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Prática de Hematologia

Prática de Hematologia Contagem total de leucócitos: Quando realizada em câmara de Neubauer: 1. Pipetar 400

Contagem total de leucócitos:

Quando realizada em câmara de Neubauer:

1. Pipetar 400 microlitros de Türk ou ácido acético em tubo de ensaio; 2. Pipetar 20

microlitros de sangue homogeneizado; 3. Limpar o excesso de sangue da parte externa da ponteira com gaze ou papel e adicionar o sangue no tubo de ensaio com o diluente; 4. Montar a câmara de Neubauer e preencher um dos lados com a diluição homogeneizada (Fig.1); 5. Contar os quatro quadrados laterais maiores (Fig. 2 e 3) e multiplicar por 50.

CÁLCULO DA CONTAGEM TOTAL DE LEUCÓCITOS:

Área de cada quadrado maior: 1mm 2

Profundidade: 1/10mm

Diluição: 1:20.

Número total de leucócitos = Número de células contadas x 10 (altura) x 20 (diluição) / 4 (número de quadrados)

n o total de leucócitos x 50 = n o total de leucócitos/mm 3 (ou microlitro – L) de sangue.

Contagem total de eritrócitos:

Proceder da mesma maneira, porém utilizar 4 mL (4.000 microlitros) de diluente. Os diluentes que podem ser utilizados são a solução de Marcano (carnívoros e eqüinos), Gower (ruminantes), ou a Sol. Fisiológica (se realizada a contagem imediata). Contar as hemácias de 5 quadrados médios centrais. Somar o resultado de cada um dos 5 quadrados médios ((Fig. 2 e3) e multiplicar por 10.000. CÁLCULO DA CONTAGEM TOTAL DE ERITRÓCITOS:

Área do quadrado central maior: 1mm 2 Profundidade: 1/10mm Diluição: 1:200. Número total de hemácias = N o de células contadas x 10 (altura) x 200 (diluição) x 5 (5 de 25 quadrados médios)

n o de hemácias contadas x 10.000 = n o total de hemácias/L) de sangue.

Hematócrito ou Volume Globular

Método do Micro-Hematócrito

1. Encher dois terços de um capilar com sangue mais anticoagulante homogeneizado. 2.

Limpar a extremidade com gaze ou papel higiênico. 3. Fechar a extremidade do tubo na chama, protegendo o sangue com o dedo e rotacionando lentamente o tubo para que ele feche por igual, sem formar deformações na ponta do capilar. 4. Centrifugar por 5 minutos a 11.500rpm. 5. Fazer a leitura no cartão especial alinhando o início da coluna de hemácias em zero e o final do plasma em 100% e obtenha o resultado em porcentagem. OBS: Pode- se usar um tubo heparinizado colhendo-se o sangue diretamente do animal, porém o resultado pode ser cerca de 3% maior que com EDTA.

Determinação da hemoglobina

Determinação da hemoglobina Há vários métodos de determinação da hemogl obina: O método mais aceitável é

Há vários métodos de determinação da hemoglobina: O método mais aceitável é o da cianometahemoglobina que é realizada em colorímetro, espectrofotômetro ou equipamentos automatizados. Podem-se utilizar kits comerciais, com reagentes semi-prontos e solução padrão comercial. Caso prefira é possível preparar as soluções no próprio laboratório: Técnica: Adicionar 20 l de sangue homogeneizado num tubo contendo 5 mL de solução de Drabkin (200mg de ferrocianeto de potássio, 50 mg de cianeto de potássio, 1g de bicarbonato de sódio e completar para 1000 mL de água destilada). Agitar, deixar por 5 minutos e fazer a leitura colorimétrica com comprimento de onda de 540 nm, usando a solução de Drabkin como branco. Anotar a leitura e compará-la com uma solução padrão. O procedimento de estabelecimento do fator de conversão é o mesmo descrito nas bulas dos kits comerciais;

é o mesm o descrito nas bulas dos kits comerciais; Figura 1. Câmara de Neubauer. Local
é o mesm o descrito nas bulas dos kits comerciais; Figura 1. Câmara de Neubauer. Local

Figura 1. Câmara de Neubauer. Local de preenchimento com a diluição.

de Neubauer. Local de preenchimento com a diluição. Figura 2. Imagem do quadrante par a contagem

Figura 2. Imagem do quadrante para contagem de hemácias ou leucócitos. Note que eles são delimitados por uma linha tripla.

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L L H H H H H L L Figura 3. Câmara de Neubauer. Locais de

Figura 3. Câmara de Neubauer. Locais de contagem dos leucócitos e hemácias

Preparo do esfregaço:

1. Preparar duas lâminas novas e desengorduradas, sendo uma lapidada e com os cantos recortados. (Também pode ser utilizada uma lamínula). 2. Colocar uma gota de sangue pequena em uma das extremidades da lâmina. 3. Tomar a lâmina de canto recortado e colocá-la à frente da gota num ângulo de 45 o , fazer um ligeiro movimento para trás até o sangue se espalhar totalmente na borda da lâmina. 4. Com um movimento uniforme, para frente, fazer esta lâmina deslizar sobre a outra. Ela arrastará atrás de si o sangue que se espalhará em fina camada. 5. Imediatamente após, agitar a lâmina ao ar até o esfregaço secar-se completamente e identificar com lápis.

Coloração da lâmina (Leishman, Rosenfeld ou Wright)

1. Colocar 15 gotas do corante sobre a lâmina durante 3-5 minutos. 2. Em seguida adicionar 15 gotas de H 2 O destilada e/ou solução tamponada sobre o corante e a lâmina. 3. Deixar corando por 15 minutos. 4. Escorrer o corante e lavar em água corrente, secar e examinar ao microscópio com objetiva de imersão. Alternativa: podem-se utilizar os corantes rápidos, tipo panótico, com coloração sequencial rápida em três soluções. Ajustar o tempo de coloração em cada frasco, a depender da qualidade do corante. Pra uma maior durabilidade, fixe na primeira por mais tempo (5 minutos) e/ou substitua-a por Metanol P.A.

Exame diferencial de leucócitos

Exame diferencial de leucócitos Fazer a contagem diferencial dos leucócitos ident ificando cada célula. Para isso

Fazer a contagem diferencial dos leucócitos identificando cada célula. Para isso contar 100 leucócitos (identificar 100 células para cada 10.00 leucócitos, em animais com leucocitose, pode ser necessário contar 200-300 células para fazer o diferencial) e calcular a porcentagem de cada uma delas. Realizar a leitura em linhas gregas (Fig. 4) ao longo dos bordos do esfregaço, ou atravessando-o de um lado ao outro em zigue-zague, sempre na região da monocamada. As células normais da série branca são: Bastonetes, Neutrófilos, Eosinófilos, Basófilos, Linfócitos, Monócitos.

Eosinófilos, Basófilos, Linfócitos, Monócitos. Figura 4. Esquema de va rredura para o exame dife rencial de

Figura 4. Esquema de varredura para o exame diferencial de leucócitos

Soluções diluentes

MARCANO, Solução para diluir hemácias de carnívoros e eqüinos

- Sulfato de Na

50g

- Água destilada

1000mL

- Formol 40%

10mL

GOWER, Solução para diluir hemácias de ruminantes

- Sulfato de Sódio

62,5g

- Ácido Acético Glacial

166,8mL

- Água Destilada Q.S.P.

1000mL

HAYEN, Solução para diluir hemácias

- Sulfato de Sódio

12,5g

- Cloreto de Sódio

2,5g

- Cloreto de Mercúrio

1,25g

- Água Destilada

500mL

TÜRK, Solução para diluir leucócitos

- Ácido Acético Glacial

- Violeta Genciana 1%

- Água Destilada

15mL

10mL

1000mL

BRECHER, Solução para diluir plaquetas (Oxalato de Amônio 1%)

Oxalato de Amônio Água Destilada

2g

200mL

Teste de compatibilidade sangüínea em animais

Teste de compatibilidade sangüínea em animais Colher sangue do receptor e doador em frascos diferentes contendo

Colher sangue do receptor e doador em frascos diferentes contendo anticoagulante EDTA ou com citrato a partir da bolsa (doador) CUIDADO: evitar hemólise Determinar Ht e PPT do receptor e do doador

1. Centrifugar o sangue do receptor e do doador

2. Separar o plasma e as hemácias do receptor e do doador

3. Lavar o concentrado de hemácias em salina por três vezes, desprezando o sobrenadante (250 L de sangue + 4 mL salina)

4. Preparar as suspensões de hemácias adicionando 2 gotas do concentrado em 3 mL de salina (solução 3 a 5%)

5. Misturar uma gota da suspensão de hemácias do receptor com três gotas do plasma do doador (Prova Menor)

6. Misturar uma gota da suspensão de células (ou 1 gota do concentrado) do doador com três gotas do plasma do receptor (Prova Maior)

7. Misturar por inclinação da lâmina, deixar na câmara úmida por 10 minutos e examinar em microscópio ou contra um fundo escuro.

8. Verificar se há aglutinação. Diferenciar a formação de Rouleaux da aglutinação verdadeira.

Verificação de hemólise. Preparar mais um tubo de cada uma das provas, conforme os itens 5 e 6. Homogeneizar e incubar os tubos a 37°C por 15’. Centrifugar e observar a ocorrência de hemólise. Realizar provas de autocontrole do receptor e do doador, misturando o plasma com a suspensão de cada animal. Animais doadores com aglutinação positiva no autocontrole devem ser retirados do programa de doação. Opcionalmente a formação de aglutinação macro pode ser realizada nos tubos ao invés das lâminas. Outros protocolos para provas de compatibilidade sanguínea podem ser obtidas em: Day, M. et al. Manual of canine and feline haematology and transfusion medicine. BSAVA, 2000. 320p.

Teste de aglutinação em salina

Teste de aglutinação em salina Diluir uma parte de sangue com 3 a 5 partes de

Diluir uma parte de sangue com 3 a 5 partes de solução salina em um tubo de ensaio (exemplo:20 microlitros de sangue em 100 microlitros de salina). Homegeneizar e pipetar uma gota para visualização entre lâmina e lamínula (preferencialmente 24x60mm). Aguardar 5 minutos em câmara úmida para visualizar a formação ou não de aglutinação. Não confundir coma formação de rouleaux. O teste positivo é indicativo de AHIM, porém o negativo não descarta a possibilidade da doença.

Pesquisa de células LE

Colher 20 mL de sangue

Deixar coagular a temperatura ambiente por 15 min

Incubar em banho-maria a 37 o C por 1h30min ou em temperatura ambiente por 2 a 3 horas

Esmagar o coágulo em peneira e depositar em um grau

Agitar em banho-maria a 37 o C por 15 minutos ou deixar a temperatura ambiente por 1 hora

Com uma pipeta flexível, preencher tubos de Wintrobe

Centrifugar a 2.000rpm por 10 minutos

Desprezar o soro e fazer várias lâminas da capa leucocitária

Corar e observar ao microscópio

Encontrar pelo menos três células LE típicas para dar o resultado como positivo. A presença de várias rosetas é apenas sugestiva de um processo imunomediado.

Fibrinogênio pelo método do refratômetro (precipitação pelo calor)

Preencher dois capilares de microhematócrito

Calibrar o refratômetro com água destilada (em 1.000)

1ª leitura do microhematócrito = PPT

Banho-maria a 56-58°C por 3’ (desnaturação do FBG)

Centrifugação a 12.000rpm por 3’

2ª leitura = PPT - FBG

FBG (g/dL) = PPT – 2ª leitura

Contagem de reticulócitos:

Contagem de reticulócitos:  Misturar partes iguais de s angue e um corante supra-vital (Azul de

Misturar partes iguais de sangue e um corante supra-vital (Azul de cresil brilhante ou

Novo azul de metileno)

Incubar em banho-maria a 37 o C por 10-15 minutos

Confeccionar um esfregaço espesso

Contracorar com corante de rotina hematológico

Contar 500 hemácias e estabelecer a % de reticulócitos

Contagem corrigida de reticulócitos:

Contagem obtida x VG do animal VG médio normal para a espécie

VG normal: cão - 45%; gato – 37%

Contagem absoluta de reticulócitos:

Contagem obtida (%) x número de hemácias por microlitro

100

Azul de cresil brilhante:

Azul de cresil brilhante

1g

Citrato de sódio P.A.

0,4g

Solução fisiológica q.s.p.

1000mL

Novo azul de metileno:

Novo azul de metileno

0,5g

Oxalato de potássio

1,6g

Água destilada q.s.p.

100mL

OU Novo azul de metileno

0,5g

Solução salina 0,85% q.s.p. 100mL Formalina – 1 mL:100mL

Hematologia comparada

Hematologia comparada As contagens de hemácias, leucócitos e trombócitos de aves, répteis, peixes e anfíbios são

As contagens de hemácias, leucócitos e trombócitos de aves, répteis, peixes e

anfíbios são realizadas em uma única solução, sendo necessário e sempre que possível,

que a diferenciação entre os tipos celulares seja feita pela morfologia na câmara de

Neubauer.

Solução de Azul de Toluidina:

Sol. Estoque: 0,1 g de azul de toluidina em 100 mL de solução fisiológica (salina 0,9%)

Diluir 1 parte da sol. estoque para 9 de salina e filtrar imediatamente antes do uso.

Solução de Natt & Herrick:

NaCl 38,8g

Na 2 SO4 2,5g

Na 2 HPO4.12H2O 2,91g

KH 2 PO4 0,25g

Formalina 37% 7,5mL

Metil violeta 2B 0,10g

H 2 O destilada 1000 mL q.s.p.

pH da solução= 7,3

Qualquer que seja a solução diluidora, a diluição costuma ser feita na proporção de

1:100, a depender da espécie. As hemácias podem ser contadas em cinco quadrados

centrais menores e os leucócitos e trombócitos nos quatro laterais maiores. Opcionalmente

podem-se preencher os dois lados da câmara para a realização de duas contagens e

obtenção de uma média.

Fator para a multiplicação de hemácias = 5.000 (100 da diluição; 10 da altura da

câmara e 5 para a correção da área de 1 mm 2 )

Fator para a multiplicação de leucócitos e trombócitos = 250 (100 da diluição; 10 da

altura da câmara e 1/4 para a correção da área de 1 mm 2 )