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AVALIAO DA ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA E CITOTXICA DO EXTRATO AQUOSO DE CONYZA BONARIENSIS (L.

) CRONQUIST
Altevir Rossato Viana1 Francielle Liz Monteiro1 Henrique Ataide Isaia1 Eliza Beti de Cssia Stefanon1 Luiz Filipe Machado Garcia2 Michele Rorato Sagrillo1,2

RESUMO A citotoxicidade significa causar efeito txico a nvel celular, podendo ser por morte celular, alteraes na permeabilidade da membrana e inibio enzimtica. A ocorrncia da apoptose e, consequente, diminuio da proliferao celular pode ser desencadeada por vrios fatores. A Conyza bonariensis pertencente famlia Asteraceae uma planta nativa da Amrica do Sul, conhecida principalmente como buva. Este trabalho tem por objetivo avaliar a atividade antiproliferativa e citotxica do extrato aquoso de Conyza bonariensis (L.) pelo mtodo de reduo do brometo de 3-(4,5-dimetil tiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazlio (MTT) em um produto com a colorao azul escuro (MTTformazan) pela enzima mitocondrial tetrazolium-succinato-desidrogenase. A buva apresentou atividade a antiproliferativa e citotxica nas concentraes de 5 e 5000g/mL, com a diminuio da proliferao celular de 25,70% e 37,04%, indicando seu potencial teraputico para inibio do ciclo celular. As demais concentraes (25; 50; 100; 500 e 1000 g/mL) no apresentaram diferena significativa com relao ao controle. Palavras-chave: Conyza bonariensis , buva, citotoxicidade, antiproliferativo, MTT.

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Centro Universitrio Franciscano (UNIFRA), Santa Maria, RS. Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), Santa Maria, RS. rossato.viana@hotmail.com
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INTRODUO
A citotoxicidade significa causar efeito txico a nvel celular. O efeito txico pode ser a morte celular, alteraes na permeabilidade da membrana e inibio enzimtica. O mecanismo de apoptose ou morte programada um processo celular fisiolgico normal que ocorre por diferentes situaes em que a clula exposta, como por exemplo, na organognese e hematopoese normal e patolgica, na reposio fisiolgica de determinados tecidos maduros, na atrofia dos rgos, na resposta inflamatria e na eliminao de clulas aps dano celular por agentes genotxicos. A ocorrncia da apoptose pode ser desencadeada por vrios fatores sendo eles: nveis aumentados de espcies reativas de oxignio (ROS), baixa quantidade de nutrientes clula, privao de fatores de crescimento, choque trmico, radiao ionizante, danos ao DNA, agentes quimioterpico e ligao de molculas a receptores de membrana (MONTAGNER, 2010). A cultura de clulas uma ferramenta valiosa para a investigao do funcionamento celular, pois consiste na manuteno e multiplicao in vitro de clulas vivas possibilitando a anlise do metabolismo e do comportamento celular frente a um componente a ser testado. Atravs da cultura possvel identificar os mecanismos envolvidos na regulao, sntese e destino de produtos celulares como protenas, componentes da matriz extracelular alm da influncia de agentes externos na biologia das clulas como, fatores de crescimento e substncias txicas, alm de informaes genticas (LUISI, 2006). A Conyza bonariensis (L.) pertencente famlia Asteraceae conhecida popularmente como buva, margaridinha-do-campo ou voadeira. uma espcie nativa da Amrica do Sul que ocorre na Argentina, Uruguai, Paraguai e Brasil. Produz grande quantidade de sementes, as quais apresentam caractersticas de fcil disperso, caracterizando a espcie como agressiva. No Rio Grande do Sul, apresenta-se como importante planta daninha infestante de lavouras de trigo, soja e milho (LORENZI, 2000). Na medicina popular, utilizada para tratar reumatismo, gota, cistite, nefrites, dor de dente, dor de cabea, lceras estomacais, digestiva, diurtica, leucemia, anemia e

na forma de infuso de diversas partes da planta, como anti-sptico, anti-ulcerativo e hepatoprotetor (ASONGALEM et al., 2004). Apesar de sua utilizao como planta medicinal, foram encontradas poucas informaes sobre a buva, fundamentandose, assim, a realizao dessa pesquisa. Este trabalho tem por objetivo avaliar a atividade antiproliferativa e citotxica do extrato aquoso de Conyza bonariensis (L.) pelo mtodo de reduo do brometo de 3-(4,5-dimetil tiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazlio (MTT) em um produto com a colorao azul escuro (MTT-formazan) pela enzima mitocondrial tetrazolium-succinato-desidrogenase.

MTODOS
A Conyza bonariensis (L.) foi colhida nos meses de novembro e dezembro na cidade de Cruz Alta (RS). A planta foi triturada e o p obtido foi homogeneizado em gua destilada e aquecido por 30 minutos 72C. O material foi filtrado e liofilizado a 18C e 13,3 Pa. Armazenou-se o extrato liofilizado em frasco mbar a 18C at sua utilizao. A atividade citotxica foi avaliada pelo mtodo colorimtrico proposto por Mosman (1983), cujo princpio baseia-se na reduo MTT em um produto com a colorao azul escuro (MTT-formazan) pela enzima mitocondrial tetrazolium-succinato-desidrogenase. A converso ocorre somente em clulas viveis e a quantidade do produto MTT-formazan proporcional ao nmero de clulas vivas presentes (MIZUNO et al., 2000). As clulas foram obtidas a partir da tcnica de separao de clulas mononucleares. Em um tubo cnico adicionou-se 7mL de histopaque e 7mL de sangue heparinizado. Assim, o tubo foi centrifugado durante 30 minutos a 1450 RPM. As clulas mononucleares foram retiradas com uma pipeta de vidro e transferidas para outro tubo cnico, na qual adicionou-se 10mL de meio RPMI. Em seguida, centrifugou-se por 10 minutos a 1150 RPM e o sobrenadante foi desprezado por inverso. O pellet de clulas mononucleares foi ressuspendido em meio RPMI com soro fetal bovino (SFB). Retirou-se uma alquota de 10L que foi misturada a 10L de tripan, para a realizao da contagem de clulas em cmara de Neubauer. A mdia de clulas dos quadrantes foi multipli-

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cada pelo fator de diluio do Azul de Tripan (2) e por 104 (constante), na qual o resultado obtido foi de 2,78.106 clulas em 1000L. Como a quantidade de clulas desejada por poo de 2.105, o volume pipetado em cada poo da placa de ELISA foi de 72L. O extrato bruto da Conyza bonariensis (L.) foi separado em sete concentraes: 5, 25, 50, 100, 500, 1000 e 5000 g/mL, partindo de uma concentrao inicial de 20000 g/mL e realizando diluies seriadas da maior concentrao para a menor. O extrato foi diludo em meio RPMI com SFB, para obteno de um volume final de 240L. Nos controles positivo e negativo, foram adicionados 72L de clulas e meio RPMI com SFB, sendo que, no controle positivo, foi adicionado 2L de fitohemaglutinina (PHA). O experimento foi realizado em triplicata. A placa de ELISA foi deixada por 120 horas em estufa 37C com 5% de CO2. Aps 5 dias, foi realizado o ensaio colorimtrico para avaliao da citotoxicidade do extrato. O MTT foi dissolvido em PBS (0,01M; pH 7,4) a 5mg/mL e, desta soluo, 20L foram adicionados em cada poo. A placa foi colocada em um shaker durante 5 minutos (150RPM) e incubada durante 4 horas em estufa a 37C com 5% de CO2. Aps este perodo, o sobrenadante foi retirado dos poos, deixan-

do somente as clulas, as quais foram ressuspendidas em 200L de dimetilsulfxico (DMSO) e novamente, a placa foi colocada em um shaker durante 5 minutos (150RPM). Logo aps, determinou-se a absorbncia em leitora de ELISA em comprimento de onda de 560nm. Os resultados obtidos foram avaliados estatisticamente no programa SPSS, sendo comparados por anlise de varincia de uma e duas vias, seguida de teste post hoc de Duncan.

RESULTADOS
Os resultados da atividade citotxica esto representados na Figura 1. Os tratamentos contendo extrato a 5 e 5000g/mL demonstraram uma diminuio da proliferao celular de 25,70% e 37,04%, respectivamente, quando comparados ao grupo controle (p<0,05). As demais concentraes (25; 50; 100; 500 e 1000 g/ mL) no apresentaram diferena significativa com relao ao controle. J o tratamento realizado com a Fitohemaglutinina, demonstrou um aumento da proliferao celular de aproximadamente 2,4 vezes maior, quando comparado ao grupo controle.

Figura 1 Mdia das absorbncias em funo dos tratamentos com o extrato aquoso de Conyza bonariensis (L.)

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DISCUSSO
As plantas medicinais so muito utilizadas na medicina popular, sendo algumas vezes, a nica fonte de medicao que a populao tem acesso. Entre as plantas com potencial medicinal, esto as espcies da famlia Asteraceae, como Baccharis trimera e Baccharis articulata nativas no sul do Brasil. Apesar da famlia Asteraceae, compreender algumas das mais antigas e mais valorizadas plantas medicinais, diferentes gneros desta famlia apresentam compostos txicos como cidos tannicos, hidrocinicos, frmicos e mlicos, rutina e furfural. importante salientar que o papel histrico das ervas medicinais no tratamento e preveno de doenas e seu papel como catalizadoras no desenvolvimento de farmacologia no mantm sua segurana para o uso ilimitado pelo pblico sem informao (DUKE, 2000). Atravs de nossos resultados, possvel verificar a presena de atividade antiproliferativa e citotxica desta espcie, indicando seu potencial teraputico para inibio do ciclo celular. Neste estudo, o extrato aquoso da planta apresentou inibio da diviso celular j na menor concentrao usual, indicando a ocorrncia de atividade antiproliferativa do extrato. Esses resultados esto em acordo com os estudos realizados por Faschinetto e Tedesco (2009), que avaliaram os extratos aquosos da espcie Baccharis trimera, da mesma famlia da planta estudada atravs do sistema teste vegetal de Allium cepa e teste de linfcitos de sangue perifrico humano. Estes autores observaram atividade antiproliferativa e mutagnica dos extratos nas concentraes de 20 mg/mL e 200 mg/mL, sendo encontrados nos dois estudos atividade antiproliferativa semelhantes s obtidas neste trabalho. Estes resultados reforam a importncia de mais estudos sobre a planta j que o mesmo apresenta resultados similares aos obtidos com outros sistemas testes. Segundo Fikej (1994), testes de genotoxicidade devem ser realizados quando a atividade antiproliferativa se mostra to eficiente em concentraes baixas, pois fornece excelente parmetro de anlise citotxica, alm da observao da ocorrncia de alteraes cromossmicas no ciclo celular usada como indicativo para prevenir a popula-

o humana sobre o consumo do produto. De acordo com Craag & Newman (2005), muitos dos agentes utilizados na terapia do cncer so derivados de fontes naturais e foram descobertos a partir de testes de citotoxicidade, por inibirem a proliferao de clulas cancerosas em modelos in vitro ou in vitro.

CONCLUSES
A Conyza bonariensis (L.) apresentou atividade antiproliferativa e citotxica nas concentraes de 5 e 5000g/mL, indicando seu potencial teraputico para inibio do ciclo celular. Mais estudos sero necessrios para estabelecer a utilizao segura desta planta pela populao, pois no h na literatura referncias desta propriedade sobre a espcie estudada.

REFERNCIAS
ASONGALEM, EMMANUEL. A; FOYET, HARQUIN S.; NGOGANG, JEANNE Y.; FOLEFOC, GABRIEL N.; DIMO, THOPHILE; KAMTCHOUING, PIERRE. Analgesic and antiinflammatory activities of Erigeron floribundus. Journal of Ethnopharmacology, v. 91, p. 301-308, 2004. CRAAG, GORDON M.; NEWMAN, DAVID J. Plants as source of anticancer agents. Journal of Ethnopharmacology, v. 100, p. 72-9, 2005. DUKE, JAMES A. Toxins: their toxicity and distribution in plant genera. In: _______. Handbook of medicinal herbs. Boca Raton: CRC Press, p. 525-68, 2000. FASCHINETTO, TEDESCO. Atividade antiproliferativa e mutagnica dos extratos aquosos de Baccharis trimera (Less.) A. P. de Candolle e Baccharis articulata (Lam.) Pers. (Asteraceae) sobre o sistema teste de Allium cepa. Revista brasileira de plantas medicinais, v. 11, p. 360-367, 2009. FIKEJ, GEIRID. Allium Test II: Assesmente of chemicals genotoxic potential by recording aberrations in chromosomes and cell divisions in root tips of Allium cepa L. Environmental Toxicology and Water Quality, v. 9, p. 235-41, 1994.

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LORENZI, HARRI. Plantas daninhas do Brasil: terrestres, aquticas, parasitas, txicas e medicinais. So Paulo. Editora Instituto Plantarum, p. 608, 2000. LUISI, SIMONE B. Comportamento de clulas pulpares humanas expostas ao TGF1 e ao FGF em cultura. Tese de Doutorado em Patologia Bucal. Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Porto Alegre, 6 de julho de 2006. MIZUNO, MASASHI; SHIOMI, YOICHI; MINATO, KEN-ICHIRO; KAWAKAMI, SACHIKO; ASHIDA, HITOSHI; TSUCHIDA, HIRONOBU. Fucogalactan isolated from Sarcodon aspratus elicits release of tumor necrosis factor-a and nitric oxide from murine macrophages. Immunopharmacology, v. 46, p. 113-121, 2000.

MONTAGNER, GREICE F. F. dos S. Efeito in vitro do polimorfismo ALA16VAL do gene da superxido dismutase dependente de mangans no metabolismo oxidativo de linfcitos . Dissertao de Mestrado em Bioqumica Toxicolgica. Universidade Federal de Santa Maria. Santa Maria, 5 de maro de 2010. MOSMAN, TIM. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal Immunology Methods, v. 65, p. 55-63, 1983.

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