RELACIN DE LOS MICROORGANISMOS DEL LICOR MEZCLA CON LA FORMACIN DE BIOPELCULAS Y EL BIOFOULING EN SISTEMAS MBR

Serrano, S., Arregui, L., Libana, R., Santos, A. y Marquina, D. Departamento de Microbiologa III. Facultad de Biologa. Universidad Complutense de Madrid suserra@ucm.es

INTRODUCCIN
Las biopelculas o biofilms son comunidades microbianas embebidas en una matriz exopolimrica (EPS) que se desarrollan sobre una superficie slida. Su complejidad es muy variable, dependiendo de las condiciones y el tipo de ambiente en el que se haya producido su formacin. En ambientes con comunidades diversas, como en los reactores biolgicos de aguas residuales, estas biopelculas son muy complejas. La formacin de las biopelculas est mediada por mecanismos de Qurum Sensing. Este es un fenmeno poblacional en el que intervienen molculas denominadas autoinductores, que inducen la expresin de genes implicados en la formacin de biopelculas sobre superficies. La formacin de biopelculas puede contemplarse desde dos puntos de vista en lo que se refiere a los sistemas de depuracin de aguas residuales: (1) Algunos sistemas de depuracin se basan en el desarrollo de comunidades estables sobre superficies slidas, que son las responsables de la eliminacin de los contaminantes. Los sistemas de pelcula fija son, entre otros, los contactores biolgicos rotativos, o sistemas como el proceso de biopelculas desarrolladas sobre soportes integrados (IFAS- integrated film activatedsludge), soportes mviles o sistemas mixtos de biomasa floculada y biomasa en soportes suspensin (MBBR-Movil bed biological reactor). (2) En otros casos, la formacin de biopelculas puede producir efectos negativos como en los sistemas MBR (Membrane bioreactors) en los que son la causa principal del biofouling o bioensuciamiento de las membranas. La investigacin sobre la formacin de biopelculas y los fenmenos de Qurum en las poblaciones microbianas puede proporcionar nueva informacin que permitir la optimizacin de los procesos de depuracin, como por ejemplo: (a) Bioprospeccin de cepas formadoras de biopelculas con actividades metablicas determinadas que puedan adherirse a soportes fijos e introducirse en los reactores biolgicos. Este aspecto es de especial inters cuando la EDAR est destinada a la eliminacin de contaminantes industriales. (b) Seleccin de cepas con capacidad de inhibicin del Qurum Sensing,e inclusin de las mismas en sistemas de membranas, con el fin de retrasar la formacin de biopelculas. El biofouling de las membranas constituye uno de los principales inconvenientes en los sistemas de depuracin MBR porque disminuye la eficacia en la filtracin, aumentando el coste operativo de la planta. Puesto que el desarrollo de biopelculas es una de las principales causas del biofouling, nuestro grupo est actualmente estudiando la capacidad de desarrollo de las mismas sobre superficies slidas y el aislamiento e identificacin de cepas microbianas con fuerte capacidad de adherencia en cultivos monoespecficos, as como las interacciones entre distintas cepas y tipos de microorganismos y su influencia sobre su capacidad filmgena.

Una estrategia muy actual de tratamiento del biofouling, sobre la cual todava es escasa la informacin, es la inhibicin del Qurum Sensing por Qurum Quenching. Puesto que en las bacterias Gram negativas, grupo dominante en el agua residual, los principales autoinductores son del tipo AHL (Acil Homosern Lactona), los estudios se centran en la bsqueda de otros microorganismos productores de acilasas y mediadores del fenmeno de Qurum Quenching. En un estudio muy reciente, Oh y colaboradores (2013), probaron la eficacia del Qurum Quenching, llevando a cabo un experimento a partir de fango procedente de una EDAR operativa y aislaron dos bacterias inhibidoras del Qurum Sensing, siendo la especie Rhodococcus qingshengii la de mayor actividad degradadora de AHL. Dicha bacteria fue posteriormente encapsulada en la membrana y mostr su eficacia en la inhibicin del ensuciamiento de las membranas.

MTODOS
A continuacin se muestra un esquema de las estrategias metodolgicas desarrolladas para el estudio de la capacidad formadora de biopelculas de distintos microorganismos del licor mezcla, tanto procariotas (bacterias) como eucariotas (levaduras).

Figura 1. Metodologa de estudio de bacterias y levaduras formadoras de biopelculas en sistemas MBR

Una vez obtenidos los cultivos puros, e identificadas las especies con tcnicas moleculares (amplificacin de secuencias del ADNr 16S en el caso de bacterias y ADNr 26S para las levaduras), se realizaron ensayos de laboratorio sobre soportes slidos en placas multipocillo hasta la formacin de los biopelculas mono o multiespecficos. La tincin y observacin con microscopa confocal se realiz en diferentes etapas del desarrollo. Por ltimo, las imgenes fueron tratadas con el software ImageJ y BioImageL para la reconstruccin tridimensional de la arquitectura de la biopelcula. En el caso de las bacterias, se seleccionaron cepas productoras de AHL, autoinductores de Qurum Sensing caractersticos de bacterias Gram negativas, mediante la utilizacin de las cepas biosensoras Chromobacterium violaceum CV026 y Agrobacterium tumefaciens A136.

8- Chryseobacterium joostei

38-Aeromonas hydrophila

11-Pseudomonas stutzeri

39-Aeromonas hydrophila

RESULTADOS Y DISCUSIN
12-Pseudozanthomonas mexicana + 41-Shewanella xiamenensis +

Biopelculas microbianas Los resultados muestran una clara capacidad de los microorganismos contenidos en el +licor mezcla 18-Aeromonas hydrophila + 43-Aeromonas hydrophila + para la formacin de biopelculas sobre soportes slidos en condiciones de laboratorio. Durante la maduracin se observa un incremento de grosor en la biopelcula (el grosor mximo alcanza 10-17 m). Segn las observaciones en microscopa de interferencia diferencial (DIC) la biopelcula madura in vivo cubre toda la superficie y presenta zonas elevadas en vertical (torres y setas), as 19-Aeromonas + 48.1-Acinetobacter junii + abundantes como canales queveronii permiten el flujo de agua, +nutrientes y oxgeno. Adems, -se observan clulas viables en la zona ms superficial, alcanzando un porcentaje del 74% sobre el total de la poblacin. Las bacterias gran negativas son claramente predominantes en la biopelcula con respecto a las gran positivas
21-Pseudomonas nitroreducens + 48.2-Aeromonas hydrophila + +

24-Aeromonas hydrophila

51-Thaurea phenylacetica

29-Aeromonas hydrophila

53-Methylosinus sporium

30-Alcaligenes sp. + + Figura 2. Biofilm maduro formado a +partir 58-Aeromonas de la hydrophila muestra original del licor mezcla. Observaciones con microscopa DIC y confocal.

Se caracterizaron 24 aislamientos de bacterias Gram negativas como productoras de AHL, siendo 31-Aeromonas hydrophila + 59-Ottowia thioxydans predominantes los gneros Aeromonas y+ Pseudomonas , entre otras. Todas las + especies se identificaron por comparacin de secuencias de ADNr 16S de las cepas con las bases de datos existentes.
33-Aeromonas hydrophila + + P-Pseudomonas aeruginosa + +

Figura 3. Resultados del estudio de cepas productoras de AHL en dos especies aisladas de depuradoras. A la izquierda se muestran los resultados del ensayo con Chromobacterium violaceum CV026 y a la derecha con Agrobacterium tumefaciens A136. Posteriormente se determin la mayor o menor capacidad de adhesin a la superficie por el mtodo del cristal violeta (Stepanovic y colaboradores, 2000). Nueve de las cepas ensayadas mostraron una fuerte adherencia, otras nueve una adherencia moderada y el resto adherencia dbil. Entre las bacterias con fuerte capacidad de adherencia se encuentran especies de los gneros Pseudomonas, Pseudoxanthomonas, Aeromonas, Cryoseobacterium, Alcaligenes y Methylosinus.

Se realiz una seleccin entre las cepas con mayor capacidad de adherencia, y se determin la estructura tridimensional y el grosor de la biopelcula formada en cultivo monoespecfico. La estructura de las biopelculas vara de unas especies a otras, algunas de ellas forman biopelculas homogneas mientras otras presentan un relieve tridimensional muy marcado, mostrndose tambin diferencias en el grosor y la distribucin de clulas viables.

Figura 4- Ejemplo de los resultados del anlisis de una biopelcula de Shewanella xiamenensis de 24 horas, observese la distribucin de clulas viables y no viables y de la biomasa total en una representacin tridimensional. Con respecto a las poblaciones de levaduras, escasamente descritas en sistemas de aguas residuales (Ghyoot y Verstraete, 2000), se identificaron un total de 17 especies pertenecientes a seis gneros diferentes, entre los que predominan Candida, Saccharomyces y Debaryomyces. Siete cepas mostraron una fuerte adherencia, de acuerdo con los resultados de absorbancia obtenidos con la tcnica del cristal violeta, principalmente especies del gnero Candida, siete presentaron una adherencia moderada y cuatro una adherencia dbil. Las observaciones con microscopa confocal del desarrollo de las biopelculas formadas por levaduras revelan, en los ensayos de laboratorio, que stas presentan un espesor mayor que los biopelculas bacterianas, a las 24h se observaron espesores mximos de hasta 39.70 m (es importante tener en cuenta que las clulas de levadura presentan un tamao notablemente mayor que el de las bacterias). De nuevo el anlisis de las imgenes de microscopa confocal indica patrones muy diversos en la estructura tridimensional de las biopelculas, as como en el porcentaje de colonizacin de la superficie. El porcentaje de viabilidad es muy elevado, a las 24 horas supera, en todos los casos, el 90%.

Figura 5. Reconstruccin tridimensional de biopelculas formadas por diferentes especies de levaduras a partir de imgenes obtenidas con microscopa confocal- Observaciones a 200 X. Obsrvese que la mayor parte de las clulas permanecen viables a las 24 h.

Se han realizado tambin ensayos sobre la influencia de los protistas sobre el desarrollo de las biopelculas, comprobndose en primer lugar la ingestin de las bacterias o levaduras por las especies seleccionadas. Posteriormente se ha determinado la incidencia que en el desarrollo de la biopelcula bacteriana generaba la presencia de las especies de protistas. En los ensayos con cepas de Aeromonas se comprob que la depredacin de Euplotes sp. y Paramecium sp. sobre la biopelcula formada por A. hydrophila/caviae provocaba la formacin de agregados bacterianos de mayor densidad y complejidad.

Figura 6- Ingestin de Aeromonas hydrophila por ambas especies de protistas. Perspectivas. Interferencia en la formacin de biofilms Qurum Quenching Una vez aisladas y seleccionadas cepas fuertemente productoras de biopelculas, en la actualidad se estn realizando ensayos multiespecficos para determinar relaciones positivas o negativas en el proceso de formacin de biopelculas mediada por qurum. Se podrn as establecer qu cepas son capaces de retrasar o eliminar dicho proceso por Qurum Quenching. Se ha demostrado que la adicin de AHL-acilasas evita o disminuye el biofouling al degradar las AHL y no inducirse, por tanto, la formacin de la biopelcula. A pesar del xito, la adicin de enzimas es un mtodo que conlleva elevados costes, por lo que nuestros estudios se han encaminado a la bsqueda de bacterias productoras de Qurum Quenching. Actualmente, a partir de la coleccin de cepas de nuestro laboratorio, se estn planificando ensayos para encontrar bacterias que inhiban el Qurum Sensing para su aplicacin en el sistema. Posteriormente, stas podrn inmovilizarse en las membranas y ensayar su eficacia. Por ltimo, tenemos en perspectiva aislar, identificar y ensayar cepas bacterianas formadoras de biopelculas que presenten determinadas actividades metablicas y puedan ser empleadas fundamentalmente en depuradoras industriales con contaminantes definidos.

CONCLUSIONES El estudio de las biopelculas microbianas y los fenmenos de Qurum Sensing permiten la optimizacin de los procesos de depuracin de aguas residuales. En sistemas MBR existen diferentes microorganismos con capacidad de formar biopelculas, entre los que se encuentran bacterias y levaduras. Las interacciones entre los diferentes componentes de la microbiota influyen positiva o negativamente sobre la capacidad de desarrollo de biopelculas La deteccin y empleo de cepas con capacidad de impedir la induccin del Qurum Sensing retrasara o inhibira el desarrollo del biofouling.

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