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FACULDADE DE FARMCIA

UNIVERSIDADE DE LISBOA

FACULDADE

FARMCIA
Universidade de Lisboa

TOXICOLOGIA
LABORATRIO
Docentes Ana Paula Marreilha dos Santos lvaro Teixeira Lopes Cristina Carvalho Ana Cristina Ribeiro Nuno Oliveira

LISBOA 2012

Trabalhos Laboratoriais
Trabalho n1 (A) Doseamento do lcool etlico no sangue (mtodo de Widmark) (B) Doseamento do lcool etlico no sangue (Cromatografia gs-lquido) Trabalho n2 (A) Doseamento do Monxido de carbono no sangue (B) Doseamento da Metahemoglobina no sangue Trabalho n3 (A) Determinao quantitativa do cido delta-aminolevulnico em urina (ALA-U) (B) Determinao quantitativa de Coproporfirinas em urina (COPRO-U) Trabalho n4 (A) Pesquisa de insecticidas Organofosforados numa amostra de terra (B) Determinao da actividade das Colinesterases em soro ou plasma

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Trabalho n1 (A)

Doseamento do lcool etlico no sangue (mtodo de Widmark)


Tcnica Experimental 1. Na cpsula do matraz de Widmark colocar 0,2 ml da amostra (sangue). 2. No fundo do matraz, introduzir 2 ml da soluo cromossulfrica. 3. Fechar e colocar o matraz durante duas horas em um banho de guaa uma temperatura de 60C, (se existir lcool na amostra de sangue este vai volatizar-se e reduzir parte do dicromato que est em excesso) 4. Paralelamente fazer um ensaio a branco. 5. Ao fim das 2 horas retirar as tampas e colocar no fundo de cada matraz 25 ml de gua destilada e 0,5 ml de soluto de KI a 5%. 6. Aps 1,5 minutos, titular o I2 libertado com tiossulfato de sdio 0,01N. (Mede-se o volume gasto na titulao (VA) e o gasto na titulao do branco (VB). e a partir da diferena (VB)-VA) que se efectuam os clculos). Reaces

3 C2H5OH + 2 K2Cr2O7 + 8 H2SO4 (x2) K2Cr2O7 + 6 KI + 7 H2SO4 (x2) 3 I2 + 6 Na2S2O3

3 CH3COOH + 2 Cr2(SO4)3 + K2OH4 +11 H2O Cr2(SO4)3 + 4 K2SO4 + 7 H2O + 3 I2 3 Na2S4O6 + NaI

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Apuramento de resultados

3 C2H5OH C2H5OH Na2S2O3

12 Na2S2O3 4 Na2S2O3 PM C2H5OH /4

+3 +4

PM (Etanol) = 46 PM Etanol /4 = 46/4 = 11.5 Soluo de Hipossulfito 0.01 N: 0,01 eq. Na2S2O3 1000 mL 1 eq. V mL 1 equivalente de Na2S2O3 em V = 105 mL

105mL Na2S2O3 (N/100) V B - VA


xg y

11,5 g lcool

x
_____________ ______________

(VB mL VA mL) Na2S2O3 x g/lcool em 0,2 ml de sangue 0,2 ml (toma de ensaio) 1000 ml

y = Quantidade de lcool em g/l Trabalho n1 (B)

Doseamento do lcool no sangue por cromatografia gs-liqudo


Em cromatografia gs-lquido, a separao dos componentes de uma mistura feita atravs de um processo de partilha entre a fase estacionria e a fase mvel (gs de arraste). Para que um produto possa ser analisado por este mtodo, necessrio que ele seja voltil e estvel temperatura a que a anlise realizada. A anlise qualitativa baseada na observao do tempo que medeia entre a injeco da amostra e a eluio do composto (pico) em estudo tempo de reteno. Na anlise quantitativa determinada a rea do pico. Em cromatografia gs lquido uma quantidade conhecida de um determinado composto (padro interno PI) muitas vezes adicionada no inicio do processo de tratamento da amostra . Este composto sofre portanto o mesmo tratamento que os compostos em estudo. A determinao do tempo de reteno do PI corrige determinados factores de variabilidade, como por exemplo a alterao do fluxo do gs de arraste durante a anlise. Mais importante ainda, determinao da relao entre a rea do pico do composto em anlise e a rea do pico do PI corrige variaes resultantes do volume de amostra injectado. Este mtodo permite detectar e determinar alcois como o etanol, metanol, 2-propanol e butanol no sangue total, plasma/soro ou urina, em concentraes da ordem dos 0,04 g/l ou superiores. Na aula prtica iremos determinar a concentrao de etanol numa amostra de sangue. 4/18

Tcnica Experimental A 0,1 ml de amostra adicionada uma soluo do PI em soluo de cido clordrico 0,01 mol/l, para precipitar as protenas . Depois de agitar no vortex e centrifugar, 1 L do sobrenadante analisado atravs de cromatografia gs-lquido com detector de ionizao de chama (GC-FID). construda uma curva de calibrao com solues padro de etanol preparadas em gua desionisada, com razes entre as reas de etanol e de PI contra as concentraes do primeiro. Condies cromatogrficas Detector: Ionizao de chama (FID) Temperatura do forno: 40 Temperatura do detector: 180 Temperatura do injector: 160 Fluxo de gs de arraste (azoto): 10 mL/min Coluna: HP 20M (Carbowax 20M) comprimento 10m, interno 530m Soluo de padro interno Diluir 0,10 ml de n-butanol para 50 ml com cido clordrico 0,01 mol/l Curva de calibrao do etanol Diluir 0,10 ml de etanol absoluto para 100 ml com gua desionisada (soluo de etanol 0,80g/l). Retirar 0,1/0,2/0,4 e 0,6 ml da soluo anterior para eppendorfs marcados Adicionar a cada tubo 0,1 ml da soluo do PI Completar com gua desionisada para 1 ml Estas solues correspondem a solues padro de etanol com concentraes compreendidas entre 0,08 e 0,48 g/l Injectar no cromatografo 1 l de cada soluo Anlise da amostra 1. Preparao da amostra Retirar 0,1 ml da amostra (sangue total homogenizar previamente) para eppendorf Adicionar 0,1 ml da soluo do PI Completar com gua desionisada para 1 ml Agitar 5 segundos no vortex Centrifigar a 4000 rpm, 4 minutos Separar 500 l de sobrenadante para um Eppendorf novo Injectar no cromatografo 1 l do sobrenadante

2. Identificar o(s) composto(s) presentes no cromatograma comparando-o com o cromatograma de uma soluo de etanol. 3. Se o etanol estiver presente preparar as solues para a curva de calibrao. 4. Analisar as solues padro e construir um grfico com as razes entre reas dos padres e do PI contra a concentrao das solues de etanol. 5. Calcular a concentrao de etanol na amostra atravs da curva de calibrao construda.

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Trabalho n2 A

DOSEAMENTO DO MONXIDO DE CARBONO NO SANGUE


O mtodo que utilizamos na aula prtica baseia-se nas propriedades redutoras do monxido de carbono , manifestadas atravs da reaco: PdCl2 + CO + H2O 2 HCl + Pd + CO2
Cloreto de paldio H2SO 4 Amostra de sangue

O CO libertado da carboxihemoglobina por uma acidificao da amostra de sangue, difundindo-se no interior de uma clula de Conway, vai reduzir uma soluo de cloreto de paldio colocada no compartimento, interior desta. O mtodo clssico de Conway consistia em determinar o cido libertado, relacionando-se com a quantidade de monxido de carbono presente. Tcnica Experimental 1. Aplique uma fina camada de silicone, ou outro produto similar , na tampa de uma clula de Conway. 2. Pipete 3 ml de soluo de cloreto de paldio 0,005N para o compartimento central da clula. 3. Pipete 1,0 ml de H2SO4 3,6N no compartimento exterior da clula e coloque a tampa de modo a ficar uma pequena abertura que permita a introduo de sangue. 4. Introduza rapidamente 0,5 ml da amostra de sangue. Tape a clula e misture o contedo do compartimento exterior por agitao suave, que se prolongar por duas horas temperatura ambiente. *Neste ponto possvel apreciar semi-quantitativamente a carboxihemoglobina, observando a extenso da reduo ocorrida. A camada negra de paldio metlico que se forma, funo da quantidade de CO libertado da amostra 5. Transfira o contedo do compartimento central para um balo de 50 ml, lavando-o por 3 vezes com HCl 0,1N (3 ml) 6. Dilua o contedo do balo para 50 ml com HCl 0,1N e misture bem. 7. Usando HCl 0,1N como referncia, determine a absorvncia, desta soluo a 278nm. 8. Usando o mesmo HCl 0,1N como soluo de referncia, determine a absorvncia de 3 ml de PdCl2 0,005N diludos para 50 ml com HCl 0,1N.

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CURVA DE CALIBRAO Enquanto aguarda o termo das duas horas, proceda ao estabelecimento de uma curva de calibrao do seguinte modo: 1. Dilua 0,5/1,0/1,5/2,0/2,5/3,0 ml de soluo de PdCl2 0,005N para 50 ml, com HCl 0,1N e misture bem. 2. Determine a absorvncia de cada uma das solues a 278nm, utilizando como branco, HCl 0,1N. 3. Marque as absorvncias obtidas em ordenadas, contra volumes de monxido de carbono / 100 ml, em abcissas. Os respectivos valores do monxido de carbono so:

Volumes de cloreto de paldio (mL/50 mL) 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5

Volumes de monxido de carbono (mL/100 mL) 0 5,6 11,2 16,8 22,4 28,0

4. Determine os volumes de CO pela curva de calibrao. 5. Faa a determinao da hemoglobina na amostra em causa e complete os clculos como segue
Volumes de CO x 100 Hemoglobina (g/dL) x 1,35 = % de carboxihemoglobina

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Trabalho n 2B

Doseamento da Metahemoglobina em uma amostra de sangue

Reagentes

. . .

Soluo de dihidrogenofosfato de potssio (sol. I)

KH2PO4

2,269 g

H2O dest. q.b. p. 1000 mL

Soluo de dihidrogenofosfato de sdio (sol. II)

Na2HPO4

2,969 g

H2O dest. q.b. p. 1000 mL

R1: Soluo tampo-fosfato - extempornea

Sol. I Sol. II

6,3 mL 3,7 mL

Soluo aquosa de cido actico glacial a 12% R2: Soluo neutralizada de cianeto de potssio extempornea A tcnica indica para no momento de emprego, neutralizar um mnimo da soluo de cianeto a 10% com uma soluo de cido actico a 12% gota a gota (verificar se o pH est prximo de 7) Proceder com cuidado a esta operao, dada a possibilidade de libertao de gs ciandrico NOTA: (dadas as caractersticas do padro de KCN existente no laboratrio pode bastar a preparao de 1mL deste composto em gua destilada, sem neutralizao. Consulte o docente)

R3: Soluo aquosa de ferricianeto de potssio a 5% - (extempornea, mas j preparada)

Tcnica Experimental
1. Introduzir 10 mL do reagente R1 num tubo de centrifuga e 0,2 mL da amostra de sangue (recolhida em heparina ou EDTA) homogeneizada. 2. Agitar, deixar em contacto por 10 min. E em seguida centrifugar. 3. Distribuir por 2 tubos de ensaio 3 mL o lquido sobrenadante. 9/18

a) Primeiro tubo: - Medir a absorvncia a 630 nm. Seja o valor medido A b) Segundo tubo: - Adicionar uma gota do reagente R2. - Medir a absorvncia a 630 nm. Seja o valor medido B c) Terceiro tubo: - Adicionar uma gota de reagente R3 - Medir a absorvncia a 630 nm. Seja o valor medido de C - Juntar em seguida na prpria tina espectrofotmetro, uma gota do reagente R2 -Medir novamente a absorvncia. Seja o valor D.

A
1 1

A diferena de absorvncias (A-B) proporcional meta-Hb existente na amostra (homolizado)

630

c.d.o.

C
3

A diferena de absorvncias (C-D) proporcional -Hb total

630

c.d.o.

Clculos
% de Metahemoglobina no sangue = 100 x (A B) (C B)

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Trabalho n 3 A

Doseamento do cido -aminolevulnico na urina (ALA-U)


Reagentes:
Soluo me de ALA (50mg/L) Acetato de Etilo Acetoacetato de Etilo Tampo acetato pH 4,6 Reagente de Ehrlich modificado

Tcnica Experimental
1. Preparar para bales de 10 mL as solues padro de concentrao 2,5 mg/L, 5,0 mg/L, 7,5 mg/L 10 mg/L, 15 mg/L a partir da soluo me de ALA (50 mg/L) 2. Para tubos de centrifuga pipetar rigorosamente 1 mL de cada soluo padro 3. Pipetar para um tubo de centrfuga 1 mL de gua destilada que servir de branco 4. Pipetar 1 mL de amostra (urina) para tubos de centrfuga 5. A cada tubo adicionar 1 mL de tampo acetato pH 4,6 6. Adicionar a cada tubo 0,2 mL de acetoacetato de etilo e agitar durante 5 segundos 7. Colocar em banho de gua (100C) durante 10 minutos 8. Deixar arrefecer e juntar 3 mL de acetato de etilo agitar 50 x 9. Centrifugar 3 minutos a 2000 rpm 10. Transferir 2 mL da fase orgnica para tubos de vidro 11. Juntar 2 mL de reagente de Ehrlich 12. Agitar no vortex e ler ler a 553 nm aps 10 minutos contra o branco 13. Fazer a curva de calibrao e calcular a concentrao em cido -aminonolevulinico em mg/L

ALA-U (mg/L)

Normal <6

Valores de ALA na urina Aceitvel Excessivo 6-20 20-40

Perigoso >40

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Trabalho 3 (B) Determinao quantitativa de Coproporfirinas em urina (COPRO-U)


AMOSTRAS E REAGENTES

Amostra(s) de urina Soluo clordrica de iodo


(1mL de soluo etanlica de iodo a 1% em 200mL de HCl a 5%)

cido actico glacial ter etlico


TCNICA 1. Em um tubo de ensaio colocar 2mL da amostra (urina), 0,2mL de cido actico e 5mL de ter etlico. 2. Agitar por 15, aguardar a separao de fases e remover a fase aquosa, desprezando-a. 3. Adicionar 5mL da soluo clordrica de iodo fase etrea, agitar e remover a fase orgnica rejeitando-a. 4. Colocar os tubos em um banho de gua a 37C durante 5. 5. Medir a absorvncia a 380nm, 430nm e no mximo da banda de Soret (em torno de 401nm) usando como referncia a soluo de cido clordrico.

CLCULOS
As concentraes de coproporfirina, expressas em g/L, so obtidas atravs da frmula: [ 2 x Amx (A430 + A380) ] x 2,093 x 1,064 x 1000 = x g/L COPRO Amx A430, A380 1,064 2,093 Absorvncia mxima de coproporfirina na banda de Soret Absorvncias referentes a impurezas Factor de correco proposto por Soulsby e Smith Factor proposto por Rimington utilizando o coeficiente de extino da COPRO e o factor de diluio usado no mtodo

Soulsby J, Smith RL, Brit. J.Ind. Med., 31, 72-74, 1974 Rimington C, Biochem.J., 75, 620-3, 1960

Copro-U (g/L)

Valores de coproporfirinas totais na urina Normal Aceitvel Excessivo <150 150-500 500-1500

Perigoso >1500

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Trabalho n4

Insecticidas Organofosforados
Propriedades e Mecanismos de Aco
Os organofosforados so, salvo raras excepes, lquidos muito lipossolveis; a sua tenso de vapor elevada mesmo a temperaturas normais, facilitando assim uma penetrao rpida por todas as vias; digestiva e respiratria. Os seus metabolitos so excretados, quase exclusivamente, numa forma degradada pela urina, decorrendo obviamente um certo tempo entre a absoro e a excreo, varivel consoante a afinidade qumica do produto ou seus metabolitos, para os tecidos. O despiste de uma intoxicao por organofosforados pode assim ser executada nos meios biolgicos, por intermdio de diversas tcnicas analticas, desde as mais simples at s mais elaboradas: reaces cromticas em cromatografia em camada fina, cromatografia fase gasosa, cromatografia lquida de alta presso, espectrofotometria de absoro de ultravioletas e de infravermelhos, espectrometria de massa, etc Pode ainda ser executada em materiais to diversos como alimentos, gua, solos, quando haja suspeita de contaminao. Um dos obstculos iniciais de qualquer anlise toxicolgica, reside no mtodo de extraco a adoptar. Quase sempre as substncias a analisar se encontram envolvidas numa matriz que pode comprometer a sua correcta determinao, pelo que se deve escolher criteriosamente a metodologia de extraco. A anlise de substncias em teores residuais obriga igualmente seleco de mtodos contnuos de extraco, como os que envolvem a extractor de refluxo de SOXHLET. A aco insecticida destes compostos foi descoberta na Alemanha, durante a 2 Guerra Mundial. Estes insecticidas so geralmente muito mais txicos para os insectos e vertebrados do que os organoclorados, e so instveis quimicamente. Esta ltima propriedade confere aos organofosforados vantagem no seu uso como substitutos dos persistentes organoclorados, especialmente do DDT. Todos os compostos organofosforados so derivados do cido fosfrico. Alis, organofosforados um termo genrico que inclui todos os insecticidas que contm fsforo,. Atribui-se-lhes a seguinte estrutura geral.
S (O) R P R' O (S) X Fig. 4 - R e R' grupo amino ou alcoxi; X - grupo aromtico, aliftico ou oheterocclico.

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Mencionam-se seguidamente alguns compostos organofosforados mais comuns


Paratio

O Paratio foi descoberto em 1944. Este composto e o seu homlogo, metil-paratio, tm sido os insecticidas organofosforados mais utilizados. Deve, porm salientar-se que a sua toxicidade para os mamferos to elevada que alguns pases tm proibido o seu uso. Este as pecto , alis, um factor limitante na sua aplicao Ateno ao esquema

S (RO)2 P O NO2

Fig. 5 Paratio ou etil-paratio R Metil-paratio R

C 2H 5 C 2H 3

o,o-dietil-o,p-nitrofenilfosforotioato o,o-dimetil-o,nitrofenilfosforotioato

Azinfos ou azinfos-metilo

Estes compostos e o seu homlogo, azinfos-etilo, so bastante eficazes contra as pragas que se alimentam das folhas das plantas cultivadas. Ambos os compostos so bastante txicos para os mamferos

S (RO)2 P S CH3 N 3 N

O
4

2 1

Fig. 6 -Azinfos-metilo Azinfos-etilo


Malatio

o,o-dimetil-s-{4-oxo-1,2,3-benzotriazino-3(4H)-ilmetil}-fosforoditioato o,o-dietil-s-{4-oxo-1,23-benzotriazino-3(4H)-ilmetil}-fosforoditioato

Devido sua baixa toxicidade para os mamferos e sua alta actividade insecticida, o malatio talvez o organofosforado mais usado. Tem sido utilizado em larga escala pela Organizao Mundial de Sade no combate dos mosquitos transmissores da malria. ainda um insecticida domstico muito divulgado para combate de pulgas, moscas e mosquitos.

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S (CH3O)2 P S CH

O C O CH2H5

CH2 C O CH2H5 O
Fig.7 Malatio: O,O-dimetilfosforoditioato de dietilmercaptosuccinato

TOXICOLOGIA DOS INSECTICIDAS ORGANOFOSFORADOS Inibio das Colinesterases

quase universalmente aceite que os insecticidas organofosforados e carbamatos so letais para os insectos e vertebrados porque inibem a enzima acetilcolinesterase. Esta enzima est localizada na membrana pssinptica, junto aos receptores sinpticos. O conhecimento do mecanismo molecular de catlise, operando no local activo da enzima fundamental para a compreenso da inibio causada pelos agentes anticolinestersicos. A reaco de hidrlise da acetilcolina no local activo da enzima acetilcolinesterase compreende 3 fases fundamentais: a) A molcula de substrato liga-se ao local activo da enzima. Esta ligao de natureza inica envolvendo um resduo aninico da enzima e o amnio quaternrio do substrato.

Esta regio tem polaridade de dimenses consentneas com a introduo de um grupo amnio quaternrio, pois os substratos e inibidores competitivos da enzima tm invariavelmente um grupo idntico.
CH3 CH3 N + CH2 CH2 O C CH3 Acetilcolina (substrato)

CH3 CH3 CH3 N + CH2 CH2 O O C (CH2)2 CH3 Butirilcolina (substrato)

CH3 CH3 CH3 N + CH2 O CH3 Muscarina (inibidor competitivo)

CH3 OH Fig. 12.

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b) O substrato reage com uma parte da enzima designada por local esterico. quase certo que este local um resduo de serina. Este resduo proporciona um mecanismo de reaco tipo cido-base. Devido proximidade da ligao ster da acetilcolina e ao carcter nucleofilico do oxignio da serina, o proto do hidroxilo rapidamente transferido para a ligao ster que se desfaz ficando o acetato com deficincia de electres . Gera-se colina que se separa e o acetato que, na condio de electrofilico (tem falta de electres), reage rapidamente com o oxignio nucleofilico da serina (tem abundncia de electres) formando-se uma ligao covalente por acetilao da serina. Deve notar-se que o importante no processo da catlise a colocao tctica da ligao susceptvel (ster) em frente do hidrxilo da serina. Assim, importante que o substrato possua colina, mas no interessa muito o comprimento da cadeia para alm da ligao ster, porque substratos como propionilcolina e butirilcolina so perfeitamente adequados, resultando a formao dos respectivos produtos. Molculas muito parecidas mas sem resduo colina so prprias como substratos, sendo no entanto, inibidores competitivos Os insecticidas organofosforados e carbamatos inibem a enzima acetilcolinesterase de modo diferente dos inibidores competitivos mencionados. Os insecticidas no so posicionados no local activo como substrato e os inibidores competitivos. O seu posicionamento no local activo motivado por interaces no inicas, uma vez que os insecticidas no tm grupos carregados. Todos os venenos insecticidas anticolinesterases tm em comum um grupo em que h assimetria de distribuio electrnica. Os organofosforados tm um grupo fosfato em que P electrofilico porque h deslocamento de electres na direco do oxignio, P=O. facto estabelecido que os compostos organofosforados tm efeito inibidor apenas na forma oxo (P=O) e no na forma de fosforotioato (P=S). A diferena fundamental que o P das formas oxo muito mais electrofilico do que o das formas P=S que no so reactivas. Essencialmente, a interao dos insecticidas anticolinesterases com o local activo da enzima faz-se segundo mecanismos cido-base, em que grupos nucleofilicos e electrofilicos do substrato e enzima esto implicados.

Determinao da actividade da Colinesterase


Dois tipos bsicos de actividade colinestersica so encontrados nos tecidos de todos os animais: a colinesterase verdadeira ou eritrocitria, detectada nos eritrcitos e tecido nervoso, exibe uma preferncia de substrato para a acetilcolina. A pseudocolinesterase encontrada principalmente no plasma, hidrolisa preferencialmente a butirilcolina e tambm a acetilcolina, esta ultima a velocidade menor. De um modo geral todos os insecticidas organofosforados e carbamatos, so potenciais inibidores da colinesterase, inibindo a maior parte deles, ambos os tipos de enzima. A determinao quantitativa da actividade colinestersica, constitui assim, um meio de diagnstico clnico da intoxicao por organofosforados, A actividade da pseudocolinesterase normalmente, mas no invariavelmente inibida mais rapidamente do que a da colinesterase eritrocitria. Dada a grande amplitude de valores considerados normais em actividade colinestersica, desejvel que quando se pretenda controlar indivduos expostos a inibidores desta enzima, se determinem previamente os seus teores normais individuais. Em regra deve-se considerar significativo e indicador de uma exposio txica, quando a actividade descer para valores abaixo de 80%, relativos ao valor mdio normal (inibio 20%).Contudo, pode existir uma acentuada inibio destas duas enzimas , sem a sintomatologia de intoxicao(!)

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Trabalho 4 (A)

Pesquisa de insecticidas organofosforados numa amostra de terra


Tcnica Experimental

O trabalho da aula prtica vai consistir na extraco de eventuais resduos de insecticidas organofosforados a partir de um material slido, e sua identificao por cromatografia de camada fina. 1. Introduzir a amostra num cartucho contentor (completar cerca de 2/3); 2. Extrair em Soxhlet durante 90 min, com a mistura: n-hexano/acetona (9:1) (150 mL); A mistura entra em ebulio e vaporiza. Aps a condensao dissolve os organofosforados no cartuxo e depois volta para o balo pelo sistema de sifo. Comea assim um novo ciclo e, dependendo do objectivo da anlise (anlise qualitativa ou quantitativa) e da quantidade de contaminante, assim continuamos ou no a extraco at se verficarem no mnimo 3 ciclos. Aps extraco procedemos concentrao da amostra em rota-vapor a presso reduzida. 3. Analisar o resduo por cromatografia em camada fina com o sistema: n-hexano/acetona (4:1) usando os seguintes padres: paratio, malatio e gusatio 4. Deteco: Observao em UV (254nm/366nm) Revelao qumica com PdCl2 (0,5%)

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Trabalho n 4 (B)

Determinao da actividade da (pseudo)colinesterase em soro ou plasma


Tcnica Experimental

O objectivo determinar se o indivduo esteve ou no em contacto com organofosforados ou anticolinestersicos . Os valores normais tm uma variao muito grande, portanto para comparar correctamente teria de se comparar com a actividade com valores previamente determinada (valor de referncia) desse mesmo indivduo.

A actividade da colinesterase determinada a partir da velocidade do aparecimento de tiocolina provocada por esta reaco.
Amostra: Soro ou plasma recolhido em heparina ou EDTA.

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Procedimento:

1) Na tina do espectrofotmetro juntar:


R1 = 350 L + 350 L de gua destilada Amostra = 40 L R2 = 560 L

2) Homogeneizar rapidamente 3) Registar os valores de absorvncia em intervalos de 30 (0,30,60,90) e calcular a mdia da variao (A). Aplicar factor
Ou

3) Calcular o tempo (t) de variao de absorvncia de 0,1. Aplicar factor 4) Registar o valor de actividade obtido e proceder a estudo comparativo

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