ARTIGO DE REVISO

Eritropoetina humana recombinante no esporte: uma reviso

Rafael Maia de Almeida Bento1, Lcia Menezes Pinto Damasceno1 e Francisco Radler de Aquino Neto1

RESUMO Eritropoetina um hormnio endgeno de natureza glicoprotica secretado pelos rins e principal regulador da eritropoese. Uma alterao na sua produo gera um desequilbrio na concentrao hormonal plasmtica, ocasionando vrios tipos de patologias relacionadas ao sistema hematopotico. Suas formas recombinantes vm sendo usadas indiscriminadamente por atletas, principalmente em esportes de resistncia, por aumentarem a concentrao de hemcias, gerando maior aporte de oxignio ao tecido muscular. A administrao de eritropoetina recombinante foi proibida pelo Comit Olmpico Internacional e seu uso considerado doping. Esta reviso tem o objetivo de rever as propriedades fsicas, biolgicas e farmacocinticas da eritropoetina endgena, bem como de sua forma recombinante, descrevendo tambm seu uso no esporte e o processo de busca de metodologias para a sua deteco no controle de dopagem.
Palavras-chave: Eritropoetina. Epoetina. Hormnios peptdicos. Controle de dopagem.

gas relacionadas al sistema hematopoytico. Sus formas recombinantes vienen siendo usadas indiscriminadamente por atletas, principalmente en deportes de resistencia, ya que aumenta la concentracin de hemates, generando un mayor aporte de oxgeno al tejido muscular. La administracin de eritropoyetina recombinante fue prohibida por el Comit Olmpico Internacional y su uso considerado como dopaje. Esta revisin tiene la intencin de rever las propiedades fsicas, biolgicas y farmacocinticas de la eritropoyetina endgena, as como la de su forma recombinante, describiendo tambin su uso en el deporte y el proceso de la bsqueda de metodologas para su deteccin en el control de dopaje.
Palabras clave: Eritropoyetina. Epoyetina. Hormonas peptdicas. Control de dopaje.

INTRODUO A eritropoetina (EPO) um hormnio endgeno de natureza glicoprotica sintetizado principalmente em clulas epiteliais especficas que revestem os capilares peritubulares renais1. Esse hormnio o principal regulador da eritropoese no homem e tambm em outros animais. Os rins apresentam funo preponderante em sua sntese, uma vez que so responsveis por secretar cerca de 90% de toda a EPO circulante. Alm disso, o fgado contribui com cerca de 10% da produo total de EPO1,2. Devido sua capacidade inerente de estimular a produo de glbulos vermelhos e, conseqentemente, aumentar o aporte de oxignio para os tecidos, a utilizao da EPO no esporte foi proibida pelo Comit Olmpico Internacional (COI) a partir de 19873. Dependendo da modalidade esportiva, a administrao de EPO em atletas de elite pode resultar em aumento artificial de seu desempenho como conseqncia de sua administrao, reduzindo, por exemplo, marcas de tempo obtidas. Visando preservar a sade do indivduo e a tica esportiva, o COI e outras federaes esportivas atualmente consideram o uso de EPO e de seus anlogos como casos de doping sanguneo por administrao exgena de hormnio peptdico4. A disponibilidade dessa classe de compostos no mercado foi aumentada drasticamente a partir da dcada de 80, com o advento da tecnologia do DNA recombinante5. A for-

RESUMEN Eritropoyetina recombinante humana en el deporte: una revisin La eritropoyetina es una hormona endgena de naturaleza glicoproteica secretada por los riones y es el principal regulador de la eritropoyesis. Una alteracin en su produccin genera un desequilibrio en la concentracin hormonal plasmtica ocasionando varios tipos de patolo1. Laboratrio de Controle de Dopagem (LAB DOP-Ladetec) do Instituto de Qumica da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), Rio de Janeiro, RJ, Brasil. Recebido em 31/1/03 2a verso recebida em 25/4/03 Aceito em 17/5/03 Endereo para correspondncia: Lcia Menezes Pinto Damasceno Centro de Tecnologia, Instituto de Qumica Bloco A, sala 512, Cidade Universitria Ilha do Fundo 21949-900 Rio de Janeiro, RJ E-mail: lucia@iq.ufrj.br
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ma sinttica da EPO, a EPO humana recombinante (rHuEPO), ficou disponvel comercialmente a partir de 19883, quando ento passou a ser usada com sucesso na clnica mdica, melhorando a qualidade de vida de pacientes que necessitavam de sucessivas transfuses de sangue, ou com quadros de anemia por insuficincia renal crnica2,5. No esporte, simultaneamente, especula-se que a rHuEPO passou a ser utilizada de forma rotineira como meio artificial de produo de glbulos vermelhos6, devido vantagem adicional da difcil deteco de sua presena na matriz biolgica atravs dos mtodos analticos convencionais, alm do efetivo ganho no desempenho esportivo. A dificuldade de deteco deveu-se ao fato de a EPO ser uma macromolcula complexa, presente em concentraes baixas nos fluidos biolgicos, com estrutura bastante semelhante da sua forma endgena, o que impossibilita sua identificao inequvoca e a comprovao de seu uso ilcito durante longo tempo7,8. O objetivo da presente reviso situar o atual estgio cientfico no combate ao abuso da EPO no mundo esportivo. Aps um breve resumo das propriedades qumicas e farmacolgicas da EPO endgena, bem como de se sua forma recombinante, ser apresentado um relato de casos suspeitos de abuso de EPO no esporte. Subseqentemente, ser apresentada a evoluo metodolgica analtica na identificao e diferenciao entre a EPO fisiolgica e a sua forma recombinante sinttica, com a finalidade de aplicao no controle de dopagem no esporte. Sero tambm discutidas novas tendncias no desenvolvimento da tcnica de deteco, bem como o potencial uso de novos substitutos anlogos EPO disponveis no mercado. ERITROPOETINA ENDGENA A EPO humana sintetizada na clula renal inicialmente como um pr-hormnio possuidor de uma seqncia total de 193 aminocidos, sendo os 27 primeiros expressos apenas para proporcionar a secreo do hormnio, no possuindo relevncia na atividade biolgica5,9. Pouco antes de ser secretada, a EPO clivada e esses 27 aminocidos so removidos. Ao entrar na circulao sangunea, h tambm a perda do aminocido arginina na posio carboxiterminal, passando o hormnio ento a possuir uma seqncia definitiva de 165 aminocidos alinhados em uma nica cadeia polipeptdica contendo duas ligaes dissulfeto intramoleculares e quatro cadeias polissacardicas independentes, ligadas a resduos de aminocidos especficos. As cadeias polissacardicas constituem cerca de 40% da massa molecular da EPO, sendo de grande importncia na funo hormonal. De modo a evitar a rpida depurao heptica da EPO antes que esta alcance seu alvo fisiolgico, a macromolcula possui um sinalizador biolgico, constitu-

do de resduos terminais de cido silico, situado em posies estratgicas na cadeia polissacardica3. Estima-se que a meia-vida da EPO, aps lanamento na circulao sangunea, seja da ordem de seis a oito horas1. A produo de EPO pelas clulas especializadas renais e seu posterior lanamento no sangue ocorrem quando estruturas celulares sensitivas renais percebem reduo na taxa de oxignio circulante ou deficincia na produo eritrocitria, resultando em diminuio da quantidade de eritrcitos circulantes10,11. As molculas de EPO produzidas, carreadas pela corrente sangunea, so conduzidas at a medula ssea, onde encontram clulas progenitoras eritrocitrias. Constata-se que o aumento da taxa de novos eritrcitos circulantes produzidos pela medula se d em cerca de um a dois dias aps o aumento dos nveis de EPO no plasma10,12. Devido ao curto intervalo de tempo entre o pico de EPO no plasma e o aumento da concentrao de novos eritrcitos, conclui-se que ela atua em clulas precursoras prximas dos eritrcitos maturados, e no em clulas mais primitivas na gnese eritrocitria10. Essas clulas precursoras so denominadas clulas formadoras de colnia de eritrcitos (CFC-E) e possuem a particularidade de s responderem EPO. Tais clulas possuem receptores especficos, pertencentes a uma grande famlia de receptores para fatores de crescimento hematopoticos, conseguindo responder a baixssimas concentraes desse hormnio, da ordem de 10-12mol/L10. A EPO, ao se ligar ao seu receptor, provoca dimerizao na superfcie extracelular do mesmo, desencadeando autofosforilao e ativao intracelular de protenas tirosina quinase13. O estmulo hormonal continua at que o nvel de oxigenao tecidual volte a valores normais. O receptor para a EPO tambm expresso em tecidos no-eritrides, como as clulas endoteliais e cerebrais. A funo desse receptor nesses stios ainda no bem compreendida, mas mutaes em sua estrutura podem estar associadas a algumas patologias observadas nesses tecidos14. As CFC-Es, ativadas pela EPO, geram eritrcitos maduros aps seis ciclos de divises celulares. Nesse estgio, as CFCEs no contm hemoglobina, protena responsvel pelo transporte de oxignio e maior constituinte, em volume, do eritrcito maturado. As CFC-Es produzidas dependem unicamente da EPO para sobreviver e proliferar. Estudos in vitro demonstram que a remoo de EPO em uma cultura de CFC-Es acarreta rpido processo de morte celular programada, denominado de apoptose1,10,15. Os eritrcitos produzidos durante a eritropoese no possuem material gentico e maquinaria celular para sua replicao, pois tanto o ncleo quanto organelas citoplasmticas importantes, tais como o retculo endoplasmtico, mitocndria e ribossomos, so extrudados do compartimenRev Bras Med Esporte _ Vol. 9, N 3 Mai/Jun, 2003

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to celular, para permitir maior armazenamento de hemoglobina5,10. Portanto, o nico modo de produo eritrocitria atravs do estmulo hormonal nas clulas CFC-Es provenientes de clulas-tronco pluripotentes hematopoticas (stem cells)10. Por ter essa funo vital de regulao da eritropoese, qualquer fator ou distrbio que afete a concentrao de EPO circulante, seja em sua sntese ou em sua liberao na corrente sangunea, ir acarretar desregulao de grau varivel na homeostase do sistema hematopotico. A concentrao sangunea de EPO alterada como conseqncia das mudanas na disponibilidade de oxignio no ambiente renal. A hemodiluio, os vrios tipos de hipxia e as diferentes formas de anemia so causas conhecidas na gerao de aumento na produo e concentrao de EPO. De forma antagnica, a concentrao de EPO reduzida na policitemia2. Alm disso, pacientes com determinadas doenas renais que incapacitam o organismo para a produo de EPO podem gerar quadros anmicos pela reduo da concentrao plasmtica deste hormnio5. Exerccios mximos ou submximos no tm efeitos imediatos sobre a concentrao de EPO, enquanto que a atividade fsica extenuante pode causar alteraes na concentrao hormonal. Essa concentrao ainda pode variar intra ou interindividualmente durante o dia, e em diferentes situaes fisiolgicas, o que dificulta a deteco de administrao abusiva de rHuEPO, por exemplo, no esporte2. ERITROPOETINA HUMANA RECOMBINANTE Sntese de rHuEPO A produo de EPO em quantidades comercialmente viveis e com elevado grau de pureza somente tornou-se possvel graas s tcnicas de engenharia gentica, permitindo assim o desenvolvimento de uma substncia recombinante correlata16. O marco inicial para a produo gentica de EPO foi a preparao altamente purificada da protena, o que foi alcanado pelo isolamento e purificao do hormnio a partir de 2.550 litros de urina proveniente de pacientes com anemia aplstica, no final da dcada de 70. Nessa ocasio, a EPO endgena foi identificada como uma glicoprotena com peso molecular de aproximadamente 34.000 daltons e com atividade hormonal de 70.000UI/mg17. Entretanto, a produo de EPO em escala industrial a partir da purificao da forma endgena humana, visando o uso teraputico, mostrou-se invivel devido ao fato de que, no organismo humano, esse hormnio encontra-se presente em baixssimas concentraes16. Os passos que viabilizaram e iniciaram uma nova era na produo da EPO sinttica consistiram no isolamento e caRev Bras Med Esporte _ Vol. 9, N 3 Mai/Jun, 2003

racterizao da regio do DNA humano que codifica a EPO endgena, e a criao de uma cpia molde complementar a essa mesma regio (cDNA). O isolamento e caracterizao da regio do DNA foram conseguidos atravs da obteno do seqenciamento dos aminocidos da EPO fisiolgica, realizando um caminho inverso ao da sua sntese protica. Esse seqenciamento, obtido a partir de tcnicas qumicas e genticas modernas, levou, mais adiante, ao mapeamento da seqncia das bases nitrogenadas do DNA codificadoras da protena. De posse da seqncia completa, foi feita uma comparao junto a outras seqncias de bases nitrogenadas cadastradas em banco de genes de DNA, a fim de determinar a posio correta em que a seqncia se encontrava no genoma humano18. Em paralelo, a criao de uma cpia molde complementar do DNA foi implementada. Para tal, o RNA mensageiro (m-RNA) codificador da protena em questo foi isolado a partir de clulas hepticas fetais, por conterem alta produo de EPO nativa. A cDNA gerada atravs da utilizao da enzima transcriptase reversa produziu uma cpia complementar do m-RNA, ou seja, a prpria seqncia protica no DNA. Finalmente, o cDNA foi incorporado a plasmdios bacterianos que foram transferidos a uma bactria de E. coli hospedeira. A cepa bacteriana, a partir desse ponto, continha as informaes genticas completas para a produo de EPO. A rHuEPO foi o primeiro fator de crescimento hematopotico clonado18. Desde ento, clones de cDNA de EPO fisiolgica foram isolados em diversos laboratrios para obter rHuEPO em maior quantidade. A expresso de clones de cDNA de EPO tambm pode ser obtida por incorporao ao material gentico de clulas de mamfero isoladas, como as clulas ovarianas de hamster chins (CHO) ou de rim de filhote de hamster (BHK)3. Esses tipos de clulas so os preferidos para a produo de rHuEPO, pois a estrutura complexa da protena contm ligaes biologicamente essenciais do tipo dissulfeto e padres de glicosilao que somente podem ser reproduzidos mediante expresso em culturas de clulas de mamferos16. A rHuEPO produzida por esse modo homognea em relao seqncia peptdica da EPO natural, mas ainda assim contm arranjo heterogneo na poro carboidrato3. A rHuEPO tornou-se o primeiro biomedicamento produzido a partir de clulas de mamferos heterlogas19. Atualmente, a rHuEPO vem sendo produzida por diversos fabricantes e, apesar de sua atividade biolgica ser idntica quela encontrada em sua forma nativa, as estruturas qumicas em duas e trs dimenses das rHuEPO manufaturadas nem sempre apresentam analogias completas, seja quando comparadas entre si ou quando confrontadas com a EPO de ocorrncia natural. Pelo fato de serem provenientes de diferentes fontes de sntese em diferentes regies do

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mundo, variaes na composio e na disposio da estrutura polissacardica em cada produto so observadas particularmente5. Estudos realizados com molculas de EPO provenientes de diversas origens exgenas mostraram que, como ocorre com vrios hormnios glicoproticos no pH fisiolgico, sua estrutura apresenta heterogeneidade de carga devido a pequenas variaes de contedo da parte polissacardica20. O desenvolvimento de um mercado negro para rHuEPO durante os ltimos anos acentuou essa discrepncia, por conta da qualidade flutuante e variabilidade de composio de cada produto comercializado5. Uso teraputico e vias de administrao de rHuEPO Alm do seu uso inicial na clnica como medicamento substituto cmodo para pacientes que necessitam de sucessivas transfuses de sangue, ou que apresentam quadros de anemia por insuficincia renal crnica2,5, a rHuEPO tambm vem sendo usada ultimamente em vrios outros tipos de anemia, como a gerada nos estgios iniciais de neoplasias16, ou a decorrente da terapia de uso de AZT em pacientes HIV positivos, entre outras3. A dosagem usual de rHuEPO no tratamento da anemia geralmente varia numa faixa que se estende de 20 a 240UI/ kg trs vezes por semana, dependendo da resposta do paciente e da taxa tima de concentrao plasmtica de hemoglobina e hematcrito5,19,21. Na prtica clnica, as vias intravenosa, subcutnea e intraperitoneal so as formas de administrao mais comuns de rHuEPO19,22. A escolha da via depende de consideraes farmacocinticas aliadas a aspectos de ordem prtica. Em pacientes tratados com hemodilise, a rHuEPO pode ser administrada endovenosamente durante ou ao final do procedimento, reduzindo o sofrimento do paciente. Aos pacientes em terapia conservadora para insuficincia renal, transplantados renais ou em dilise peritoneal recomendada a utilizao de rHuEPO por via subcutnea, geralmente em rotao na regio da coxa, de modo a poupar as veias perifricas para futuro acesso vascular. A administrao intraperitoneal deve ser reservada para situaes clnicas especiais em pacientes em dilise peritoneal, particularmente em crianas com traumas de injees22. A baixa disponibilidade por essa via exige doses semanais mais elevadas do que as demais vias de administrao. Verifica-se que a eritropoese mais eficaz em resposta a injees freqentes com doses fracionadas de rHuEPO do que por picos intermitentes com grande dosagens23. Entretanto, nenhuma das modalidades ou vias de administrao exgena consegue reproduzir o padro fisiolgico de secreo ou o ritmo circadiano do hormnio natural22. Aps administrao intravenosa, picos mximos de concentrao de rHuEPO no plasma so obtidos em questo de

minutos, enquanto valores mximos para a administrao subcutnea podem ser obtidos de cinco a 24 horas aps a aplicao24, ou um pouco acima desse valor22. Estudos clnicos realizados em meados da dcada de 90 analisando as formas de administrao intravenosa e subcutnea no mostraram diferena de eficcia no tratamento, ou na presso sangunea, quando os dois processos foram comparados. A administrao subcutnea possui biodisponibilidade baixa e varivel25, entre 20 e 40%22 porm, ainda assim, gera altos nveis sricos de rHuEPO25. Apesar de h cerca de trs dcadas se acreditar que a concentrao urinria de EPO endgena fosse aproximadamente proporcional ao seu nvel srico e resultando em uma taxa de eliminao diria inferior a 10% do total administrado26, hoje em dia sabe-se que a excreo urinria de rHuEPO aps administrao em voluntrios saudveis negligencivel, sendo menor do que 1% da dose administrada27. Sugeriu-se quela poca que o fgado e a prpria medula eram os possveis stios de depurao de EPO endgena26. Hoje em dia sabe-se, atravs da presena de produtos de degradao heptica28, que o fgado efetivamente est envolvido no processo de degradao da rHuEPO, aps a remoo gradual de resduos de cido silico terminais da molcula (desialao in vivo), tornando-se, ento, o passo limitante na taxa de depurao da EPO circulante28,29. Formas comerciais de rHuEPO Epoetina alfa, epoetina beta e epoetina mega so as denominaes comerciais para as formas da rHuEPO atualmente disponveis no mercado para uso teraputico30,31. Tal classificao dependente do mtodo de fabricao, sendo as duas primeiras sintetizadas a partir de clulas CHO, enquanto que a ltima produzida em clulas BHK. Apesar de as clulas CHO e BHK glicosilarem protenas de modo bastante similar ao que ocorre na clula humana, algumas regies de carboidratos no so sintetizadas por estas clulas devido ausncia de enzimas acar-transferases especficas. Enquanto a sntese da cadeia peptdica geneticamente regulada, as cadeias polissacardicas so processadas e ligadas por uma srie de reaes enzimticas30. Comparaes efetuadas entre diversos lotes de epoetina alfa e beta evidenciaram atividade biolgica distinta devida a diferentes valores encontrados para as razes de potncia relativa in vivo:in vitro para cada uma dessas formas, sendo tais valores mais elevados para epoetina beta do que para a forma alfa31. Essas formas de rHuEPO so compostas por diversos tipos de isoformas, devido micro-heterogeneidade na estrutura do hormnio provocada pela variao na composio polissacardica3,30,31. As isoformas da rHuEPO alfa e beta diferem parcialmente em sua composio quando analisadas pela tcnica de focalizao
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isoeltrica. Atravs dessa tcnica, possvel visualizar no s maior nmero de bandas referentes s isoformas da epoetina beta, significando maior quantidade de isoformas, bem como uma regio com bandas extras em valores de pH mais elevados, conferindo-lhes caractersticas mais bsicas31. Alm de variaes quanto atividade biolgica e composio estrutural, as duas formas de rHuEPO possuem perfis farmacocinticos e farmacodinmicos distintos, sendo o volume de distribuio e a meia-vida de eliminao superiores em 7,7% e 20%, respectivamente, para a epoetina beta em relao epoetina alfa32,33. Contudo, o clearance de ambas as formas no apresenta diferenas significativas32, o que contraria os resultados de estudos obtidos anteriormente34,35. Em relao administrao subcutnea, observa-se atraso na absoro da epoetina beta quando comparada com a forma alfa, encontrando-se valores mais baixos para as concentraes plasmticas da forma beta durante as primeiras 18 horas aps a administrao. Entretanto, no intervalo de tempo entre 48 e 66 horas aps a administrao, os valores de concentrao da forma beta aumentam de modo a suplantar os da alfa32. Valores de concentrao mxima de EPO no soro (Cmax), de tempo para Cmax (tmax) e de rea sobre a curva (AUC) no apresentam diferenas significativas entre as formas, mostrando biodisponibilidade similar32,33. Fato interessante refere-se ao relato de voluntrios com relao a sensaes de dor ao fazerem uso da forma alfa (56%), quando comparadas com as forma beta (5,6%), aps a aplicao subcutnea32. Pacientes em hemodilise sob tratamento com rHuEPO para anemia por insuficincia renal crnica mostraram reao semelhante em estudo subjetivo mediante estipulao de uma faixa numrica de intensidade de dor sentida. Como explicao para comportamentos to distintos entre as formas, sugere-se que os aditivos que participam na formulao de cada medicamento, ou o prprio tipo de rHuEPO por si s, seriam os responsveis pelas diferenas na reao dolorosa36. USO DE rHuEPO NO ESPORTE A definio de dopagem sangunea foi introduzida na dcada de 70 para descrever o uso de transfuses de sangue com o objetivo de aumentar artificialmente a massa de clulas vermelhas, proporcionando maior disposio na entrega de oxignio, principalmente em esportes de resistncia em que prepondera o exerccio muscular aerbico, como ciclismo, esqui de fundo37,38, corridas de longa distncia, maratona8 e triatlon38, entre outros. Exerccio aerbico um termo associado manuteno de exerccio intenso por longo perodo de tempo. A capacidade de realizar um trabalho aerbico est intimamente associada quantiRev Bras Med Esporte _ Vol. 9, N 3 Mai/Jun, 2003

dade de oxignio que pode ser transportada para os msculos39. A dopagem sangunea21,40-42 foi formalmente adicionada lista de mtodos proibidos em 1985 aps diversos ciclistas dos Estados Unidos terem admitido que se doparam com sangue durante as Olimpadas de Los Angeles em 198443. Entretanto, ao longo do tempo, questes legais, ticas e religiosas sempre foram um empecilho amostragem sangunea, pelo fato de a coleta ser um mtodo invasivo21,42,44. Mesmo assim, testes regulares tendo o sangue como matriz de anlise foram realizados em torneios de atletismo entre os anos de 1993 e 1994. As atenes naquela ocasio estavam mais voltadas para o rastreamento da dopagem por transfuso, na deteco de alguns esterides endgenos e de alguns hormnios peptdicos proibidos. Entretanto, para estes ltimos, os ensaios eram bem pouco sensveis, sendo efetuados por tcnicas imunolgicas40. Atualmente, a dopagem sangunea est mais vinculada administrao de rHuEPO do que aos vrios tipos de transfuses possveis37. A transfuso foi gradualmente preterida devido necessidade de assistncia de um mdico ou de outros profissionais treinados para a retirada, preparao, estocagem e transfuso do sangue. Por outro lado, a rHuEPO pode ser obtida e administrada sem superviso mdica, o que, no entanto, aumenta o risco de seu abuso45-47. Antes mesmo da comercializao da rHuEPO, suspeitava-se da possibilidade de uso abusivo por parte de atletas na busca artificial de melhor desempenho, culminando com o surgimento de rumores e denncias annimas sobre o seu uso ilcito. Nos anos que se seguiram ao surgimento da rHuEPO, vrias reportagens relatavam a utilizao de hormnios peptdicos, como a epoetina alfa, mas provas conclusivas de sua manipulao no foram geradas6,43. A classe cientfica, entretanto, sabia que mais cedo ou mais tarde a substncia iria ser usada devido vantagem de aumentar os nveis de hemoglobina sem as complicaes e dificuldades apresentadas pelos outros tipos de dopagem sangunea. De modo a evitar o uso de rHuEPO com a finalidade de aumento de desempenho esportivo, foram lanados programas educativos sobre os riscos dos efeitos colaterais potenciais, mostrando-se que as doses administradas em pacientes para elevar o valor de hematcrito no poderiam ser extrapoladas para pessoas sadias6, alm do que, mesmo aps a interrupo da sua administrao, o efeito do hormnio sobre a medula ssea poderia continuar por mais alguns dias e o hematcrito tenderia a aumentar at atingir nveis perigosos47. A desidratao, freqente durante e aps o esforo fsico intenso de uma competio, aliada he-

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moconcentrao, poderia acarretar risco iminente sade, por aumento da viscosidade sangunea e reduo do dbito cardaco6,38,39,48,49, levando a quadros de hipertenso5,48,49 e possveis eventos trombticos6,38,39,48,50. Embora a utilizao de rHuEPO na teraputica se tenha mostrado relativamente segura quando medicamente assistida, casos de aplasia eritrocitria em pacientes sob uso de rHuEPO so reportados, embora com baixa incidncia. Observa-se o desenvolvimento de anticorpos anti-EPO que neutralizam tanto a rHuEPO quanto a sua forma endgena, produzindo a referida doena51. Entretanto, a melhora significativa da qualidade de vida e/ou prolongamento da sobrevida, associados prevalncia reduzida da doena nesses pacientes, compensam o risco da prescrio de tal medicamento para fins teraputicos. Contudo, em casos de dopagem por rHuEPO, em que os atletas saudveis no necessitam de qualquer tratamento, o seu uso inadmissvel, e o risco de desenvolvimento da doena torna-se potencial, podendo levar dependncia de transfuses de sangue contnuas para o resto da vida52. Casos fatais vinculados prtica da dopagem ocorreram no incio dos anos 90 quando ciclistas profissionais holandeses competindo na Europa morreram durante repouso por falha cardaca inexplicvel, tendo alguns at morrido durante o prprio sono5,37,39. Esses esportistas esto entre os mais de 20 casos de mortes de ciclistas na Europa relatados entre os anos de 1987 e 1991, coincidindo com o incio da disponibilidade de rHuEPO naquele continente46, 53,54 . Evidncias da utilizao de rHuEPO ocorreram aps controle hematolgico efetuado em ciclistas profissionais na Itlia, acusando sobrecarga na concentrao plasmtica de ferro, s comparvel com doentes com hemocromatose gentica. Os nveis de ferritina (protena associada quantidade de ferro armazenada no corpo) nesses ciclistas mostraram-se anormalmente elevados, indicando claramente a administrao de ferro intravenoso e de rHuEPO1,37. Em 1998, a descoberta de ampolas de rHuEPO com ciclistas de vrias equipes participantes do Tour de France talvez seja o fato mais marcante e divulgado em relao aos casos esportivos recentes de dopagem por rHuEPO9,55. Na ocasio, foram encontradas caixas com vrias ampolas do frmaco em veculos das principais equipes, e at mesmo a rHuEPO nos alojamentos dos competidores, configurando o uso endmico do hormnio entre os ciclistas de elite55-57. Durante os 21 dias de competio, apreenses da substncia, inquritos e prises fizeram parte daquela corrida, sendo apelidada de Tour de Farce pelos jornais franceses56,57. Alguns atletas, aps complicaes de sade decorrentes do uso ilcito de rHuEPO, admitiram a utilizao do horm-

nio. Tal fato mencionado no caso de um ciclista que apresentava sintomas de fortes dores de cabea, nuseas, vmitos e fotofobia iniciados dois meses antes de uma competio, o que levou diagnose de quadro de hipertenso idioptica intracraniana, no responsiva a tratamento padro. Exames mdicos e laboratoriais sugeriram o uso de rHuEPO, fato este confirmado pelo atleta quando questionado58. Apesar de todos os casos acima apresentados, a liberao do uso da substncia foi defendida por determinados grupos, sob o argumento da impossibilidade de deteco da rHuEPO, preferindo-se a total liberao de sua administrao59. Entretanto, o COI incluiu esse hormnio recombinante na lista de substncias proibidas a partir de 199060 aps os Jogos Olmpicos de Inverno de Calgari, onde o seu uso foi evidenciado, e os Jogos Olmpicos de Seul, ambos em 1988, mesmo sendo tal proibio apenas moral, devido falta de tecnologia analtica necessria para detectar e diferenciar a rHuEPO da EPO endgena de maneira irrestrita7,8,37,46,61-63. MTODOS DE PREVENO E DE DETECO PARA rHuEPO Marcadores biolgicos indiretos Durante vrios anos foram pesquisadas maneiras de contornar o problema da dopagem por rHuEPO devido impossibilidade de sua deteco e diferenciao, por se tratar de uma substncia estruturalmente complexa de elevada massa molecular, presente em baixas concentraes nos fluidos biolgicos e bastante semelhante sua forma endgena7,8. A soluo possvel de ser adotada ao longo dos anos para diferenciao entre um nvel plasmtico elevado de EPO endgena estimulado por treinamentos em altitude ou atravs do uso de cmaras de oxignio hipobricas, permitidos at o momento pelo COI, e a administrao ilcita de rHuEPO foi a de estabelecer faixas ou limites tidos como normais de parmetros intimamente ligados ao processo da eritropoese, tornando-os assim marcadores do uso imediato ou prvio de rHuEPO37,39,55,58,64. Assim, em 1997, a Unio Internacional de Ciclismo (UIC) implementou teste aleatrio de sangue antes de cada competio. O teste envolvia a medio do nvel de hematcrito e estipulava que atletas masculinos com valor de leitura superior a 50%, e competidoras do sexo feminino com hematcrito superior a 47% no poderiam competir, sob a alegao de que isso seria uma corrida de risco65. De fato, o hematcrito uma varivel fisiolgica intimamente ligada ao ganho de desempenho no exerccio. Estudo realizado com administrao subcutnea de rHuEPO demonstrou aumento do hematcrito, do tempo de exausto no exerRev Bras Med Esporte _ Vol. 9, N 3 Mai/Jun, 2003

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ccio, do consumo mximo de oxignio e da presso sistlica do sangue65. Os efeitos colaterais descritos para a rHuEPO so mais proeminentes quando doses excessivas do hormnio elevam o hematcrito a valores entre 50 e 55%, o que normalmente tambm ocorre em esportes de resistncia devido natural desidratao45,46,54,59. Recentemente, a UIC adotou como parmetro adicional para liberao de atletas para competies o nvel mximo de hemoglobina plasmtica de 17g/dL37,39. A UIC sempre declarou que os testes realizados consistiam em avaliaes de sade, de modo a evitar que atletas competissem com o hematcrito perigosamente alto e um resultado positivo no implicava necessariamente o uso de rHuEPO, sendo os esportistas apenas suspensos por duas semanas39,66. Controvrsias foram geradas quanto a tal limite, uma vez que o estado de hidratao, a hora do dia em que ocorre a coleta e a postura corprea do atleta so fatores limitantes, alm da existncia de pequena incidncia de esportistas de elite que apresentam hematcrito superior ao limite estabelecido sem fazer uso de rHuEPO37,39,67. Contra-argumentaes foram levantadas ao mostrar, entretanto, que os valores de hematcrito encontrados em amostras de sangue de atletas que competiram em perodo anterior ao do incio da disponibilidade comercial de rHuEPO exibiam valores dentro dos limites especificados68. A Federao Internacional de Esqui tambm implantou procedimentos de excluso, sendo adotado apenas o valor limite de 18,5g/dL para a concentrao plasmtica de hemoglobina. Limites excessivamente elevados s contribuem para a gerao de mais casos de dopagem37, encorajando atletas a administrarem a rHuEPO at atingirem valores prximos ao limite de hematcrito59 (o que possvel pelo uso prolongado de baixas doses do hormnio)69. Contadores de clulas portteis e centrfugas passaram a estar presentes nos ambientes esportivos como forma de garantir a no extrapolao dos limites estabelecidos59. Devido s limitaes na coleta e problemas ligados confiabilidade na associao dos valores de hematcrito, vrios componentes plasmticos foram avaliados como possveis marcadores indiretos da atividade hormonal70. Reticulocitose e macrocitose so observadas no sangue perifrico, refletindo atividade medular aumentada, tanto aps a secreo de EPO endgena, quanto pela administrao de rHuEPO. Portanto, tanto os reticulcitos quanto os macrcitos se mostraram parmetros de maior potencialidade para ser indicadores de abuso, por apresentar resposta em termos de concentrao srica bem proporcional ao teor de rHuEPO circulante2,71. Outros parmetros avaliados como potenciais marcadores do uso de rHuEPO foram o aumento na concentrao do receptor de transferrina solvel (RTS, um marcador da atiRev Bras Med Esporte _ Vol. 9, N 3 Mai/Jun, 2003

vidade eritride)72-75 e o aumento da razo RTS/ferritina srica2,53,76. Entretanto, essa razo no pode ser usada isoladamente como marcador, uma vez que a suplementao adicional de ferro tende a equilibrar essa razo pelo aumento do nvel de ferritina1,7,67,77,78. Quando a suplementao de ferro mascara a relao RTS/ferritina, observa-se aumento na concentrao de eritrcitos hipocrmicos, que neste caso funcionam como melhores marcadores quando diagnosticados logo aps a aplicao da rHuEPO67. Quando dosada no plasma aps a administrao de doses elevadas de rHuEPO, a concentrao de RTS aumenta no mximo cinco vezes acima do nvel basal. Entretanto, foi visto que o mRNA que expressa esse receptor aumenta cerca de 40 vezes. Esse dado sugere que ser possvel em futuro prximo estender as observaes para a anlise de marcadores genticos eritrides como peas para detectar o abuso de rHuEPO no esporte7,15,77. Devido concentrao baixssima de EPO circulante, uma possibilidade analtica pesquisada para detectar as formas comerciais de rHuEPO consistiu na sua extrao imunolgica com anticorpos mono ou policlonais anti-EPO humana. Um teste realizado com uma gama de anticorpos provenientes de vrias espcies biolgicas e fabricantes diferentes mostrou que, de modo geral, os anticorpos policlonais apresentavam alta atividade, porm com ndice elevado de reaes cruzadas com protenas, enquanto que os anticorpos monoclonais demonstraram boa especificidade, mas atividade baixa. Resultados mais animadores foram obtidos quando prolas magnticas ativadas com anticorpos imobilizados foram usadas como fase slida em procedimentos extrativos imunomagnticos9. O uso de anticorpos anti-rHuEPO tambm pode vir a ser adotado em controle de dopagem de animais, principalmente em eqinos, devido reatividade cruzada destes para com a EPO eqina79,80. Esforos para detectar diretamente rHuEPO na urina levaram a pesquisas paralelas que buscaram marcadores fisiolgicos da atividade hormonal neste fluido biolgico. Baseados nesse fato, foi proposto que o uso de rHuEPO pode atuar no somente estimulando a eritropoese, mas tambm promovendo um processo de fibrinlise e/ou fibrinogenlise sangunea. Essa ao catablica da EPO estaria associada a valores de concentrao urinria de produtos de degradao da fibrina e do fibrinognio, que so protenas sanguneas participantes da cascata de coagulao. Um rastreamento realizado em 76 atletas de nvel internacional praticantes de esportes potenciais para o uso de rHuEPO mostrou que mais do que 13% tinham nvel elevado, na urina, desses produtos de degradao das protenas. Como foi percebido que o desgaste fsico por si s no promove significantemente esse efeito, concluiu-se que os atletas haviam usado a rHuEPO8,75,81.

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Deteco de rHuEPO nas Olimpadas No final da dcada de 90, o COI destinou mais de 1,25 milho de dlares para fundos de pesquisa da EPO para o desenvolvimento de um teste que pudesse ser utilizado no rastreamento do hormnio nas Olimpadas de Sydney, no ano 200039,55. Apesar do pessimismo inicial em relao ao cumprimento dos prazos, um consrcio internacional estabelecido no Australian Sports Drug Testing Laboratory desenvolveu a tempo um mtodo indireto82,83 baseado em alteraes fisiolgicas na resposta hematolgica provocada pela ao do hormnio55. Esse teste indireto media cinco parmetros sanguneos separadamente: os nveis de eritrcitos, macrcitos e reticulcitos atravs do hematcrito, bem como a concentrao plasmtica de EPO e de RTS2,37,71, 82-84. Embora sabendo que a rHuEPO era rapidamente degradada, tal mtodo geraria resultados confiveis, mesmo que o atleta interrompesse a administrao duas a trs semanas antes da coleta de sangue71. Estudos farmacocinticos e farmacodinmicos foram realizados em atletas de elite, com o intuito de proporcionar um perfil fisiolgico normal de determinadas variveis EPO endgeno-dependentes, alm de encontrar faixas de referncia para os mesmas variveis sanguneas aps a administrao do hormnio recombinante2,39,70,74,78,84-92. Dois modelos matemticos foram construdos utilizando dados obtidos com placebo e rHuEPO: o modelo ON, objetivando encontrar os usurios correntes de rHuEPO, e o modelo OFF, em que se pretendia identificar o atleta que havia suspendido a administrao de rHuEPO recentemente2,82,93,94. Aps avaliao dos diversos parmetros sanguneos em situaes que poderiam causar resultados falso-positivos e falso-negativos, foram definidos, a partir de equaes matemticas, valores a serem tomados como referenciais para os dois modelos (ON e OFF)2,83,94. Concomitantemente, foi desenvolvido um teste direto para a rHuEPO pelo laboratrio de controle de dopagem de Paris, baseado nas diferenas sutis existentes entre os resduos de carboidratos da rHuEPO e da EPO fisiolgica55,95. Esse teste detecta a presena do hormnio sinttico na urina devido a diferenas nas cargas eltricas presentes em cada uma das duas formas sob comparao, o que permite a separao mediante a tcnica eletrofortica de focalizao isoeltrica3,30,59,95. Nessa tcnica, aps a separao, pode-se visualizar comparativamente o deslocamento das bandas (isoformas separadas) do hormnio presente na urina, ao longo de uma faixa de pH. A disposio das bandas para as formas alfa e beta (epoetina) da rHuEPO muito similar (ambas tm ponto isoeltrico na faixa de 4,42 a 5,11) embora a epoetina beta apresente bandas bsicas extras. Ambas diferem da EPO purificada natural (com ban-

das mais cidas e ponto isoeltrico de 3,92 a 4,42). Esse teste foi ensaiado antes da Olimpada de Sydney em competidores do Tour de France de 1998, mostrando bandas tpicas do hormnio recombinante nos atletas tidos como suspeitos95. Os dados obtidos na ocasio mostraram que o teste urinrio s seria capaz de detectar o hormnio em at trs dias aps a ltima injeo de rHuEPO, o que permitiria aos atletas continuarem usando a rHuEPO a at poucos dias antes do incio das competies, participando dos eventos ainda sob os efeitos do hormnio e resultando em laudo negativo para rHuEPO. Dessa forma, esse teste se adequaria mais para rastreamento dos atletas em pr-temporada e/ou como um teste complementar para o teste indireto australiano55,71,93,95. Os dois testes (urina e sangue) para a anlise de rHuEPO foram utilizados durante a Olimpada de Sydney 200094,96. Contudo, para evitar a possibilidade de falso-positivo no evento, as possveis sanes s seriam tomadas com resultados positivos em ambos os testes71,93. Naquela ocasio, as autoridades do Comit declararam que os atletas que se recusassem a fazer as anlises alegando questes ticas ou religiosas seriam afastados sumariamente da competio96. Nenhum caso positivo para rHuEPO foi relatado durante os Jogos, embora houvesse alguma indicao de que um pequeno nmero de atletas aparentemente parou de usar rHuEPO algumas semanas antes de sua chegada a Sydney93,94. Apenas 400 testes anti-rHuEPO foram realizados em Sydney e, em relao ao nmero total de competidores, este percentual baixo foi um fato a favor do atleta usurio, uma vez que somente um para cada 20 atletas foi amostrado para rHuEPO, e a idia de ter jogos limpos no passou de uma fantasia utpica96. Desde ento, anlises de rHuEPO baseadas nos mtodos descritos foram efetuadas em eventos esportivos internacionais de grande porte, como nos Jogos Olmpicos de Inverno de Salt Lake City de 2002. Nesse evento foram efetuadas, durante a competio, 1.222 anlises sanguneas e 72 anlises de sangue e urina combinadas para a deteco da rHuEPO. Para esse evento, anlises combinadas de sangue e urina tambm foram realizadas fora de competio, perfazendo um total de 77 testes. Nenhum caso positivo de rHuEPO foi encontrado na ocasio. Entretanto, trs casos positivos foram descritos para outro hormnio sinttico anlogo EPO, recentemente lanado no mercado, denominado darbepoetina alfa (Aranesp)97,98. Esse hormnio, que se diferencia bioquimicamente das formas de rHuEPO por possuir mais duas cadeias de carboidratos ligadas a tomos de nitrognio e apresenta substituies de aminocidos em cinco posies no esqueleto peptdico, tambm estimula a produo de clulas vermelhas e, portanto, tamRev Bras Med Esporte _ Vol. 9, N 3 Mai/Jun, 2003

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bm pode aumentar o desempenho de atletas, especialmente nos esportes de resistncia99-101. PERSPECTIVAS FUTURAS RELACIONADAS rHuEPO inteno das autoridades do COI de que a anlise da seja cada vez mais aperfeioada, uma vez que o mtodo direto ainda consome muito tempo e no muito sensvel. Aliado a esse fato, maior nmero de laboratrios credenciados deve ser capaz de efetuar essas anlises, mas um ponto importante na implementao rotineira de anlises para a rHuEPO o fator custo. Uma anlise envolvendo as triagens necessrias para o monitoramento de todas as substncias proibidas em controle de dopagem possui custo relativamente elevado e a incluso de testes para a rHuEPO ir acarretar aumento significativo em seu preo. Clculos preliminares j mostraram que apenas o teste indireto responsvel por acrscimo em torno de 25 dlares no custo de cada amostra, no incluindo gastos com a coleta de sangue71. Apesar desse fato, algumas confederaes esportivas brasileiras j patrocinam programas de controle para rastreamento de rHuEPO em alguns de seus campeonatos, tendo sido, inclusive recentemente, detectado um caso positivo desse hormnio utilizado por atleta brasileiro102,103. Os laboratrios de controle de dopagem tero desafios importantes a vencer na deteco das substncias do tipo endgeno. Novas molculas estimuladoras da eritropoese geradas a partir de EPO modificada vm sendo desenvolvidas pela indstria farmacutica com a finalidade de prolongar a durao de seus efeitos, reduzindo a freqncia na administrao, tornando-se assim de grande interesse para atletas que fazem uso deste tipo de recurso ilcito96. Os desenvolvimentos analticos esperados para os prximos anos levam a mtodos de deteco sensveis envolvendo a eletroforese em zona capilar104, bem como a combinao de outras tcnicas cromatogrficas e espectromtricas3,105. O futuro dos testes sanguneos parece estar vinculado aos avanos tecnolgicos da medicina. A nanotecnologia vislumbra ser nos prximos anos o caminho a ser seguido para anlise de frmacos, tanto na teraputica quanto no esporte, uma vez que permite a deteco de diversas substncias diferentes com a coleta de apenas uma gota de sangue ou de outro fluido biolgico. Espera-se que, a partir de ento, os atletas faam menos objeo realizao de testes sanguneos e que limites de deteco mais baixos sejam alcanados96. provvel, entretanto, que nas Olimpadas de 2008 algum atleta geneticamente modificado possa vir a subir em um pdio. Tcnicas de terapia gentica esto sendo utilizadas na medicina para tratamento experimental de doenas
rHuEPO
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e podero vir a ser empregadas por atletas inescrupulosos. Experimentalmente, vem sendo administrado no tratamento de anemias e de doenas renais o gene que codifica a EPO, uma vez que produz uma forma de hormnio efetivamente endgena. Contudo, como o uso clnico de injees de DNA ainda no est amplamente disseminado devido dificuldade em controlar o tecido que recebe tal aplicao, espera-se que essa prtica tarde mais um pouco a entrar no mundo esportivo106.
AGRADECIMENTOS Dra. Marlia Rugani do HemoRio, pela reviso crtica do documento. Fundao Universitria Jos Bonifcio (FUJB), Conselho Nacional de Pesquisas (CNPq) e Confederao Brasileira de Futebol pelo apoio e ao Instituto de Qumica-UFRJ pelo apoio incondicional pesquisa na rea do controle de dopagem.

Todos os autores declararam no haver qualquer potencial conflito de interesses referente a este artigo.

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