Daos, Mutaciones y Mecanismos de Reparacin del ADN

Daos en el ADN: Alteraciones en la estructura del ADN causadas por

agentes fsicos o qumicos. Si los daos no son reparados, algunos pueden llevar a mutaciones o muerte celular

Mecanismos de Reparacin: Procariotas y Eucariotas poseen

mecanismos que reparan daos en el ADN antes de la fijacin de mutaciones. Genoma eucariota >130 genes de reparacin

Mutaciones: Cualquier cambio permanente en la secuencia genmica del

ADN en clulas somticas o germinales

Daos en el ADN no reparados

Bloqueo de la replicacin y transcripcin

Mutaciones Regiones intergnicas Silenciosas

Codn sinnimo Mutacin silenciosa

Genes
Codn No sinnimo

Missense: aminocido distinto Non sense: codn de terminacin Read through: codn de terminacin eliminado

Mutaciones
Cambios en la secuencia de DNA: Cambios puntuales (1 nt),
inserciones, deleciones Espontneas
Errores en la replicacin Prdida de bases Desaminacin de bases
Incrementada por agentes qumicos y fsicos

Ambientales
Mutgenos Cambios estructurales del DNA que afectan la capacidad de apareamiento

Transiciones: Purina por purina o pirimidina por pirimidina. GA AG CT TC

Transversiones: Purina por pirimidina y

viceversa. G T G C A T A C T G C G T A C A

Agentes fsicos o qumicos que provocan daos en el ADN

Qumicos
Anlogos de Bases Agentes alquilantes Agentes intercalantes

Fsicos
Radiacin UV Radiacin ionizante Calor

Estructuras Bsicas en DNA

Bases

Nuclesido

Unin N-Glicosdica

Esqueleto de DNA: molculas de desoxirribosa unidas por grupos fosfato. Unin H:

Unin fosfodiester

Sitios en los nucletidos que pueden ser daados

Dao oxidativo Ataque hidroltico Metilacin

Daos que puede sufrir el DNA

Unin covalente entre bases de la misma cadena Unin de grupos alquilo Ruptura de simple cadena (nick) Ruptura de doble cadena Prdida de bases Desaminacin Mismatch (mal apareamiento)

Pirimidinas

Desaminacin
100 a 500 eventos/cel./dia Transicin C T

Purinas

Prdida de Bases

-DEPURINACION: Prdida espontnea de purinas

clula humana: 2000 a 10.000 purinas/clula/dia. E. coli: 1 purina/genoma/generacin.

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Dao Oxidativo
Dao en el DNA provocado por especies reactivas de oxgeno.

-H2O2. -OH. -O2.

.OH ataque sobre azcar prdida de base y rupturas .OH ataque sobre las bases

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Radiacin Ionizante
Formacin de molculas ionizadas y excitadas.
Las ms importantes son especies formadas por radilisis del agua, que forma productos capaces de causar dao oxidativo.

Produce:
Dao en la base y azcar Prdida de bases Ruptura de la cadena

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Fuente de radicales
Intracelular -Respiracin. -Metabolismo de los Peroxisomas Extracelular -Radiacin ionizante. -UV. -Calor. -Algunas drogas.

Defensas:

SOD Glutatin Catalasa Vit C, Vit E

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Luz Ultra Violeta (UV)

Fotoproducto principal dmeros de pirimidina

6-4 photoproduct (T-T) Cyclobutane dimer (T-T)

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Agentes alquilantes

-Sitios de alquilacin : anillos nitrogenados y algunos grupos oxgeno

Debilitamiento unin N-glicosdica Prdida de la base Afecta apareamiento correcto de la base

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Agentes Alquilantes
1) -EMS (Ethyl methano sulfonato). -Nitrosamina -Nitrosourea

2) Agentes bifuncionales: pueden reaccionar con 2 centros nucleoflicos unin inter- o intra-cadena de DNA -Mostaza nitrogenada -Mitomicina -Cisplatino -Psoralen 3) -Benzopyreno -Aflatoxinas

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Examples of DNA bases damaged by endogenous agents

Nilsen, H. et al. Carcinogenesis 2001 22:987-998; doi:10.1093/carcin/22.7.987

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Anlogos de Bases
1) Derivados halogenados de uracilo 5-bromo-uracilo Anlogo de timina

La presencia de bromo en el C-5 incrementa la proporcin de la forma tautomrica rara (enol)

Consecuencia: Errores en la replicacin Mismatch

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Mismatch: Errores en la replicacin

-Replicacin del DNA 1 error en 107/generacin -Mecanismos de reparacin corrigen un 99% -Frecuencia real de mutacin por nucletido es 10-9-10-12

Errores de la DNA polimerasa

Incorporacin de base errnea
Seleccin de nucletido Funcin correctora Tautmeros de bases
U al nt Cambio al sitio activo U fosfodiester

Inserciones y deleciones (en regiones de secuencias cortas repetidas)

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Cambios Tautomricos
Rearreglos transientes de las bases (1 en 104 a 105). Si se incorporan durante la replicacin provocan un apareamiento alterado de las bases.

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Mecanismos de Reparacin
1. Sistemas de Reparacin directos
Enzimas que revierten directamente el dao

2. Reparacin por Escisin (BER , NER, MMR) 3. Sistemas de Tolerancia

Sistema SOS (E.coli)

4. Sistemas de Recuperacin
Recombinacin

5. Reparacin de rupturas de doble cadena

Recombinacin homloga NHEJ: unin de extremos no homlogos

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1. Sistemas de Reparacin Directa

No requieren sntesis ADN Nick (ruptura de unin fosfodiester en una cadena)
DNA ligasas

Daos por alquilacin

Enzimas especficas que eliminan el grupo alquilo Ada (E.coli) remueve grupos alquilo de posicin 4 y 6 de T y G MGMT (humana) remueve grupo alquilo de posicin 6 de guanina

Dmeros de timina (Fotorreactivacin)

Fotoliasa (E.coli)

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2. Reparacin por escisin

BER
Remocin de la base daada Especfico (especificidad dada en la etapa de remocin)

NER
Repara daos que distorsionan la doble hlice No especfico

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BER
1) Iniciado por DNA glicosilasa especfica reconoce el dao y cliva la unin glicosdica entre base y azcar

2) Sitio AP reconocido por AP endonucleasa (cliva 5 de AP)

3) Fosfodiesterasa (cliva 3)

4) DNA polimerasa rellena el gap DNApol I (E.coli) DNA pol (mamferos)

5) DNA ligasa

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BER

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Table 14.3. Examples of human DNA glycosylases

DNA glycosylase Specific for

MBD4 MPG NTH1 OGG1 SMUG1 TDG UNG

Uracil Ethenoadenine, hypoxanthine, 3-methyladenine Cytosine glycol, dihydrouracil, formamidopyrimidine, thymine glycol Formamidopyrimidine, 8-oxoguanine Uracil Ethenocytosine, uracil Uracil, 5-hydroxyuracil

Based on Lindahl and Wood (1999) and Wood et al. (2001).

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The BER pathway is initiated by DNA glycosylases and may follow a short-patch (A and B) or a long-patch (C) route, in part depending on the type of initiating DNA glycosylase

Nilsen, H. et al. Carcinogenesis 2001 22:987-998; doi:10.1093/carcin/22.7.987

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NER
E.coli Sistema Uvr ABC
Remocin de 12nt

Eucariotas Remocin de 24-29 nt

Humanos al menos 16 protenas involucradas XP (Xeroderma pigmentosum) XPA reconocimiento del dao XPB y XPD helicasas (subu TF II H) XPG y XPF endonucleasas

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29

30

3. Reparacin de Mismatch (MMR)

Errores post-replicacin No apareamiento (mismatch) No mutagnico requiere corregir la cadena nueva

Distincin entre cadena parental e hija:

En E.coli metilacin del DNA (dam, dcm) retardo en metilacin pos-replicacin En otros organismos pueden ser otras seales

Reduce los errores de replicacin de 10-7 a 10-10/ pb / replicacin

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MMR
E.coli genes mut S, L, H
Reemplaza hasta 1kb Metilacin diferencial (dam, dcm)

MutS reconoce el mismatch MutH distingue ambas cadenas clivaje en GATC Mut Lcoordina actividad de Mut S y H

En eucariotas homlogos de protenas Mut

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MMR

33

34

Nucleotide and base excision repair in the context of chromatin

Peterson C. L., Ct J. Genes Dev. 2004;18:602-616

2004 by Cold Spring Harbor Laboratory Press

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4. Sistema de Tolerancia
Daos no reparados bloquean la replicacin Los sistemas de tolerancia permite pasar sobre el dao de DNA durante la replicacin (bypass) con el costo de introducir mutaciones Respuesta SOS en E.coli DNA Polimerasas EP en otros organismos

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Estrategias de tolerancia al dao

Hacen uso de la informacin provista en la cadena complementariaLibre de error

Sntesis a travs de la lesin (TLS) Mutagnico

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De acuerdo al tipo de dao y el entorno predominan distintos tipos de mutaciones

Sustitucin de base

Cambio de fase

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Sistema SOS (E.coli)

Activado por el frenado del complejo replicativo por dao en el DNA no reparado Desacoplamiento de replicacin de cadena lider y retrasada

Activacin de protena Rec A por unin a DNA sc

Rec A * (coproteasa) Degradacin de Lex A (represor transcripcional)

Activacin de transcripcin de alrededor de 40 genes

Reparacin Recombinacin DNA polimerasas (DNA pol II, DNA pol V y DNA pol IV)

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Induccin del sistema SOS por UV en E.coli

UV
LexA

rec A < 1min

pol B < 1min Pol II UmuD

umuDC 45 min

Dao en el ADN

LexA RecA*

UmuC UmuD

Pol V

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DNA pol II libre de error

Modelo de reinicio de replicacin

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DNA polimerasa V
Sntesis de DNA a travs de la lesin

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Model of SOS translesion replication by DNA polymerase V. The two DNA strands are shown as green lines, and the replication-blocking lesion is represented by the red rectangle

Sntesis a travs de la lesin

Livneh, Z. J. Biol. Chem. 2001;276:25639-25642

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EP Polimerasas Eucariotas

Replicacin de moldes de ADN imperfectos (daos en el ADN) Hipermutacin Somtica

EP polimerasas eucariotas: aprox. 14 polimerasas distintas

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6. NHEJ Unin de extremos no homlogos

Mecanismo de reparacin de rupturas de doble cadena (DSB) Unin de extremos con poca o ninguna homologa (sin apareamiento) En eucariotas principal mecanismo de reparacin de DSB Presente en eucariotas y procariotas

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Mecanismo de NHEJ
1- Reconocimiento de extremos y sinpsis
Ku: Heterodmero: Ku70 y Ku80 forma una estructura en anillo Sinpsis: acercamiento de los 2 extremos. Requiere Ku y DNA-PK completa (DNA-PKsc + Ku)

2- Procesamiento Terminal
RAD50, Mre11, Nbs1 actividad endo y exonucleasa Helicasas, DNA polimerasas

3- Ligacin de extremos
DNA ligasa asociada a XRCC4

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Schematic representation of the pathway of DNA NHEJ, indicating the known players in this pathway in vertebrates

Jackson, S. P. Carcinogenesis 2002 23:687-696; doi:10.1093/carcin/23.5.687

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Overview of the main steps and factor requirements of the DNA DSB repair pathway of HR

Jackson, S. P. Carcinogenesis 2002 23:687-696; doi:10.1093/carcin/23.5.687

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Repair of DNA DSBs in chromatin

Peterson C. L., Ct J. Genes Dev. 2004;18:602-616

2004 by Cold Spring Harbor Laboratory Press

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