Anexo 4: Tcnicas coproparasitoscpicas para la deteccin e identificacin de parsitos gastrointestinales Tcnica de Flotacin-Centrifugacin usando solucin sobresaturada de azcar Preparacin

de Solucin de flotacin: solucin sobresaturada de azcar Combinar 355 mL de agua y 454 de azcar Disolver el azcar en el agua, se puede usar calor indirecto Despus de disolver el azcar, agregar 10 mL de formol al 40%

Procedimiento: Mezclar 3 gr. de heces en 42mL de agua, agitar hasta que las heces estn en suspensin. Verter la mezcla a travs de un capa de gasa colocada en un colador, dentro de dos tubos de 15 mL de capacidad. Enjuagar la gasa y el colador y verter el lquido en los tubos. Centrifugar a 1000 o 1200 rpm por 5 min. Decantar el sobrenadante y llenar con solucin de flotacin la mitad del tubo, remover el sedimento y homogenizar con la solucin de flotacin usando un aplicador. Luego agregar ms solucin de flotacin hasta que el tubo este lleno y forme un menisco. Colocar una laminilla sobre el menisco e inmediatamente centrifugar a 1000 o 1200 rpm por 3 a 5 min. Despus de centrifugar retirar cuidadosamente la laminilla y colocarla en una lmina portaobjeto conteniendo una gota de lugol. Observar en el microscopio a 10x y confirmar a 40x.

Tcnica de Baermann modificado en copa

Colocar un colador sobre una copa y llenar con agua la mitad de la copa. Colocar 5 a 10 gramos de heces sobre una capa de gasa. Colocar la gasa con la muestra sobre el colador. Llenar la copa con agua hasta cubrir la muestra. Dejar en reposo 24 horas. Despus de las 24 horas: Si es para la deteccin de huevos se recoge, con un gotero, 1 a 2 mL de lquido del fondo de la copa y se coloca en una placa Petri. Y se observa al microscopio a 4 10x y se confirma a 40x. Si es para la identificacin de larvas se recoge de 1 a 2 mL de lquido, hasta completar todo el lquido, y se coloca en una placa Petri, luego se observa al microscopio a 4 0 10x y se confirma a 40x.

Coprocultivo

Disgregar las heces usando un aplicador, para un buen cultivo las heces deben ser hmedas pero no acuosas, las heces muy secas deben mojarse con agua; si son acuosas deben aadirse heces estriles, turba o carbn animal hasta obtener la consistencia correcta.

Esta mezcla se coloca en placas de vidrio y se mantienen en una estufa regulada a 27C, donde permanecen durante 7 o 10 das, momento en el que las larvas han alcanzado el estado infectivo. Si no se dispone de una estufa adecuada, puede dejarse el cultivo a la temperatura del laboratorio durante 10 a 20 das.

Se remueve el cultivo diariamente para favorecer el aireamiento de las capas profundas y evitar el desarrollo de hongos.

Despus del tiempo establecido se recuperan las larvas a travs de la tcnica de Baermann modificado en copa.

Esporulacin de ooquistes

Se prepara un cultivo sencillo emulsionando una pequea cantidad de heces en una solucin de dicromato de potasio al 2%.

Se deja que los ooquistes esporulen a temperatura ambiente por 4 a 7 das. Luego se procede a realizar la tcnica de flotacin - centrifugacin para recuperar los ooquistes.

Tcnica cuantitativa de Kato Katz

Preparacin de la solucin de glicerina: Glicerina pura 30 mL Agua destilada 30 mL Verde de malaquita al 3% 1 mL (Solucin acuosa) Mezclar bien en frasco de boca ancha con tapadera e introducir los cuadrados de celofn para sumergir en esta solucin 24 horas o ms antes de usar. (El verde de malaquita no es indispensable en caso que no se cuente con l). Procedimiento: Extender el papel peridico sobre la mesa de trabajo.

Identificar el porta-objetos con la muestra a examinar. Colocar sobre ste el templete de plstico (Un templete de 9 mm X 1 mm entrega 50 mg de heces. El factor de multiplicacin para determinar huevos por gramo ser de 20. Un templete de 6 mm de dimetro X 1.5 mm de grosor entrega 41.7 mg de heces. El factor de multiplicacin ser de 24).

Con una esptula de plstico o de madera tomar una cantidad de heces y colocarla sobre una superficie plana (tapadera del frasco, papel peridico).

Colocar sobre estas heces un cuadrado de tela metlica o nylon que hace las veces de colador.

Raspar la superficie de la tela con la esptula plstica o palo de chupete tomando suficientes heces coladas para llenar el agujero del templete. Descartar la esptula si es de madera.

Remover el templete, descartar ste y la tela en desinfectante y cubrir el redondel de heces con un cuadrado de celofn empapado en glicerina, con una esptula plstica o de madera extender la muestra hasta homogenizar en toda el rea del celofn.

Colocar sobre una superficie protegida de insectos (mosca, cucaracha) y agua. Esperar que aclare. Esto depender de la temperatura y humedad del ambiente, entre 30 min. y 45 min. Si se desea interrumpir el aclaramiento, invertir la lmina sobre una superficie plana lo necesario hasta continuar el proceso.

Observar al microscopio y realizar el recuento por tipo de huevo de nematodo, en toda el rea del celofn, a 10x y confirmar a 40x.

Multiplicar el nmero de huevos encontrados por el factor (en este caso 24), para obtener el nmero de huevos por gramo de heces (nhpg).