121

INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLGICAS

EVALUACIN DE LA CONCENTRACIN DE
ARSNICO EN AGUA EMPLEANDO BIOSENSORES
MICROBIANOS
T E S I S

QUE P AR A OBT E NE R E L GR ADO DE :
MAESTRO EN CIENCIAS QUIMICOBIOLGICAS
P R E S E N T A

Q.B.P OLIVER VALENZUELA ROSAS

Directoras de Tesis

Dra. Enriqueta F. Amora Lazcano
Dra. Sofa E. Garrido Hoyos
MXICO, D.F. 2010

El presente trabajo se realiz en el Laboratorio de Bioqumica Microbiana
y el Laboratorio de Fitopatologa del departamento de Microbiologa en la
Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas, bajo la direccin de la Dra.
Enriqueta Feliciana Amora Lazcano y la Dra. Sofia Esperanza Garrido
Hoyos.
El sustentante fue becario del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa
(CONACyT), en el periodo de Febrero 2008 a Diciembre 2009 y del
Programa Institucional de Formacin de Investigadores (PIFI) durante el
mismo periodo.
Este trabajo fue financiado por la Secretara de Investigacin y Posgrado
(SIP) mediante los proyectos SIP-20080976 y SIP-20090553 para la Dra.
Enriqueta Feliciana Amora Lazcano; para la Dra. Sofa Esperanza
Garrido Hoyos el proyecto SEP/CONACYT- 2004-C01-47076.

AGRADECIMIENTOS

Dra. Enriqueta Amora Lazcano por la confianza y paciencia depositada en m para la
realizacin de este proyecto y por ser ms que mi maestra, mi segunda mam en todos
estos aos.

Dra. Sofa Garrido Hoyos por compartir sus conocimientos conmigo y por confiar en m a
pesar de no conocerme tanto.

Dra. Thelma Villegas Garrido por la valiosa ayuda proporcionada para la interpretacin de
mis resultados

A los sinodales por todas las observaciones realizadas a mi trabajo y los consejos
proporcionados a lo largo de este tiempo.

A mis compaeros, Selene, Claudia, Denisse, Francisco, Hctor, J osam y Ariana.

A la nueva familia que me recibi con los brazos abiertos en su laboratorio Prof.
Cristina, Dr. Luis, Prof. Isaac, Prof. J os Luis y David.

i

NDICE GENERAL

ndice general i
ndice de figuras iv
ndice de tablas vii
Abreviaturas viii
Glosario ix
Resumen x
Abstract xi

I. Introduccin.

1.1 El Arsnico 1
1.2 Caractersticas qumicas 1
1.3 Qumica del arsnico en el agua 2
1.4 Ciclo del arsnico 4
1.5 Fuentes ambientales de exposicin 6
1.6 Efectos txicos del arsnico en el hombre 7
1.6.1 Toxicocintica 7
1.6.2 Absorcin 7
1.6.3 Distribucin 7
1.6.4 Biotransformacin 8
1.6.5 Excrecin 9
1.6.6 Toxicodinamia 9
1.7 Mecanismos de toxicidad 10
1.8 Efectos adversos 10
1.8.1 Efectos agudos 10
1.8.2 Efectos crnicos 11
1.9 Presencia del arsnico en agua en diferentes estados
de la Repblica Mexicana 12
II. Antecedentes 14

2.1 Mtodos de anlisis del arsnico en el agua 14
2.1.1 Mtodos convencionales 14
2.1.2 Mtodos no convencionales 15

ii

2.1.2.1 Wagtech Arsenator digital 15
2.1.2.2 Biosensores 16
2.1.2.2.1 Genes reporteros y usos 18
2.1.2.2.2 Ventajas y desventajas 22
2.1.2.3 Biosensor para la deteccin de Arsnico en agua
(E. coli modificada) 22
2.1.2.3.1 Construccin de los biosensores 24
2.1.2.3.2 Fundamento de los biosensores 27

III. Justificacin 30

IV. Objetivos generales 31
4.1 Objetivos particulares 31

V. Materiales y mtodos. 32

5.1 Muestra biolgica 32
5.2 Medio de cultivo empleado 32
5.3 Solucin patrn de arsnico 32
5.4 Muestras 32
5.5 Verificacin de la pureza de las cepas 35
5.6 Conservacin de las cepas 36
5.7 Cuantificacin de arsnico en muestras de agua utilizando
la cepa de E. coli pMV132-arsR-ABS 36
la cepa de E.coli pJAMA-arsR-ABS 39
5.9 Cuantificacin de arsnico en agua por espectrofotometra en lnea de absorcin
atmica con generacin de hidruros 40
5.10 Cuantificacin de arsnico en agua utilizando
el Wagtech Arsenator Digital 41
5.11 Prueba semicuantitativa para la deteccin de arsnico en agua
en muestras de campo 42
5.12 Parmetros estadsticos empleados 43

iii

VI. Resultados 44

la cepa de E. coli pMV132-arsR-ABS 44
la cepa de E.coli pJAMA-arsR-ABS 46
6.3 Cuantificacin de arsnico en agua por espectrofotometra en lnea de absorcin
atmica con generacin de hidruros 48
6.4 Cuantificacin de arsnico en agua utilizando
el Wagtech Arsenator Digital 48
6.5 Comparacin de los mtodos utilizados para evaluar la concentracin de
arsnico en agua 49
6.6 Concentraciones de las muestras problema 50
6.7 Prueba semicuantitativa para la deteccin de arsnico
en agua en campo 52

VII. Discusin 54
VIII. Conclusiones 60
IX Perspectivas 61
X. Anexo 62
XI. Bibliografa 69

iv

NDICE DE FIGURAS

Pgina
Figura 1

Estructura qumica del gas 2-cloroetenildicloroarsina (tomado de URL-1).

1
Figura 2

Representacin esquemtica de las estructuras qumicas que presenta el
arseniato (A) y arsenito (B) (tomado de URL-2, URL-3).

2
Figura 3

Diagrama pH-Eh de especies de arsnico en agua (Ferguson y Galvis, 1972).

3
Figura 4

Representacin esquemtica del ciclo del arsnico (modificado de
(Mukhopadhyay et al., 2002).

5
Figura 5

Origen del arsnico en restos minerales (tomado de (Liu et al., 2008).

6
Figura 6

Biotransformacin del arsnico inorgnico (modificado de Heck et al., 2009).

8
Figura 7

Lesiones hipercromicas causadas por el consumo de arsnico en agua por
periodos muy prolongados (Tomado de URL-5).

11
Figura 8

Estados de la Repblica Mexicana en la cual se han reportado concentraciones
de arsnico en fuentes de abastecimientos de agua potable que sobrepasan la
norma oficial.

13
Figura 9

Mtodo no convencional para la cuantificacin de arsnico de la marca Wagtech
Arsenator Digital Kit (tomado de URL-6).

15
Figura 10

Representacin esquemtica de los eventos celulares que dan lugar a la
expresin de la protena reportera; el analito pasa a travs de la membrana
celular y se une a una protena reguladora, activando la transcripcin y
traduccin del gen reportero, tras la adicin un sustrato externo se produce una
seal fcil de medir (tomado de Daunert et al., 2000).

17
Figura 11

Representacin esquemtica del opern de resistencia a arsnico, est
conformado por tres genes estructurales (arsA,arsB, arsC) y dos genes
reguladores (arsD , arsR).

23
Figura 12

Representacin esquemtica del plsmido de E. coli pMV132-arsR-ABS
(Stocker et al., 2003).

25
Figura 13

Representacin esquemtica del plsmido de E. coli pJ AMA-arsR-ABS (Stocker
et al., 2003).

26

v

Figura 14
Principio del biosensor de E. coli pJ AMA-arsR-ABS. (A) La protena ArsR regula
la expresin de los genes reporteros, esta se encuentra unida al sito operador/
promotor de arsR, cuando no hay presencia de arsnico. (B) Cuando se detecta
la presencia de arsnico; sta se une a ArsR cambiando la conformacin de la
protena, haciendo que esta se despegue del sitio operador /promotor para la
expresin de los genes reporteros (luxA, luxB y lacZ) (Stocker et al., 2003).

27
Figura 15

Representacin esquemtica de la reaccin que lleva a cabo la -galactosidasa
en presencia del ONPG (URL-7).

28
Figura 16

Reaccin que lleva a cabo la luciferasa en presencia de su sustrato (n-decanal).

29
Figura 17

Sistema ptico del luminmetro Fluoroskan Ascent Fl, Thermo Electron
Corporation.
29
Figura 18

Ubicacin topogrfica de las muestras manejadas en el estudio.

34
Figura 19

Mtodo qumico de la marca Wagtech Arsenator digital para la cuantificacin de
arsnico en agua.

40
Figura 20

Curva tipo de E. coli pMV132-arsR-ABS, el ensayo se llevo a cabo en un tiempo
de incubacin de 5 min a 28C con la adicin de SDS al 0.1%, los datos
mostrados son el producto de 3 rplicas del ensayo.

43
Figura 21


44
Figura 22


44
Figura 23

de incubacin de 10 min a 28C sin la adicin de SDS al 0.1%, los datos

45
Figura 24

Curva tipo de E. coli pJ AMA-arsR-ABS, la reaccin se llev a cabo en un tiempo
de incubacin una hora a 30C en agitacin, los datos mostrados son el
producto de 3 rplicas del ensayo.

46
Figura 25

Curva tipo de E. coli pJ AMA-arsR-ABS, la reaccin se llev a cabo en un tiempo
de incubacin de dos horas a 30C en agitacin, los datos mostrados son el

46
Figura 26

Curva tipo del espectrofotmetro de absorcin atmica, con diferentes
concentraciones conocidas de arsnico (0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 y 1.0 M),
las cuales fueron tratadas segn lo marcado en la norma oficial mexicana.
47

vi

Figura 27

Curva tipo de Wagtech Arsenator digital, la reaccin se llev a cabo en un
tiempo de incubacin una 20 min a 30C, los datos mostrados son el producto
de 3 rplicas del ensayo.

48
Figura 28A

Prueba semicuantitativa para la deteccin de arsnico en agua empleando tiras
de papel impregnadas con la cepa de E. coli pJ AMA-arsR-ABS a diferentes
concentraciones, A) 1.5 L clulas y 20 L Xgal (1mg/mL), B) 1.5 L clulas y
20 L Xgal (5mg/mL), C) 3 L clulas y 20 L Xgal (1mg/mL).
52
Figura 28B

Prueba semicuantitativa para la deteccin de arsnico en agua empleando tiras
de papel impregnadas con la cepa de E. coli pJ AMA-arsR-ABS a diferentes
concentraciones D) 3 L clulas y 20 L Xgal (5mg/mL), E) 9 L clulas y 20 L
Xgal (1mg/mL), F) 9 L clulas y 20 L Xgal (5mg/mL).
53

vii

NDICE DE TABLAS
Tabla 1
Comparacin de la toxicidad aguda de los compuestos arsenicales (Hamdi et
al., 2009).
10
Tabla 2 Protenas represoras, reacciones qumicas y mtodos de deteccin empleados
en biosensores celulares (modificado de Daunert et al., 2000).
19
Tabla 3A Muestras de agua recolectadas de distintos lugares de la Repblica Mexicana
y Guatemala.
33
Tabla 3B Muestras de agua recolectadas de distintos lugares de la Repblica Mexicana
y Guatemala.
34
Tabla 4 Comparacin de mtodos analticos, empleando pruebas inciales de
desempeo, con un nivel de confianza de p=0.05 con n-2 grados de libertad.
49
Tabla 5 Resultados obtenidos de las muestras problemas, mediante la interpolacin en
las curvas tipo para cada mtodo empleado.
50
Tabla 6 Promedio del porcentaje de recuperacin (%R) para cada uno de los mtodos
probados.
50

viii

ABREVIATURAS

A.C: Antes de Cristo.
As: Arsnico.
CNA: Comisin Nacional de Agua.
D.O: Densidad ptica.
DNA: Acido desoxiribonucleico.
EAA: Espectrofotometria de absorcin
atmica
Fe: Fierro.
FI-HG-AAS: Espectrofotometra de
Absorcin Atmica con Generacin de
Hidruros.
FMN: Flavina Mononucletido.
GFP: Protena Verde Fluorescente.
IMTA: Instituto Mexicano de
Tecnologa del Agua.
IPTG: Isopropil -D-
tiogalactopiransido.
L: Litro.
L: Luria .
mg: Miligramo.
mL: Mililitro.
OMS: Organizacin Mundial de la
Salud.
ONPG: o-Nitrofenil -D
Galactopiranosido.
PCR: Reaccin en Cadena de la
Polimerasa.
pH: Potencia de hidrogeno.
RNApol: RNA polimerasa.
rpm: Revoluciones por minuto.
SDS: Dodecil Sulfato de Sodio.
URL: Localizador Uniforme de
Recursos.
RLU: Unidades Relativas de Luz.
g: Microgramo.
M: Micromolar.

ix

GLOSARIO

Carcinognico: Sustancia o agente fsico que puede causar cncer.

Carcinoma: Es una forma de cncer con origen en clulas de tipo epitelial o
glandular, de tipo maligno.

Cianosis: La cianosis es la coloracin azulada de la piel o de las membranas
mucosas causada por una deficiencia de oxgeno en la sangre.

Edema: Acumulacin de lquido en el espacio tisular intercelular o intersticial,
adems de en las cavidades del organismo.

Hiperemia: Aumento en la irrigacin a un rgano o tejido.

Hiperqueratosis: Trastorno caracterizado por el engrosamiento de la capa externa
de la piel, que est compuesta de queratina.

Hipoproteinemia: Disminucin de la concentracin de protenas en la sangre.

Hipovolemia: Disminucin del volumen circulante de sangre debido a mltiples
factores como hemorragias, deshidratacin, quemaduras, entre otros.

Mutagnico: Sustancia o agente fsico que causa mutaciones, es decir, que altera de
forma permanente el DNA de las clulas.

Sorcin: Retencin de una sustancia por otra cuando estn en contacto

Teratognico: Cualquier sustancia que produzca defectos de nacimiento no
hereditarios.

x

RESUMEN

El origen ms comn del arsnico es la oxidacin de minerales con un alto contenido en este
elemento, como pueden ser, la arsenopirita, la escorodita y la orpimenta que pueden
aparecer en diferentes ambientes geolgicos. La toxicidad del arsnico es conocida a travs
de reportes epidemiolgicos de cnceres y problemas como la enfermedad de pie negro y
lesiones cutneas, relacionados con la exposicin crnica a arsnico en agua para uso y
consumo humano. En Mxico se han identificado concentraciones de arsnico en fuentes de
abastecimiento de agua que alcanzan valores de 2.348 mg/L, rebasando el lmite mximo de
la Norma Oficial Mexicana, 0.025 mg/L. Existen mtodos para la cuantificacin de arsnico
en agua como la espectrofotometra de absorcin atmica, Kits comerciales y el uso de
biosensores. El objetivo de este trabajo es implementar los biosensores microbianos
(Escherichia coli) por medio de tcnicas que nos permitan la cuantificacin de arsnico en
muestras de agua de diversos orgenes. Se emplearon cepas transformadas de cepas E. coli
pMV132-arsR-ABS y E. coli pJ AMA-arsR-ABS la cual tienen insertado un plsmido que les
confiere resistencia a la ampicilina as como genes reporteros que codifican para la -
galactosidasa y luciferasa respectivamente. Se determinaron las condiciones ptimas de
operacin en base a una serie modificaciones a mtodos propuestos por Stocker y Van Der
Meer empleando soluciones conocidas de arsnico (0. 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 y 1.0 M),
posteriormente se evaluaron estos mtodos junto con EAA y Wagtech Arsenator digital
mediante un anlisis estadstico, encontrndose que el EAA y Wagtech Arsenator digital
presentan mayor sensibilidad as como intervalo de trabajo ms amplio y dems no
presentan ningn tipo de efecto matriz en comparacin con los biosensores probados. Sin
embargo a pesar de estas desventajas se encontr que estos mtodos basados en
biosensores presentaron un porcentaje de recuperacin alta con muestras problemas
recolectas en diferentes puntos de la repblica mexicana y Ciudad de Mxico, lo que indica
que estos pueden ser empleados como mtodos alternativos para la cuantificacin de
arsnico de agua, los cuales no generan productos txicos y son menos costosos. Adems
se monto una prueba semicuantitativa con la cepa E. coli pMV132-arsR-ABS, sometindola a
una mezcla de diferentes soportes, los cuales ayudan al microorganismo a sobrevivir al
estrs tras la desecacin despus de colocarlos en tiras de papel Whatman 3M, estas
mismas fueron sometidas a concentraciones de arsnico conocidas (0. 0.05, 0.1, 0.2, 0.4,
0.6, 0.8 y 1.0 M), encontrndose una buena respuesta con 3L de clulas y 20 L de Xgal
5mg/mL

xi

ABSTRACT

The most common source of arsenic is the oxidation of minerals with a high content of this
element, for example, arsenopyrite, scorodite and orpimenta that may appear in different
geological environments. The toxicity of arsenic is known through epidemiological reports of
cancers and problems such as black foot disease and skin lesions associated with chronic
exposure to arsenic in water for human use and consumption. In Mexico has found
concentrations of arsenic in water sources that reach values of 2.348 mg / L, exceeding the
ceiling of the Norma Oficial Mexicana, 0.025 mg / L. There are methods for the quantification
of arsenic in water as atomic absorption spectrophotometry, commercial kits and the use of
biosensors. The aim of this work is to implement the microbial biosensors (Escherichia coli)
by means of techniques that allow us the quantification of arsenic in water samples from
different origins. We used E. coli pMV132-arsR-ABS y E. coli pJ AMA-arsR-ABS strains
transformed, which they have inserted a plasmid that confers resistance to ampicillin and
reporter genes coding for -galactosidasa and luciferase, respectively. We determined the
optimum operating conditions based on a number changes to methods proposed by Stocker
and Van Der Meer using known solutions of arsenic (0. 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 y 1.0 M),
these methods were subsequently evaluated with EAA and Wagtech Arsenator digital by
statistical analysis, finding that the EAA and Wagtech Arsenator digital have greater
sensitivity and broader range of work and others do not have any effect compared with the
parent biosensor tested. However was found that methods based of biosensors showed a
high recovery rate problems with samples collected at different points of the Mexican
Republic and Mexico City, indicating that these can be used as alternative
methods quantification of arsenic in water, dont generate toxic compounds and less
expensive. In addition, a test amount with the strain semiquantitative E. coli pMV132-arsR-
ABS, subjecting a mixture of different materials, which help the organism to survive the stress after
drying after they are placed on strips of Whatman 3M paper, the same were subject to known
concentrations of arsenic (0. 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 y 1.0 M), found a good answer with
3L cells and 20 L of 5 mg / ml Xgal.

1

1. INTRODUCCIN

1.1 El Arsnico
Los compuestos arsenicales tienen una larga historia como agentes
medicinales y venenos. Su uso fue descrito desde el ao 400 A.C por
Hipcrates, quien recomend la aplicacin de una pasta (AsS) para tratar
ulceras cutneas. Durante la edad media, el arsnico blanco (trixido de
arsnico) fue el veneno de eleccin, debido a su alta toxicidad. Durante la
primera guerra mundial, se desarrollaron y utilizaron como armas qumicas los
gases arsenicales, entre ellos el gas Lewisita (Fig. 1) (2-
cloroetenildicloroarsina), que es un potente agente vesicante, irritante local y
txico sistmico (Liu et al., 2008).
A principios del siglo pasado, los arsenicales orgnicos se emplearon para
combatir enfermedades como la tripanosomiasis y la sfilis mientras que
algunos compuestos de arsnico inorgnico, se usaron para el tratamiento de
enfermedades pulmonares. Su uso medicinal esta actualmente limitado a
casos avanzados de la enfermedad del sueo y como componente de drogas
antiparasitarias de uso tpico (Liu et al., 2008).

1.2 CARACTERSTICAS QUMICAS DEL ARSNICO

El arsnico (As) es un elemento ubicuo, est clasificado como metaloide que
junto con el nitrgeno y el fosforo, con los que comparte propiedades,
pertenece al grupo V de la tabla peridica. En el estado oxidado, el As puede
tener las valencias +3 [As(III)] y +5 [As(V)](Georgiadis et al., 2006).
Fig 1 Estructura qumica del gas 2-cloroetenildicloroarsina (tomado de URL-1)

2

Los compuestos de As (III) forman derivados piramidales con un par de
electrones no compartidos, lo que le permite formar complejos con cidos de
Lewis y metales de transicin. En contraste, los compuestos de As (V) tienen
una estructura trigonal bipiramidal, en los cuales los enlaces suelen ser ms
largos. El As (V) no tiene electrones no compartidos, lo que probablemente
contribuye a su estabilidad en la naturaleza (Fig.2) ( Georgiadis et al., 2006).

1.3 QUMICA DEL ARSNICO EN EL AGUA

El arsnico puede estar presente en cuatro estados de oxidacin en el agua;
segn las condiciones de xido-reduccin, como arseniato (As
5+
), arsenito
(As
3+
), arsina (As
3-
) o su estado elemental (As
0
), pero generalmente se
encuentra en las formas trivalente y pentavalente.

Su carcter qumico est determinado por el hecho de que cambia
rpidamente de un estado de oxidacin a otro, a travs de reacciones qumicas
o biolgicas que ocurren en el ambiente. As, el control del equilibrio en la
solubilidad y movilidad del arsnico depende de las condiciones de oxido-
reduccin, el pH y la actividad biolgica (Ferguson & Galvis, 1972). La
especiacin del arsnico en el agua, se muestra en la Figura 3, que presenta
las diferentes especies de arsnico en funcin del pH y el potencial redox.

A
B
Fig. 2 Representacin esquemtica de las estructuras qumicas que presenta el arseniato (A)
y arsenito (B) (tomado de URL-2, URL-3).

3

En la construccin de este diagrama se asume una sola fase (agua), siendo los
nicos componentes el arsenato, el arsenito y los iones hidrgeno. Un aspecto
sobresaliente del diagrama es que el As (III) se presenta como una especie
soluble sin carga en el intervalo de pH neutro y el As (V) como anin para todo
el intervalo de pH.

Las reacciones cidobase del arsnico son muy rpidas, pero las de xido-
reduccin son lentas, a menos que se aplique un oxidante fuerte. Las
investigaciones demuestran que el As (III) es estable por varios das en
presencia de oxgeno, es decir, a un potencial redox lo suficientemente alto
para causar la oxidacin espontnea a As (V), por lo que esta se lleva a cabo
lentamente. En aguas que contienen oxgeno, el As (V) es predominante,
existiendo en formas aninicas como H
2
AsO
4
-
, HAsO
4
2-
o AsO
4
3-
en el pH
comn del tratamiento de agua (pH 5-12).

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
-0, 20
-0, 40
-0, 60
-0, 80
Eh (volts)

3
H AsO
3
-3
AsO
2 3
H AsO
-
4
HAsO
=
-
4
H AsO
2
4
H AsO
3
3
HAsO
=
tot
AGUA CON PODER OXIDATIVO
AGUA CON PODER REDUCTIVO
pH
AsO
4
-3
3
Fig. 3 Diagrama pH-Eh de especies de arsnico en agua (Ferguson y Gal vis, 1972).

4

Bajo condiciones anxicas, el As (III) es estable, con especies no inicas
(H
3
AsO
3
) y aninicas (H
2
AsO
3
-
), las cuales predominan por arriba y por debajo
de un pH de 9.22, respectivamente. Soluciones fuertemente cidas o alcalinas,
as como la presencia de sales de cobre, carbn o altas temperaturas pueden
incrementar la tasa de oxidacin (Ferguson & Galvis, 1972).

Sustancias como el cloro, el xido de manganeso, el permanganato y otro tipo
de oxidantes pueden transformar directamente el As (III) en As (V) en ausencia
de oxgeno. Dentro de zonas oxigenadas, el As (V) es estable y puede
permanecer en solucin o coprecipitar con xidos de hierro o manganeso si
stos se encuentran presentes. Altas concentraciones de ortofosfatos pueden
competir con el As (V) por los sitios de sorcin en esta zona, incrementando las
concentraciones de arsnico soluble, as como su movilizacin (Ferguson &
Galvis, 1972).

La principal va de dispersin del arsnico en el ambiente es el agua. An si se
considera la sedimentacin, la solubilidad de los arseniatos y arsenitos es
suficiente para que este elemento se transporte en los sistemas acuticos. La
concentracin del arsnico en aguas naturales frescas es muy variable y
probablemente depende de las formas de arsnico en el suelo (URL-4).

1.4 CICLO DEL ARSNICO
Las industrias que son la mayor fuente de contaminacin al ambiente con
arsnico son: la quema de carbn, la metalrgica y ms recientemente la de
los semiconductores; as como, la liberacin de minerales ricos en arsnico por
la industria minera (Fig. 4).

5

El arseniato es absorbido por organismos marinos que van desde el
fitoplancton, algas, crustceos, moluscos y peces; estos los convierten en
pequeos compuestos orgnicos (tales como: el acido metilarsonico el acido
dimetilarsinico) o se convierten en forma de depsitos orgnicos, los cuales
son excretados al medio (Mukhopadhyay et al., 2002).

Sin embargo, algo de ese arsnico es retenido por el fitoplancton que lo
metaboliza a compuestos orgnicos complejos. La transformacin del arsnico
inorgnico en compuestos liposolubles podra ser un mecanismo adaptativo
para el fitoplancton marino, compensando as la limitada disponibilidad de
nitrato. Algunas algas transforman los compuestos arsenicales en formas ms
complejas que son solubles en agua tal como los arsenosacridos
(dimetilarsenosacrido) o lpidos. Mientras que el fitoplancton y algunas
macroalgas son productores primarios de arsnico orgnico complejo

Fig 4 Representacin esquemtica del ciclo del arsnico (modificado de

6

Los peces y animales invertebrados acumulan el 99% del arsnico en su forma
orgnica; los tejidos de algunos crustceos y moluscos llegan a contener
concentraciones de arsnico ms altas que los peces. El compuesto de
arsnico orgnico ms comnmente aislado de organismos marinos en la
arsenobetana (Fig. 4). Este est presente en algas, almejas, langostas,
camarones y tiburones (Mukhopadhyay et al., 2002).

No se conoce cuantos arsenolpidos y arsenosacridos son convertidos en
arsenobetana en animales superiores marinos. Esta es degradada en los
sedimentos marinos por los microorganismos que la transforman acido
metilarsonico y arsnico inorgnico.

1.5 FUENTES AMBIENTALES DE EXPOSICIN

El arsnico se encuentra contenido en minerales como la arsenopirita (FeAsS),
la escorodita (FeAsO
4
2H
2
O) y la oropimenta (As
2
S
3
) (Fig. 5) las cuales se
encuentran en diferentes ambientes geolgicos (Peters & Blum, 2003; Scareck
et al., 2004); este elemento tambin puede ser liberado al ambiente por la
actividad volcnica, la erosin de depsitos minerales y por diversas
actividades humanas (Liu et al., 2008).

Fig. 5 Origen del arsnico en restos minerales (tomado de (Liu et al., 2008).
Oropimenta Arsenopirita

7

1.6 EFECTOS TXICOS DEL ARSNICO EN EL HOMBRE

1.6.1 TOXICOCINTICA
Las principales vas de entrada del arsnico al organismo son el tracto
gastrointestinal (TGI) por el consumo de agua y el respiratorio debido a la
aspiracin de aerosoles generados por la aspersin de plaguicidas o
compuestos que lo contengan. La absorcin por va drmica es baja y alcanza
solamente el 2% (Heck et al., 2009).
1.6.2 ABSORCIN
En los seres humanos, y en la mayora de las especies animales, la absorcin
de compuestos arsenicales a travs del TGI es alta (95%) cuando se
administran en solucin acuosa. La absorcin de arsnico por va respiratoria
depende del tamao de las partculas inhaladas, de su solubilidad y de la forma
qumica del compuesto. La principal forma qumica presente en el aire es el
As(III), el cual es de origen antropognico. Las partculas grandes se depositan
en vas superiores, son removidas por el movimiento ciliar y transportadas al
TGI, en donde son absorbidas dependiendo de su solubilidad. Las partculas
menores a 7 mm se absorben en un 75 a 85 % (Heck et al., 2009).
1.6.3 DISTRIBUCIN
Los compuestos arsenicales tienden a acumularse principalmente en hgado,
rin, pulmn y bazo. El As(III) se une preferentemente a los grupos sulfhidrilo
de las protenas como la queratina, por lo que se deposita en pelo y uas (Liu
et al., 2008, Heck et al., 2009).

8

1.6.4 BIOTRANSFORMACIN
El metabolismo del arsnico se realiza principalmente en hgado y, aunque su
mecanismo no est bien establecido, se propone que en l intervienen dos
procesos:
Reacciones de reduccin que convierten el As (V) en As (III),
Reacciones de metilacin oxdativa que transforman el As (III) en especies
metiladas (Fig. 6).
El proceso de metilacin propuesto es la reduccin del As (V) a As (III);
seguida, de la adicin del primer grupo metilo para obtener cido monometil-
arsnico (MMA); seguida de una reduccin de MMA(V) a MMA(III) antes de la
segunda metilacin, lo que produce el cido dimetil-arsinico (DMA). Se ha
propuesto a la S-adenosilmetionina como donador de los grupos metilo y al
glutatin reducido (GSH) como principal agente reductor transportador del
arsnico (Thomas et al., 2007).

Fig 6 Biotransformacin del arsnico inorgnico (modificado de Heck et
al., 2009)

9

Existen varios factores que pueden influir en la capacidad de metilacin del
arsnico, entre ellos: la dosis, el tiempo de exposicin y una dieta alta en
metionina y protenas azufradas.
Se ha encontrado un incremento significativo de DMA que son excretados en la
orina de individuos que han estado expuestos crnicamente a altas
concentraciones de arsnico en agua de consumo (Heck et al., 2009).
1.6.5 EXCRECIN
El arsnico se elimina principalmente por el rin en forma de DMA (50-70 %)
y un 20% se excreta sin metilar en la orina (Fig. 6). Las proporciones relativas
de As(III), As(V), MMA y DMA en la orina pueden variar, dependiendo de la
forma qumica, el tiempo de exposicin, la dosis y la especie animal expuesta
(Drobn et al., 2005, Liu et al., 2008).
En comparacin con el hombre, en la mayora de las especies animales la
excrecin de MMA es muy baja (<4 %) mientras que, en la rata, la retencin y
distribucin de arsnico difieren de las observadas en otras especies, pues la
mayora del DMA formado se une a los eritrocitos (Drobn et al., 2005).
1.6.6 TOXICODINAMIA
La toxicidad del arsnico es compleja pues depende de la va de exposicin,
del estado de valencia y de la forma qumica (inorgnica u orgnica) del
compuesto. El arsnico inorgnico es el responsable de la mayora de los
casos de intoxicacin en humanos. El gas Arsina es considerado como la
forma ms txica del arsnico, debido a que acta como un potente agente
hemoltico, sin embargo, este gas difcilmente alcanza niveles txicos en el
ambiente (Drobn et al., 2005). Generalmente las sales inorgnicas de As (III)
son mas toxicas que las de As (V) (Tabla 1) y la solubilidad de los compuestos
de arsnico inorgnico est relacionada con su toxicidad (Hamdi et al., 2009).

10

C Co om mp pu ue es st t o o D DL L
5 50 0
( (m mg g/ /K Kg g) ) A An ni i m ma al l / /V V a a
A Ar rs se en ni it to o d de e s so od di io o 4 4. .5 5 R Ra at ta a/ /i in nt tr ra ap pe er ri it to on ne ea al l
A Ar rs se en ni ia at to o d de e s so od di io o

1 14 4- -1 18 8
R Ra at ta a/ /i in nt tr ra ap pe er ri it to on ne ea al l
M MM MA A 1 1 8 80 00 0 R Ra at ta a/ /O Or ra al l
D DM MA A 1 1 2 20 00 0 R Ra at ta a/ /O Or ra al l
A Ar rs se en no ob be et ta ai in na a 1 1 0 00 00 00 0 R Ra at ta a/ /O Or ra al l
1.7 MECANISMOS DE TOXICIDAD
El mecanismo ms importante para explicar la toxicidad de los compuestos
arsenicales trivalentes es a travs de su afinidad por los grupos sulfhidrilo de
las protenas. Las enzimas son particularmente afectadas si el grupo SH est
ubicado en un sitio critico para su actividad. El As(V) puede substituir al grupo
fosfato en las reacciones que son catalizadas enzimticamente, afectando
procesos como la produccin del ATP y la sntesis del DNA; sin embargo, el
dao que produce es difcil de evaluar pues el As(V) se reduce a As(III) en el
organismo (Ratnaike.,2003).
1.8 EFECTOS ADVERSOS
1.8.1 EFECTOS AGUDOS
Los efectos caractersticos de la exposicin aguda al arsnico son alteraciones
gastrointestinales, cardiovasculares, nerviosas, renales y hepticas. Es posible
observar vasodilatacin e hiperemia, edema debido al dao capilar, con cada
de la presin arterial, lo que a menudo conduce a un estado de choque.
Tambin ocurre perdida de los movimientos voluntarios, confusin, psicosis,
delirio, coma y muerte. Otras manifestaciones incluyen cambios de la piel,
como hiperpigmentaciones y la aparicin de lneas transversales blanquesinas
en la uas. Algunos compuestos arsenicales, como el trixido de arsnico, son
muy irritantes (Ratnaike., 2003).

Tabla 1 Comparacin de la toxicidad aguda de los compuestos arsenicales (tomado de Hamdi
et al., 2009)

11

1.8.2 EFECTOS CRNICOS
Los efectos de la exposicin crnica al arsnico dependen de la va de
exposicin y se presentan en varios sistemas incluyendo piel, sistema
cardiovascular, vas respiratorias, rin, hgado y sistema nervioso. El arsnico
es un agente teratognico, mutagnico y carcinognico. Los efectos crnicos
ms importantes se resumen a continuacin (Ratnaike, 2003).
LESIONES CUTNEAS
La exposicin crnica al arsnico en el agua de consumo causa lesiones muy
caractersticas; se presentan hipocromas e hipercromas (Fig. 7)
principalmente en las partes no expuestas del cuerpo, hiperqueratosis
palmoplantar y papular en cualquier parte del cuerpo, as como lesiones
ulceradas compatibles con un diagnostico de carcinoma epidermoide (McCarty
et al., 2007, Rosen et al., 2009).

ALTERACIONES EN EL SISTEMA CARDIOVASCULAR
La exposicin crnica por inhalacin de compuestos de arsnico inorgnico
afecta el sistema cardiovascular, pues altera las contracciones del miocardio y
causa arritmias cardiacas. Se presentan dilatacin e incremento de la
permabilidad capilar, lo que ocaciones hipovolemia, hipoproteinemia.
Fig. 7 Lesiones hipercromicas causadas por el consumo de arsnico en agua por
periodos muy prolongados (URL-5).

12

En poblaciones expuestas a arsnico en el agua de consumo en Taiwan (Lui et
al., 2003); Estados Unidos (Peters y Blum, 2003) y la India (Ahmed et al., 2004)
se han descrito efectos vasculares perifricos caracterizados por cianosis y
prdida progresiva de la circulacin en las extremidades, que pueden finalizar
en gangrena seca, mejor conocida como enfermedad del pie negro (States et
al., 2009).
MUTAGENICIDAD Y CNCER
El arsnico inorgnico est clasificado por la Agencia Internacional de
Investigacin sobre el Cncer (IARC) como un agente carcinognico. Los
trabajadores expuestos a arsnico por va area presentan un incremento en
cncer de pulmn, mientras que la exposicin oral a arsnico incrementa el
riesgo de presentar cncer de piel, aunque tambin se presentan tumores en
vejiga, rin, hgado y pulmn (Liu et al., 2008, States et al., 2009, Heck et al.,
2009).
1.9 PRESENCIA DEL ARSNICO EN AGUA EN DIFERENTES ESTADOS DE
LA REPBLICA MEXICANA

En Mxico (Fig. 8) se han identificado concentraciones de arsnico en fuentes
de abastecimiento de agua potable (Baja California Sur, Chihuahua, Coahuila,
Durango, Guanajuato, Hidalgo y Morelos) que alcanzan valores de 2.348 mg/L,
rebasando el lmite mximo permisible de la Norma Oficial Mexicana, 0.025
mg/L (NOM-127-SSA1-1994; CNA, 2000).

13

Se estima que alrededor de 500,000 habitantes de las zonas rurales que
habitan los estados anteriormente nombrados se encuentran expuestos a
concentraciones de arsnico mayores de 0.05 mg/L por el agua que ingieren
(Del Razo, et al., 1990; Cebran et al., 1994; Rodrguez et al., 1996).

Fig. 8 Estados de la Repblica Mexicana en la cual se han reportado concentraciones de
arsnico en fuentes de abastecimientos de agua potable que sobrepasan la norma oficial.

14

2 ANTECEDENTES

2.1 MTODOS DE ANLISIS DEL ARSNICO EN AGUA

2.1.1 MTODOS CONVENCIONALES

La espectroscopia en lnea de absorcin atmica con generacin de hidruros
(Flow injection hybride generation atomic absortion spectroscopy, FI-HG-AAS),
la cual se basa en la conversin del As
+3
a un hidruro voltil en presencia de
borohidruro de sodio, el hidruro generado es arrastrado por una corriente de
gas inerte (argn nitrgeno) a una celda de cuarzo a temperatura elevada en
la que se realiza la atomizacin de la muestra, de esta manera los tomos
tienen la capacidad de absorber una cantidad discreta de energa luminosa de
una sola longitud de onda (193,7 nm), siendo esta proporcional a la
concentracin de arsnico presente en la muestra (NOM-117-SSA1-1994).

Los mtodos con kits comerciales ms utilizados son: 1) Arsen-test (Merck) el
cual trabaja a concentraciones menores de 10 g/L o mayores de 100 g/L.
Adems, durante su desarrollo se produce gas de arsina que es muy txico.
La parte ms dbil de ste mtodo es la escala de color y los tubos de reaccin
que son de cristal. 2) Hach, tiene una gama de colores ms amplia y la escala
de concentraciones es entre 10 y 70 g/L. Los tubos de reaccin tienen una
tapa, la cual atrapa el gas arsina producido en la determinacin (Erickson,
2003).

15

2.1.2 MTODOS NO CONVENCIONALES

2.1.2.1 Wagtech Arsenator digital

El Wagtech Arsenator digital (Fig. 9) permite determinar concentraciones de
arsnico en un intervalo de 2-100 g/L. A concentraciones mayores de 100
g/L se realiza por comparaci n de tonalidad con una carta estndar de
colores (100-500 g/L).
El equipo utiliza dos reactivos A1 (cido sulfmico en polvo) y A2 (borohidruro
de sodio en tableta); dos filtros de prueba, uno en el frasco con etiqueta negra
el cual est revestido de bromuro de mercurio y el otro en el frasco con
etiqueta roja que contiene un filtro revestido con yoduro de potasio que acta
como depurador y absorbente del exceso de gas arsina liberado en la reaccin.
La prueba se realiza en un recipiente de reaccin cerrado y el mtodo qumico
se basa en una variacin del mtodo Gutzeit, que consiste en reducir el
arsnico (V) a arsnico (III) con el cido sulfmico (Reactivo A1) ya que el
arsnico presente en la muestra puede encontrarse en estado de oxidacin (III)
y/o (V) y no puede medirse en su forma soluble; posteriormente, se agrega el
borohidruro de sodio generndose la arsina por accin del hidrgeno
proveniente de los compuestos arsenicales. La arsina reacciona con un papel
recubierto de bromuro de mercurio (Br
2
Hg) formando complejos coloridos.
(Erickson, 2003).

Fig 9 Mtodo no convencional para la cuantificacin de arsnico de la marca Wagtech
Arsenator Digital Kit (tomado de URL-6)

16

2.1.2.2 BIOSENSORES

Un biosensor bioreportero es un dispositivo de medicin que est
conformado por un componente de deteccin biolgico que es capaz de
reconocer cambios fsicos o qumicos, unido o acoplado a un elemento de
transduccin que produce una seal medible en respuesta a cambios en el
ambiente (Daunert et al., 2000). Los biosensores pueden clasificarse en tres
tipos, basados en el componente de deteccin:
Moleculares
Celulares
Tisulares

Los biosensores moleculares utilizan componentes subcelulares
macromolculas como elementos de deteccin. Estos elementos incluyen
anticuerpos, cidos nucledos, enzimas, canales inicos y bicapas lipidicas.
Los biosensores basados en tejidos y clulas, se obtienen a partir de aislados
de clulas enteras (bacterias, animales, plantas) o tejidos intactos (Daunert et
al., 2000).

Las ventajas de los biosensores moleculares, son su alta especificidad,
selectividad y reaccin rpida. Sin embargo, estos sistemas no proveen
informacin verdica sobre la biodisponiblidad del analito. Por otra parte, la
extraccin y aislamiento de macromolculas acorta su vida, las cuales pueden
ocasionar reacciones (Daunert et al., 2000).

A travs de la ingeniera gentica, los biosensores celulares, pueden presentar
una alta especificidad y selectividad por el analito y ser estables en diversos
ambientes, incluyendo variaciones en el pH y temperatura. Una de las ventajas
de estos sistemas es su capacidad de proporcionar datos fisiolgicos
importantes en respuesta al analito, as como su biodisponibilidad (Daunert et
al., 2000).

17

Los biosensores tisulares se componen de varios tipos de clulas, estos
proporcionan datos funcionales del analto, sin embargo este tipo de sistemas
son generalmente menos estables y por lo tanto su aplicacin es limitada
(Daunert et al., 2000). Los biosensores celulares se pueden clasificar de
acuerdo a la respuesta al elemento de deteccin, como son: cambios en el
metabolismo celular, pH, expresin de genes alterados en organismos
genticamente modificados.

Estos biosensores basados en la tecnologa del DNA recombinante, puede
provocar una respuesta en presencia del analito por medio del acoplamiento de
los genes de deteccin con un reportero por medio de una fusin de genes, la
cual producir una seal fcil de medir (Daunert et al., 2000).

Los genes de deteccin estn compuestos por protenas reguladoras y
secuencias promotoras de DNA cromosmico o plasmidico. La especificidad de
estos elementos por el analito, confiere selectividad al sistema, mientras que la
protena reportera determina el lmite de deteccin y sensibilidad. Como
observamos en la figura 10, el analito disponible pasa a travs de la membrana
celular, por transporte activo o pasivo y se une a la protena reguladora,
activando as la transcripcin del gen reportero que se traduce el mRNA, dando
as una protena reportera, esta genera una seal en presencia del sustrato
estimulo externo (Daunert et al., 2000).

Fig.10 Representacin esquemtica de los eventos celulares que dan lugar a la expresin de la
protena reportera; el analito pasa a travs de la membrana celular y se une a una protena
reguladora, activando la transcripcin y traduccin del gen reportero, tras la adicin un sustrato
externo se produce una seal fcil de medir (tomado de Daunert et al., 2000).

18

2.1.2.2.1 GENES REPORTEROS Y USOS

La expresin de genes reporteros produce una seal fcil de medir, que puede
ser distinguida de la actividad de protenas endgenas. Para usos analticos,
los genes reporteros o sus respectivas protenas a menudo se unen a
elementos de deteccin que reconocen al analito y as confiere selectividad al
sistema, mientras que las protenas reporteras producen seales, las cuales se
pueden medir, confindole una alta sensibilidad. Estos elementos de deteccin
pueden ser enzimas, receptores, anticuerpos (Daunert et al., 2000, Van Der
Meer et al., 2004).

Para que un gen pueda ser usado como reportero, es necesario que cumpla
algunas condiciones; primero, la cuantificacin actividad de su expresin
tiene que ser llevado a cabo usando un ensayo simple. Segundo, la cantidad o
actividad de la protena represora tiene que ser el reflejo del analito estudiado.

Se han desarrollado biosensores celulares con genes reporteros en el estudio
de una amplia variedad de analitos endgenos y exgenos; estos incluyen
metales pesados tales como el antimonio, arsnico, mercurio, cadmio, cobalto,
nquel, cromo, cobre y zinc; tambin compuestos orgnicos (benceno, tolueno,
xileno, naftaleno), antgenos virales bacterianos que afectan el aparato
respiratorio del hombre y por ultimo una variedad de sustancias endgenas
que incluyen azucares y aminocidos. A continuacin mencionaremos los
genes reporteros ms usados en biosensores celulares (Daunert et al., 2000).

Cloranfenicol transferasa (CAT)

El CAT es derivado de Escherichia coli, esta fue la primera de las protenas
usadas como reporteros en el monitoreo de la transferencia de genes, as
como identificar y medir mecanismos moleculares de toxicidad asociados a
carcingenos (Daunert et al., 2000).

19

-galactosidasa (-gal)

Proveniente de Escherichia coli, la -gal, esta codificada por el gen lac z; la
enzima cataliza la hidrlisis de -galactsidos. La -gal es usada como
protena reportera que ha sido utilizada en el estudio de la transcripcin y
traduccin gentica. Se han desarrollado biosensores con este gen reportero,
el cual ha permitido identificar una variedad de analitos que incluyen metales
pesados, sales toxicas, en ambientes naturales (Daunert et al., 2000).

Por medio de la cristalografa de rayos x se ha identificado que la -gal es un
tetrmero compuesto por un 40% de -plagadas, 35% de -hlices, 13% de
espirales y un 12 % de horquillas aleatorias. Existen varios mtodos de
deteccin de para la -gal, entre las cuales tenemos mtodos colorimtricos,
histoqumicos, fluorescentes, luminiscentes y electroqumicos (Tabla 2).

Las estrategias de deteccin dependen del sustrato usado, el ms empleado
es el ONPG (o-nitrofenil -D-galactopiransido) para la deteccin colorimtrica.
Tambin tenemos al Xgal (5-bromo-4-cloro-3-indolil -galactsido) que est
adaptado principalmente a mtodos de deteccin histoqumicos (Daunert et al.,
2000).
hv COOH R O H FMN O CHO R FMNH + + + + + 2 2 2
CoA diacetil CoA acetil acetil
acetil CoA CAT acetil
CoA CAT acetil acetil CAT
CAT 3 , 1 CAT 1
CAT 1 3
3 CoA
+ +
+
+ +
Tabla 2 Protenas represoras, reacciones qumicas y mtodos de deteccin empleados en
biosensores celulares (modificado de Daunert et al., 2000).

20

Luciferasa bacteriana (Lux)

Luciferasa es el nombre genrico para la enzima que cataliza la reaccin de
emisin de luz. Esta liberacin de luz es llevada a cabo por algunos
organismos que contienen a esta enzima. El trmino para describir este
fenmeno se le conoce como bioluminicencia. Los organismos bioluminicentes
incluyen bacterias, algas e insectos entre otros. En este caso nos enfocaremos
a la biolumicencia bacteriana, en el que hay tres gneros representativos:
Vibrio, Photobacterium y Xenorhabdus. La luciferasa bacteriana cataliza la
oxidacin de la flavina mononucleotida reducida (FMNH
2
) a monoflavina
oxidada (FMN) en presencia de aldehdos grasos de cadena larga y
transformndola en oxigeno. Esta reaccin da como resultado la emisin de
una luz azul-verdosa.

Todas la luciferasa bacterianas son protenas heterodimricas, compuestas por
dos subunidades, una (40KDa) y una (37KDa) cuya secuencia de
aminocidos puede variar hasta un 45% y 55% entre especies bacterianas.
(Daunert et al., 2000, Meighen., 1991).

Las subunidades y de la luciferasa bacteriana son codificadas por los
genes luxA y luxB respectivamente, localizandose en el opern lux, donde
adems estn tres genes adicionales (luxC, luxD, luxE) que codifican
protenas asociadas para formar una reductasa para la sntesis de cidos
grasos as como su reciclado. Estos cinco genes estn conservados en todas
las especies identificadas de este grupo bacteriano. La expresin de los genes
luxA y luxB en una clula hospedera, es suficiente para una seal de
bioluminicencia, sin embargo la expresin de los cinco genes representa una
ventaja ya que no se requiere de la adicin de un sustrato (Meighen, 1991).

21

Al fusionar el opern lux con sus respectivos promotores y la expresin del
mismo en clulas hospederas ha permitido aplicar como un marcador de
exposicin de algunos contaminantes como metales pesados, compuestos
orgnicos y el ion nitrato, en bioensayos con clulas completas. Aunque la
luciferasa bacteriana es til para una deteccin muy precisa, su aplicacin es
limitada en sistemas con clulas eucariotas, debido a que estas enzimas son
sensibles a temperaturas superiores a los 30C (Daunert et al., 2000).

Protena verde fluorescente (GFP)

La Protena verde fluorescente (GFP) es una fotoprotena que ha sido aislada y
clonada de la medusa Aequorea victoria. La principal ventaja de la GFP como
protena reportera es su autofluorescencia, su uso no requiere la adicin de
cofactores o sustratos exgenos para producir luz. Esta es el resultado de la
formacin de un cromforo imidazolinona. La formacin de este cromforo
ocurre por modificaciones pos-traduccionales, resultado de la ciclizacin de 3
residuos de aminocidos de la protena (Ser65-Tyr66-Gly67) (Daunert et al.,
2000).

La GFP tiene numerosas cualidades lo que la hacen ideal como gen reportero,
esta se ha utilizado para medir la expresin de genes, as como identificar
clulas transformadas, tambin se ha usado como reportero en biosensores
celulares con fibra ptica para la deteccin de L-arabinosa. Este sistema es
altamente selectivo ya que es capaz de discriminar esteroismeros de D-
arabinosa de una amplia variedad de pentosas y hexosas (Daunert et al.,
2000).

22

2.1.2.2.2 VENTAJAS Y DESVENTAJAS

La mayor ventaja de los biosensores es tienen la capacidad de detectar la
biodisponiblidad del contaminante, lo que permite una evaluacin ms precisa
del sitio y de los riesgos potenciales involucrados (Strosnider, 2003).

Adems los biosensores son rpidos, seguros, menos costosos esta al
compararlos con los mtodos qumicos convencionales: tal es el ejemplo del
espectrofotmetro de absorcin atmica. Los resultados obtenidos a partir de
los biosensores son comparables con los mtodos tradicionales; adems,
pueden ser aplicados en trabajo de campo (Strosnider, 2003).

Sin embargo, el funcionamiento de estos sistemas es limitado, adems es
difcil determinar las condiciones del procedimiento en el rendimiento de los
biosensores, tales como temperatura, pH, tiempo de incubacin, medio de
cultivo, reactivos empleados, sin embargo con la ayuda de la ingeniera
gentica se pueden hacer algunas mejoras a estos sistemas, superando as
algunos de estos factores (Strosnider, 2003).

2.1.2.3 BIOSENSOR PARA LA DETECCIN DE ARSNICO EN AGUA (E.
coli modificada)

El uso de biosensores microbianos puede ser una alternativa para la deteccin
de arsnico en agua potable, para tal efecto se utiliz a Escherichia coli, la cual
posee un mecanismo de resistencia natural al arsenito, arsenato. Que esta
codificada en el plsmido de E. coli R773, este tiene un opern denominado
ars, formado por una serie de genes estructurales (arsA, arsB y arsC) y dos
genes reguladores (arsR y arsD) (Fig. 11).

23

La expresin de los genes reguladores da como resultado ArsR la cual controla
los niveles bsales de la protena de expresin y ArsD controla los niveles
mximos de esta misma protena (Daunert et al., 2000, Stoker et al., 2003).

En ausencia de arsenito, el represor ArsR est unido al sito operador/promotor
del opern ars y evita la expresin de los genes estructurales. Cuando el
arsenito entra en la clula por una arsenito reductasa, interacciona con ArsR
unindose a sta, ocasionando un cambio en la conformacin del represor lo
que trae como consecuencia la disociacin de ArsR del sito operador/promotor
y subsecuentemente hay una elevada expresin de los genes del opern ars
(Stoker et al., 2003).

Las bacterias nativas contienen el opern ars, el cual no produce por si solo
una seal analtica til, por tal motivo Stoker et al (2003) adicionaron por medio
de tcnicas de biologa molecular un marcador que estando unido al gen arsR
produzca la expresin de una protena fcilmente medible (Stoker et al., 2003).

Fig 11 Representacin esquemtica del opern de resistencia a arsnico, est conformado
por tres genes estructurales (arsA,arsB, arsC) y dos genes reguladores (arsD , arsR).

24

Actualmente, el uso de biosensores posee una alta demanda debido a su
exactitud, precisin y facilidad de uso, as como a su prcticamente nula
generacin de productos txicos. (Erickson, 2003; Stocker et al., 2003).

2.1.2.3.1 CONSTRUCCIN DE LOS BIOSENSORES

BIOSENSOR CON EL GEN REPORTERO Lac Z

El biosensor fue construido en E.coli DH5. La parte sensible de sensor deriva
del gen arsR proveniente del plsmido pBGD23, que contiene clonado el
fragmento del opern de resistencia al arsnico. Usando la reaccin en cadena
de la polimerasa (PCR) se amplio el gen arsR del plsmido pBGD23
incluyendo el promotor arsR y excluyendo la parte arsD.

Los iniciadores usados en la PCR fueron: ArsRfor640 (5ccc ttt cgt ctt ttc caag
3; 129 pb rioarriba del inicio de arsR e introduciendo un sito HindIII) y
ArsRrev1120 (5aac ata tga att cag gca aat ttt ttag 3, obteniendo un codn de
terminacin de arsR e introduciendo un sitio nico EcoRI). Los fragmentos
fueron clonados dentro de pGEM-T-Easy (Promega Corp., Catalys AG,
Wallisenllen, Switzerland) produciendo ArsR regulable en la expresin del gen
lac z. El fragmento fue recuperado del plsmido cortando con HindIII y EcoRI.
El fragmento arsR fue ligado en pMV132, que contiene los promotores de la
galactosidasa. Despus se llevo a cabo la transformacin en E. coli dando
como producto al plsmido pMV-arsR.

Para reducir la formacin en la expresin del promotor arsR, fue clonada una
segunda copia de DNA del sito de unin a ArsR y su respectivo gen reportero
(lac Z). El sito de unin de ArsR fue amplificado por PCR con los iniciadores
001126 (5gaa ttc caa gtt atc tca cct acc 3, 124 pb ro arriba del inicio de
arsR) y 010834 (5aat tca cata ac caa aaa cgc ata tga tg 3, 52 pb rio arriba de
arsR).

25

Posteriormente el fragmento fue clonado con pGEM-T-Easy, el fragmento de
60 pb fue recuperado y cortado con EcoRI. El fragmento fue insertado en el
plsmido pPR-arsR (proveniente de la fusin de arsR con una protena de
fluorescencia verde gfp), dando origen a pPR-arsR-ABS.

Para la obtencin del plsmido pMV132-arsR-ABS (Fig. 12), el cual se utiliz
en ese estudio, fue cortado el plasmido pPR-arsR-ABS con SphI y SpeI
recuperando el fragmento arsR-ABS. Posteriormente este fragmento se lig al
plsmido pMV132 cortando con EcoRI (Stocker et al., 2003).

BIOSENSOR CON LOS GENES LUX A y LUX B COMO REPORTEROS

El biosensor fue construido en E.coli DH5. La parte sensible de sensor deriva
del gen arsR proveniente del plsmido pBGD23, que contiene clonado el
fragmento del opern de resistencia al arsnico. Usando la PCR fue
amplificado el gen arsR del plsmido pBGD23 incluyendo el promotor arsR y
excluyendo la parte arsD.

Los iniciadores usados fueron: ArsRfor640 (5ccc ttt cgt ctt ttc caag 3; 129 pb
rioarriba del inicio de arsR e introduciendo un sito HindIII) y ArsRrev1120
(5aac ata tga att cag gca aat ttt ttag 3, obteniendo un codn de terminacin
de arsR e introduciendo un sitio nico EcoRI).
Fig. 12 Representacin esquemtica del plsmido de E. coli pMV132-arsR-ABS

26

Los fragmentos fueron clonados dentro de pGEM-T-Easy (Promega Corp.,
Catalys AG, Wallisenllen, Switzerland) produciendo ArsR regulable en la
expresin del gen reportero. El fragmento fue recuperado del plsmido
cortando con SphI y SpeI. El fragmento arsR fue insertado en pJ AMA8, cortado
con SphI y XbaI, el cual contiene promotores de los genes de la luciferasa
(genes lux A y lux B) provenientes de Vibrio harveyi.

Para reducir la formacin en la expresin del promotor arsR, fue clonada una
segunda copia de DNA del sito de unin a ArsR y su respectivo gen reportero
(lux A y lux B). El sito de unin de ArsR fue amplificado por PCR con los
iniciadores 001126 (5gaa ttc caa gtt atc tca cct acc 3, 124 pb ro arriba del
inicio de arsR) y 010834 (5aat tca cata ac caa aaa cgc ata tga tg 3, 52 pb rio
arriba de arsR).

Posteriormente el fragmento fue clonado con pGEM-T-Easy, el fragmento de
72 pb fue recuperado y cortado con EcoRI. El fragmento se insert en el
plsmido pPR-arsR (proveniente de la fusin de arsR con una protena de
fluorescencia verde gfp), dando origen a pPR-arsR-ABS. Para la obtencin
del plsmido pJ AMA-arsR- ABS, el cual se utiliz en este estudio, fue cortado
el plsmido pPR-arsR-ABS con SphI y SpeI recuperando el fragmento arsR-
ABS. Posteriormente este fragmento fue ligado al plsmido pJ AMA8 cortando
con SphI y XbaI (Fig.13) (Stocker et al., 2003).

Fig. 13 Representacin esquemtica del plsmido de E. coli pJAMA-arsR-ABS

27

2.1.2.3.2 FUNDAMENTO DE LOS BIOSENSORES

Como podemos observar en la figura 14B, el gen arsR controla la expresin de
los genes reporteros (luxA, luxB y lacZ), as como la expresin de los mismos.
La expresin del gen nos da como resultado una protena represora (ArsR), la
cual se une en ausencia de arsenito a su sitio especfico que se encuentra ro
arriba del promotor. Cuando la clula entra en contacto con el arsenito, este se
une a ArsR cambiando su conformacin ocasionando que la protena se
separe del sito de unin permitiendo que la RNApol transcriba los genes
reporteros los cuales llevan a cabo la expresin de la luciferasa y/o
galactosidasa (Stocker et al., 2003).

Fig. 14 Principio del biosensor de E. coli pJAMA-arsR-ABS. (A) La protena ArsR regula la expresin
de los genes reporteros, esta se encuentra unida al sito operador/ promotor de arsR, cuando no hay
presencia de arsnico. (B) Cuando se detecta la presencia de arsnico; sta se une a ArsR
cambiando la conformacin de la protena, haciendo que esta se despegue del sitio operador
/promotor para la expresin de los genes reporteros (luxA, luxB y lacZ) (Stocker et al., 2003).

28

En la figura 14A, el principio es similar, la diferencia radica que en este caso se
encuentran dos sitios de unin a ArsR, los cuales estn ubicados, uno ro abajo
de arsR y el segundo se encuentra ro arriba del mismo gen. Cuando la clula,
no detecta la presencia de arsenito, la protena represora esta unida en los dos
sitios antes mencionado impidiendo la transcripcin y subsecuentemente la
sntesis de los genes reporteros (Stocker et al., 2003).

La cantidad sintetizada a partir del gen LacZ de los genes lux A y B
depender de:

a. La cantidad de arsenito detectada por las clulas.
b. El tiempo de exposicin de las clulas al arsenito.
c. La constitucin gentica de la clula de E.coli usada.

La actividad de -galactosidasa puede ser cuantificada de diferentes maneras,
una de las ms simples es usando un sustrato especfico para la enzima que
permita la formacin de color (Fig. 15). Este, puede ser medido un
espectrofotmetro (Stocker et al., 2003).

Fig. 15 Representacin esquemtica de la reaccin que lleva a cabo la -
galactosidasa en presencia del ONPG (URL-7).

29

La actividad de luciferasa puede ser cuantificada por medio de una reaccin de
luminiscencia (Fig. 16). El sustrato especfico para la enzima es el n-decanal
que en presencia de oxigeno produce un cido, agua y luz (Meighen, 1991).
Este, puede ser medido empleando un luminmetro (Fluoroskan Ascent FL,
Thermo Electron Corporation) el cual posee un sistema ptico (Fig. 17), y
consta de una lmpara de halgeno, un filtro de excitacin, un espejo y un
fotomultiplicador, que capta la luz emitida desde el micropozo y reflejada a
travs de un espejo que la desva hacia un filtro de excitacin llegando as al
fotomultiplicador, el cual nos dar una seal de lectura (Thermo Electron
Corporation).

Luciferasa +n- decanal (C
10
H
20
O) +O
2
H
2
O +R-COOH +hv

Fig. 16 Reaccin que lleva a cabo la luciferasa en presencia de su sustrato (n-decanal).
Fig. 17 Sistema ptico del luminmetro Fluoroskan Ascent Fl ( Thermo Electron Corporation).
Lmpara de halgeno
Filtro de excitacin
Espejo
Micropozo
Fotomultiplicador

30

3 JUSTIFICACIN

Se ha reportado que en diferentes regiones de nuestro pas el agua de
consumo excede los niveles de Arsenico permitidos; esto aunado a los
reportes que demuestran que la exposicin a este elemento a travs de la
ingesta de agua de consumo, da lugar a cambios en la pigmentacin y textura
de la piel; a enfermedades vasculares perifricas y a trastornos
gastrointestinales. Se considera necesario evaluar las concentraciones de este
metal con tcnicas que ofrecen un respuesta mas rpida, eficaz y segura,
siendo una aopcion el uso de biosensores microbianos (E.coli modificada), ya
que los mtodos convencionales (espectrofotmetro de absorcin atmica y
kints comcerciales) producen sustancias toxicas y peligrosas durante el
proceso.

31

4 OBJETIVO GENERAL

Implementar el uso de biosensores microbianos (Escherichia coli) que nos
permitan la cuantificacin de arsnico en muestras de agua de diversos
orgenes.

4.1 OBJETIVOS PARTICULARES

Encontrar las condiciones adecuadas para la cuantificacin de arsnico en
agua de una manera rpida, eficaz y segura con las cepas E. coli pMV132-
arsR-ABS y E. coli pJ AMA-arsR-ABS.

Evaluar la concentracin de arsnico en las muestras problema con los
biosensores y comparar los resultados con los obtenidos a travs de las
tcnicas en las cuales se utilizan el Wagtech Arsenator digital el
espectrofotmetro de absorcin atmica con generacin de hidruros.

Desarrollar pruebas semicualitativas para la deteccin de arsnicos para la
deteccin de arsnico en agua, en campo.

32

5 MATERIALES Y MTODOS

5.1 MUESTRA BIOLGICA

Se utilizaron las cepas modificadas de E. coli pMV132-arsR-ABS y E. coli
pJ AMA-arsR-ABS, las cuales poseen genes reporteros Lac Z y Lux AB,
respectivamente, ambas cepas fueron proporcionadas por el Dr. J an Roelof
Van Der Meer del Instituto Federal Suizo de Ciencia y Tecnologa Ambiental,
Dbendorf Suiza.

5.2 MEDIO DE CULTIVO EMPLEADO

Se empleo el medio Luria (L) (ver anexo) para mantener y propagar las cepas
bacterias, las cuales fueron utilizadas para las determinaciones de arsnico en
agua.

5.3 SOLUCIN TIPO DE ARSNICO

Se prepar una serie de diluciones a partir de una solucin tipo de Arsnico, la
cual contiene 1 g de As/ L (13 mM) (J . T. Baker, Deventer, The Netherlands)
las concentraciones utilizadas fueron: 0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 y 1.0 M.
Las diluciones se hicieron con agua de grado II para HPLC (Harms et al., 2005).

5.4 MUESTRAS

Cada muestra fue recolectada en dos envases de plstico con tapones del
mismo material de un litro, uno se ocupo para la cuantificacin de arsnico de
acuerdo a la norma oficial mexicana (NOM-117-SSA1-1994) y el otro se utilizo
para la determinacin de arsnico usando los biosensores y el Wagtech
Arsenator digital.

33

El muestreo se realiz tomando un poco del agua que se va a analizar, se
cierra el envase agitandose fuertemente para enjuagar, esta operacin se
realiz dos o tres veces y enseguida se tom la muestra, la cual se coloc en
una hielera con bolsas refrigerantes o bolsas de hielo para su transporte al
laboratorio. Las muestras provinieron de lugares donde se ha reportado no la
existencia de arsnico en el agua (Tabla 3 y Fig.18) (Ngo et al., 2002; CNA,
2000).

No.
Muestra
Lugar de procedencia
M1 Delegacin Gustavo A. Madero, Mxico, D.F
M2 Cuemanco, Delegacin Xochimilco, Mxico, D.F
M3 Ecatepec, Estado de Mxico.
M4 Delegacin Miguel Hidalgo, Mxico, D.F
M5 Chapultepec, Delegacin Miguel Hidalgo, Mxico, D.F
M6 Cuemanco, Delegacin Xochimilco, Mxico, D.F
M7 Hgado, Pachuca, Mxico.
M8 Yurecuaro, Michoacn, Mxico.
M9 Tenancingo, Toluca, Estado de Mxico.
M10 Ixtapa de la sal, Toluca, Estado de Mxico.
M11 Cuautitlan Izcali, Estado de Mxico.
M12 Ciudad de Nezahualcoyotl, Estado de Mxico.
M13 Ciudad de Nezahualcoyotl, Estado de Mxico.
M14 Torren, Coahuila, Mxico.

Tabla 3A Muestras de agua recolectadas de distintos lugares de la Repblica Mexicana y
Guatemala

34

No.
Muestra
Lugar de procedencia
M20 Mixco, Guatemala, Centro Amrica.
M21 Mixco, Guatemala, Centro Amrica.
P6 Torren, Coahuila, Mxico.

Tabla 3B Muestras de agua recolectadas de distintos lugares de la Repblica Mexicana y
Guatemala

35

5.5 VERIFICACIN DE LA PUREZA DE LAS CEPAS

Para la cepa E. coli pMV132-arsR-ABS, se tom una asada y se sembr por
estra cruzada en medio L con 50 g/mL ampicilina, adicionado con Xgal (20
g/mL) a 37C por 48 horas. Posteriormente se revis el crecimiento y la
morfologa de las colonias, estas hidrolizan al X-gal por medio de la -
galactosidasa a galactosa y 5-bromo-4-cloro-3-hidroxindol. Este ltimo es
oxidado a 5,5'-dibromo-4,4'-dicloro-indigo, un compuesto azul insoluble.
Fig.18 Ubicacin topogrfica de las muestras manejadas en el estudio

36

La cepa E. coli pJ AMA-arsR-ABS se sembr por estra cruzada en medio L
(ver anexo) con y sin de ampicilina (50 g/mL) a 37C por 48 horas.
Posteriormente se revis el crecimiento y la morfologa colonial. Se realiz el
mismo procedimiento con una cepa silvestre de E. coli como testigo.

5.6 CONSERVACIN DE LAS CEPAS

Para mantener las cepas de E. coli pMV132-arsR-ABS y E. coli pJ AMA-arsR-
ABS se inocul una asada de cada microorganismo en 5 mL de medio L con
50 g/mL de ampicilina a 37C, se dej en un cultivo de toda la noche,
posteriormente se tom un mL del cultivo y se transfiri a un matraz
Erlenmeyer que contena 50 mL del mismo medio el cual se incub a 37C en
agitacin, ajustando a una concentracin celular de 1 x 10
8
cel/mL.

El cultivo se coloc en un bao de hielo durante 15 min, posteriormente se le
adicion 10 mL de glicerol fro (87% v/v), la mezcla se dividi en alcuotas de
1.0 mL en tubos eppendorf de 2 mL; estos se transfirieron a una mezcla
hielo/etanol durante un minuto, posteriormente se coloc en un congelador a -
72C para su conservacin.

5.7 CUANTIFICACIN DE ARSNICO EN MUESTRAS DE AGUA
UTILIZANDO LA CEPA DE E. coli pMV132-arsR-ABS

La metodologa utilizada fue propuesta, por Van Der Meer et al., 2004 se
hicieron las modificaciones necesarias para adaptarla a nuestras condiciones
de trabajo.

Se tom un vial congelado de la cepa E. coli pMV132-arsR-ABS la cual se
descongelo a temperatura ambiente, se realiz una dilucin 1:10 con medio L
fresco. En un tubo eppendorf, se adicionaron 500 L de la suspensin celular
diluida y 500 L de la muestra problema.

37

Los ensayo se realizaron en tubos de vidrio de 13 x 100 mm y se incubaron a
37C por 60 minutos en una plataforma rotatoria a 120 rpm, posteriormente se
coloc en bao de hielo por 10 minutos, despus se centrifug a 13 000 rpm
por 2 minutos, se elimino el sobrenadante y se adicionaron 500 L del
regulador P frio (ver anexo).

Se resuspendieron las clulas nuevamente con 500 L de regulador P frio y se
centrifugaron a 13 000 rpm por 2 minutos, se desecho el sobrenadante e
inmediatamente se les adicion 100 L de regulador P frio. El paquete celular
se resuspendi; de la suspensin se tomaron 50 L colocndose en un tubo
eppendorf nuevo y se les adiciono 700 L de regulador Z (ver anexo), 80 L de
cloroformo y 40 L de SDS al 0.1 % (ver anexo); se agit en vortex a mxima
velocidad por 20 segundos y se incub 20 minutos a temperatura ambiente,
despus se agregaron 150 L de ONPG 4 mg/mL (ver anexo) y se incub
nuevamente a 28C, observndose la aparicin de color, inmediatamente se
detuvo la reaccin agregando 400 L de carbonato de sodio 1M (ver anexo).
Por ltimo se extrajo el sobrenadante y se midi la D.O en un
espectrofotmetro (BioMate
TM
3 Series Spectrophotometers, Termo Spectronic)
a 420 nm.

Las modificaciones que se hicieron fueron las siguientes:

Caso 1

Se cambi el tiempo de incubacin al momento de agregar la muestra con
arsnico a las clulas pasando de 60 a 120 min y se decido fijar un tiempo de
incubacin despus de la permeabilizacin de las clulas con 80 L de
cloroformo y 40 L de SDS al 0.1 %, que fue de 30 minutos, transcurrido ese
tiempo se agrego 150 L de ONPG 4 mg/mL, en este punto fue requerido
establecer un tiempo de incubacin de 5 minutos a 28C.

38

Caso 2

Las condiciones antes mencionadas fueron las mismas a excepcin del tiempo
de incubacin despus de la adicin de ONPG 4 mg/mL que fue de 10 minutos
a 28C.

Caso 3

El tiempo de incubacin tras la permeabilizacin de las celular, no cambio, solo
se modific el tiempo de incubacin tras la adicin del ONPG 4 mg/mL que fue
de 15 min a 28C.

Caso 4

Se decidi eliminar el SDS al 0.1% en la permeabilizacin de las clulas, as
como cambiar el tiempo de incubacin despus de la adicin del ONPG 4
mg/mL, que fue de 10 min.

En todos los casos, se construyeron curvas tipo con diferentes
concentraciones de arsnico (0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 y 1.0 M) a partir
de una solucin tipo.

39

UTILIZANDO LA CEPA DE E. coli pJAMA-arsR-ABS

La tcnica propuesta por Stocker et al.,(2003) fue tambin modificada hasta
obtener resultados confiables de acuerdo a nuestras condiciones de trabajo.
Se tom uno de los tubos congelados de la cepa E. coli pJ AMA-arsR-ABS, se
coloc en un bao con agua a 25C y una vez descongelada, en una
microplaca negra (Corning Incorporated, Costar) de 96 pozos se colocaron 50
L de las clulas descongeladas en cada uno de los pozos a utilizar, en esto se
agregaron 100 L de cada una de las concentraciones que compone la curva
tipo la cual fue elaborada a partir de una solucin tipo de arsnico (J . T. Baker,
Deventer, The Netherlands) y las muestras problema. La microplaca se cubri
e incub a 35C en agitacin (190 rpm) por treinta minutos. Posteriormente se
adicionaron 25 L de n- decanal 2mM a cada uno de los pozos (ver anexo). La
microplaca se incub nuevamente con agitacin durante 3 minutos. Se midi la
intensidad de luz con un tiempo de integracin de 10 segundos en el
luminmetro (Fluoroskan Ascent FL, Thermo Electron Corporation). Los
resultados de las muestras problema, se interpolaron en la curva tipo (0, 0.05,
0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 y 1.0 M de arsnico) para obtener la concentracin de
arsnico, la cantidad de arsnico presente en las muestras es directamente
proporcional a la cantidad de luz emitida.

Las modificaciones realizadas a la tcnica fueron las siguientes:

Caso 1

Se realiz una dilucin 1:2.5 de la suspensin bacteriana descongelada,
tomando de ella 25 L. El tiempo de incubacin se incremento de 30 minutos a
una hora a 30C.

40

Caso 2

Las condiciones antes mencionadas se conservaron excepto el tiempo de
incubacin que fue de dos horas a 30C.

Como se ha mencionado, los resultados obtenidos a partir de muestras
problemas, para ambas cepas de E. coli, se compararon con resultados
obtenidos a travs de tcnicas usadas por normas oficiales y aquellas
recomendadas por las OMS, como son la espectrofotometra de absorcin
atmica con generacin de hidruros y el Wagtech Arsenator digital.

5.9 CUANTIFICACIN DE ARSNICO EN AGUA POR
ESPECTROFOTOMETRA DE ABSORCIN ATMICA CON GENERACIN
DE HIDRUROS.

Para esta metodologa se construy una curva tipo con diferentes
concentraciones de arsnico (0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 y 1.0 M), a las
cuales previamente se les adicion cido ntrico concentrado hasta obtener un
pH menor a 2, posteriormente se sigui el protocolo marcado por la noma
oficial mexica (NOM-117-SSA1-1994) empleando un espectrofotmetro de
absorcin atmica (Marca Varian, Modelo Spectra AA220). Este procedimiento
fue aplicado tambin a las muestras problema.

41

5.10 CUANTIFICACIN DE ARSNICO EN AGUA UTILIZANDO EL
WAGTECH ARSENATOR DIGITAL

Para este mtodo se procedi a agregar 50 mL de la muestra en un matraz de
125 mL, posteriormente se adicion cuidadosamente un sobre con el reactivo
A1 (ver anexo) evitando que el reactivo quedara adherido a las paredes del
matraz y mezclar hasta disolver el reactivo. Se colocaron los filtros respectivos
en la tarjeta negra y roja, estos capturaran el producto de la reaccin, y se
pondrn en la trampa de arsnico, se agrego una pastilla con el reactivo A2
(ver anexo) en el matraz e inmediatamente se tap con la trampa de arsnico y
se dejo incubar durante 20 min. Transcurrido este tiempo, se retiro la tarjeta
negra y se coloc en la ranura del fotmetro que previamente se calibr
usando una tarjeta negra con un filtro nuevo, una vez hecho esto se espero el
resultado (Fig. 19). Los pasos mencionados anteriormente fueron aplicados
tanto a las muestras problemas as como a la elaboracin de una curva tipo
con diferentes concentraciones de arsnico (0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 y 1.0
M).

Fig. 19 Mtodo qumico de la marca Wagtech Arsenator digital para la cuantificacin de
arsnico en agua.

42

5.11 PRUEBA SEMICUANTITATIVA PARA LA DETECCIN DE ARSNICO
EN AGUA EN CAMPO

Se tom uno de los tubos congelados de la cepa E. coli pJ AMA-arsR-ABS, se
coloc en un bao con agua a 25C, una vez descongelada la muestra se
sembr por estra cruzada en medio L con ampicilina (100 g/mL) y se incub
a 37C por 48 horas, transcurrido ese tiempo se tom una colonia y se sembr
en 50 mL de medio L con ampicilina (100 g/mL) posteriormente se incub a
37C por 16 horas obteniendo una densidad celular de 1.8 x 10
10
cel/mL . El
cultivo se centrifug a 5000 rpm por 10 min, se elimin el sobrenadante al cual
se le adicionaron 2 mL de regulador de fosfatos pH 7, se resuspendi el
paquete celular y se volvi a centrifugar, se elimin el sobrenadante y se
obtuvo el paquete celular. Por otro lado, se preparo una mezcla de los
siguientes soportes (Stocker et al., 2003):

Soporte Cantidad
Gelatina al 15% 400 L
Peptona de casena al 1% 250 L
Ascorbato de sodio al 1% 200 L
Extracto de levadura al 1% 250 L
Rafinosa al 5% 300 L
Glutamato al 5% 300 L

Todo se homogeniz perfectamente, posteriormente. A estos se le adicion por
separado 1.5, 3 y 9 L de la suspensin celular y se impregnaron en tiras de
papel Whatman 3M de 5 cm x 0.45 mm estriles, las tiras se dejaron secar por
2 hrs, despus se sumergieron en 100 L de cada una de las soluciones que
contenan arsnico (0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 y 1.0 M de arsnico). Se
incubaron a 60 min a temperatura ambiente. Pasado este tiempo se le adicion
a cada tira 20 L de Xgal 1 mg/mL 5 mg/mL, se incub por 30 min a
temperatura ambiente.

43

Se observ la presencia de un color azul ndigo, la intensidad fue directamente
proporcional a la cantidad de arsnico presente en la muestra.

5.12 PARMETROS ESTADSTICOS EMPLEADOS (VER ANEXO)

Los parmetros empleados en el anlisis estadsticos de las curvas tipo son:
intervalo de linealidad, intervalo de trabajo, lectura estadstica del blanco (Y
B
),
sensibilidad (S), error estndar de la regresin (S
y/x
), limite de deteccin (LD),
limite de cuantificacin (LC), limite de decisin (Ld) y centro de gravedad de la
recta (X
prom
,Y
prom
) (Miller y Miller, 2002).

44

6 RESULTADOS

UTILIZANDO LA CEPA DE E. coli pMV132-arsR-ABS

En las figuras 20, 21, 22 y 23, se muestran las diferentes curvas tipo obtenidas
al modificar el mtodo propuesto por Van Der Meer et al.,(2004) empleando la
cepa de E. coli pMV132-arsR-ABS, para as llegar a las condiciones de trabajo
que nos dieron los datos ms confiables (Fig. 23).

Fig. 20 Curva tipo de E. coli pMV132-arsR-ABS, el ensayo se llev a cabo con un tiempo
de incubacin de 5 min a 28C con la adicin de SDS al 0.1%, los datos mostrados son el

45

Fig. 22 Curva tipo de E. coli pMV132-arsR-ABS, el ensayo se llevo a cabo en un tiempo de
incubacin de 15 min a 28C con la adicin de SDS al 0.1%, los datos mostrados son el
producto de 3 rplicas del ensayo
incubacin de 10 min a 28C con la adicin de SDS al 0.1%, los datos mostrados son el

46

UTILIZANDO LA CEPA DE E.coli pJAMA-arsR-ABS

Las figuras 24 y 25, muestran las variantes a las condiciones propuestas por el
mtodo de Stocker et al,(2003) empleando la cepa de E. coli pJ AMA-arsR-
ABS, observndose una curva tipo con una r
2
de 0.997, por lo que
consideramos que es confiable.

incubacin de 10 min a 28C sin la adicin de SDS al 0.1%, los datos mostrados son el

47

Fig. 24 Curva tipo de E. coli pJAMA-arsR-ABS, la reaccin se llev a cabo en un
tiempo de incubacin una hora a 30C en agitacin, los datos mostrados son el
Fig. 25 Curva tipo de E. coli pJAMA-arsR-ABS, la reaccin se llev a cabo en un
tiempo de incubacin de dos horas a 30C en agitacin, los datos mostrados son el

48

Fig. 26 Curva tipo del espectrofotmetro de absorcin atmica, con diferentes
concentraciones conocidas de arsnico (0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 y 1.0 M), las
cuales fueron tratadas segn lo marcado en la norma oficial mexicana.
6.3 CUANTIFICACIN DE ARSNICO EN AGUA POR
ESPECTROFOTOMETRA DE ABSORCIN ATMICA CON GENERACIN
DE HIDRUROS

En la figura 26 se presenta la curva de tipo para la cuantificacin de arsnico
empleando un espectrofotmetro de absorcin atmica, utilizando el mtodo
indicado en la norma oficial mexicana (NOM-117-SSA1-1994). Se obtuvo una
recta con una r
2
de 0.999.

6.4 CUANTIFICACIN DE ARSNICO EN AGUA UTILIZANDO EL
WAGTECH ARSENATOR DIGITAL

En la figura 27 se presenta la curva tipo obtenida con el Wagtech Arsenator
Digital, utilizando las soluciones tipo. La curva present una r
2
de 0.998.

49

Fig. 27 Curva tipo obtenida de Wagtech Arsenator digital, la reaccin se llev a cabo
en un tiempo de incubacin una 20 min a 30C, los datos mostrados son el producto
de 3 rplicas del ensayo.

6.5 COMPARACIN DE LOS MTODOS UTILIZADOS PARA EVALUAR LA
CONCENTRACIN DE ARSNICO EN AGUA

En la tabla 4 se pueden observar los parmetros llamados pruebas de
desempeo, los cuales nos permiten saber, si las curvas tipo pueden ser
usadas para generar resultados confiables.

50

6.6 CONCENTRACIONES DE LAS MUESTRAS PROBLEMA

En la tabla 5 y 6 se muestran las concentraciones obtenidas de las muestras
problemas por interpolacin en las curvas tipo para cada uno de los mtodos
probados, as como el promedio del porcentaje recuperacin (%R).

Parmetro EAA -galactosidasa Luciferasa
Wagtech Arsenator
Digital
Intervalo
de
linealidad
r=0.9998 0-1 M r=0.9973 0-1 M r=0.9989 0-1 M r=0.9995 0-1 M
Intervalo
de
Trabajo
r=0.9998
5-74.57
g/L
r=0.9973
0.15 -0.24
Abs
r=0.9989
4.82E+05 -
1.57E+06
URL
r=0.9995
9.5-74. 41
g/L
YB -0.0302 0.1297 2.31E+05 -0.0919
S 74.5741 0.1042 1.34E+06 74.41
S
y/x
0.6147 0.0031 2.52E+04 0.9794
LD 0.0247 0.0883 0.0563 0.0395
LC 0.0824 0.2945 0.1876 0.1316
Ld 0.0495 0.1797 0.1125 0.079
X
prom
,
Y
prom

0. 3938, 29.33 0.3938, 0.1707 0.3938, 7.59E+05 0.3938, 29.2083

Tabla 4 Comparacin de mtodos analticos, empleando pruebas inciales de desempeo, con un
nivel de confianza de p= 0.05 con n-2 grados de libertad.

51

Muestras
Biosensor -
galactosidasa
g/L
Biosensor
Luciferasa
g/L
Arsenator
g/L
EAA
g/L
M1 6.1 6.1 5 6.2
M2 0 0 0 0
M3 12.8 12.9 10.9 13
M4 1.1 1.15 0 1.2
M5 0 0 1 0
M6 0 0 0 0.005
M7 7.2 7.38 10 7.4
M8 0 0 6 0.005
M9 0 0 9 0.005
M10 354.6 355 353 355.9
M11 6.1 6.15 6 6.2
M12 0 0 0 0.005
M13 0 0 0 0.005
M14 42.8 43.5 44 43.9
M15 19.8 20 22 20.5
M16 23.1 23.9 22 24.3
M17 29.2 29.3 31 29.7
M18 26.8 26.8 26 27.2
M19 42.8 43 44 43.1
M20 120 120.02 13 12.08
M21 110 110.24 10 11.36
M22 58 60 59 61
M23 71 71 70 72
M24 99.6 100 95 101.3
M25 95.8 96.1 92 96.9
M26 71.9 70.8 69 72.4
P6 49 48.5 49 50
P10 49.2 48.9 49 50
P23 68.45 69.1 67 69
P32 74.6 74.8 74 75
P65 58.2 58.7 57 59

Tabla 5 Resultados obtenidos de las muestras problemas, mediante la interpolacin en las
curvas tipo para cada mtodo empleado.

52

% Recuperacin
Promedio
MTODOS
-galactosidasa Luciferasa Arsenator
98.361.82 99.011.03 98.109.25

6.7 PRUEBA SEMICUANTITATIVA PARA LA DETECCIN DE ARSNICO
EN AGUA EN CAMPO.

Las determinaciones que se muestran a continuacin se realizaron con
soluciones de concentracin conocida de arsnico, un aumento en la
intensidad de color azul debido a la actividad de la -galactosidasa sobre la
molcula de Xgal (Fig. 28).

Tabla 6 Promedio del porcentaje de recuperacin (%R) para cada uno de los mtodos
probados.

Fig .28 A Prueba semicuantitativa para la deteccin de arsnico en agua empleando tiras
de papel impregnadas con la cepa de E. coli pJAMA-arsR-ABS a diferentes
concentraciones, A) 1.5 L clulas y 20 L Xgal (1mg/mL), B) 1.5 L clulas y 20 L Xgal
(5mg/mL), C) 3 L clulas y 20 L Xgal (1mg/mL).

53

Fig .28B Prueba semicuantitativa para la deteccin de arsnico en agua empleando tiras
de papel impregnadas con la cepa de E. coli pJAMA-arsR-ABS a diferentes
concentracionesD) 3 L clulas y 20 L Xgal (5mg/mL), E) 9 L clulas y 20 L Xgal
(1mg/mL), F) 9 L clulas y 20 L Xgal (5mg/mL).

54

7 DISCUSIN

La presencia de arsnico en altas concentraciones en el agua de consumo, ha
trado como consecuencia que se desarrollen tcnicas para evaluar las
concentraciones de este elemento, estas como ya se mencionaron pueden ser
por anlisis qumicos (EAA, Kits y el Wagtech Arsenator Digital) sin embargo,
estas presentan la formacin de sustancias txicas como la arsina. Por otro
lado, el desarrollo de las ingeniera gentica y la creacin de biosensores ha
revolucionado la forma de llevar a cabo la evaluacin de ciertos compuestos;
as aprovechando la capacidad que tiene E.coli de ser resistente a la presencia
de arsnico fue que Van Der Meer et al., (2004) desarrollaron dos cepas
modificadas genticamente para utilizarlas en la cuantificacin de arsnico en
agua. En este trabajo se llev a cabo la adecuacin del uso de estas bajo
nuestras condiciones de trabajo y se hizo una comparacin con los mtodos
qumicos.

Los cambios realizados al mtodo propuesto por Van Der Meer et al.,(2004)
para trabajar con la cepa de E. coli pMV132-arsR-ABS, que tiene a la -
galactosidasa como protena reportera, se presentan a continuacin:

Variables
-galactosidasa
MTODO ORIGINAL MTODO MODIFICADO
Tiempo de incubacin
con el biosensor y la
muestra
60 minutos 120 minutos
Adicin de SDS al 0.1
%
40 L Sin SDS
Tiempo de incubacin
despus de la
permeabilizacin
20 minutos a
temperatura ambiente
30 minutos a temperatura
ambiente
Tiempo de incubacin
tras la adicin del
ONPG
Hasta la aparicin de
color
10 minutos

55

Se sabe que el SDS afecta a las protenas desnaturalizndolas, debido al
rompimiento de enlaces no covalentes, provocando que las protenas pierdan
su conformacin nativa, en este caso podra estar inhibiendo la actividad de la
-galactosidasa (Garay et al., 2008).

Al comparar los parmetros estadsticos del mtodo del biosensor con -
galactosidasa con los del mtodo de EAA podemos observar que la recta
obtenida para l primero, present un intervalo de trabajo con una r=0.9973 de
0 a 1 M, mientras que la del mtodo de EAA present un intervalo de
linealidad con una r=0.9998. Cumpliendo ambas con el requisito de ser lineales
en un intervalo de concentracin (Miller y Miller, 1993).

Por otro lado, tenemos que el intervalo de trabajo para el biosensor con -
galactosidasa es de 0.15 a 0.24 unidades de absorbancia, siendo mucho
mayor el de EAA por lo que ste ltimo nos permite trabajar con muestras con
baja o alta concentracin de arsnico sin la necesidad de concentrarlas o
diluirlas (Miller y Miller, 2002).

Otro de los parmetros a evaluar fue la desviacin de estndar de la recta
(S
y/x
), como su nombre indica este valor nos permite ver la dispersin de los
puntos en la recta; adems nos es til para poder obtener con un nivel de
confianza aceptable para los valores de YB (la ordenada de origen), y as como
su sensibilidad (S), representada por la pendiente ,si observamos estos
parmetros para el mtodo de EAA, veremos que el valor de S
y/x
es bajo
teniendo en cuenta que la sensibilidad es muy alta (74.570.61); as como que
la ordenada al origen que pasa por el cero(-0.0302), lo cual es indicativo de
que este mtodo no presenta ningn tipo de absorcin de fondo es decir, la
lectura arrojada por el blanco es cero y por lo tanto no hay ningn componente
que pueda darnos una seal extra que la presentada por el blanco (Miller y
Miller, 2002).

56

Si comparamos los valores para el mtodo de -galactosidasa, Y
B
(0.1297) y S
(0.10420.003) lo que indica que el mtodo presenta baja sensibilidad as
como una absorcin de fondo propia del blanco. Los lmites de deteccin (LD),
de cuantificacin (LC), de decisin y centro de gravedad de la recta
(X
prom
,Y
prom
); nos indican que el mtodo EAA es ms confiable que el biosensor
de -galactosidasa, ya que para este los valores son ms altos, demostrando
que este ltimo es menos sensible (Miller y Miller, 1993).

Para el mtodo propuesto por Stocker et al., (2003) empleando la cepa de E.
coli pJ AMA-arsR-ABS que contiene a la luciferasa, se realizaron dos
modificaciones las cuales se muestran a continuacin:

Al comparar los parmetros estadsticos de este, con los de EAA se determin
que para el intervalo de linealidad para este mtodo es menor que el que
presenta la EAA, sin embargo ambas curvas son lineales en un intervalo de
concentracin de 0 a 1 M. Por otra parte el intervalo de trabajo para el mtodo
de la luciferasa fue de 4.82x 10
5
a 1.57 x 10
6
URL (unidades que representa la
cantidad de luz generada por la reaccin de oxidacin entre la luciferasa y el n-
decanal), comparando este valor con el mtodo de EAA este ultimo presenta
un intervalo de trabajo amplio.

Variables
Luciferasa
MTODO ORIGINAL MTODO MODIFICADO
Adicin de clulas Clulas sin diluir Clulas diluidas 1:2.5
Tiempo de incubacin con el
biosensor y la muestra
30 minutos a 35C 120 minutos a 30C

57

El valor de S
y/x
para el mtodo de EAA, es bajo, teniendo en cuenta que su
sensibilidad es muy alta (74.570.61); la ordenada al origen pasa por el cero.
Comparando estos valores para el mtodo de luciferasa, Y
B
(2.31x 10
5
) y S
(1.34x 10
6
2.52x 10
4
), el mtodo presenta una alta sensibilidad pero presenta
una absorcin de fondo. Los parmetros LD, LC, Ld y (X
prom
,Y
prom
); nos indica
que el valor el mtodo de EAA, es ms confiable que el biosensor de
luciferasa, ya que estos valores son altos (Miller y Miller, 2002).

Para el mtodo Wagtech Arsenator digital, presenta valores muy similares a los
encontrados con el mtodo de EAA, lo que sugiere, que este mtodo presenta
un intervalo de linealidad muy buena, adems de tener un intervalo de trabajo
amplio as como poseer una alta sensibilidad y tiene la capacidad de medir
pequeos cantidades de analito (Miller y Miller, 2002).

Los porcentajes del recuperacin obtenidas de las muestras (%R) refirindose
al cociente del valor obtenido experimentalmente y el valor de referencia de las
muestras probadas, tomando este como el valor obtenido por el EAA,
observamos que dichos porcentajes son muy similares entre los mtodos
empleados con biosensores y as como el mtodo Wagtech Arsenator digital, lo
que nos indica que el valor obtenido experimentalmente se aproxima al valor
de referencia (Quattrocchi et al., 1992).

De las veinte y seis muestras que se analizaron, veinte y cuatro dieron positivo
a la presencia de arsnico (tabla 6); las muestras M10, M14, M17, M18, M19
as como P6, P10, P23, P32 y P65 presentan concentraciones de arsnico por
encima de lo estipulado por la norma, las muestras provienen del estado de
Torren Coahuila, aqu se dedican a la extraccin de plomo, plata, zinc, oro y
cadmio en los cuales el arsnico se encuentra unido a estos elementos, dems
que se han reportado casos de intoxicacin de arsnico (Bucio, 2004).

58

Las muestras M1, M2, M3, M4, M5, M6, M7, M8, M9, M11,M12 y M13
representan concentraciones de arsnico que estn por debajo de la norma
oficial mexicana (NOM-127-SSA1-1994), aun as estas pequeas cantidades
nos indica un aumento incontrolado en la poblacin as como un aumento en la
creacin de nuevas industrias, afectando seriamente la calidad del medio
ambiente y representando un riesgo para la salud humana (Morton et al.,
2009). La muestra M10 se encontr una concentracin alta de arsnico (355
g/L) que supera los lmites permisibles en la norma oficial mexicana, dicha
concentracin se debe a que dicha muestra proviene de aguas con actividad
geotermal en donde hay una predominancia por el azufre, el cual es un
elemento muy afn al arsnico (Ferguson y Galvis, 1972; Instituto de Geologa
2000).

En la prueba semicuantitativa, utilizando la cepa de E. coli pJ AMA-arsR-ABS,
se observa en la figura 27D, las cantidades necesarias para obtener una
escala de color, cuya intensidad aumenta conforme se incrementaba la
concentracin de arsnico, fue de 3L de clulas mas 20 L de Xgal a una
concentracin de 5 mg/mL, la mezcla de soportes nos brindo una preservacin
del biosensor, para que este fuera capaz de resistir el estrs causado por la
desecacin (Bjerkettorp et al.,2006), evitando as que perdiera su viabilidad y
su capacidad de reaccionar con el arsnico contenda en el agua. Este tipo de
pruebas nos ser de gran utilidad ya que esta ser aplicada en muestras de
campo, sin la necesidad de emplear equipos sofisticados y costosos.

59

Ya se ha observado que el mtodo de EAA y Wagtech Arsenator digital
presentan varias ventajas competitivas con respecto a otros mtodos mediante
el anlisis estadstico de su recta, sin embargo hay que considerar algunos
aspectos tcnicos tales como, que en ocasiones la disponibilidad del equipo es
muy difcil de tener ya que estos en la mayora de los casos son muy costosos
adems generan desechos muy txicos tanto para el hombre como al medio
ambiente, en estos mtodos se tiene que realizar tratamientos previos a las
muestras lo que dificulta la obtencin de resultados. Considerando todo esto es
conveniente el uso de biosensores ya estos a pesar de sus desventajas ya
mencionadas esos nos dan resultados similares con respecto al EAA y
Wagtech Arsenator digital (ver tabla 6), adems estos no generan desechos
txicos para el hombre y son menos costos (Strosnider, 2003).

60

8 CONCLUSIONES

Se establecieron las condiciones optimas para la cuantificacin de arsnico en
agua de una manera rpida, eficaz y segura con las cepas E. coli pMV132-
arsR-ABS y E. coli pJ AMA-arsR-ABS.

El mtodo empleado para la cuantificacin de arsnico en agua usando la cepa
de E. coli pJ AMA-arsR-ABS posee una buena sensibilidad comparndola con
el mtodo marcado por la norma oficial mexicana.

Las determinaciones de arsnico en las nuestras problema nos dio respuestas
equiparables con los mtodos usados por la norma oficial mexicana.

Se desarrollo pruebas semicuantitativas, para la deteccin de arsnico para ser
aplicados en muestras de campo empleando la cepa de cepas E. coli pMV132-
arsR-ABS.

61

9 PERSPECTIVAS

Aun se requiere hacer ms estudios, acerca de la prueba semicuantitativa para la
deteccin de arsnico en agua en muestras de campo. Por ello se recomienda
establecer una escala de colores a diferentes concentraciones de arsnico a su
vez usando clculos de matrices para poder predecir las mejores combinaciones
de color, lo que nos permitir saber la concentracin aproximada que tiene la
muestra. Tambin sera ideal establecer una prueba cuantitativa usando las tiras
de papel impregnadas con el biosensor, diseando un mtodo colorimtrico y as
saber la concentracin exacta en la muestra problema.

62

10 ANEXO

MEDIOS DE CULTIVO

Medio de cultivo Luria (L)

Peptona de casena 10.0 g
Extracto de levadura 5.0 g
NaCl 10.0 g
H
2
O destilada 1000 mL
pH 7.0-7.2

Disolver los componentes uno a uno en agua destilada.
Ajustar el pH 7.0 7.2 con NaOH.
Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos.
Para preparar medio slido adicionar agar a una concentracin del 1.5%
Aforar y esterilizar.

Cuando se requiera medio L con antibiticos:

Esterilizar por filtracin los antibiticos.
Adicionar los antibiticos al medio de cultivo estril y enfriado a 75C
aproximadamente.
Las concentraciones finales de los antibiticos son:

Ampicilina 50 g/mL
Tetraciclina 10 g/mL
Kanamicina 25 g/mL

63

REACTIVOS

Regulador P (5 mM) pH 7

NaH
2
PO
4
H
2
O 0. 69 g
Na
2
HPO
4
7 H
2
O 1. 34 g
H
2
O desionizada 1000 mL

Ajustar el pH 7.0 con NaOH.
Esterilizar por filtracin.

Regulador Z pH 7

NaH
2
PO
4
H
2
O 5.5 g
Na
2
HPO
4
7 H
2
O 16.1 g
KCl 0.75 g
MgSO
4
7 H
2
O 0.246 g
-mercaptoetanol 2.7 mL
H
2
O desionizada 1000 mL

Ajustar el pH 7.0 con NaOH.
Esterilizar por filtracin.

ONPG (o-nitrofenil--D-galactopiransido) 4 mg /mL

Pesar 0.08 g de ONPG y disolverlo en 2 mL de regulador p, conservar en
refrigeracin a 4C.

64

SDS (Dodecil Suldato deSodio) al 1%.

Pesar 1 g de SDS y aforar a un volumen final de 100 mL con agua
desionizada.

SDS (Dodecil Suldato deSodio) al 0.1%

Tomar un mL de la solucin de SDS al 1% y aforar aun un volumen final de
100 mL

Carbonato de sodio 1M

Pesar 117 g de carbonato de sodio y disolverlo en 1000 mL de agua
desionizada.

Xgal (5-bromo-4-cloro-3-indolil -galactsido) 5 mg/mL.

Pesar 10 mg de Xgal en un tubo eppendorf de 2 mL, posteriormente adicionar
1mL de dimetilformamida, mezclar y cubrir el tubo con papel aluminio,
almacenar a 20C.

IPTG (Isopropil--D-tiogalactosido) 100 mM.

Pesar 0.23 g de IPTG, disolverlo en 10 mL de agua desionizada, esterilizar por
filtracin y conservar en alcuotas de 1 mL en congelacin.

Reactivo para realizar la reaccin de luciferasa

N-Decanal 2 mM en etanol/agua (50% v/v)
Se realiza una solucin 0.2 M (tomar 3.9 mL de n-decanal puro y aforar a 100
mL con una mezcla etanol/agua 50% v/v). Tomar un mL y aforar a 100 mL con
una mezcla de etanol / agua 50% v/v.

65

Reactivos Wagtech Arsenator Digital
Reactivo A1
cido Sulfmico (NH
2
SO
3
H) 1.0 g
Reactivo A2
Borohidruro de sodio (NaBH
4
) 3.0 g

PARMETROS ESTADSTICOS EMPLEADOS

Coeficiente de correlacin:

Donde:

, =Puntos individuales de la recta.
=Promedio de los valores de

Pendiente de la recta de mnimos cuadrados:

Donde:

, =Puntos individuales de la recta.

66

Ordenada en el origen de la recta de mnimos cuadrados:

=Pendiente de la recta

Error estndar de la regresin

Donde:

n-2=grados de libertad

Desviacin estndar de la pendiente:

67

Desviacin estndar de la ordenada en el origen:

Limite de deteccin (LD)=Y
B
+3S
B

Limite de cuantificacin (LC) =Y
B
+10 S
B

Limite de decisin (Ld)=Y
B
+6 S
B

Donde:

Y
B
=Lectura del blanco
S
B
=Desviacin estndar del blanco.

68

Tabla de distribucin de t

69

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