TP 5 : Microscopie

Licence Professionnelle Optronique Plate-forme optique

ufr

de physique

Le microscope utilis en TP prsente de nombreuses fonctionnalits : fond clair, fond noir, polariseurs croiss, contraste de phase. Il est aussi muni d'une camra qui vous permettra de visualiser vos chantillons sur un cran d'ordinateur. Il s'agira dans une premire partie de reprer les dirents composants et comprendre leur fonctionnement avant de passer la phase de rglage pour enn examiner quelques chantillons.

Prise en main
reconnatre les dirents composants

questions sur les caractristiques du microscope

En vous aidant des rappels de cours donns en n d'nonc 6 prciser :

Le grandissement minimum, maximum Pourquoi faut-il privilgier des objectifs avec une bonne planit et une correction chromatique ? Quelle est l'utilit d'un condenseur ? d'un diaphragme de champ ? d'ouverture ? Quelle est l'ouverture numrique maximale possible lorsque l'on travaille dans l'air ? Quelle est la meilleure rsolution que l'on puisse obtenir ? Quel est l'avantage principal dans le fait d'utiliser des objectifs de grossissement pas trop imporExpliquer pourquoi il vaut toujours mieux commencer les rglages avec des objectifs de grandisQuels sont les avantages de l'utilisation d'un systme contraste de phase par rapport la

tants (<x40) ? sement plus petits puis augmenter au fur et mesure ? technique de strioscopie ?

2
2.1

Rglages
Mise en place
Mettre une prparation en place (pelure d'oignon), utiliser l' objectif grossissement x10. Eectuer la mise au point l'aide du bouton (5) Fermer le diaphragme de champ (10) ainsi que le diaphragme d'ouverture (7)

a. Diaphragme de champ ni focalis, ni centr b. Diaphragme de champ focalis mais pas centr c. Centr et focalis mais le diamtre est trop petit d. Diamtre du diaphragme de champ = diamtre champ de vision (= illumination de Koehler)
gure a, rien n'est rgl, l'aide du bouton (3) eectuer le rglage en hauteur du condenseur, rechercher la plus grande nettet des bords du diaphragme de champ (gure b), rgler la vis bute (4) une fois la hauteur dtermine. Mais le diaphragme n'est toujours pas centr. Il faut agir sur les deux vis de centrage (9) du condenseur pour amener celui-ci au centre du champ (gure c). Ouvrir progressivement le diaphragme de champ (10) ceci permet de corriger le centrage si ncessaire. La gure d est le rsultat nal obtenir, ce rglage est appel rglage de Koehler.

2.2

Rglage des anneaux pour le contraste de phase

Pour cela nous allons utiliser la lunette de rglage, elle se positionne la place d'un des deux oculaires. Elle a pour but en tirant sur la partie amovible, de mettre au point les deux anneaux visualiss dans le trajet optique permettant ainsi le centrage prcis de l'anneau du condenseur en fonction de l'objectif contraste de phase PH1 ou PH2

Le centrage mcanique des anneaux de phase s'eectue l'aide de deux cls de centrage (2) amovibles. En serrant ou desserrant les vis de centrage et en observant dans la lunette, un des anneaux se dplace. Le rglage consiste superposer les deux anneaux.

talonnage
L'un des oculaires est muni d'une mire ou micromtre constitu de petits traits rgulirement Il faut, pour chaque objectif, dterminer la correspondance entre le micromtre oculaire et la taille

espacs. de l'objet tudi. Pour cela utiliser comme objet un micromtre constitu d'un trait de longueur 1 mm divis en segments de longueur 100 m.

Eectuer l'talonnage pour chacun des objectifs. Prcisez vos incertitudes de mesure. Dterminer les dimensions d'une cellule d'oignon, d'une vsicule ou de tout autre objet votre

disposition en utilisant la mthode d'observation la plus approprie.

Entre polariseurs croiss

Un premier polariseur est install de faon xe au niveau de l'oculaire, un deuxime mobile, se

trouve juste au dessus de la lampe d'clairage.

4.1

Dtermination de l'paisseur d'un ob jet

Sachant qu'une lame couvre objet fait 0.17 mm d'paisseur talonner la molette de mise au point, dterminer l'paisseur de petits cristaux ou de tout autre objet, prcision ?

4.2

paisseur optique

Croiser les polariseurs, placer la plaquette munie de la lame de quartz compensateur. Reprer les direntes couleurs et en tirer les variations de dirence de marche lorsqu'on fait coulisser la lame. Sachant que pour le quartz marche correspondent. tudier la birfringence d'une lame de mica

n0 = 1.5443

et

ne = 1.5534

, prciser quelles paisseurs ces dirences de

4.3

Ligne neutre

Vous avez votre disposition, dirents chantillons cristallins. Entre polariseurs croiss, rechercher les lignes neutres de dirents cristaux, expliquer votre dmarche. Expliquer les dirences entre un cristal un peu fractur ou abm mais monocristallin et un polycristal. Utiliser par exemple les chantillons R9 Gneiss, M7 Orthose ou l'Andsite.

Observations diverses
Vous disposez d'une couche mince de verre dans laquelle ont t dilue de tout petits cristaux

organiques, la taille de ces cristaux est de l'ordre de 0.5 non pourquoi ?

m. Expliquez ce que vous observez en clairage

direct et entre polariseurs croiss. Pouvez-vous conclure quelque chose sur la taille des cristaux et si Parmi les modes d'observation il existe l'clairage fond noir (bague DF)

Que voit-on l'aide d'un tel dispositif A quoi cela sert-il ?

6
6.1

Rappel de cours
Le microscope

6.1.1

gnralits

Le microscope est gnralement tudi en optique lmentaire comme une optique compose de l'association de deux systmes centrs : l'objectif et l'oculaire. Par exemple pour deux systmes de distances focales respectives 2 mm et 10 mm, spars de 180 mm et pour une image virtuelle la distance minimale de vision distincte de 250 mm, les lois des lentilles conduiraient un grossissement

180 2

250 10

= 2250

Un tel grossissement ne peut pas tre observ pour deux raisons :

L'augmentation des aberrations gomtriques lie l'ouverture numrique de l'objectif. La rsolution thorique limite la longueur d'onde par diraction.

Dans la ralit, un microscope optique permet d'obtenir un grossissement maximal de l'ordre de 1700, permettant d'observer des objets de dimension voisine de quelques microns.

6.1.2

grandissement-grossissement

Il convient de rappeler comment on distingue le grandissement du grossissement.

Le grandissement est le rapport de la hauteur de l'image, non accessible car sur la rtine, sur la Le grossissement est le rapport de l'angle sous lequel on observe l'image virtuelle de l'objet

hauteur de l'objet. travers le microscope sur l'angle sous lequel on observerait l'objet s'il n'y avait pas d'optique (i.e. sans le microscope). Malheureusement, une assez grande confusion entre les deux grandeurs rgne, compte-tenu du fait qu'elles mesurent le mme eet. Notamment il est courant d'utiliser la dnomination de grossissement commercial pour le grandissement obtenu l'aide d'une optique de focale l'image serait la distance minimale de vision distincte

f,

o la distance de l'oeil

dm = 25 cm

Grossissement commercial =

dm f

6.1.3

objectifs

Sur le ft de l'objectif sont graves entres autres des indications numriques du type : contraste de phase la notation PH remplace Plan. 160 reprsente la longueur (en mm) du tube sur lequel il doit tre viss.

40 /0.65

, elles reprsentent le grandissement et l'ouverture numrique. Quand l'objectif est aussi destin au

0.17 reprsente l'paisseur (en mm) de la lamelle de microscope qu'il faut placer sur l'objet pour que les aberrations soient minimales

6.2

Rle du condenseur

Il permet d'clairer de faon homogne le champ du microscope. Le dispositif le plus courant est le condenseur de Khler constitu d'une source lumineuse, suivie d'un diaphragme de champ (limitant l'illumination du champ microscopique visible) une lentille collectrice qui collecte la lumire de la source, un diaphragme d'ouverture permettant d'ajuster l'ouverture numrique du condenseur en fonction de celle de l'objectif utilis (donc d'ajuster la luminosit de l'image), et enn la lentille condenseur qui focalise l'illumination l'objectif, tout en clairant l'chantillon de faon homogne. Le rglage des dirents paramtres du condenseur est capital pour l'obtention d'une image rsolue et de bon contraste.

6.3

Ouverture numrique

L'ouverture numrique NA, est une caractristique essentielle d'un objectif, gure ci-dessous) o

N A = n sin

(voir

est l'indice du milieu, le plus souvent il s'agit de l'indice de l'air.

C'est elle qui est directement responsable de la luminosit et de la rsolution d'un objectif. Elle dpend directement de 1- l'indice de rfraction du milieu. 2- de l'angle form par trois points particuliers qui sont : le centre de la lentille, le foyer objet de la lentille et le bord de la lentille. Plus cet angle sera grand et meilleures seront la luminosit (plus de rayons lumineux se trouvent collects) et la rsolution. Deux autres caractristiques de l'objectif dpendent de l'ouverture numrique : ce sont la distance de travail D et la profondeur de champ 180

z .

Un objectif de haute qualit sera caractris par une grande

ouverture numrique (1.0<NA<1.45) ce qui a comme consquence une distance de travail limite (90

m)

et une profondeur de champ rduite (eet de sectionnement optique).

D'une manire gnrale les objectifs de faible grossissement (5x 20x) sont dots d'une faible NA (0.5 0.75), ils orent une grande distance de travail et une grande profondeur de champ. Les objectifs de grandissement suprieur (40x, 100x) ont une NA suprieure 0.75 et orent une excellente rsolution mais une faible profondeur de champ. Voici une illustration permettant de comprendre la notion de profondeur de champ.

6.4

Optique ondulatoire

La formation d'une image dans un microscope est la rsultante de deux fonctions de rpartition de la lumire

la fonction d'talement du point dans le plan focal conditionnant la rsolution latrale (en X et la fonction de dfocalisation conditionnant la rsolution axiale (en Z).

en Y). La fonction d'talement du point (ou PSF pour Point Spread Function) est la description mathmatique de l'image du disque d'Airy (gure ci-dessous) obtenue lorsque l'on observe un point lumineux idal (inniment petit) au travers d'un objectif. Elle est directement lie la rsolution.

6.5

Rsolution

La rsolution confre par un objectif est dite limite par la diraction. Elle rsulte des interfrences au niveau du plan image, des ondes lumineuses diractes le long du trajet des rayons.

La rsolution telle qu'elle est dnie par Rayleigh (dmin Rayleigh) correspond la distance entre deux points objets pour laquelle le maximum d'intensit du disque d'Airy du premier point correspond au premier minimum d'intensit du disque d'Airy du second point. Elle est gale en thorie

dmin = 0.61/N A.

Cette dnition n'est valable que si l'objectif collecte de la lumire provenant d'un

condenseur ayant la mme ouverture numrique.

6.6

Observation en fond clair

Un diaphragme iris plac devant la lampe permet de rduire le champ clair de faon viter que la lumire parasite pntrant dans le microscope puisse diminuer le contraste de l'image observe.

6.7

clairage en fond noir

L'clairage fond noir (bague DF : Dark Field) est un procd particulier d'clairage par lumire transmise, un cran arrte tous les rayons lumineux qui pntrent directement dans l'objectif, de sorte que les faisceaux qui clairent la prparation sont trs obliques, leur inclinaison tant suprieure l'angle d'ouverture

6.8

Contraste de phase

Une source ponctuelle S, suppose l'inni, claire un objet plat transparent AB qui est par exemple une lame face parallle mince. Une lentille L forme de la source S une image S' dans son plan focal image. L'image de l'objet AB se forme dans le plan conjugu A'B'. L'expression des vibrations lumineuses dans la face de sortie de la lame AB peut se mettre sous la forme : dans le plan image A'B' :

V0 = A sin t

et s'crira

V0 = A sin(t ).
7

Nous supposerons maintenant que l'objet AB, au lieu d'tre d'paisseur optique rigoureusement constante, prsente de petites variations locales d'paisseur optique, dues soit des variations d'paisseur

e,

soit des variations d'indice de rfraction

n.

Les irrgularits de chemin optique de l'objet se manifestent dans la structure de l'onde qui a travers cet objet. L'amplitude des vibrations de cette onde est partout constante, mais sa phase subit des altrations locales. Aprs traverse de l'objet la surface d'onde prsente un prol irrgulier retant les ingalits de chemin optique de l'objet, et les vibrations arrivant dans le plan image peuvent se mettre sous la forme :

V = A sin(t + )

est l'avance de phase, positive ou ngative et

variable de place en place. Comme l'oeil n'est pas sensible aux phases du phnomne lumineux et que l'clairement en chaque point est proportionnel L'expression

A2 ,

le plan image paratra uniformment clair. Les ingalits de chemin

optique ne se manifesteront pas dans la perception de son image.

peut se mettre sous la forme :

V = A cos sin(t ) + A sin cos(t ) 1

et

Si les uctuations locales de chemin optique introduites par l'objet restent petites par rapport

de la lumire : V = A sin(t ) + A cos(t ).

la longueur d'onde

sin , l'expression de V se simplie : V peut tre considre comme due la superposition de deux ondes : l'onde principale V0 = A sin(t ) non aecte par les irrgularits de chemin optique de l'objet, et une onde secondaire : V1 = A cos(t ) dont l'amplitude A reste
L'onde lumineuse petite et varie localement, proportionnellement aux variations locales de chemin optique. principale et de ne conserver que l'onde d'amplitude variations de phase taient donc bien visibles. Dans le cas du TP ltrage du 1er semestre nous avions plac une tache opaque sur le trajet du faisceau principal de faon ne laisser passer que les rayons diracts par l'objet de phase. Le procd d'observation imagin par Zernike en 1934 dire de la strioscopie par le fait que la lame qui couvre la tache de l'onde principale est maintenant une lame d'paisseur optique un dphasage de

2,

cos

Remarque : Dans le cas du TP ltrage, la tche noire nous avait pour but d'liminer l'onde A et donc d'intensit proportionnelle 2 . Les

/4

, c'est--dire impliquant

2 . Si V0

est avanc de

2 on parle de contraste de phase positif, dans le cas contraire

le contraste de phase sera ngatif.

En l'absence de lame de phase, les ondes principales

V0

et secondaires

V1

sont en quadrature, aprs

introduction de la lame de phase elles sont en concordance, soit en opposition de phase. Dans le cas

V0 = A sin(t + 2 ) et l'onde rsultante aura l'expression : V = V0 + V1 == A sin(t + ) + A cos(t ) = A(1 + ) sin(t + ). 2 2 2 L'clairement du fond (endroits o = 0) est proportionnel I0 = A . Aux rgions de l'image
de contraste de phase positif, l'onde principale devient : correspondant une avance de phase de l'onde (

> 0),cavit

de l'objet) l'clairement est

A2 (1 + )2

A2 (1 + 2).

Aux rgions de l'image correspondant un retard de phase de l'onde (

I1 = < 0,

bosses de l'objet) l'clairement est

A2 (1 2 ||). Les cavits de l'objet donnent des images plus claires,

les bosses des images plus sombres que le fond. De la rpartition d'intensit dans le plan image on peut en dduire la topographie de l'paisseur optique de l'objet. Si le contraste de phase est ngatif , les contrastes sont inverss.

6.9

Biblio

G. Dvor et R. Annequin : Cours de Physique : Optique II (Vuibert 1964) G. Bruhat : Optique (Masson 1942) Sextant : Optique exprimentale (Hermann 1997) Y. Usson : Bases de la microscopie (cours net : http ://www-timc.imag.fr/Yves.Usson/COURS/BASES-MICROSCOPIE.pdf ) Notice Leca