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05/04/2013

Biorreatores e Processos Fermentativos

Aula 6 Profa. Dra Ilana L. B. C. Camargo Cincias Fsicas e Biomoleculares IFSC - USP

Biorreator ou fermentador

PARTE II

05/04/2013

Biorreator ou fermentador
Classificao dos biorreatores

Quanto ao tipo de biocatalisador;

Quanto configurao do biocatalisador (clulas/enzimas livres ou imobilizadas); Quanto forma de se agitar o lquido no reator.

Biorreator ou fermentador
Biocatalisadores: Enzimas ou clulas vivas (microbianas, animais ou vegetais)

Classificao dos Biorreatores quanto ao tipo de biocatalisador: Grupo dos Reatores Bioqumicos Biorreatores nos quais as reaes ocorrem na ausncia de clulas vivas, ou seja, so tipicamente os reatores enzimticos;

Grupo dos Reatores Biolgicos Biorreatores nos quais as reaes se processam na presena de clulas vivas;

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Biorreator ou fermentador

Classificao mista dos biorreatores segundo Kleinstreuer: Baseada no tipo do biocatalisador empregado (enzima, microrganismo aerbio ou anaerbio) e na configurao deste (livre, imobilizado ou confinado entre membranas)

Grande variedade !!!

I) Reatores em fase aquosa (fermentao submersa) (I.1) Clulas/enzimas livres Reatores agitados mecanicamente (STR: Stirred tank reactor) Reatores agitados pneumaticamente - Torre - Coluna de bolhas - Reatores air-lift Reatores de fluxo pistonado (plug-flow) (I.2) Clulas/enzimas imobilizadas em suportes Reatores com leito fixo Reatores com leito fluidizado (I.3) Clulas/enzimas confinadas entre membranas Reatores com membranas planas Reatores de fibra oca (hollow-fiber)

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II) Reatores em fase no-aquosa (fermentao semi-slida) Reatores estticos (reatores com bandejas) Reatores com agitao (tambor rotativo) Reatores com leito fixo Reatores com leito fluidizado gs-slido

Biorreator ou fermentador
I. Reatores em fase aquosa (fermentao submersa) (I.1) Clulas/enzimas livres Mais amplamente utilizados: reatores agitados mecanicamente (STR, stirred tank reactor), conhecidos tambm como reatores de mistura, constituindo cerca de 90% do total de reatores utilizados industrialmente.

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Reatores agitados mecanicamente (STR)

Agitao mecnica favorece a homogeneizao, suspenso de slidos, disperso gs-lquido, aerao e a transferncia de calor e massa Chicanas / Baffles
Quebra espuma

Agitadores

Sistema de aerao

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Reatores agitados mecanicamente (STR) Agitadores ou impelidores: geralmente so colocados em volta de um eixo central rotatrio e distribudos ao centro e fundo do tanque. O tipo, tamanho e nmero de agitadores, bem como a localizao influenciam diretamente na mistura e transferncia de massa no reator. A velocidade de rotao (rpm) dos agitadores definida pelo usurio. Principais agitadores:

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Reatores agitados pneumaticamente Pense nos aqurios!! Ar

Ar

Microrganismos para decomposio

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Reatores agitados pneumaticamente a)Biorreatores em torre b)Biorreatores coluna de ar/bolhas c)Biorreatores air-lift (Loop reactor)

Tubo difusor

A B Reator tipo Torre


Relao altura/dimetro de 3:1 Pode ter at 20 m de altura!

C Reatores tipo Loop reactor

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Reatores agitados pneumaticamente Biorreatores coluna de ar/bolhas Ponto de vista construtivo mais simples Cilindro com fundo e tampas abauladas Serpentinas de resfriamento internas ou externas Entrada de ar pelo fundo

Produo de cido ctrico at antibiticos Relao altura/dimetro de 4:1 a 5:1 Pode chegar at 23 m de altura
Quando h serpentinas internas, passam a funcionar mais como air-lift e no como bubble column fermenter

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Reatores agitados pneumaticamente Biorreatores com borbulhamento / coluna de ar

Miniatura
Betts and Baganz Microbial Cell Factories 2006 5:21

http://www.microbialcellfactories.com/content/figures/1475-2859-5-21-3-l.jpg

http://ct-cr4.chem.uva.nl/bc/lit_radi.html

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Reatores agitados pneumaticamente Biorreatores com borbulhamento / coluna de ar

Ausncia de agitao mecnica Menores tenses de cisalhamento

Aplicao: clulas animais e vegetais

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Reatores agitados pneumaticamente Biorreatores air-lift - promove movimentao cclica do fluido usando um cilindro central em cuja base inserido o ar A presena do tubo difusor permite: Aumentar a mistura axial no reator; Reduzir a coalescncia das bolhas que circulam numa mesma direo (igual a do lquido); Equalizar as foras de cisalhamento ( distribuda

uniformemente pelo reator).

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Reatores agitados pneumaticamente Biorreatores air-lift Regies do Tubo Difusor
Riser / fluxo ascendente: regio onde as bolhas de gs so liberadas. Pode ser dentro ou fora do tubo central. A ascenso das bolhas causa o fluxo de lquido na direo vertical. Para contrabalanar, o lquido flui em direo descendente no downcomer / fluxo descendente. Isto permite a circulao do lquido e aumenta a eficincia de mistura quando comparado a coluna de bolhas.
Zona de alvio

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Reatores agitados pneumaticamente Biorreatores air-lift Zona de Alvio: Adiciona volume ao reator; Reduz a espuma; Minimiza a circulao de bolhas pelo downcomer devido ao sbito alargamento do topo do reator que diminui a velocidade da bolha e a libera do fluxo do lquido. Assim previne-se a entrada de bolhas ricas em CO2 no downcomer; Reduo da perda de meio devido a formao de aerossol Os reatores airlift so utilizados com fluidos menos viscosos e quando h necessidade de agitao mais suave e transferncia de oxignio a baixo custo.
Zona de alvio

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Reatores agitados pneumaticamente Biorreatores air-lift Caractersticas: Extrema simplicidade
Baixo investimento Maior facilidade para ampliao da escala Menor consumo de energia Adaptao mais fcil ao cultivo de clulas sensveis ao cisalhamento Relao de altura dimetro varia de 5:1 at 10:1 Relao do dimetro do tubo central e dimetro do reator de 0,6 0,8, o que maximiza a circulao do meio e, portanto, obtm menor tempo de mistura

Biorreator ou fermentador
Desvantagens dos Biorreatores tanque agitado mecanicamente em relao aos air-lift :

-Maior consumo de energia -Maior nvel de espuma -Nem sempre compatvel com alguns tipos de clulas (animais e vegetais)

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Reatores de fluxo pistonado (plug-flow) Meio e inculo so misturados a partir da base do reator e a cultura flui, idealmente, em velocidade constante, sem ocorrer mistura longitudinal.
Meio Inculo

O fluxo contnuo e o tempo dentro do reator curto, por isso utilizado para reaes rpidas.

http://www.pilot-plant.com/images/plug-flow-reactor.jpg

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(I.2) Clulas imobilizadas em suportes

Principal caracterstica:
Estrutura fsica de confinamento que obriga as clulas a permanecerem em uma regio particular de um biorreator

Sem necessidade de clulas vivas

Enzima/Sistema ezimtico envolvido na converso bioqumica ativo (1 ou algumas, sem coenzimas e vias anablicas presentes na replicao celular)

Com necessidade de clulas vivas

Produtos a serem formados requerem mltiplos passos de transformaes, regenerao de coenzimas, presena de cadeia respiratria, vias metablicas geradoras de intermedirios e outros inerentes s clulas vivas

Schmidell W. et al, 2001. V.2 cap. 16

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(I.2) Clulas imobilizadas em suportes

Vantagens do uso da clula imobilizada: Possibilidade de utilizao de altas concentraes celulares no volume reacional, implicando em maiores velocidades de processamento; Operao de sistemas contnuos com velocidade de alimentao acima da velocidade especfica mxima de crescimento da clula (no imobilizada); Eliminao de problemas com reciclo externo de clulas (sedimentadores, filtros, centrfugas); Provvel obteno de maiores fatores de converso de substrato ao produto desejado; Possibilidade de utilizao de projetos de biorreatores mais adequados cintica do sistema biolgico utilizado; Maior proteo ao sistema biolgico em relao ao estresse ambiental, ocasionado por elevadas concentraes de substratos, pH e cisalhamento.
Schmidell W. et al, 2001. V.2 cap. 16

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(I.2) Clulas imobilizadas em suportes

A imobilizao conseguida atravs do contato do material utilizado para a imobilizao com as clulas vivas que se pretende imobilizar, sob condies ambientais controladas. O material utilizado para a imobilizao denominado Suporte. Caractersticas de um suporte: a) No ser txico para as clulas; b) Ter alta capacidade de reteno; c) Ser resistente ao ataque qumico e microbiano; d) Ter pouca sensibilidade s possveis solicitaes mecnicas (compresso por peso, tenses de cisalhamento ou presses internas ou externas de gases); e) Alta difusividade de substratos e de produtos.

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(I.2) Clulas imobilizadas em suportes

Polmeros naturais
Alginato K-Carragena gar Pectina Dextrana Colgeno Celulose

Polmeros sintticos
Poliacrilamida Cloreto de polivinila Poliestireno Poliuretano Polietileno glicol

Materiais inorgnicos
Alumina Slica Zircnia Vidro Diatomita Vermiculita

Mtodos de imobilizao em partculas:


Adsoro, Ligao covalente e Envolvimento

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(I.2) Clulas imobilizadas em suportes

Reatores com leito fixo ou fluidizado

Mtodos de imobilizao em partculas 1. Adsoro (interaes eletrostticas, ligaes inicas e ligaes covalentes parciais) Limitao: Influncia do meio na capacidade de reteno das clulas ao suporte (concentrao inica, pH, e idade da populao celular)
Suportes comerciais utilizados no mtodo de adsoro Nome comercial
Cytodex Cytopore Cytoline Siran

Material
dextrana Celulose Polietileno e slica Vidro poroso

Dimetro (mm )
0,20 0,23 2,0 a 2,5 1,0 a 2,0

Densidade (g/mL)
1,04 1,03 1,03 a 1,3 1,6

Clula
Mamfero Mamfero e microrganismo Mamfero e microrganismo microrganismo

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(I.2) Clulas imobilizadas em suportes Reatores com leito fixo ou fluidizado

Mtodos de imobilizao 2. Ligao covalente (suporte com grupamento qumico responsvel


pela imobilizao da clula ao suporte) silanizao de esferas de vidro (100 a 500m) seguida de reao com glutaraldedo.
(100 a 500 micra)

O
Suporte

O
Suporte

HO

O H

-O-Si-C-C-C-NH2 O

-O-Si-C-C-C-N-C-C-C-C-C O

Tratamento com -aminopropil-trietoxisilano (APTS)

Tratamento do aminoalquil-suporte com glutaraldedo

Interao da carbonila do suporte com aminas da parede celular

Limitao: Potencial toxicidade do sistema devido ao Glutaraldedo


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(I.2) Clulas imobilizadas em suportes Reatores com leito fixo ou fluidizado

Mtodos de imobilizao 3. Envolvimento - Imobilizao de clulas vivas Mais usado!!

Confinamento de uma populao celular em uma matriz polimrica formadora de um gel hidroflico. Os poros da matriz formada so menores que as clulas contidas em seu interior. Materiais mais utilizados para partculas de gel so os polmeros naturais: Agar K-carragena Alginato Pectina
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Meio

Substrato

Produto

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Imobilizao de clulas por envolvimento em gel hidroflico induzida por Ca2+ e K+


Soluo do polmero em gua 1 a 4%

Polissacardeo + Clulas

Partculas contendo clulas imobilizadas


Agitador magntico

Soluo de KCl ou CaCl2 0,05 a 0,5M

Partculas com dimetro de 0,5 ou 5 mm e densidade populacional de at cerca de 250 mg de biomassa seca g-1 de matriz

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(I.2) Clulas imobilizadas em suportes Reatores com leito fixo ou fluidizado

Mtodos de imobilizao 3. Envolvimento Vantagens: a) Facilidade b) Baixssima toxicidade c) Alta capacidade de reteno celular

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(I.2) Clulas imobilizadas em suportes Reatores com leito fixo ou fluidizado

Mtodos de imobilizao 3. Envolvimento Desvantagem: Limitao imposta pela difuso intraparticular de substratos e produtos metablicos Para minimizar os efeitos, deve-se otimizar: O tamanho da partcula; A difusividade das espcies atravs da matriz polimrica Concentrao celular na partcula

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(I.2) Clulas/enzimas imobilizadas em suportes Reatores com leito fixo ou fluidizados

O confinamento celular permite a utilizao de biorreatores de configuraes bastante diferenciadas.

A maior parte dos biorreatores estudados para sistemas de clulas imobilizadas consistem-se de colunas operadas continuamente, contendo leito fixo ou fluidizado das partculas com as clulas imobilizadas.

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(I.2) Clulas/enzimas imobilizadas em suportes

Reatores com leito fixo

Clulas ou enzimas so imobilizadas em grandes partculas slidas ou gelatinosas formando pacotes. O meio adicionado ou bombeado atravs da coluna preenchida com partculas onde esto aderidas ou aprisionadas as clulas que vo converter o substrato em produto.

Suportes slidos: clulas se aderem na superfcie Partculas de gel: clulas aprisionam-se na rede de polmero (melhor
reteno e maior rea efetiva superficial para imobilizao)

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(I.2) Clulas/enzimas imobilizadas em suportes Reatores com leito fixo

Biocatalisador suporte inerte

imobilizado (alginato,

em

um

K-carragena,

pectina, cermica, vidro, slica etc). Finalidade: atingir, manuteno celulares, de elevadas podendo-se elevadas

concentraes

consequentemente,

produtividades no processo em questo

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(I.2) Clulas/enzimas imobilizadas em suportes Reatores com leito fixo

Aplicaes: -Tratamento de resduos (suportes slidos filtros biolgicos) -Produo de enzimas (suportes gelatinosos) -Biotransformao de esterides - Produo tradicional de vinagre!

Schmidell W. et al, 2001. V.2 cap. 16

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(I.2) Clulas/enzimas imobilizadas em suportes

Reatores com leito fixo: produo de vinagre


Mistura de soluo de lcool acidificado com cido actico e nutrientes para o crescimento de bactrias produtoras do cido actico e inculo de espcies de Acetobacter. 25-300C. necessrio sistema de controle de temperatura e o vinagre produzido em 10 dias por este mtodo.

Bacilo GAerbio

Raspas de madeira Grades de madeira

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(I.2) Clulas/enzimas imobilizadas em suportes Reatores com leito fixo

Vantagens: -Fcil recuperao do produto Desvantagens: -Deficincia na transferncia de O2 e nutrientes; -Entupimento (crescimento das clulas) e alteraes de fluxo (caminhos preferenciais); -Homogeneizao prejudicada; -Com o tempo h perda por lavagem de clulas aderidas ou aprisionadas

Schmidell W. et al, 2001. V.2 cap. 16

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(I.2) Clulas/enzimas imobilizadas em suportes Reatores com leito fixo

Departamento de Hidrulica e Saneamento - SHS, da Escola de Engenharia de So Carlos - EESC/USP

Desenvolvimento de Reator Horizontal de Leito Fixo para Tratamento de Esgotos Sanitrios.

Reator anaerbio de leito fixo

Biomassa imobilizada em Espuma de poliuretano

http://www.finep.gov.br/Prosab/1_esgoto_usp.htm

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(I.2) Clulas/enzimas imobilizadas em suportes

Reatores com leito fluidizado

Adsoro ou envolvimento

Podem ser definidos como grandes tubos ocos (colunas verticais) dentro dos quais partculas contendo clulas ou enzimas imobilizadas so carregadas (at cerca de 70% do volume til) fluidizadas ou expandidas atravs de um dos mecanismos: 1) Gs inerte (N2 ou CO2) ou ar atmosfrico inserido na base da coluna; 2) Reciclo parcial do efluente da coluna; 3) Movimentao interna do fluido promovida por agitao mecnica

Eventualmente: prprio gs carbnico formado durante o processo

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(I.2) Clulas/enzimas imobilizadas em suportes

Reatores com leito fluidizado

Movimentao interna do fluido promovida por agitao mecnica.

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(I.2) Clulas/enzimas imobilizadas em suportes

Reatores com leito fluidizado

Conforme o gs passa pelo distribuidor, o meio contendo as partculas slidas se agita fazendo com que tenhamos um fluxo (Leito empacotado). Se esse fluxo alcana uma certa velocidade as partculas slidas se dispersam no lquido e se tem o leito fluidizado. Muito usado na indstria petroqumica.
http://www.nationmaster.com/encyclopedia/Fluidized-bed-reactor

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(I.2) Clulas/enzimas imobilizadas em suportes

Reatores com leito fluidizado

Vantagens: - Alta taxa de transferncia e homogeneizao; -Baixo atrito; -Fcil recuperao do produto (no precisa separar as clulas) -No h problemas de entupimento como leito fixo -Boa produtividade volumtrica (maior que leito fixo e tanques agitados)

Schmidell W. et al, 2001. V.2 cap. 16

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(I.2) Clulas/enzimas imobilizadas em suportes

Reatores com leito fluidizado

Biofilme no carvo

O reator foi construdo em ao carbono zincado a quente, com dimetro da base de 1,50 m e 15,0 m de altura, tendo como material do leito, partculas de carvo ativado granulado. Foi utilizado, para receber e tratar cerca de 40% da vazo dos esgotos gerados no Campus I da USP, de So Carlos - SP. As fotos apresentam este reator e uma partcula (recheio) de carvo ativado, mostrando o seu aspecto na fase de aderncia de microrganismos para a formao do biofilme.

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(I.3) Clulas/enzimas confinadas entre membranas
- Reatores com membranas planas - Reatores de fibra oca (hollow-fiber)

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(I.3) Clulas/enzimas confinadas entre membranas
- Reatores com membranas planas
Bioreactor de membrana combina tratamento biolgico com um processo de separao utilizando membranas de microfiltrao. constitudo por um tanque reator e uma unidade de microfiltrao. No reator, os microrganismos (principalmente bactrias) transformam matria poluda dissolvido em biomassa, e do nitrognio amoniacal ("amonaco") em nitrato. Assim poluentes orgnicos biodegradveis so eliminados pelo biorreator (gorduras, cidos orgnicos, resduos vegetais, etc), bem como um certo nmero de metais que so oxidados em compostos insolveis em grande parte. Os slidos em suspenso so ento eliminados por meio da membrana de microfiltrao.

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(I.3) Clulas/enzimas confinadas entre membranas

- Reatores de fibra oca (hollow-fiber)

http://www.fibercellsystems.com/about.htm

(I.3) Clulas/enzimas confinadas entre membranas

- Reatores de fibra oca (hollow-fiber)

http://www.fibercellsystems.com/advantage.htm

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II) Reatores em fase no-aquosa (fermentao semi-slida) Definio de fermentao semi-slida: Processo que se refere a cultura de microrganismos sobre ou dentro de partculas em matriz slida (substrato ou material inerte), onde o contedo de lquido (substrato ou meio umidificante) ligado a ela est a um nvel de atividade de gua que, por um lado, assegure o crescimento e metabolismo das clulas e, por outro, no exceda a mxima capacidade de ligao da gua com a matriz slida
Materiais insolveis em gua sobre os quais microrganismos crescero: -Suporte slido que atua como fonte de nutrientes; -Matriz slida, inerte ou no, que absorve o meio de cultura lquido que traz os nutrientes.

Em geral, na literatura, o suporte slido atua como fonte de nutrientes

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II) fermentao semi-slida

Substrato forma natural: bagao da cana, sabugo de milho produtos ou resduos agroindustriais baixo ou nenhum valor comercial - forma sinttica: argila Pode-se incorporar soluo nutriente ao substrato slido, visando adequ-lo melhor s condies nutricionais do microrganismo para a fermentao desejada

Ex. Produo de -galactosidase por Aspergilus niger em composto de farelo de trigo. So adicionados: uria (fonte de nitrognio), gua de macerao de milho (fonte de fatores de crescimento), farinha de soja (indutores da enzima) e cido ctrico (favorece a produo da enzima)

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II) fermentao semi-slida

Caracterstica do substrato para maior rendimento: - Alto grau de acessibilidade do microrganismo a todo o meio Porosidade Tamanho Formato das partculas Porosidade: absoro de gua, facilita transporte de enzimas e metablitos por entre o meio e os microrganismos Tamanho das partculas velocidade de fermentao

Granulometria prpria para permitir circulao do ar, dissipao de gases e calor

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II) fermentao semi-slida

Exemplos de matria prima para fermentao em estado slido e produtos finais: Farelo e palha de trigo, farinha e farelo de soja, palha de arroz, bagao da cana Produo de enzimas Bagao da ma, de uva, melao de cana-de-acar produo de lcool Bagao de cana, gua de macerao de milho, farelo de milho produo de antibiticos Soja miso, shouyo

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II) fermentao semi-slida

Microrganismos: Fungos filamentosos (baixos nveis de gua no sistema) Rhizopus renina microbiana Trichoderma Penicillium penicilina Aspergillus Bactria: Bacillus thurigiensis produo de bioinseticida amilase

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II) Reatores em fase no-aquosa (fermentao semi-slida)

Reatores estticos Reatores com agitao Reatores com leito fixo Reatores com leito fluidizado gs-slido

Reatores de vidros Reatores de bandejas (madeira, bambu, alumnio) Esteira rolante Tubular horizontal (tambor rotativo)

Ausncia de gua livre teor de umidade 30 a 80% que depende das caractersticas de reteno de gua do substrato slido empregado

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II) Reatores em fase no-aquosa (fermentao semi-slida)

Cultivo dos microrganismos em suportes slidos sob baixo teor de umidade (frascos, colunas, tanques, bandejas ou tambores rotatrios) Suportes podem ser resduos agrcolas (palha, fibra de cascas de arroz, trigo, milho, mandioca), alimentos (gros e farinhas) ou ainda suportes inertes (argilas). Fermentao ocorre em nveis de umidade semelhantes aos encontrados no ambiente natural dos microrganismos Muito usado para processos que envolvem microrganismos filamentosos como a produo de enzimas por fungos filamentosos

Biorreator ou fermentador
II) fermentao semi-slida

Exemplos

Queijo Roquefort
produzido com leite de ovelha no-pasteurizado ao qual adicionado o fungo Penicillium roqueforti. A umidade e a quantidade de ar no local de maturao, necessrias para que o fungo se desenvolva no queijo, so rigorosamente controladas. Originrio da regio de Rouergue, Frana, tem forma cilndrica e pesa de 2 kg a 3 kg. A casca pegajosa de cor marfim bem clara e a textura macia, com um aroma caracterstico e sabor que pode ser mais ou menos picante de acordo com o grau de maturao.

10 oC 90% umidade vrias semanas


http://www.queijosnobrasil.com.br/queijo_roquefort.htm http://www.frenchentree.com/tarn-aveyron-food-drink/DisplayArticle.asp?ID=16885

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II) fermentao semi-slida

Celulase Foi observada a atividade celuloltica de extratos enzimticos obtidos a partir de Trichoderma reesei, Trichoderma viride, Penicillium citrinum, Penicillium chrysogenum, e Fusarium oxysporum, tendo como substrato palha de trigo, bagao de cana seco ao sol, casca de arroz e fibra de coco. Foram utilizadas, como condies de processo, um pH inicial de 5,8 a um teor de umidade de 80% e temperatura de 250C a 300C, durante um perodo de 7 14 dias. Observou-se que a produo em meio slido foi trs vezes superior submersa.

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II) fermentao semi-slida

Sequncia tpica de processo de produo de enzimas pelo mtodo de cultura slida


Meio de cultura base de farelo de trigo umedecido, esterilizado com vapor

Resfriamento e inoculao com esporos de Aspergillus Mistura e colocao em bandejas ou tambores rotativos Incubao a 20 45 0C de 1 a 7 dias

Extrao de enzima com gua ou soluo tampo

secagem e moagem da cultura

Extrato enzimtico

Farelo enzimtico

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II) Reatores em fase no-aquosa (fermentao semi-slida)

Vantagens da Fermentao semi-slida em relao fermentao submersa: -Menor custo de capital e operacional; -Menor risco de contaminao (baixa umidade); -Maior facilidade de remoo do produto final; -Utilizao de fontes de carbono no convencionais insolveis; -Ausncia de atrito; -Permite o desenvolvimento de estruturas diferenciadas; importante para formao de alguns produtos (fungos). Desvantagens: -Dificuldade de parmetros fsicos durante o cultivo (gradientes) -Natureza heterognea do meio devido a dificuldades na homogeneizao

Bibliografia

Schmidell W, Lima UA, Aquarone E, Borzani W. Biotecnologia Industrial: Engenharia Bioqumica. Volume 2. Ed Edgard Blcher LTDA, So Paulo, 2001. Cap. 8-13 , 16, 20

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