l cultivo in Vitro se hace en frascos cerrados y en condiciones controladas y estriles.

El sustrato de cultivo conocido normalmente como medio de cultivo ha de contener los elementos necesarios para que las plantas puedan crecer lo suficiente como para despus ser trasplantadas al sustrato definitivo.

Material necesario para llevar a cabo la siembra y procecimientos. Procesos de esterilizacin y procedimientos. Sembrado y gernimacin. Repique. Plantado en sustrato. Links.

MATERIALES.

Qu materiales nos hacen falta para llevar a cabo el cultivo in Vitro?. 1.2.3.4.5.6.7.Medio de cultivo: componentes, obtencin, mezclado, esterilizacin y utilizacin, etc... Cmara de esterilidad: descripcin-construccin, esterilizacin y uso. Frascos de cristal con tapa (pueden ser potitos de nio, frascos pequeos de mermelada, miel, etc). Una olla a presin (que todo el mundo tiene en casa). Cuanto ms grande mejor. Bistur y pinzas metlicas largas (ms de 20 cm). Se compran en tiendas de materiales de laboratorio y ortopedia. Alcohol de 96. Algunos tarros de plstico (polipropileno PP) para microondas que sean bajos. (los he visto en tiendas todo a cien a precios econmicos). ^ .- El medio de cultivo: sus componentes. Estos elementos son bsicamente: agua, sales minerales, azcar, vitaminas, y en algunos casos hormonas vegetales. Adems hace falta un elemento que d consistencia al medio que suele ser el agar (antiguamente se usaba gelatina), aunque tambin es posible usar vermiculita. La adicin de extracto de levadura es muy beneficiosa pues proporciona vitaminas inusuales, algo de nitrgeno en forma de aminocidos y oligopptidos (fragmentos muy cortos de protena de entre dos y 10 aminocidos), oligoelementos y cofactores.

PROPORCIN DE CADA ELEMENTO BSICO A MEZCLAR Abono mineral 20-20-20 (sin urea) Agar Agua Azcar comercial Extracto de levadura Complejo de vitamina B Otros aditivos (leche de coco, pltano, etc) 1 gr 8 gr 1 Litro 10 gr 1 gr 1 ampolla, vial Leer bajo esta tabla

Se puede aadir tambin: leche de coco verde filtrada por un filtro normal de caf (20 ml por cada litro de medio), papilla de banana (muy fina) a razn de media banana por litro 25 ml de zumo de pia natural filtrado (NO el de Tetrabrik), aunque el zumo de pia no lo recomiendo si no se tiene forma de controlar el pH, pues es muy cido y hay que corregirlo despus, necesitando entonces de aparataje. Hay peachimetros muy econmicos que siempre son tiles, pero se puede prescindir de ellos. A tener en cuenta que:

La leche de coco suele ir mejor para germinacin o cultivo de tejidos y el pltano para el desarrollo de plntulas. No usar los dos a la vez. La banana como aditivo funciona muy bien (que no est pasado, los entre verdes y amarillos son ideales). El agua preferiblemente destilada, pero se podra usar de lluvia siempre que est bien limpia. Si se usa vermiculita como soporte, no se aade agar. ^

Obtencin de los elementos anteriores:

Abono mineral:

En cualquier tienda de abonos. Si adems trae magnesio, hierro y oligoelementos, mejor an. Si no se encuentra de 2020-20, se corrige de forma proporcional (Hay que tener en cuenta que la regla de tres es inversa). Un ejemplo, sera usar 2 gramos si el abono fuera de 10-10-10 2,8 gramos, si el abono fuera de 7-7-7. Sin embargo es conveniente irse a la mayor concentracin posible, debido a que cuanto ms puro est, menos residuo insoluble queda. Azcar comercial: Cualquier supermercado. Extracto de levadura, En farmacias, tiendas de diettica y productos para vitamina B y agar: deportistas. Bananas, En cualquier comercio.

cocos, pias: ^ Cmo mezclamos todo esto? Simplemente se disuelve todo en una parte del agua excepto el agar. Si se usa pltano debe hacerse papilla muy fina con una fraccin de agua y despus mezclarlo todo. Finalmente verificar el pH si se usa zumo de pia natural (debe quedar entre 5.5 y 6) y aadir el resto de agua necesaria. El pH lo podemos corregir adicionando una base fuerte (hidrxido sdico o potsico generalmente). Finalmente aadir el agar. Esto se mete en el microondas y como el agar tarda en disolverse, para no calentar mucho la mezcla, sern necesarios varios golpes de calor hasta que se disuelva. Entre golpe y golpe se saca del microondas y se agita con una esptula o una cuchar. Una vez disuelto el agar se espera a que enfre un poco (bsicamente para uno evitar quemarse) sin que llegue a volverse slido y se vierte en los frascos de cultivo la cantidad necesaria. Finalmente se meten en la olla a presin para ser esterilizados.

Atencin:
Este medio o substrato es muy rico en nutrientes, y al igual que crecen las plantas lo pueden hacer tambin hongos, levaduras y bacterias con lo cual necesitaremos que est estril. Los medios una vez mezclados deben ser esterilizados, no pueden esperar en la nevera ms de un da. Una vez esterilizados pueden conservarse hasta un mes, mximo dos a temperatura ambiente, o varios meses en la nevera (no el congelador).

Es conveniente que mientras se disuelve el agar la mezcla no llegue a hervir pues las vitaminas se descomponen si hierve repetidas veces. ^ .- Cmara de esterilidad: caractersticas bsicas. En cultivo in Vitro hablamos de esterilidad cuando no hay bacterias ni otros microorganismos: slo est vivo el material vegetal que queremos hacer crecer. Se hace una caja de metacrilato de unos 40 cm de altura por 60 de ancho y 40 de profundidad, sin fondo, que ser la superficie de la mesa. En la parte frontal se hacen unos orificios adecuados para introducir las manos a los que se

les acoplan unos guantes largos. Por este sistema podremos trabajar sin tocar los materiales que estarn estriles.

La distancia entre agujeros y sobre todo el tamao de los mismos va a ser variable, dependiendo principalmente de la altura de la mesa, de la silla sobre la que trabajaremos y de nuestra constitucin fsica (a brazos ms gruesos lgicamente agujeros ms grandes). Sin embargo en el agujero debe haber algo de holgura para no cortarse en los brazos. El modo de acoplar los guantes tambin se puede hacer de varias formas: Se pueden acoplar dos bolsas alargadas pegadas con cinta aislante al agujero por el exterior y al fondo dejar una abertura para las manos. Con las manos ya en la cmara nos ponemos unos guantes de ltex (tipo cirujano) que se superponen parcialmente sobre la bolsa, pues son ms sensibles para trabajar. Estos se pueden tratar con alcohol simplemente pulverizando con el que se va a esterilizar la cmara de modo que se evitan contaminaciones. Otra forma de acoplarlos es dejarlos permanentes, usando guantes de cocina lo ms sensibles posible acoplndolos a la bolsa y fijndolos con cinta. ^ PROCESOS DE ESTERILIZACIN: 1.2.3.De materiales y medios de cultivo. De semillas y cpsulas. De la Cmara de Esterilidad. Duracin de la esterilizacin. ^ .- Esterilizacin de materiales y medios de cultivo

Olla a presin grande, cuanto ms mejor. Papel de aluminio. Tarros para microondas con la indicacin PP (Polipropileno).

El medio de cultivo mezclado como anteriormente se indic en "Cmo mezclamos todo esto?" se vierte en los frascos de mermelada, echando unos 3 cm de altura. stos se introducen en la olla con la tapa del frasco floja pues si no se rompen (la olla por supuesto con agua, pero que no rebose los frascos). El resto de los materiales (pinzas, tarros de microondas, etc) puede ir sobre los frascos (nunca nadando en el agua). Tambin es conveniente tener trozos de papel de filtro y papel de aluminio estriles para poder hacer cualquier manipulacin en esterilidad dentro de la cmara. Estos se pueden esterilizar previamente en la olla en tarros de microondas o envueltos en papel de aluminio. Una vez que estn todos los materiales en la olla se cuecen 10 minutos (contados a partir de que empieza a hervir). Pasado ese tiempo se deja enfriar se sacan con cuidado y se aprietan (sin abrirlos) las tapas de los frascos de medio de cultivo. Se deja todo en un lugar fresco y seco hasta su uso.

Atencin:
Todos los materiales han de estar envueltos en papel de aluminio y abrirlos slo en la cmara de esterilidad una vez esterilizada. Es conveniente no usar los frascos preparados con el medio de cultivo hasta pasados tres o cuatro das, desechando los que se hayan contaminado (lo normal es que no se contamine ninguno). Guardados en un lugar fresco, pueden usarse hasta despus de unos meses.

A tener en cuenta que:

En el caso de usar vermiculita como soporte para el cultivo, se ponen tambin unos 3 cm de vermiculita y se adiciona medio lquido (sin agar) hasta que se moje. Es muy importante que no haya exceso de lquido. Las semillas no deben (ni saben) nadar. Algunos tarros para microondas no sirven. Tienen que tener la indicacin PP (polipropileno). En algunos la tapa no es de polipropileno con lo cual estos no sirven, se derretiran en la olla a presin. ^

.- Esterilizacin de Semillas y cpsulas:

Papel de filtro (ya esterilizado) Un recipiente con Leja al 20% Tres recipientes con agua esterilizada Pinzas metlicas Bistur

Las semillas son muy pequeas por lo que se usan pequeos sobrecitos hechos con papel de filtro, para esterilizar y lavar. Cada sobrecito no debera contener ms volumen de semilla que el equivalente a tres o cuatro granos de arroz. Esto supone unas 2000 a 20000 semillas dependiendo de las especies, cantidad ms que suficiente para obtener suficientes seedlings. Como dato orientativo, con cpsulas grandes se puede hacer un mnimo de 10 15 bolsitas. Se esterilizan en leja al 20% (1 parte de leja y 4 de agua) durante 15-20 minutos, moviendo algo el sobrecito de vez en cuando para que la leja acte ms eficientemente y no queden zonas no estriles, tratando de evitar que se rompa y salgan las semillas, pues despus nos ser casi imposible recogerlas. Despus se lavan varias veces en agua estril. Para este proceso, es necesario tener un frasquito con leja al 20% y cuatro frasquitos estriles con agua para hacer cuatro lavados (2 3 minutos cada lavado. Para pasar las semillas de uno a otro se toman los sobrecitos con las pinzas (que tambin han de estar estriles). Si se usan cpsulas verdes, stas interiormente estn estriles (microbiolgicamente), por lo que se manejan simplemente con las pinzas a travs de la leja y los lavados. Adems no es necesario meterlas en los sobrecitos: se esterilizan por fuera y despus de los lavados se abren (longitudinalmente) con el bistur y se siembran las semillas inmaduras que hay en el interior. Cada especie tiene diferentes tiempos de recoleccin como cpsula verde y de maduracin hasta semillas secas. Estos tiempos son extremadamente variables y van en ambos casos desde menos de un mes hasta varios aos.

Atencin:
Todos los materiales que toquen las semillas han de estar estriles (frascos, agua, etc), pues de lo contrario nos crecern hongos y bacterias en vez de las semillas. Todo el proceso (esterilizacin, lavado y siembra) ha de hacerse en la cmara de esterilidad (previamente esterilizada). Del bien hacer dentro de la cmara depender el xito del cultivo. ^

.- Esterilizacin de la cmara de esterilidad: La cmara de esterilidad la podemos esterilizar de dos maneras: a) b) Con la aplicacin de alcohol de 70%, proceso. Con lmparas germicidas, proceso. Existen en el mercado tubos o lmparas germicidas fluorescentes econmicas, semejantes a los de los rayos UVA, que emiten radiacin ultravioleta y matan todo lo que hay en su radio de accin en unas 2 horas, sustituyendo al tratamiento con alcohol que es bastante engorroso. Estas lmparas se usan de forma industrial en alimentacin (cmaras frigorficas, pastelera, etc). A tener en cuenta que:

Aunque la exposicin humana momentnea a esta radiacin no es nociva, no se debemos exponernos ms de 2 minutos. El inconveniente es que hay que encenderla 2 horas antes de empezar a trabajar para dejarla apagada mientras trabajamos, pero es francamente til. Tambin es conveniente cubrir la cmara con un pao para evitar accidentes con la radiacin.

Procedimiento con Alcohol:

Introducimos en la cmara todos los materiales (ya estriles) con los que tengamos que trabajar que han salido de la olla y estn cubiertos por papel de aluminio, pues una vez esterilizada la cmara no se puede abrir, y si hay que hacerlo, la esterilizacin ha de repetirse de nuevo. Se nebuliza cuidadosamente con alcohol con la ayuda de un pulverizador toda la cmara, de manera que matemos todos los microorganismos que estn continuamente flotando en el aire. Para evitar que los materiales se nos empapen de alcohol se cubren con papel de aluminio. Adems es conveniente tener dentro papel de cocina para recoger todo el alcohol que se va depositando sobre la mesa. Antes de empezar a trabajar se debe esperar 5 minutos a que se deposite todo el alcohol nebulizado. Encender las lmparas durante dos horas, teniendo en cuanta las precauciones mencionadas anteriormente.

Procedimiento con lmparas germicidas.

Atencin:
Durante la esterilizacin de la cmara, a las semillas hay que cubrirlas con papel de aluminio para que no les haga dao el alcohol ni la radiacin.

Duracin de la esterilizacin de la cmara: Si la cmara est ms o menos estanca (que no entre aire) se podra trabajar toda la tarde. Sin embargo, es conveniente tener en la cmara un vasito con alcohol que nos permita esterilizar de vez en cuando pinzas o bistur, sobre todo si trabajamos con diferentes semillas, pues algunas podran estar contaminadas y trasladar esta contaminacin a otros materiales. Una inmersin del material durante unos minutos es suficiente (en una parada para tomar un caf o descansar un ratito). El instrumental as esterilizado debe ser secado con un trozo de papel de filtro estril previamente a volver a trabajar, pues el alcohol tambin es nocivo para las semillas de las orqudeas. ^ SEMBRADO Y GERMINACIN Se esterilizan las semillas y/o cpsulas en sobrecitos hechos de papel de filtro (para que entre la leja), segn he indicado. No sobrepasar los 20 minutos pues tambin matarais las semillas. Algunas especies s necesitan ms de 20 minutos, pero no suele ser el caso de las orqudeas tropicales. Los sobrecitos se abren con las pinzas y bistur sobre trozos de papel de aluminio estril que hemos situado sobre las tapas de los tarros de microondas estriles y se introducen unas 100-200 semillas en cada frasco, lo ms separadas posible (las semillas se pueden recoger del sobrecito con una cucharilla de caf muy pequea estril). En general, la germinacin es mejor en oscuridad, as que despus mejor guardar los frascos en una caja bien cerrada y observarlas semanalmente. Despus de unos 15 das a un mes (a veces ms) se empiezan a ver las semillas engrosar y ms adelante formar la yema apical y la primera raz. ^ REPICADO Cuando tienen aproximadamente medio cm ya han consumido casi todo el nutriente, por lo que se cambian al mismo medio fresco, tambin en esterilidad dejando aproximadamente 1030 plantitas por frasco y sacar ya a la luz (no luz directa, puede ser cerca de una ventana o en un lugar sin sol directo en el invernadero.

Tambin se puede aplicar luz (y sera lo mejor) con 2 fluorescentes puestos a unos 30 cm de los frascos que estn funcionando 16 horas al da, pero encarece el proceso. Sin fluorescentes crecen un poco ms despacio, pero para uso particular pueden valer perfectamente. ^ PLANTADO EN SUSTRATO Como norma general, cuando las plantas tienen unos 3-4 cm de alto (estn suficientemente desarrolladas), se pueden adaptar al sustrato. Al principio se debe usar un sustrato menos poroso (puede ser vermiculita, abonada con abono lquido), y cubrirlas con bolsitas de plstico invertidas tipo celofn. La adaptacin tiene que ser progresiva, pues estas plantitas tan pequeas se secan muy rpidamente. Tambin los botellines de agua cortados por la mitad y puestos sobre la planta son ideales para evitar la deshidratacin rpida. Poco a poco se va abriendo a intervalos de tiempo (o mejor haciendo pequeos agujeros en los botellines) hasta que la planta ya puede crecer y desarrollarse sin proteccin como las dems. Adems, se hace necesario un tratamiento con un funguicida, pues en esta etapa de adaptacin hay una fuerte tendencia a la infeccin por hongos. Cuando se ha desarrollado adecuadamente se la puede instalar en el sustrato definitivo que depender de la especie. En laboratorio, con medios de cultivo ms controlados, la luz adecuada y aparataje se pueden obtener plantas en menos de un ao. En casa, en aproximadamente un ao, se podran poner las plntulas (seedlings) en sustrato, y a partir de otros dos aos (dependiendo de la especie) podran florecer. ------------------------------------------------Tengo que sealar que esta no es la forma en que se hace el cultivo in Vitro en un laboratorio. Para hacer cultivo in Vitro en laboratorio se utiliza un aparato que se conoce como cabina de flujo laminar, y que bsicamente es un aparato que genera una suave corriente de aire estril, donde te permite trabajar en condiciones de esterilidad. Esta corriente de aire estril se genera mediante un motor que hace pasar el aire normal a travs de dos filtros, uno retiene las impurezas grandes y el siguiente que elimina hasta las esporas del ambiente. No es muy difcil hacerse una de ellas, pero los materiales son muy especficos y no se encuentran en cualquier parte, adems de ser relativamente caras (si alguien se atreve le ayudo a conseguirlos). Existen algunos aparatos de aire acondicionado para alrgicos que tienen sistemas de filtros para el polen que producen aire estril y se podra usar en cultivo in Vitro, pero ya hablamos de encarecer el proceso y tratamos de hacer algo asequible a todo el mundo. Por el sistema

que he descrito, aficionados de todo el mundo estn reproduciendo sus hbridos a escala domstica.