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Inicialmente fue considerada inicialmente como una tcnica particularmente difcil de aprender. Sin embargo, hoy en da estas dificultades estn superadas gracias a factores como los medios de composicin definida, la disponibilidad de antibiticos, las instalaciones aspticas (salas de cultivo limpias, cabinas de flujo laminar, incubadores estriles, etc), dispositivos de cultivo (botellas con tapones filtrantes, placas de Petri ventiladas, etc).
En 1948, Earle y col. aislaron clulas de la lnea celular L y mostraron que eran capaces de formar clones en el cultivo de tejidos. Demostraron que para que una clula llegue a dividirse necesita ser alimentada con los nutrientes correctos. En 1952, Gry y col. establecen la primera lnea celular continua, las clulas HeLa. El medio empleado era extremadamente complejo y poco definido: plasma de pollo, extracto de embrin bovino y suero de cordn umbilical humano. En 1954, Rita Levi-Montalcini y col. establecen que el factor de crecimiento nervioso estimula el crecimiento de los axones en tejidos en cultivo. Este trabajo supuso el Premio Nobel para Levi-Montalcini en 1986. En 1955, Eagle realiza la primera investigacin sistemtica de los requerimientos nutritivos de las clulas en cultivo. En 1961, Hayflick y Moorhead establecieron que la duracin de los cultivos de fibroblastos era finita: podan mantener estos cultivos durante 12 pases. No consiguieron establecer lneas estables. En 1965, Ham introduce el primer medio definido libre de suero capaz de mantener algunas clulas de mamfero en cultivo indefinidamente. En 1969, Augusti-Tocco y Sato establecen la primera lnea celular estable de neuroblastoma aislando clones que establecan procesos nerviosos y que eran elctricamente excitables. Se empiezan a establecer las primeras lneas celulares diferenciadas. En 1975, Kohler y Milstein establecen la primera lnea celular productora de anticuerpos monoclonales. El establecimiento de la tecnologa de obtencin de anticuerpos monoclonales les vali el Premio Nobel. En la dcada de 1980 se empiezan a conocer los mecanismos de la transformacin. En la dcada de 1990 empezaron a producirse medicamentos a escala industrial en biorreactores. Se desarrolla la biotecnologa. En 1998 se produce cartlago mediante ingeniera de tejidos y en 2003 se experimenta el auge de esta nueva disciplina. En 2007 se reprograman clulas adultas para convertirlas en clulas pluripotenciales inducidas.
Cultivo de rganos Se coloca el rgano sobre una rejilla situada en la interfase lquido-gas de un medio del que obtiene los nutrientes y al que puede liberar los desechos. Este tipo de cultivo permite mantener, al menos en parte, la arquitectura caracterstica del tejido in vivo. Se conservan las interacciones histolgicas y, gracias a ello, este tipo de cultivo permite mantener los tipos celulares diferenciados, por lo que representan una buena rplica del tejido de origen. Sin embargo, no crecen mucho (la proliferacin celular se limita a las clulas embrionarias de la periferia) y no se pueden propagar. Se necesita un nuevo explante par cada experimento lo que supone mucho ms trabajo y una limitada reproducibilidad de la muestra. Cuantificar es difcil y la cantidad de material que se puede cultivar es reducida.
Explantes primarios Se coloca un fragmento de tejido o de rgano en la interfase slido-lquido de un soporte de vidrio o de plstico. Las clulas se adhieren a la superficie y las clulas de la periferia del explante pueden migrar y proliferar por la superficie del soporte.
Cultivo celular primario Es el tipo de cultivo ms utilizado. Se puede obtener a partir de explantes primarios o de suspensiones de clulas disgregadas. La disgregacin celular se realiza por mtodos enzimticos o mecnicos. En estos cultivos se pierden las interacciones clula-clula y las interacciones de la clula con la matriz extracelular. Sin embargo, las clulas son capaces de proliferar y la poblacin celular crece notablemente. Cuando las clulas ocupan toda la superficie disponible se dice que han alcanzado la confluencia. En esta etapa, las clulas establecen contactos entre ellas que inhiben su proliferacin y el crecimiento se detiene. Por eso, al cabo de un tiempo hay que transplantar las clulas a un nuevo soporte. Esta operacin se denomina subcultivo o pase.
Existen dos tipos de cultivo celular primario: Cultivos en monocapa: las clulas crecen adheridas sobre un soporte slido (plstico o vidrio). El anclaje al sustrato es un prerrequisito para la proliferacin celular. Es el mtodo utilizado para la mayora de las clulas excepto para las hematopoyticas. Cultivos en suspensin: las clulas se encuentran dispersas en el medio de cultivo. Su crecimiento no depende del anclaje. Este tipo de cultivo se restringe a las clulas hematopoyticas, clulas madre, lneas celulares transformadas y clulas tumorales. Alcanzan la confluencia cuando el nmero de clulas es grande y los nutrientes son insuficientes.
Subcultivos y lneas celulares Las clulas del cultivo primario en monocapa se dispersan por mtodos enzimticos y se pasan a un nuevo frasco de cultivo. En el caso de clulas en suspensin, sencillamente se diluyen en medio fresco. Los sucesivos cultivos as formados se denominan una lnea celular. La formacin de una lnea celular a partir de un cultivo primario implica que: aumenta el nmero de clulas obtenidas acaban predominando uno o dos tipos celulares: los que tienen mayor tasa de crecimiento la poblacin celular se hace uniforme y homognea sus caractersticas se conservan durante las sucesivas generaciones y, si se conservan en nitrgeno lquido, de forma indefinida
Normalmente, las lneas celulares tienen una vida finita que, segn el tipo de clula, se puede prolongar entre 20 y 100 generaciones. Superado ese lmite, las clulas entran en una etapa que se denomina senescencia en la que pierden su capacidad de proliferar, supuestamente por el acortamiento de los telmeros, y mueren. Sin embargo, algunas clulas (como las clulas de roedores y las clulas tumorales) evitan la senescencia y dan lugar a lneas celulares continuas, que crecen indefinidamente. Estas clulas pueden surgir de forma espontnea (exposicin a radiaciones ionizantes o a carcingenos qumicos) o inducida (infeccin vrica o transfeccin de ADN) y son el resultado de un cambio genotpico denominado transformacin.
Las clulas transformadas se caracterizan porque: Son inmortales: crecen indefinidamente Su crecimiento es aberrante: se pierde la inhibicin por contacto, la limitacin de la densidad celular durante la proliferacin y la dependencia del anclaje Son malignas: invaden tejidos y dan lugar al crecimiento de tumores Son genticamente inestables: son heteroploides (vara el nmero de cromosomas) y presentan aberraciones cromosmicas
En 1952 se obtuvo la primera lnea celular continua humana. Son las denominadas clulas HeLa, clulas extradas a partir de un tumor de cuello del tero de una paciente afroamericana que se llamaba Henrietta Lacks. Cultivos histotpicos y organotpicos Los cultivos histotpicos son cultivos de un solo tipo celular que consigue alcanzar una elevada densidad celular (tal y como ocurre en los tejidos). Los cultivos organotpicos constan de varios tipos celulares que interaccionan entre s de una forma que intenta parecerse lo ms posible a la original. El objetivo final de este tipo de cultivos es la creacin in vitro de tejidos u rganos completamente funcionales que puedan ser utilizados en injertos o en transplantes. Los cultivos organotpicos constituyen la base de una nueva disciplina denominada ingeniera de tejidos.
En la investigacin aplicada, las tcnicas de cultivo celular utilizan en reas tan diversas como: Virologa: Cultivo de virus animales y de plantas, produccin de vacunas, etc.
Biotecnologa: produccin industrial de frmacos en biorreactores (interfern, insulina, hormona de crecimiento, etc.) Inmunologa. Produccin fenmenos de inflamacin. de anticuerpos monoclonales, sealizacin,
Farmacologa: Efecto de diversos frmacos, interacciones con el receptor, fenmenos de resistencia, etc. Ingeniera de tejidos. Produccin de tejidos artificiales (piel, cartlagos) para el tratamiento de grandes quemados, injertos o autotransplantes, desdiferenciacin y diferenciacin inducida, etc. Toxicologa: citotoxicidad, mutagnesis, carcinognesis, etc.
la sustancia a las clulas sin que se diluya y sin que sufra ningn tipo de modificacin metablica. El coste de los ensayos clnicos se reduce considerablemente y se puede hacer un mayor nmero de pruebas. Tambin se reducen los costes relacionados con la fabricacin del posible nuevo medicamento: en lugar de fabricar cantidades del orden del gramo (para el estudio en animales) basta con que se sinteticen unos pocos miligramos. d) Cuestiones ticas La investigacin biomdica supone el sacrificio cada ao de muchos miles de animales de experimentacin. El cultivo celular no puede reemplazar siempre al ensayo 'in vivo' pero es una alternativa vlida en muchas situaciones. Para obtener un cultivo celular primario es posible que haya que sacrificar algn animal, pero con ellos se pueden ensayar un elevado nmero de condiciones experimentales que, en otras circunstancias, supondran el sacrificio de decenas o cientos de animales de experimentacin.
Los cultivos celulares tambin pueden suponer algunas desventajas: a) Tcnica sensible El crecimiento de las clulas animales se tiene que realizar en estrictas condiciones de asepsia porque su crecimiento es mucho ms lento que el de los contaminantes ms habituales (hongos, levaduras, bacterias, micoplasmas, etc.). Adems, las clulas animales son incapaces de mantenerse vivas en ausencia de la compleja mezcla de nutrientes presente en el plasma o en el fluido intersticial. Todo esto condiciona en gran medida el instrumental requerido y el grado de preparacin del personal encargado de los cultivos. b) Cantidad y coste Producir 1 gramo de clulas en cultivo cuesta 10 veces que obtenerlas a partir del tejido de un animal. En un laboratorio normal se pueden conseguir hasta 10 gramos de clulas
sin que se resienta mucho el presupuesto de investigacin. Para producir hasta 100 gramos de clulas hay que incrementar tanto el instrumental como el personal. Para producir cantidades mayores se necesitan instalaciones de tipo industrial. c) Inestabilidad Muchas lneas celulares continuas son inestables y adoptan una dotacin cromosmica aneuploide, lo que afecta tanto a su velocidad de crecimiento como a su capacidad para diferenciarse. Es posible, por tanto, encontrar diferencias significativas en la lnea celular de una generacin a la siguiente. La nica manera de evitarlo es emplear lneas estables que se resiembran cada determinado tiempo o despus de un determinado nmero de generaciones a partir de un stock congelado.
d) Desdiferenciacin e identificacin de las clulas Al propagarse la lnea celular, las clulas pierden las caractersticas fenotpicas propias del tejido de procedencia. Este fenmeno se denomina desdiferenciacin y, entre otras, cosas se hacen mviles e inician su proliferacin. La relacin entre las clulas cultivadas y las clulas originales del tejido puede perderse. En este caso se necesitan marcadores estables que permitan identificar la procedencia de las clulas. En algunos casos es posible revertir la desdiferenciacin, bien por procedimientos de diferenciacin inducida por hormonas, bien por compuestos qumicos (steres de forbol) pero no est claro si el estado rediferenciado es equivalente al estado de diferenciacin in vivo.
e) Validez del modelo 'in vitro' En realidad, un cultivo celular es un disgregado celular de un tejido y se diferencia de ste en que: se ha perdido la organizacin espacial tridimensional propia del tejido ya que stas se propagan en dos dimensiones. se han perdido las interacciones entre los distintos tipos celulares y entre las clulas y la matriz extracelular. Adems, al formarse una lnea celular slo se conservan uno o dos tipos celulares (los que proliferan a mayor velocidad). carece de los componentes sistmicos implicados en la regulacin de la homeostasis in vivo, especialmente los sistemas nervioso y endocrino. La presin parcial de O2 es reducida, ya que no hay un transportador de oxgeno como la hemoglobina. Por tanto, la energa se obtiene principalmente a travs de la glicolisis, ya que el ciclo de Krebs juega un papel muy reducido.
Por tanto, hemos de ser precavidos en cuanto a la validez de los resultados obtenidos in vitro porque pueden diferir de lo que pueda observarse in vivo.
Slo ocasionalmente puede mantenerse un cultivo primario durante ms generaciones de las esperadas. Es debido a la aparicin en el cultivo de clulas inmortales. Estas clulas forman lneas estables o cultivos celulares permanentes. En la mayora de los casos se desconoce la razn de la aparicin de clulas inmortales pero se ve favorecida por infecciones virales y por tratamientos con mutgenos, lo que podra estar relacionado con la prdida, espontnea o inducida, de las vas de control celular. La capacidad de un cultivo celular primario para establecerse como lnea estable est relacionada directamente con su variabilidad gentica. Las lneas celulares que nunca se establecen como estables se mantienen euploides, como es el caso de fibroblastos humanos, fibroblastos de pollo y la glia humana. Las lneas que, con frecuencia, se convierten en aneuploides son las que suelen transformarse en lneas celulares estables, como es el caso de las clulas epidrmicas. En general, una lnea celular ser tanto ms fcil de establecer o cultivar cuanto ms indiferenciada sea, con las excepciones de las lneas tumorales de clulas diferenciadas. Los cultivos primarios de muchos tipos celulares son posibles porque las clulas pierden algunas de sus propiedades diferenciadas, entre ellas la incapacidad de dividirse. Esta prdida de algunas de sus propiedades caractersticas puede deberse a desdiferenciacin o a desadaptacin. La desdiferenciacin implica una prdida irreversible de una propiedad diferencial del tipo celular. Por ejemplo, un hepatocito en cultivo puede perder algunas anzimas (como la arginasa o las aminotransferasas), o ser incapaz de almacenar glucgeno o de sintetizar las protenas del suero. En la desadaptacin, la prdida no es irreversible ya que se debe a la ausencia de algn tipo e seal (hormonal, nerviosa, etc.) y que basta con recuperar esa seal para que la caracterstica se vuelva a expresar. Por ejemplo, cuando crecen sobre una matriz de colgeno, los hepatocitos de rata pueden volver a expresar la enzima tirosina aminotransferasa en presencia de ciertas hormonas (insulina e hidrocortisona).