordare direct asupra aplicaiei te nologiei *D+ recombinant pentru mbuntirea tulpinilor, i a fost definit ca Tmbuntirea direct a formrii produsului sau a propietilor celulare prin modificarea unor reacii bioc imice specifice sau introducerea altora noi cu folosirea te nologiei *D+ recombinantU %&E'. $n acest definiie termenul Treacii bioc imiceU trebuie interpretat n sensul lui mai larg. =eea ce distinge ingineria metabolic de aplicaiile clasice de biologie molecular este folosirea unei abordri directe. *ceasta presupune cunotine bogate despre sistemul folosit i, dup cum a fost menionat n introducere, ingineria metabolic conine dou pri! partea analitic i partea sintetic. *ceast situaie este ilustrat n Figura +. $n anumite cazuri partea sintetic o precede pe cea analitic, dac natura substratului are nevoie de o e#tindere prin e#presia unei enzime eterogene, dar n toate cazurile este important ca prile analitic i sintetic s mearg mn n mn. *cest lucru este foarte bine ilustrat prin ncercrile de a e#tinde natura substratului. *ici, n mod clar, primii pai sunt de a introduce gene dou strategii diferite! a. introducerea unei gene ce codific o protein de legtur a membranei, care transport un anumit substrat n celul n combinaie cu o gen ce codific o protein responsabil pentru scindarea substratuluiF b. introducerea unei gene ce codific o protein secretat n mediul e#tracelular, unde substratul de interes este transformat sau scindat n substraturi care ar putea fi asimilate direct de organismul gazd. eteroloage care activeaz metabolismul substratului de interes, iar n acest scop este important s lum n consideraie

(-

Figura +. Aspecte variate ale ingineriei metabolice mprite n partea analitic i partea sintetic.

9ndiferent de strategia aleas, este important s se asigure c genele eterogene sunt e#primate suficient n noul sistem gazd. *ceasta poate implica luarea n considerare a unor posibile modificri postranslaionale, care pot diminua sau elimina activitatea enzimei de interes, iar aceasta necesit analize atente ale tulpinii recombinante. Dup obinerea unui organism recombinant ce poate folosi un anumit substrat, deseori se obin rate sczute i
(D

Drojdiile ca ageni biotehnologici

producii n general mici ale produsului din substratul respectiv. ,entru a identifica problema cea mai important i a direciona urmtorul pas sintetic este necesar s se detvolte o analiz detaliat a fiziologiei celulei. *ceasta poate fi ilustrat n mod clar n ncercarea de a transforma #iloza la etanol prin fermentaii anaerobe cu Saccharomyces cerevisiae. *stfel, ingineria metabolic aproape ntotdeauna va implica o strns interaciune ntre prile analitic i sintetic, de obicei fiind necesare mai multe tipuri de construcii de tulpini, nainte de obinerea unei tulpini recombinante optime. $n ingineria metabolic la Saccharomyces cerevisiae, partea sintetic este relativ devansat de partea analitic. *ceasta se datoreaz comple#itii metabolismului celular, ce poate interaciona cu e#primarea genelor, ce poate determina niveluri metabolice prin concentraia de enzime. $n multe cazuri sunt necesare multiple modificri, iar pentru fiecare modificare, pot aprea sc imbri neateptate ale metabolismului celular. ,artea analitic se refer n mod clasic la fiziologie, n ultimii ani numeroase te nici avansate fiind utilizate pentru o analiz mult mai elaborat a fiziologiei celulare. *ceasta include te nici ale *D+ pentru analiza transcriptoamelor /cuantificarea simultan a tuturor genelor transcrise ntr-o celul1, gel bidimensional de electroforez pentru analiza proteoamelor /cuantificarea simultan a unui numr mare de proteine ntr-o celul1, gaz cromatografie cu sprectrometria de mas /.= 7 M51 i lic id cromatografie cu spectrometrie de mas /2= 7 M51, pentru analiza nivelurilor metabolice intracelulare, e#perimente cu =&- pentru analiza reelei metabolice, studii avansate de fermentaie cu monitorizare on ( line a variabilelor de cultivare mai importante i bioinformatica /modele matematice pentru analiza structurii cilor i structurii flu#urilor1. 1.-.1.1. Anali#a transcriptoa"elor .i proteoa"elor *naliza metodologiei *D+ n domeniul transcriptoamelor este o te nic nc nou n prezent nefiind e#emple despre modul cum a fost folosit te nica n ramurile ingineriei metabolice. Deoarece multe provocri n ingineria metabolic implic sc imbri genetice multiple, analiza transcriptoamelor va fi foarte important pentru ingineria metabolic n viitor, deoarece aceast analiz permite studierea sc emei e#primrii multor gene. =a i analiza transcriptoamelor, analiza proteoamelor este important n ingineria metabolic. Deseori cile de activitate sunt corelate direct cu concentraia proteinelor, i cnd e#primarea genelor iJsau interaciunile protein 7 protein sunt supuse unei regularizri metabolice, este important s se cuantifice concentraia proteinelor n diferite tulpini recombinante. $n mod clar, o analiz detaliat a proteomului poate fi valoroas, deseori fiind
(<

suficient stabilirea concentraiei de proteine implicate n cile studiate i uneori msurarea unor proteine reglatorii ce afecteaz e#primarea genelor relevante. 1.-.1.%. $ile de anali#$ =ile de analiz sunt folosite deseori pentru a descrie aplicaia analizei flu#ului metabolic /M"*1 i analiza controlului metabolic. =ile de analiz s-au dovedit a fi un succes, ca instrument ajuttor pentru partea analitic a ingineriei metabolice. M"* este o abordare global a celulei, unde se ia n calcul reeaua complet a reaciilor intracelulare, unde sunt cuantificate flu#urile, prin ramurile individuale ale reelei. "lu#urile metabolice pot fi estimate din balanele i msurtorile de metabolii ale ctorva ci, prin introducerea substraturilor marcate cu =&-, urmate de msurtorile distribuiei acestora n metaboliii intracelulari. $n acest caz spectroscopia de rezonan magnetic nuclear sau .= 7 M5 poate fi folosit pentru a msura tiparul metaboliilor precursori marcai. *plicarea de substraturi marcate permite determinri de flu# ale reaciilor reversibile i cuantificarea raiilor de flu# ntre cile biosintetice ce duc la acelai metabolit. =ompararea distribuiilor flu#ului obinute n diferite condiii fiziologice poate da informaii de pre despre interaciile dintre diferite ci sau poate ajuta la identificarea unor posibile reacii bioc imice, care nu au fost descoperite n prealabil ntr-un anumit microorganism %(4'. Cotui, M"* poate fi folosit n alegerea unei strategii bune pentru ingineria metabolic, dar, poate fi folosit i ca un instrument pentru caracterizarea fiziologic a unei tulpini, ce a fost manipulat n vederea introducerii unei propieti noi sau modificate. >n domeniu n care M"* este interesat este mbuntirea productivitii. *cest lucru este ilustrat n "igura (, n care se prezint o cale foarte simpl, n care substratul * este convertit n produsul ), cu formarea produsului =. 5ubstratul * poate fi glucoza, produsul ) poate fi etanolul i produsul = poate fi glicerolul. Depirea obinerii produsului de substrat este determinat de raia flu#urilor V ) i V*, unde productivitatea este dat de flu#ul V). 9ntermediarul 9 nu se poate acumula n interiorul celulei, flu#ul acestui metabolit va fi egal cu flu#ul ce iese din polul metabolitului. /Figura -1. "lu#urile sunt descrise de ecuaia! V* S V) B V=, unul din aceti termeni poate fi calculat, dac celelalte dou sunt msurate. *cesta este conceptul balanei metaboliilor. N strategie clar pentru a mbunti obinerea total de V) este de a reduce sau de a elimina flu#ul V= i astfel n mod direct va ajunge mai mult carbon la produsul V). Nricum, formarea lui = joac de obicei un rol important n metabolismul celular, iar eliminarea V= de o deleie a unei gene, va fi letal pentru celul sau va conduce spre au#otrofie. $n unele cazuri flu#urile pot fi determinate de constrngeri adiionale, dac
(:

Drojdiile ca ageni biotehnologici

anumii cofactori ca +*D/,1M sunt implicai n diferite ramuri. Modularea distribuiei flu#ului n jurul punctului metabolic 9, cere bineneles analiza complet a reelei metabolice i de aceea conceptul de M"* este foarte important. M"* este n general cel mai folositor n cazurile n care o fraciune relativ mrit a lui = este direcionat spre produs n vederea obinerii de metabolii primari. +u n ultimul rnd, conceptul de M"* poate, de asemenea, s contribuie la nelegerea modului n care producerea de metabolii secundari sau proteine eteroloage este legat de metabolismul central al lui =, prin canalul metaboliilor precursori. %(&' M"*, de asemenea joac un rol important n clasificarea ramurilor metabolice. ,rin analiza diferitelor mutante este posibil obinerea de informaii despre reglarea diferitelor flu#uri, dac o anumit locaie a cii metabolice este fle#ibil sau nu. ,entru o locaie metabolic rigid, enzimele din jurul punctului metabolic 9 din Figura 1 pot fi reglate prin regularizarea alosteric. *stfel, implicarea activitii uneia dintre enzime, n cascada de reacii dintre intermediarul 9 spre produsul ), ar putea s se rezolve printr-o cretere a flu#ului V ) i implicit a randamentului n produs.

Figura -. "lu#ul metabolic V*, V) i V= prin intermediul 9 care este un precursor al metaboliilor ) i =.

*ceasta sugereaz un alt aspect important al cilor de analiz, i anume identificarea enzimei, care e#ercit controlul flu#ului ntr-o cale metabolic dat. De fapt, problema cu locul de intire al genomului, pentru a obine o cretere a flu#ului printr-o anume cale, este legat de toate categoriile de inginerie metabolic menionate n introducere.
(3

Figura 1. =ile metabolice ale glucozei i #ilulozei.

*naliza controlului flu#ului este o e#aminare a bazelor celulare TlocaleU ce deseori sunt implicate ntr-o singur cale metabolic, n contrast cu M"*, unde se considera ntreg metabolismul celular. 5tudierea controlului flu#ului determin efectele perturbrilor n activitile enzimatice, pentru a identifica cea mai bun int enzimatic pentru manipularea genetic. 9nteresul general este de a suprae#prima genele specifice de codificare a enzimelor, care e#ercit cel mai mare control asupra flu#ului dintr-o cale, deoarece suprae#primarea unei ci ntregi poate fi foarte laborioas i deseori imposibil. ,entru e#aminarea controlului flu#ului printr-o anume cale metabolic, cadrul analizelor de control metabolic poate servi ca o unealt folositoare. H#ist o varietate de metode pentru determinarea aa 7 numiilor Tcoeficieni de control al flu#uluiU, care determin un flu# relativ mrit datorit unei oarecare creteri a activitii enzimelor individuale %&:'. 2a dezvoltarea analizei cilor metabolice este, de asemenea important s se determine intermediarii ce ar lua parte ntr-un anumit mecanism metabolic, care ar putea fi to#ici pentru celul n anumite condiii. $n plus, este important s tim dac o anumit cale intermediar este implicat ntr-o cale de transducie 7 semnal, care
(E

Drojdiile ca ageni biotehnologici

regularizeaz flu#ul prin calea metabolic de interes, prin anumite interaciuni specifice protein 7 protein sau prin influen la nivel transcripional %(('. =ea mai bun strategie utilizat n studiile de inginerie metabolic la Saccharomyces cerevisiae pentru consumul de #iloz a fost introducerea genelor KI2& i KI2( originale din drojdii capabile s utilizeze #iloza /)andida shehatae, #ichia stipitis1. .ena KI2& codific #iloz-reductaza /KG1 care reduce #iloza la #ilitol cu consum de +*D/,1M. =onversia #ilitolului n #iluloz este obinut de gena KI2( care codific #ilitol-de idrogenaza /KDM1 /Figura 11.

1.-.%. re.terea productivit$ii .i produciei *spectele variate ale ingineriei genetice asupra drojdiei de bere au fost revizuite acum civa ani. Hste posibil s fie introduse propieti noi n drojdia de bere, printr-o puternic cone#iune ntre calea analitic a ingineriei metabolice i manipularea genetic a celulei, pentru a ajuta ca procesul s fie mai profitabil. >nul dintre principalele motive pentru cererea unei lungi perioade de folosire a berii este conversia nonenzimatic i nceat a acetolactatului, la componentul nedorit i fr arom 7 diacetilul, care este convertit enzimatic la aceton i subsecvenial la (, - butan 7 diol. N cale de a evita pierderea aromei, cauzat de diacetil, este introducerea unei metode alternative de dereglare a - acetolactatului, pentru a se trece peste formarea acetilului. Cotui, modificrile genetice asupra drojdiei de bere prin introducerea - acetolactat decarbo#ilazei eterogen, determin tulpinile transformate s produc acetona direct din acetolactat, ceea ce accelereaz procesul de cretere prin diminuarea fazei de lag de la sptmni la ore /Figura 21. - *cetolactat decarbo#ilaza a fost evideniat cu succes n drojdii i provine de la "lebsiella terrigena, !nterobacter aerogenes i *cetobacter xilinum. %(-' *lte ncercri de a minimaliza formarea de diacetil n drojdiile de bere au fost ncununate de succes, prin screening pentru anumite mutante i suprae#primarea unor gene specifice, care codific enzime implicate n procesul de biosintez a valinei.

(0

Figura 2. =ile bioc imice ce conduc la glicerol, piruvat i etanol.

,rin te nicile de screening pentru mutante rezistente la erbicidul sulfometuron metil i e#punerea gradat n mediu deficient n valin i izoleucin /izoleucin - i valin-1, s-au descoperit tulpini cu activitate de sintez a acetolactatului sczut, ce determin un flu# de carbon sczut, direcionat spre formarea de - acetolactat. +umai jumtate din cantitatea de diacetil a fost produs de unele din acele tulpini n comparaie cu tulpinile parentale. N alt strategie de succes a fost cea de cretere a flu#ului, prin calea biosintetic a valinei, n scopul de a trece peste formarea diacetilului. Manipularea cii metabolice centrale la Saccharomyces cerevisiae a fost folosit pentru a se crete productivitatea de etanol. =nd E enzime diferite ale glicolizei au fost e#primate separat n multivectori, nici una dintre tulpinile transformate nu a determinat o producere mai mare de etanol dect tulpina de tip slbatic. +ici c iar suprae#primarea enzimelor ce catalizeaz reaciile ireversibile, ca
-4

e#oc inaza, fosfofructoc inaza i

Drojdiile ca ageni biotehnologici

piruvatc inaza, nu au avut efect asupra producerii de alcool. *ceste rezultate ilustreaz rigiditatea controlului flu#ului prin metabolismul central al Saccharomyces cerevisiae. Nricum, alte studii au raportat c folosirea fosfofructazei a mbuntit productivitatea de etanol n cazul resturilor celulare imobilizate care cresc doar aerob. N problem major n legtur cu producerea de etanol prin fermentaia anaerob la Saccharomyces cerevisiae este formarea substanial de glicerol, ca produs secundar. $n condiiile de cretere aerob, +*DM citosolic format din biomasa poate fi reconvertit la +*DB prin formarea de glicerol, n concordan cu de idrogenazele +*DM mitocondrial e#tern, codificate de genele +DH& i +DH( i alternativ printr-un sistem necunoscut. *naerob, o#idarea +*DM citosolic se poate produce doar prin formarea de glicerol, deoarece fosforilarea o#idativ nu funcioneaz n astfel de condiii. H#ist dou gene, .,D& i .,D(, amndou codificnd glicerol - - - fosfat de idrogenaza, care regenereaz +*DBdin +*DM, n timp ce convertete di idro#iaceton 7 fosfatul la glicerol - - - fosfat, dar izoenzima codificat de gena .,D( s-a demonstrat ca fiind cea mai important dintre cele dou, n condiii de anaerobioz. =onversia total a glucozei la etanol este redo# neutr, deoarece +*DM este format de gliceralde ida - - - fosfat -de idrogenaza i deoarece conversia acetalde idei la etanol include regenerarea +*D - din +*DM /Figura 21 de ctre alcool de idrogenaza 9 /codificat de *DM&1 %(D'. *stfel, formarea glicerolului este important pentru meninerea ec ilibrului redo# din citosol, pentru a reo#ida +*DM format. N posibil strategie pentru a optimiza producia de etanol poate fi deducerea formrii glicerolului, prin redirecionarea flu#ului de carbon, prin manipularea metabolismului redo#. =nd o mutant gpd( a fost crescut n condiii de anaerobioz a fost obinut o producie mai mare de etanol cu EA n concordan cu reducerea de D4A a formrii glicerolului, dar creterea specific ma#im a fost redus cu D<A n comparaie cu tulpina de tip slbatic, ;-4- 7 &* %(<'. Gezultate similare au fost obinute cu o mutant gpd(, provenit de la alt tulpin de tip slbatic, unde producia de etanol a fost mrit doar cu D,3< fiind observat o reducere a ma#imului specific de cretere. =um o tulpin mutant cu o dubl deleie gpd& i gpd( este incapabil de a crete n condiii de anaerobioz, introducerea unei noi ci pentru a regenera +*D B- a fost realizat prin e#primarea unei trans idrogenaze bacteriene /ce catalizeaz +*DM B +*D,B +*DB B +*D,M1, provenite de la *zotobacter vinelandii, ntr-o mutant dubl gpd&gpd(. Din nefericire, unirea +*D B a devenit limitatoare pentru sinteza biomasei, nainte ca trans idrogenaza s fie capabil de a susine sinteza de +*DB, observndu-se de asemenea i lipsa creterii n condiii de anaerobioz.
-&

Figura 3. *similarea +MDB n Saccharomyces cerevisiae, unde ( - o#oglutaratul i +MDB sunt transformate n glutamat prin dou ci diferite.

$ntr-o alt abordare asupra implicrii ingineriei metabolice n mrirea produciei de etanol la Saccharomyces cerevisiae s-a intervenit n metabolismul energetic care a fost condus n sensul sc imbrii cerinelor cofactorilor, n asociaie cu asimilarea de amoniac. *similarea de amoniac la Saccharomyces cerevisiae este descris n Figura 3. *moniacul i ( 7 o#oglutaratul pot fi convertii n glutamat, de diferite izoenzime ale glutamat de idrogenazei, folosind +*D,M /.d &1 sau +*DM/.d (1 drept cofactori %(('. *moniacul poate fi asimilat i de glutamin 7 sintetaza /.lu&1, cu formarea de glutamin, care este convertit n glutamat prin aciunea glutamat 7 sintetazei /.lt&1F suma celor dou reacii ale .lu& i .lt& este artat n "igura <. *ceste dou reacii cuplate folosesc +*DM i *C, i au un nivel crescut dac formarea de glutamat apare doar pe aceast cale. 5trategia este de a reduce surplusul de +*DM format n asociaie cu sinteza biomasei n combinaie cu producerea unei creteri de consum de *C,, care ar reduce cerinele referitoare la producerea de glicerol i ar crete formarea de etanol. Deleia genei .D999 va da o cretere a produciei de etanol cu EA i o descretere a produciei de glicerol, dar ma#imul ratei specifice de cretere a fost pe jumtate 7 n comparaie cu cel al unei tulpini de tip slbatic, datorit unei reduceri a ratei de sintez a glutamatului. ,rin deleia genei .D999 i suprae#primarea genelor .2+& i .2C& de ctre promotorii ,.L, producia de etanol a fost mrit cu -A, n comparaie cu tulpina gd &, suprae#primarea acestor dou gene reducnd ma#imul ratei specifice de cretere la 04A fa de tipul slbatic. =nd .DM( a fost suprae#primat de un promotor, ntr-o tulpin mutant
-(

Drojdiile ca ageni biotehnologici

.DM, ma#imul ratei specifice de cretere a fost n principal egal cu cel al unei tulpini de tip slbatic. Nricum scderea observat n formaiunile de glicerol a rezultat nu dintr-o cretere considerabil a produciei de etanol, ci, mai degrab dintr-o cretere a producerii de biomas. Cotui ingineria metabolic care diminueaz formarea de glicerol prin solicitarea unei cantiti mrite de +*DM reo#idat n celul, nu conduce neaprat la o mrire a produciei de etanol. ,entru a servi acestui scop, o reducere a surplusului de +*DM ar trebui combinat cu un consum mai mare de *C, n formarea biomasei, unde celula compenseaz pentru cererea energetic mrit, prin creterea flu#ului spre etanol. *cest e#emplu ilustreaz cum un flu# mbuntit pe una din ci poate fi obinut prin ingineria unei ci complet diferite i arat c este important ca ntreaga reea metabolic s fie luat n consideraie. $n completarea e#emplului mai sus amintit, mrirea ratei de conversie a *C, la *D, poate fi obinut prin introducerea activitii unei *C,-aze unei anumite celule, unde producia unui anumit component poate fi mbuntit. Gecent, au fost descrise numeroase aplicaii ale acestei abordri %(:'. $n contrast cu drojdiile folosite n industria buturilor alcoolice, este de dorit s direcionm flu#ul de carbon spre glicerol n timpul formrii de etanol la drojdiile productoare de vin, deoarece glicerolul poate mbuntii calitatea vinului, oferindu-i consisten. 1.-.(. I"bun$t$irea per*or"anelor procesului ,entru a mbunti producia la nivelul produilor biote nologici, este foarte important s se utilizeze disciplinele de inginerie genetic, care se ocup de designul bioreactorului i optimizarea te nologiilor fermentative, care poate duce la o mbuntire a performanelor procesului biote nologic, obinndu-se supraproducii. ,roblematica dezvoltrii unor metode optime, pentru mbuntirea anumitor operaii ale procesului te nic este legat de capacitatea tulpinilor de Saccharomyces cerevisiae de mbuntii performanele procesului. Saccharomyces cerevisiae care poate suferi o cretere pseudo ifal, poate forma asociaii floculare, proprietate ce este de obicei atribuit drojdiilor de fermentaie %(3'. N tulpin de drojdie de bere potrivit ar trebui s fie n stare de a produce floculare, deoarece aceast proprietate este cea mai convenabil de a limpezi berea n comparaie cu celelalte metode convenionale, cum ar fi filtrarea i centrifugarea %(E'. +umeroase studii privind flocularea au generat o baz mare de date, dar din nefericire, compararea acestor date este restricionat, datorit diferenelor privitoare la condiiile de
--

testare i de cretere. Dou mecanisme de floculare complet diferite au fost observate pn acum! fenotipul +eW"lo, gsit n numeroase tulpini de drojdii de bere, i fenotipul "lo&, gsit n cele mai multe tulpini floculare de laborator.=ele dou fenotipuri difer remarcabil c iar prin felul de a flocula. "enotipul "lo& d natere la floculaie n timpul creterii, neinnd seama de semnalele pe care le primete din mediu, cum ar fi limitarea nutrienilor, n timp ce flocularea fenotipului +eW"lo se pare a fi lansat la sfritul creterii e#poneniale, cnd i face apariia lipsa de glucoz. >ltima apariie a floculrii la fenotipul +eW"lo este un avantaj evident pentru industria buturilor, ajutnd la separarea drojdiilor de butur, dar genetica fenotipului +eW"lo rmne a fi descoperit. Cotui o continuare a muncii este necesar pentru a da o imagine complet asupra genelor implicate n fenotipul "lo&, deoarece sunt necesare mai multe cunotiine genetice, dect pentru fenotipul +eW"lo. "enotipul "lo&, conine una sau mai multe din genele dominante floculare, din care a fost studiat gena "2N&. *ceasta codific o protein a suprafeei celulare, care joac rolul principal n procesul de floculare. ,roteina "lo& este ancorat n peretele celular unde partea +- terminal este e#pus mediului, iar n timpul floculrii acest fragment +-terminal se poate ataa de manoproteinele din peretele celular vecin. .ena "2N& a fost integrat cu succes n genomul unei tulpini de drojdie de bere monoflocular, obinndu-se o tulpin flocular stabil. "locularea prin fermentare cauzeaz o micorare a numrului de celule, mrind timpul general de fermentaie. .ena "2N& din tulpinile cu fenotipul "lo&, pare a fi legat la nivel transcripional de o cretere n transcrierea "2N&, corelat cu o cretere a floculrii. "locularea constitutiv a fost observat n toate stadiile de cretere, dar a fost intensificat n fazele de declin i n faza staionar a creterii. ,entru a introduce flocularea ntr-o gazd nefloculant ar fi necesar s se stabileasc un sistem genetic care s e#prime gena pentru floculare doar spre sfritul fermentaiei. *stfel, ingineria metabolic ar trebui s se concentreze pentru a determina un anumit sistem genetic, care conine una sau mai multe gene floculare dominante. 5ubiectul mecanismului de control care este responsabil pentru apariia floculrii la limitarea nutrienilor la tulpinile fenotipului +eW"lo este nc necunoscut %(E, (0'. Dei, introducerea floculrii la drojdiile de bere este o metod convenabil de separare a drojdiei din mediu se utilizeaz nc filtrarea berii care este o etap te nic important n industria de buturi. ,rezena - glucanilor n orz, mpiedic filtrarea datorit vscozitii mrite, /Saccharomyces cerevisiae nu poate idroliza legturile &,D ale - glucanilor1 i de aceea este necesar adugarea unor enzime comerciale. *lternativ, poate fi introdus in drojdia de bere o gen eteroloag care codific - gluconaza de +acillus subtilis i
-D

Drojdiile ca ageni biotehnologici

Crichoderma yeesei. >ltima opiune servete ca sarcina pentru ingineria metabolic, deoarece substratul este mrit pentru a include i - glucanul i n consecin procesul de obinere a berii poate fi mbuntit. %-4' 1.-.+. 4"bun$t$irea propiet$ilor celulare >n efort mrit s-a depus pentru a mbunti propietile e#istente ale Saccharomyces cerevisiae, legate de e#ploatarea industrial a acestui organism. 9nteresante n acest sens sunt cercetrile legate de a obine o reducere a represiei glucozei, folosit n consumul de sucroz i maltoz, care sunt prezente n amestecurile de za r din industrie i care sunt metabolizate n mod natural de Saccharomyces cerevisiae. Drojdia de bere este produs aerobic din melase, care conin D4A pn la <4A sucroz. ,roducia de etanol i produsele de panificaie sunt procese anaerobe folosite la scar larg, unde Saccharomyces cerevisiae metabolizeaz amestecurile de za r. Malul folosit pentru producerea de etanol conine <4 7 :4A maltoz, iar amidonul prezent n aluatul pentru pine este continuu descompus n oligoza aride prin aciunea amilazelor %-&' Saccharomyces cerevisiae idrolizeaz e#tracelular sucroza i intracelular maltoza prin aciunea invertazei /5uc(1 i respectiv maltazei /Mal51 / Figura 51. Cransportorul maltozei /MalC1 joac un rol esenial n e#primarea genelor M*2, deoarece maltoza este cerut ca un inductor al acestor gene, n contrast cu e#primarea genei 5>=(, care nu are nevoie de inducere. .ena M*2 cuprinde, de asemenea, gena M*2G, care codific o protein reglatoare responsabil pentru inducerea genelor M*2C i M*25.

Figura 5. Metabolismul sucrozei i maltozei, n concordan cu genele respective! 5uc( invertaza, MalC permeaza, Mal5 maltaza, MalG responsabil de reglarea proteinelor pentru inducerea genei Mal5 i MalC.

=nd maltoza sau sucroza sunt prezente n mediu mpreun cu glucoza, fazele de lag intermitente sunt situate ntre consumul glucozei i consumul iniial de sucroz sau maltoz,
-<

fenomen descris ca fiind sub controlul glucozei. *cest mecanism reglator poate avea un efect costisitor asupra proceselor menionate mai sus, datorit timpului destinat procesului de control al glucozei. 5istemul reglator care asigur consumarea glucozei naintea altor za aruri a fost studiat mai ales la nivel transcripional, la nivelul represiei glucozei. Gepresia glucozei, nlesnit de proteina Mig&, controleaz e#primarea ambelor gene 5>=( i M*2. Mecanismul molecular al represiei glucozei cu ajutorul Mig&, este o cascad reglatorie care poate implica un comple# de proteine ce conine 5sn:, Cup& i Mig&, unde Mig& dirijeaz comple#ul spre un consens specific, spre promotorii genelor int. .enele int ale Mig& sunt limitate nu numai de genele ce codific proteinele implicate n funciile periferice ale celulei, cum ar fi gena 5>=(, gena M*2 i gena .*2 /ce codific proteinele responsabile de utilizarea galactozei1 i de genele metabolismului central al carbonului %-(, --'. ,entru a depi represia glucozei e#ercitat de gena 5>=(, deleia M9.& ntr-o tulpin de laborator aploid /;-4- 7 &a1 s-a dovedit a fi un succes, deoarece s-a observat o cretere a e#primrii genei 5>=(, ce a fost obinut atunci cnd celulele au crescut pe glucoz. $n plus, micorarea controlului de glucoz a fost observat la creterea a ( mutante mig& derivate dintr-o alt tulpin de laborator aploid i o tulpin poliploid industrial, respectiv pe amestecurile sucroz 7 glucoz. N alt protein recent descoperit, Mig(, contribuie de asemenea la controlarea e#primrii genei 5>=(. Deleia adiional a M9.( ntr-o tulpin mutant mig& a artat o depreciere continu a e#primrii genei 5>=(. 5tudiile fiziologice ale deleiilor tulpinilor mig&mig( au indicat c frmiarea lui M9.( a condus la o continuare a micorrii controlului glucozei i o mrire a activitii respiratoriiF mai mult, s-a obinut o cretere de &(A a ratei specifice de cretere pe glucoz n comparaie cu tipul slbatic. ,rin urmare, deleia concomitent a lui M9.& i M9.( s-a dovedit a fi un succes n producia drojdiilor de panificaie, deoarece controlul glucozei este micorat cu succes n metabolismul sucrozei %-D'. Gata de consumare a glucozei folosit n procesul industrial poate fi mrit fr a aprea efectul =rabtree, iar rata specific de cretere, care servete ca un important parametru n producia drojdiilor de panificaie, este mrit prin aceast abordare. 5trategiile de succes pentru metabolismul energetic al genelor M*2 pentru diminuarea e#tinderii controlului glucozei e#ercitat asupra acestor gene este diferit de strategiile mai sus amintite. Cransferul genei M9.& n tulpina aploid de tip slbatic )((D a micorat ncet controlul glucozei e#ercitat asupra genelor M*2. Nricum, acest efect nu s-ar fi putut obine cu mutante mig& derivate din aploida =H+. ,L&&- 7 3D i tulpina poliploid industrial D.&-D(.%-<' Culpinile mutante mig& derivate din ultimele dou tulpini de tip slbatic au
-:

Drojdiile ca ageni biotehnologici

nceput s consume maltoza la niveluri mai sczute de glucoz, cnd au fost cultivate n medii comple#e cu glucoz 7 maltoz, n comparaie cu tipurile parentale. 5-a concluzionat c aceasta se datoreaz unei inactivri mai puternice a metaboliilor permeazei maltozei. 5cindri adiionale ale genei M9.( n mutante derivate din tipul slbatic =H+. ,L&&- 7 3D au artat un fenotip uor mai represat dect mutanta mig&. Desfacerea lui M9.& /i M9.(1 poate derepresa anumite proteine implicate n semnalizarea glucozei, iar aceste proteine mediaz inactivarea permeazei maltozei. Mai multe raporturi arat c inactivarea catabolic a permeazei maltozei, are un impact major asupra metabolismului maltozei, iar analizele de control metabolic indic de asemenea, c permeazele maltozei limiteaz metabolismul maltozei %-:'. $n loc de a inti gene reglatoare ca M9.& i M9.(, mbuntirea consumului de maltoz din amestecurile glucoz 7 maltoz au fost obinute prin e#primarea constitutiv a genelor structurale M*2. H#primarea constitutiv a M*2C i M*25 n mutanta mig& derivat din tipul slbatic )((D, a artat o utilizare simultan a glucozei i maltozei. =nd M*2C i M*25 au fost suprae#primate n tulpina de tip slbatic, maltoza a fost utilizat n defavoarea glucozei. Dup ct se poate presupune, suprae#primarea genei M*2C contracareaz complet efectul de inactivare a catabolismului carbonului n transportorul maltozei. $n sprijinul micorrii controlului glucozei, suprae#primarea celor dou gene strcturale M*2 a crescut rata specific de cretere cu 4,4comparativ cu cea a tipului slbatic %-3'. Deci, aceast strategie pare s fie atractiv pentru micorarea controlului glucozei n metabolismul maltozei n cazul drojdiilor de fermentaie, ceea ce reduce timpul de producere a etanolului. =ontrolul redus al glucozei arat, de asemenea, un timp redus al procesului de producere a pinii, care este mai departe micorat deoarece aluatul poate crete i mai repede, ca rezultat al mririi ratei specifice de cretere. Deleia genelor ce codific proteinele represoare de transcripie sau suprae#primarea genelor ce codific activatorii transcripionali pozitivi, poate fi o strategie de succes pentru ingineria metabolic, n anumite sisteme metabolice. *ceast strategie poate rezulta din suprae#primarea mai multor gene, care sunt subiectul controlului transcripional implicnd proteina represoare de deleie sau proteina represoare. $n anumite cazuri aceast abordare va fi favorabil n comparaie cu suprae#primarea genelor ce codific unele sau toate enzimele unei anumite ci metabolice %(('.
-&

i la glucoz i la maltoz,

1.1. !roducerea de proteine heteroloage

-3

De-a lungul studiilor efectuate asupra comportamentului Saccharomyces cerevisiae, ca i a importantei capacitii acestei drojdii de a e#prima gene strine n combinaie cu aparatul ei secretor, face din Saccharomyces cerevisiae un organism-gazd atractiv pentru producerea de anumite proteine eterogene. +umeroase proteine eterogene care au fost folosite n scopul de a diagnostica sau ca ageni terapeutici umani i vaccinuri au fost produse cu succes de Saccharomyces cerevisiae. 9nterferonul uman a fost prima protein recombinant produs de Saccharomyces cerevisiae n &0E&, iar n anul urmtor a fost produs primul vaccin obinut prin intermediul ingineriei genetice %-E'. ,roducia industrial de insulin de ctre Saccharomyces cerevisiae, acoper aproape jumtate din nevoia de insulin a &<D de milioane de diabetici din ntrega lume %-0'. $n ultimii ani secreia de insulin a Saccharomyces cerevisiae a fost mbuntit prin ingineria proteinelor secvenei leader, iar de mbuntirile realizate va beneficia nu numai farmaciile i diabeticii, ci i potenialul de organism-gazd al Saccharomyces cerevisiae pentru producerea, de alte proteine eterogene. Saccharomyces cerevisiae are o cale secretorie multipl i este capabil de a produce modificri posttranslaionale ale proteinelor eterogene, cum ar fi maturarea proteolitic a pro ormonilor i formarea legturilor bisulfidice.%D4' *ceste trsturi se aseamn cu cele ale celulelor mamiferelor, iar unele proteine ale mamiferelor active biologic pot fi e#primate prin urmare cu succes i secretate de Saccharomyces cerevisiae. $n plus, transformarea Saccharomyces cerevisiae cu *D+ strin i binescunocuta te nologie de fermentare a acestui organism, face din Saccharomyces cerevisiae o gazd bun pentru producerea de proteine eteroloage. =u toate acestea, Saccharomyces cerevisiae prezint unele dezavantaje, cnd este folosit pentru producerea unor anumite proteine recombinante eterogene. *stfel de probleme au fost observate ca rezultat al instabilitii plasmidiale ducnd la iperglicozilarea proteinelor eterogene secretate, ceea ce poate cauza efecte de imunogenitate nedorite. ,entru a depi astfel de modulri nedorite ale proteinelor recombinante de interes, au fost investigate tulpini alternative, pentru a fi folosite ca organisme gazd %D&, D('. =elulele aploide de mperec ere de tip ale Saccharomyces cerevisiae, secret

feromonul factor - , printr-o combinare eficient a celulelor aploide a i . "actorul - al Saccharomyces cerevisiae prepro 7 leader este cel mai folosit ca sistem de e#primare secretorie pentru proteinele eterogene n numeroase i diferite tulpini, incluznd i Saccharomyces cerevisiae. "uziunea ntre secvena prepro 7 leader cu o gen eterogen, permite ca Saccharomyces cerevisiae s secrete proteine eterogene, deoarece secvena leader
-E

Drojdiile ca ageni biotehnologici

mediaz translocarea cotranslaional /Figura 161 a fuziunii proteinei n eucariote %3'. ,reregiunea secvenei leader este separat de o peptidaz 7 semnal, iar n aparatul .olgi endoproteaza Le#( separ preregiune n partea =-terminal a maturrii dibazice Le#(. $nainte de secreie, peptida spaiatoare a maturrii Le#( de la e#tremitatea =-terminal este nlturat prin aciunea dipeptidil 7 aminopeptidazei, codificat de gena 5CH&- i proteina eterogen este eliberat n mediul e#tracelular %D-'. De-a lungul timpului au fost efectuate studii pentru a mbunti secreia de insulin prin folosirea factorului prepro 7 leader al Saccharomyces cerevisiaeF ntregul - factor prepro 7 leader al Saccharomyces cerevisiae a fost folosit pentru studiile iniiale n secreia de insulin cu o peptid spaiatoare avnd o secven .lu 7 *la 7 .lu 7 *la, care rezult prin fuziunea proteinelor artate n "igura &4 %DD'.

Figura 16. 9lustrarea unui factor prepro-leader fuzionat cu un precursor al insulinei.

$n acest studiu, peptida spaiatoare a fost ndeprtat cu greu de dipeptidil 7 aminopeptidaza, obinndu-se n principal un precursor al insulinei .lu 7 *la 7 .lu 7 *la, deci spaiatorul a fost ndeprtat prin mutageneza direct asupra locului. *ceast modificare a factorului al secvenei leader a relevat cu succes e#primarea i secreia a numeroi precursori insulinici. *lte studii au artat avantajul unui spaiator, deoarece poate fi atins o mbuntire a procesrii Le#(p, ceea ce n cazul insulinei este de preferat deoarece procesarea insuficient a Le#(, poate cauza o iperglicozilare i o depreciere a produciei de insulin. =nd spaiatorii potrivii i creai n aa fel nct s poat fi ndeprtai de tripsin sau de *chromobacter lyticusce cu o proteaz specific 26s&, au fost introdui ntre Le#( dibazic i precursorul insulinic, producia de precursor al insulinei a fost mbuntit. ,rezena unui spaiator nu numai c s-a dovedit a fi un succes pentru secreia secvenei leader a factorului fuzionat cu precursorul insulinei, dar i glicozilaza + 7 lincat a celor dou pri a factorului propeptidglicozilat, localizate aproape de precursorul insulinei, joac un rol de

-0

pivot n procesul de secreie, deoarece lipsa acestor dou glicozilaze micoreaz semnificativ secreia precursorului insulinei %D<'. N alt e#primare a fost recent demonstrat la Saccharomyces cerevisiae sub designul secvenelor prepro 7 leader obinute prin combinarea unei abordri raionale i a unei optimizri treptate %D:'. Dac liderii sintetici au fost folosii ntr-un conte#t spaiator potrivit, producia de precursor de insulin a depit producia obinut cu - factori prepro 7 leaderi, i mai departe liderii sintetici au facilitat secreia nu numai a insulinei, dar i a altor proteine eterogene %D:'. H#perimentele pulsatorii au artat un timp de transmisie prelungit al liderului sintetic al proteinei de fuzionare a precursorului insulinei la Hucariote cu fuziunea proteinelor ce conin - factor prepro 7 leader, fapt ce ofer o e#tindere a timpului pentru mpac etarea corect a precursorului insulinei i deci producie mrit. =nd prepro 7 leaderii sintetici lipsesc din glicozilaza + 7 lincat, prile fuzioneaz cu proteina precursoare a insulinei obinndu-se o producie mai mare a precursorului de insulin mpac etat corect n comparaie cu cea obinut datorit secvenelor leader cu - factori. Cotui, lipsa de legturi + 7 glicozilate ale prepro 7 leaderilor, nu a avut un impact asupra capacitii de secreie, ceea ce contrasteaz cu ceea ce a fost pentru prepro 7 leaderii - factori, dup cum s-a menionat mai sus %D3'. $nlocuirea prii de maturare Le#(, cu o alt parte procesat enzimatic, aparinnd prepro 7 leaderilor cu legturile + 7 glicozilaz lips, a dus la o secreie a precursorului insulinei neprocesat, iar acest precursor neprocesat ar putea fi purificat din mediul de cultur i maturat in vitro prin adugarea de l6s6l 7 proteaz specific produs de *chromobacter lyticus %D3'. $nlocuirea situsului de maturare Le#( cu un alt situs proteolitic poate fi potrivit pentru secretarea de proteine eterogene, ce au secvena de maturare Le#( n structura lor, deoarece o anume protein poate fi scindat de endoproteaza Le#(, ceea ce cauzeaz o descretere a produciei de proteine eterogene. Deci, prin alegerea unei enzime proteolitice a crei secven de procesare nu este prezent n proteina eterogen de interes, aceast protein poate fi secretat ca o protein de fuziune neprelucrat ntr-o tulpin mutant 8e#( i treptat maturarea se poate induce in vitro. $n continuare, secreia unei proteine eterogene neprelucrate ce are un pro 7 leader sintetic poate fi comparat avantajos cu secreia unei proteine eterogene prelucrate, deoarece acest pro 7 leader induce o stabilitate i o solubilitate a proteinei de fuziune, ceea ce este de preferat nainte de nceperea purificrii i maturrii proteinei de fuziune. +oua descoperire a secvenei sintetice prepro 7 leader s-a demonstrat a fi o prg ie e#trem de puternic pentru e#primarea i secreia de insulin, iar aceste secvene
D4

Drojdiile ca ageni biotehnologici

leader pot activa e#primarea i secreia proteinelor eterogene, ceea ce nu este posibil cu factorul - prepro 7 leader folosit n mod tradiional. =onceptele descrise mai sus relateaz cteva e#emple de obinere de tulpini de Saccharomyces cerevisiae cu propieti noi sau mbuntite prin inginerie genetic i metabolic. 9deea de baz n utilizrile tulpinilor de Saccharomyces cerevisiae este aceea de a satisface din ce n ce mai multe scopuri biote nologice. Deoarece secvena complet genomic a drojdiei este cunoscut, sc imbrile genetice int sunt mai uor de obinut prin te nologia *D+ recombinant, ceea ce faciliteaz i accelereaz studiile de inginerie metabolic.. Cotui, rigiditatea Saccharomyces cerevisiae privind alterarea funciilor ei metabolice poate limita anumite abordri ale metabolismului ingineresc, acest microorganism are cu siguran un potenial mrit pentru cile energetice. >n numr de noi aplicaii bazate pe Saccharomyces cerevisiae vor aprea n viitor, iar acestea, mpreun cu e#emplele menionate, vor ilustra clar potenialul tulpinii Saccharomyces cerevisiae, ca fabric celular n procesele biote nologice.

7ibliogra*ie
1. 5pencer, 9., 5pencer, D., ,easts -echnology, 5pringer @erlag, )erlin Meidelberg +eW Ior8, --:<, /&00D1. %. ;al8er, M. .., ,east #hysiology and +iotechnology, ;ile6 9. and 5ons, (:D--&0, /&0EE1. (. )err6, D. G., Gussell, 9. and 5teWard .. .., ,east +iotechnology, *llen and >nWin, 2ondon, /&0E31. +. Minnen, *., )u#ton, "., = and uri, )., Mein, 9., Mottinger, C., Me6 ac8, )., ,o lig, .., .ene expression in recombinant micro/organism, *. 5mit , Marcel De88er 9nc., +eW Ior8, &(&-&0-, /&00<1. -. ,iper, ,.;., Lir8, +., .enetically !ngineered #roteins and !nzymes from yeasts , ,roduction =ontrol, *. ;iseman, Hllis MorWord, 2eic ester, >L, &D3-&E0, /&00&1. 1. "aber, L. +., Morder, ;., *b. .., @ecn uis, M., ,east, 11, &--&-&-DD, /&00<1. 2. )ra8e, *. 9., ,east .enetic !ngineering, ,. V. )arr, *. V. )ra8e and ,. @alenzuela, )utterWart s, )oston, (:0-(E4, /&0E01. 3. H# art, M. G., )ussineau, =. M., )urrent opinion in +iotechnology, 2, <(<-<-4, /&00:1. 5. Milt, ;., ;olf, D. M., &olecular &icrobiology, 1, (D-3-(DD(, /&00(1. 16. ;olf, L., 0onconventional ,easts in +iotechnology, 5pringer @erlag, )erlin Meidelberg +eW Ior8, /&00:1. 11. 2odder, V., -he ,easts, +ort Molland ,ubl. =o, amsterdam, /&0341. 1%. ,rillinger, M., NberWin8ler, "., >mile, =., )auer, G., .en *ppl &icrobiol , (5, &--D, /&00-1. 1(. Lutzman, =. ,., &ethods !nzymol, %%+, --<--DE, /&00-1. 1+. 2utti8, M. *. M., Nver8amp, ,., 1 +iol )hem , %2(, (D<(0-(D<-D, /&00E1. 1-. 5tep anopoulos, .., *ristodon, *., +ielsen, V., &etabolic engineering, academic ,ress, 9nc. 5an Diego, =alif., /&00E1. 11. 2indQuist, .., &olecular #sychiatry, 1, -3:--30, /&00:1.
D&

12. .offeau, *., )arell, .. )., )uss6, )., 2ife 3ith 6000 genes, 5cience, %2+, <D:-<:3, /&00:1. 13. )aile6, V. H., Science, %-%, &::E-&:3<, /&00&1. 15. Marv, *., De .raaf, *. *., ;iec ert, ;., Hggeling, 2., .a m, M., +iotechnol +ioeng , +5, &&&-&(0, /&00:1. %6. = ristensen, )., +ielsen, V., *dv +iochem !ng +iotechnol , 11, (40-(-&, /&0001. %1. ,edersen, M., =arlsen, M., +ielsen, V., *ppl !nviron &icrobiol , 1-, &&-&0, /&0001. %%. Nstergaard, .., Nlsson, 2., +ielsen, V., &icrobiol &olec +iol , 1+, -D-<4, /(4441. %(. Iamano, 5., Comizu8a, L., .one, M., 9mura, C., Cana8a, V, 9none, C., 1 +iotechnol., (5, (4-(:, /&00<1. %+. Hri8son, ,., *ndre, 2., *nsell, G., )lamberg, *., *dler, 2., &ol &icrobiol , 12, 0<-&43, /&00<1. %-. @aladi, M., 2arsson, =., .ustafsson, 2., *ppl &icrobiol +iotechnol, -6, D-D-D-E, /&00E1. %1. Vensen, ,. G., 5noep, V. 2., ;ester off, M. @., #)- 'nternational publication no ;N 53J16635, /&00E1. %2. 5tratford, M., *dv &icrob #hysiol , ((, &-3&, /&00(1. %3. Ceunissen, *., @an der )erg, V. *., 5teensma, M. I., yeast, 11, &44&-&4&-, /&00<1. %5. Ceunissen, *., @an der )erg 5teensma, M. I., ,east, 11, D-<-DD:, /&00<1. (6. Nlsen, N., C omsen, L.,L., )arlberg 4es )ommun -+, (0--08 /&0E01. (1. Hrnandes, V. G., ;illiams, V. ;., Gussell, 9., 5teWard, .. 5., 1 'nst +re3, 55, <3-3&, /&00-1. (%. Mu, O., +e lin, V. N., Gonne, M., Mic els, =. *., )urr .enet., %3, (<E-(::, /&00<1. ((. Crumbl6, G. V., &ol &icrobiol., 1, &<-(&, /&00(1. (+. 2utfi66a, 2. 2., Vonston, M., &ol )ell +iol , 11, D304-D303, /&00:1. (-. Llein, =. V. 2., Gasmunsen, V. V., GonnoW, )., Nlsson, 2., +ielsen, V., 1 +iotechnol., 13, &03-(&(, /&0001. (1. Llein, =. V. 2., Nlsson, 2. 2., +ielsen, V., !nzyme &icrob -echnol , %(, 0&-&44, /&00E1. (2. Llein, =. V. 2., Nlsson, 2., GonnoW, )., Mi88elsen, D. V., +ielsen, V., 5ood -echnol +iotechnol , (-, (E3-(0(, /&0031. (3. Mitzeman, G. *., Magie, ". H., 2evine, M. 2., 0ature, %5(, 3&3-3((, /&0E&1. (5. @elenzuela, ,., Medina *., Gutter, ;., V., *mmerrer, .., Mall, D., 0ature, %53, -D3--<4, /&0E(1. +6. 5c e8man, G., +ovic8, ,., -he molecular biology of the yeast Saccharomyces , =old 5pring Marbor +.I., -:&--0-, /&0E(1. +1. )uc8 olz, G. .., .leeson, M. *. 5., *ppl +iochem +iotechnol ,(38 &4<-&D4, /&00&1. +%. Gomanos, M. *., 5corer, =. *., =lare, V. V.8 ,east, 3, D(--DEE, /&00(1. +(. Osebo, L. M., 2u, 5., "iesc 8o, V. =., .oldstein 9., 1 +iol )hem , %11, <E<E-<E:<, /&0E31. ++. C im, 2., Mansen, M. C., +orris, L., )oel, H., #roc 0at *cad , 5ci >5* 3(, :3::-:33E, /&0E:1. +-. =orplan, 5., .reen, G., Gocco, V., Lurjan, V., 1 +acteriol, 12(, :(3-:-<, /&00&1. +1. Ljeldsen, C., ,etterson, *. "., Mac , M., Diers, 9., Mansen, ,. M., *ndersen, *. 5., #rotein !xpr #urif, 5, --&---:, /&0031. +2. Ljeldsen, C., Mac , M., ,etterson, *. "., Mar8ussen, V., #rotein !xpr #urif , 1+, -40-&:, /&00E1.

D(