REPARACIN DE LOS DAOS EN EL ADN

Cono hemos venido viendo hasta el momento, existen muchos agentes fsicos y qumicos que pueden producir lesiones en el ADN. Por tanto, deben existir mecanismos que permitan prevenir y reparar los daos que se producen en el material hereditario tanto de forma espontnea como los inducidos. Como ya hemos visto cuando hablamos de la replicacin del ADN, la propia ADN polimerasa III posee la subunidad que tiene una funcin correctora de pruebas que permite detectar cuando la ADN polimerasa ha introducido un nucletido que no es el correcto y retirarlo. Este es un primer mecanismo que evita que se produzcan mutaciones durante la replicacin. Adems de este mecanismo existen otros que previenen posibles daos y que reparan las lesiones producidas:

Sistemas que evitan los errores antes de que ocurran. Reparacin directa de las lesiones en el ADN. Sistemas de reparacin por escisin. Reparacin posterior a la replicacin.

SISTEMAS QUE EVITAN LOS ERRORES ANTES DE QUE OCURRAN Superxido dismutasa: este enzima convierte los radicales superxido en perxido de hidrgeno. Catalasa: este enzima convierte el perxido de hidrgeno en agua. Gen mutT: este gen codifica para un enzima que impide la incorporacin de la 8-oxo-G al ADN. Este enzima hidroliza el trifosfato de la 8-oxo-G a la forma monofosfato. REPARACIN DIRECTA DE LAS LESIONES EN EL ADN Fotorreactivacin: sistema de reparacin directa de los daos producidos por la luz UV. La luz UV produce dmeros de pirimidinas, fundamentalmente dmeros de Timinas. El enzima Fotoliasa codificada por el gen phr reconoce en la oscuridad los dmeros de Timina y se une a ellos, y cuando se expone a la luz (mediante un fotn) deshace el dmero de Timinas. Transferasa de grupos alquilo (metilo o etilo): elimina los gupos alquilo producidos por el EMS o por NG. El enzima metiltransferasa transfiere el grupo metilo de la O-6-metilguanina a una cistena (cys) de la enzima. SISTEMAS DE REPARACIN POR ESCISIN Reparacin de los daos de la luz UV (Endonucleasa uvrABC): La Endonucleasa uvrABC es una escilnucleasa codificada por los genes uvrA, uvrB y uvrC que corta el ADN. La Helicasa II de ADN separa las dos hlices y retira 12 nucletidos. La ADN polimerasa I rellena el hueco producido por la Helicasa II y la Ligasa sella los extremos.

Reparacin AP: reparacin de las sedes apurnicas o apirimidnicas. La llevan a cabo las Endonucleasas AP de la clase I que cortan por el extremo 3' y las de la clase II que cortan por el extremo 5'. Una exonucleasa elimina una pequea regin que contiene entre dos y 4 nucletidos, la ADN polimerasa I rellena el hueco y la Ligasa sella los extremos. Reparacin mediante glucosidasas: estas enzimas detectan las bases daadas y las retiran rompiendo el enlace N-glucosdico con el azcar. Como consecuencia se origina una sede AP que se repara de la forma indicada anteriormente (reparacin AP). La Glucosidasa de Uracilo elimina el Uracilo (U) del ADN. La Glucoxidasa de Hipoxantina, elimina la Hipoxantina (H) del ADN. Adems de estas dos glucosidasas existen otras diferentes. Sistema GO: dos glucosidasas producto de los genes mutM y mutY actan conjuntamente para eliminar las lesiones que produce la 8-oxo-G (GO). REPARACIN POSTERIOR A LA REPLICACIN Reparacin de apareamientos incorrectos: la reparacin de apareamientos incorrectos posterior a la replicacin requiere la existencia de un sistema que sea capaz de realizar las siguientes operaciones:

Reconocer las bases mal apareadas. Determinar cual de las dos bases es la incorrecta. Eliminar la base incorrecta y sintetizar.

Esta reparacin la realizan los productos de los genes mutH, mutL, mutS y mutU. Adems, para distinguir la hlice de nueva sntesis de la hlice molde y as saber eliminar la base incorrecta, el sistema consiste utiliza el hecho de que la hlice de nueva sntesis tarda un cierto tiempo en metilarse la Adenina (A) de la secuencia GATC, mientras que la A de la secuencia GATC de la hlice molde ya est metilada. El enzima que reconoce la secuencia GATC metilando la A que contiene es la Metilasa de Adenina.

Reparacin directa: Fotorreactivacin

Reparacin por escisin: daos UV

Reparacin posterior a la replicacin

Reparacin sedes AP

Reparacin por recombinacin: cuando la ADN polimerasa III encuentra un dmero de Timina (T) producido por luz UV no sabe que nucletido poner saltando la regin y dejando un hueco. Como consecuencia esa regin queda como ADN de hlice sencilla. Debido a que la luz UV produce muchos dmeros de Timina, se produce un bloqueo en la replicacin y para evitar que la clula muera y pueda replicarse se dispara el sistema de emergencia SOS. La puesta en marcha del sistema SOS comienza porque el ADN de hlice sencilla activa a la protena RecA que a su vez interacciona con la protena LexA. La protena LexA es un represor de los genes uvrA, uvrB, uvrD, sulA y sulB. Todos estos genes tienen en el promotor una secuencia denominada caja SOS. La protena LexA normalmente impide la transcripcin o expresin de los genes citados anteriormente, pero cuando interacciona con la protena RecA deja de impedir la expresin de estos genes, pudindose sintetizar las protenas correspondientes y reparar los daos producidos por la luz UV.

REVERSIN
Restauracin total o parcial del fenotipo normal (apariencia externa, actividad proteica) a partir de un individuo mutante. Reversin genotpica: se produce por causas genticas. Reversin fenotpica: se produce por causas no genticas (ambientales). 1 mutacin Individuo Normal 2 mutacin Mutante

Revertiente Fenotipo normal

Fenotipo mutante Reversin

La reversin es una 2 mutacin que restaura total o parcialmente el fenotipo normal a partir de un individuo mutante. Al individuo que recupera el fenotipo normal por medio de esta 2 mutacin se le denomina Revertiente.

REVERSIN GENOTPICA La reversin genotpica se puede conseguir de dos maneras:

Retromutacin (en sentido estricto): consiste en recuperar la secuencia exacta de nucletidos en el ADN. Mutacin supresora: es una mutacin secundaria que restaura total o parcialmente la funcin prdida.

RETROMUTACIN Consiste en recuperar la secuencia exacta de nucletidos en el ADN, un ejemplo de esta situacin sera: AAA (lys)GAA(glu)AAA(lys). A veces tambin se habla de retromutacin en sentido funcional, de manera, que se recupera la actividad enzimtica normal pero no se recupera la secuencia original de nucletidos en el ADN, por ejemplo: UCC(ser)UGC(cys)AGA(ser). Sin embargo, el concepto de retromutacin funcional no se diferencia del concepto de mutacin supresora y puede inducir a error. MUTACIN SUPRESORA Es una mutacin secundaria que restaura total o parcialmente la funcin prdida. En la siguiente tabla se resumen los diferentes tipos de mutacin supresora: Mutacin Supresora intragnica Cambio de fase o pauta La 1 mutacin es una adicin y de lectura de signo la 2 mutacin es una delecin. opuesto

La segunda La segunda mutacin recupera Cambio de sentido en un mutacin afecta al la actividad de la protena o 2 sitio mismo gen que la enzima. primera. Mutacin supresora de codones sin sentido o de FIN. Por ejemplo, ARN-t de tyr que lee un Mutacin codn de fin (UAG) supresora Mutacin supresora de cambio e intergnica Mutaciones supresoras fase o pauta de lectura. Por informacionales ejemplo, ARN-t que lee un codn La segunda de 4 bases y suprime una mutacin afecta a adicin. un gen distinto al que afect la Mutacin supresora de cambio primera mutacin. de sentido. Por ejemplo, ARN-t de gly que lee codones de arg. Mutaciones supresoras Defecto en una ruta metablica

fisiolgicas

compensado por una segunda mutacin que abre otra ruta alternativa con el mismo resultado.

CARCTER PREADAPTATIVO DE LA MUTACIN

Una de las preguntas ms importantes acerca de las mutaciones es saber si estas se producen en los individuos de las poblaciones independientemente de si confieren o no al individuo alguna ventaja adaptativa, en cuyo caso la mutacin tendra un carcter preadaptativo, o si por el contrario, las mutaciones se producen como consecuencia de una adaptacin fisiolgica de los individuos al ambiente, en cuyo caso la mutacin tendra un carcter postadaptativo, ya que estara inducida por el propio ambiente. PRUEBA DE FLUCTUACIN (LURIA Y DELBRCK, 1943) Las mutaciones que confieren resistencia a agentes ambientales especficos que no son tolerados por los individuos normales o silvestres, se pueden estudiar con facilidad en bacterias. El fago T1 infecta y mata a la mayora de las clulas de E.coli. Si se siembra una placa con un gran nmero de bacterias (alrededor de 109) y fagos, la mayora de las bacterias morirn y unas pocas sobrevivirn produciendo colonias de bacterias resistentes que pueden ser aisladas. Cuando se observaron las primeras bacterias resistentes a T1 se pens que podan explicarse por mutacin al azar de un alelo sensible TonS a un alelo resistente TonR o bien a una adaptacin fisiolgica de la bacteria que detectara la presencia del fago y ajustara su metabolismo resistiendo la infeccin. Este ajuste fisiolgico sera semejante al realizado por las bacterias cuando se aade al medio un nuevo nutriente.

Adaptacin Fisiolgica

Mutacin al azar

Luria y Delbrck (1943) disearon un experimento ya clsico para distinguir entre estas dos hiptesis y la metodologa empleada serva para calcular tasa

de mutacin y continua utilizndose hoy da. Este experimento se ha denominado Prueba o test de Fluctuacin. Luria y Delbrck recibieron en 1969 el Premio Nobel por sus descubrimientos sobre el ciclo de reproduccin de los virus y el papel del material gentico en las bacterias y los virus.

Salvadore E. Luria

Max Delbrck

Luria y Delbrck pensaron que si la causa de la resistencia a T1 era un suceso de mutacin poco frecuente, tal suceso podra producirse pronto o tarde durante el crecimiento del cultivo bacteriano, ya que la mutacin es un fenmeno aleatorio a lo largo del tiempo. Si se produce pronto en la historia del cultivo dara lugar a una gran cantidad de clulas resistentes, por el contrario, si se produce tarde originara muy pocas clulas o bacterias resistentes. Por consiguiente, si se analizan muchos cultivos bacterianos pequeos, esperaramos una gran variacin en el nmero de bacterias resistentes de un cultivo a otro. Sin embargo, si se trata de una adaptacin fisiolgica no hay razn para esperar dicha variacin, ya que la adaptacin fisiolgica sera bastante constante en su funcionamiento. Para llevar a cabo el experimento utilizaron 20 cultivos pequeos de 0.2 ml con una concentracin inicial de 103 clulas de E.coli por mililitro. Adems iniciaron un cultivo grande de 10 ml con igual concentracin (103 clulas de E.coli por mililitro). Dejaron crecer ambos tipos de cultivos hasta alcanzar una concentracin de 109 clulas por mililitro (alrededor de 20 generaciones). Cada uno de los cultivos pequeos d 0.2 ml se sembr por separado en una placa que haba sido cubierta con una densa capa de fago T1. Por otro lado, tomaron 10 muestras de 0.2 ml del cultivo grande o masivo y las sembraron por separado en 10 placas cubiertas con una densa capa de fago T1. Si la resistencia se debiera a una mutacin al azar y poco frecuente que ha tenido lugar en alguna de las 20 generaciones transcurridas desde el inicio de los cultivos, en cada cultivo pequeo la mutacin se habra producido en un momento distinto, en algunos al principio (apareciendo como resultado muchas clulas resistentes), en otros al final (apareciendo pocas clulas resistentes) y en otros incluso ni se habra producido (no habra clulas resistentes). Por tanto, en los cultivos pequeos se observara una variacin grande en el nmero de colonias resistentes. Por el contrario, si la resistencia se debe a una adaptacin fisiolgica inducida por la presencia del fago T1, sera esperable que la tasa de clulas resistentes fuera la misma de un cultivo a otro.

El cultivo grande o masivo sirve como control, ya que lo que se espera en las 10 muestras de 0.2 ml tomadas de dicho cultivo es que todas tengan el mismo comportamiento ya que proceden del mismo cultivo grande y comparten la misma historia, por consiguiente, el nmero de colonias resistentes en las placas procedentes de las 10 muestras del cultivo grande debera ser semejante y la variacin sera muy pequea. Los resultados obtenidos fueron los siguientes: Cultivos procedentes del cultivo grande o masivo N de colonias N de colonias Nmero de cultivo Nmero de cultivo resistentes a T1 resistentes a T1 1 1 1 14 2 0 2 15 3 3 3 13 4 0 4 21 5 0 5 15 6 5 6 14 7 0 7 26 8 5 8 16 9 0 9 20 10 6 10 13 11 107 12 0 13 0 14 0 15 1 16 0 17 0 18 64 19 0 20 35 Media = 11.3 Media = 16.7 Varianza = 694 Varianza = 15 Coeficiente de variacin =61 Coeficiente de variacin =0.9 Cultivos pequeos de 0.2 ml Como puede observarse, los resultados obtenidos apoyan el carcter preadaptativo de la mutacin, es decir, la mutaciones se producen al azar independientemente de si confieren o no alguna ventaja adaptativa a los individuos.

PLACA REPLICADA (LEDERBERG Y LEDERBERG 1952)

El experimento llevado a cabo por Luria y Delbrck (1943) sugiere que el fago T1 selecciona a las bacterias que ya son previamente resistentes y no induce su aparicin. Es decir, el agente ambiental selecciona a los individuos de la poblacin que son previamente resistentes sin inducir su aparicin. Por consiguiente, cabe preguntarse si es posible demostrar la existencia previa de los mutantes resistentes en una poblacin antes de introducir el agente selectivo. Dicha demostracin la llevo a cabo el matrimonio Lederberg y Lederberg en 1952.

J. Lederberg

Experimento de la Placa Replicada (Lederberg y Lderberg 1952)

Sembraron una poblacin de bacterias (107 colonias) que no haban estado en contacto con el fago T1 en una placa sin el agente selectivo (sin fago T1). A esta placa se la llama Placa Matriz. Mediante un tampn o muequilla con una pieza de terciopelo estril de la forma de la placa se saca una copia de las colonias de la Placa Matriz poniendo en contacto la pieza de terciopelo con la Placa Matriz y posteriormente se aplica el terciopelo a tres placas nuevas (Placas replicadas) que contienen el agente selectivo (fago T1). Esta operacin se lleva a cabo marcando la Placa Matriz y las tres Placas Replicadas de manera que no se altere la posicin relativa de las colonias de la Placa Matriz. Teniendo en cuenta que la mutacin de resistencia es poco frecuente, aparecieron pocas colonias resistentes en las Placas Replicadas, pero lo ms interesante es que en las tres Placas Replicadas aparecan las mismas colonias resistentes y en las misma posiciones relativas. Si se tratar de una adaptacin fisiolgica a la presencia del fago T1, la distribucin espacial de colonias resistentes en las tres replicas no tendra que ser la misma. Sin embargo, si las bacterias ya eran resistentes al fago T1 antes de entrar en contacto con l, las tres replicas presentaran el mismo nmero de colonias resistentes y en las mismas posiciones. Adems, sera posible identificar en la Placa Matriz las colonias resistentes tomar muestras de ellas e iniciar un cultivo lquido en presencia de T1, si realmente son resistentes las bacterias creceran, cosa que sucedi. Sin embargo, si se toma de la Placa Matriz una muestra de colonias que no han originado bacterias resistentes en las replicas y se inicia

un cultivo lquido en presencia de T1 las bacterias no crecen. Por consiguiente, este experimento demuestra que en la poblacin inicial de bacterias sembradas en la Placa Matriz ya haba mutantes resistentes al fago T1 (agente selectivo) antes de haber estado en contacto con l, es decir, demuestra que la mutacin tiene Carcter Preadaptativo.

TASA Y FRECUENCIA DE MUTACIN

Tasa de mutacin: es el numero de mutaciones que se producen por unidad de tiempo, las unidades de tiempo que se emplean habitualmente son el perodo correspondiente a la vida de una clula, de un organismo (generacin) o de una divisin celular. Como puede observarse, las unidades de tiempo corresponden a unidades biolgicas. En el esquema de la izquierda ha tenido lugar una sola mutacin (M) y el perodo de tiempo completo para que la mutacin haya tenido lugar es o bien el nmero total de lneas (14 perodos generacionales) o bien el nmero total de divisiones celulares (siete). En este ltimo caso la tasa de mutacin sera 1/7. Esquema de tasa y frecuencia de mutacin Explicacin clculo de la tasa de mutacin

En general, las mutaciones son poco frecuentes, en la siguiente tabla (datos recopilados por Stadler) se indican las frecuencias de mutacin de diferentes loci en maz. N de gametos analizados Rr 554786 Ii 265391 Prpr 647102 Susu 1678736 Yy 1745280 Shsh 2469285 Wxwx 1503744 Gen N de mutaciones 273 28 7 4 4 3 0 N medio de mutaciones por milln de gametos 492.0 106.0 11.0 2.4 2.2 1.2 0.0

Como se puede observar en el caso de maz, diferentes genes muestran diferentes frecuencias de mutacin. Frecuencia de mutacin: es la frecuencia con la que se observa un tipo particular de mutacin (o mutante) en una poblacin de clulas o de individuos. La poblacin de clulas puede referirse a gametos, esporas sexuales o casi

cualquier otro tipo celular. En el esquema anterior la frecuencia de mutacin de la poblacin final de 8 clulas sera 2/8 = 0.25. En la siguiente tabla se indican algunas tasas y frecuencias de mutacin en varios organismos diferentes. Organismo
T2 (fago) T2 (fago) E. coli (bacteria)

Mutacin
Inhibicin lisis rr
+ +

Valor
1 x 10 3 x 10
+ -8 -9 -7 -8

Unidades
Tasa: Alelos mutantes por replicacin gnica Tasa: clulas mutantes por divisin celular

Rango de hospedador h h

Fermentacin de lactosa laclac Requerimiento de histidina his E. coli (bacteria) + his Chlamydomonas reinhardtii Sensibilidad a estreptomicina s r (alga) str sts Requerimiento de inositol inos Neurospora crassa (hongo) + inos Requerimiento de adenina ad Neurospora crassa (hongo) + ad Zea mays (maz) Drosophila melanogaster (mosca) Mus musculus (ratn) Homo sapiens (humanos) Susu, (ver tabla anterior) Color de los ojos Ww Pelaje de color diluido Dd

2 x 10 4 x 10 1 x 10 8 x 10 4 x 10

-6

-8

-8

Frecuencia por espora asexual Frecuencia por gameto Frecuencia por gameto

2.4 x 10 4 x 10 3 x 10

-6

-5 -5

Mutacin
Enfermedad de Huntington Sindrome "ua-rtula" Epilopia

Valor
0.1 x 10 -5 0.2 x 10 0.4-0.8 x -5 10
-5

Unidades

Autosmicos dominantes

Ligados al X recesivos Cultivo de clulas mdula sea

Poliposis mltiple en intestino -5 1-3 x 10 grueso -5 Acondroplasia (enanismo) 4-12 x 10 -5 Neurofibromatosis 3-25 x 10 -5 Hemofilia A 2-4 x 10 -5 Distrofia muscular de Duchenne 4-10 x 10 Normalresistencia a azaguanina 7 x 10
-4

Frecuencia por gameto

Tasa: clulas mutantes por divisin celular