UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS E. A. P. DE CIENCIAS BIOLGICAS

Cariotipo y aspectos citogenticos de Dactylopius coccus Costa, 1835:

"la cochinilla del carmn"

TESIS para optar el ttulo profesional de Bilogo con mencin en Zoologa

AUTORA Sally Jesmille Molero Obregn

Lima-Per 2009

A mis padres con Amor y Gratitud.

AGRADECIMIENTOS

A la Mg.Sc. Olga Bracamonte Guevara Por su asesora permanente en el desarrollo de la tesis y por las facilidades brindadas para la realizacin de la misma.

Al Dr. Misael Guevara Por sus acertadas sugerencias desde un inicio, as como la ayuda en el anlisis de los resultados y la bsqueda bibliogrfica. Por brindarme las condiciones de laboratorio necesarias para la realizacin del presente trabajo.

A la Mg. Mara Siles Vallejos Por su ayuda en la interpretacin de los resultados y por al anlisis crtico del mismo. Por su apoyo a lo largo de la tesis y por su amistad.

Al Mg. Liberato Portillo Profesor de la Universidad de Guadalajara, Mxico Por su ayuda con el material bibliogrfico, por su confianza depositada en mi y en la presente investigacin.

Al Mg. Sc. Gildardo Aquino Prez Colegio de Postgraduados San Luis de Potos, Mxico. Por haberme facilitado material bibliogrfico de primera calidad, particularmente por su Tesis: Estudio Cromosmico en cuatro tipos de cochinilla (Dactylopius spp.) (Homptera: Dactylopiidae) del Nopal (Opuntia spp.)

A la Dra. Rina Ramrez Mesas Por su orientacin en el inicio de esta investigacin y por sus palabras de aliento presentes en todo momento.

Al Blgo. Jos Pino y la Blga. Betty Shiga Por las facilidades brindadas para la medicin de los cromosomas.

A la Dra. Rosmarina Marn y a la Mg. Sc. Norberta Martnez. Por la ayuda con la bibliografa sobre Dactylopius coccus Costa.

A los Blgos. Marielena Rodrigo, Jos Meja y Rodolfo Velazco. Por su apoyo en el desarrollo de la presente investigacin, su amistad y su confianza.

A mis padres el Ing. Gustavo Molero y la Lic. Educ. Celia Obregn. Por todo el apoyo brindado a lo largo de mi carrera, por su comprensin, sus enseanzas, su amor y la energa positiva que siempre me transmiten.

A todos los amigos del Laboratorio de Citogentica Por esos gratos momentos compartidos y por sus aportes en la presente investigacin.

INDICE

Resumen1 Abstract.....2

1.Introduccin...3 2. Antecedentes.....5 2.1 Dactylopius coccus Costa la cochinilla del carmn5 2.1.1 La importancia de Dactylopius coccus Costa en el mundo..5 2.1.2 Biologa de Dactylopius coccus Costa.....6 2.1.2.1 Ciclo de vida y los factores que influyen en su desarrollo...6 2.1.2.2 Dactylopius coccus Costa y la produccin de cido carmnico...7 2.2 La importancia de los estudios del Cariotipo y la Citogentica.8 2.3 Los Cromosomas Holocntricos...10 2.3.1 Caractersticas de los cromosomas holocntricos. 10 2.3.2 Los cromosomas holocntricos en los insectos.11 2.3.3 Fusin y Fisin de los cromosomas holocntricos12 2.3.4 Avances moleculares en cromosomas holocntricos.13 2.4 La evolucin en los cccidos....13 2.5 Heterocromatinizacin y determinacin del Sexo....14 2.5.1 La Heterocromatina..14 2.5.2 La heterocromatinizacin y la determinacin del sexo en los cccidos.15 2.6 Poliploida17 2.7 Microncleos 18 3. Materiales y Mtodos..19 3.1 Materiales....19 3.1.1 Material biolgico19 3.1.2 Material qumico..19 3.1.3 Material de vidrio.19

3.1.4 Equipos e instrumentos.19 3.2 Metodologa..20 3.2.1 Preparaciones Citolgicas.20 3.2.2 Mtodo estadstico21 4. Resultados..23 4.1 Sobre la Metodologa23 4.2 Determinacin del Cariotipo de D. coccus...24 4.3 Mitosis en clulas embrionarias de D. coccus......26 4.4 Poliploida en clulas embrionarias de D. coccus.28 4.5 Presencia eventual de microncleos MN..............................................................30 5. Discusin de Resultados31 5.1 Cariotipo de D. coccus........31 5.2 Mitosis en D. coccus.......37 5.3 Clulas Poliploides en D. coccus....39 5.4 Presencia eventual de microncleos (MN).............................................................40 6. Conclusiones...41 7. Recomendaciones...42 8. Referencias Bibliogrficas43 9. Anexos.50 9.1 Longitud de los cromosomas metafsicos de D. Coccus...50 9.2 Placas metafsicas utilizadas al medir los cromosomas de D. coccus70 9.3 Idiograma de D. coccus..90 9.4 Fusin y Heterocromatinizacin en los cromosomas de D. coccus.......91 9.5 D. coccus en el laboratorio93 9.6 Mapa Geogrfico de San Bartolom- Huarochir- Lima...94

RESUMEN

Dactylopius coccus Costa, Dactylopiidae: Hemptera, es un insecto parsito de las cactceas y es muy apreciado por su contenido de cido carmnico producto que es aprovechado por el hombre desde hace muchos siglos. Con el desarrollo de la biotecnologa, la demanda del cido carmnico se ha incrementado, por lo que se han venido desarrollando diferentes metodologas con el fin de mejorar la produccin del mismo. La Citogentica es una herramienta bsica para la mejora de especies, adems de su utilidad en otras reas como la sistemtica evolutiva, e ingeniera gentica, este tipo de investigaciones en la cochinilla del carmn son de mucha importancia para el Per, porque es el primer productor de carmn a nivel mundial. En el presente trabajo se determin el cariotipo de Dactylopius coccus Costa, obtenindose que su nmero diploide es 2n=16 cromosomas, todos son holocntricos y disminuyen gradualmente en tamao desde el primer par homlogo hasta el ltimo. As mismo se caracteriz la mitosis, que es particular por la naturaleza holocntrica de los cromosomas y al estudiarse en clulas embrionarias se observ la heterocromatinizacin como mecanismo de determinacin del sexo, donde la condensacin de los cromosomas es homognea en hembras y heterognea en machos. Los procesos de poliploida observados parecen estar relacionados con el desarrollo del embrin. Finalmente se observ la presencia eventual de microncleos, lo que resulta indicador de contaminacin ambiental en la zona de colecta.

Palabras clave: Dactylopius coccus Costa, cariotipo, holocntrico, heterocromatinizacin, poliploida, microncleos.

ABSTRACT

Dactylopius coccus Costa, Dactylopiidae: Hemiptera, is a parasitic insect of the cactaceous ones and is very appreciated by its carminic acid content product that is profiteer by the man for many centuries. With the development of the biotechnology, the demand of carminic acid has been increased, reason why they have come developing different methodologies with the purpose of to improve the production of the same. Cytogenetic is a basic tool for the improvement of species, besides its utility in other areas like evolutionary systematic, and genetic engineering, this type of investigations in the cochineal of the carmine one are of much importance for Peru because it is the first producer of carmine at world-wide level. In the present work karyotype of Dactylopius coccus Costa was determined, obtaining itself that its diploide number is 2n=16 chromosomes, all is holocentric and falls gradually in size from the first homologous pair to the last one. Also the mitosis was characterized, that is particular by the holocentric nature of the chromosomes and when studying in embryonic cells the heterochromatinization like mechanism of determination of sex was observed, where the condensation of the chromosomes is homogenous in females and heterogeneous in males. The observed processes of poliploidy seem to be related to the development of the embryo. Finally the possible presence of micronuclei was observed, which is indicating from environmental contamination in the zone of collection.

Key words: Dactylopius coccus Costa, karyotype, holocentric, heterochromatinization, poliploidy, micronuclei.

1. INTRODUCCIN
El gnero Dactylopius rene especies de valor gentico, eco1gico y econmico a nivel mundial. Dactylopius coccus Costa "la cochinilla del carmn (llamada nocheztli por los aztecas, e induco por los mixtecos), es un pequeo insecto parsito de la tuna Opuntia ficus -indica y de otras especies de Nopalea y Opuntia (Ferris, 1955). Por paradjico que suene, la cochinilla siendo plaga es utilizada en Sudfrica para el control biolgico de varias especies de Opuntia que invaden los pastizales dedicados a la ganadera (Garca et al., 1999). La cochinilla ha sido utilizada durante siglos desde el Pre clsico (100 a.C. a 100 d.C.) hasta nuestros das en la industria alimentaria, farmacutica, textil, cosmtica y cermica debido a su contenido de cido carmnico (De Lotto, 1974). En el Per, la cultura preincaica Paracas, cuya textilera tiene reconocimiento internacional por conseguir cerca de 190 tonalidades en sus telas, empleaba la cochinilla para los tonos que iban desde el rojo al violeta (Lock, 1997). El gnero Dactylopius es netamente americano, as lo demuestran los estudios de filogenia, no est bien definido si su centro de origen es Mxico o Per (Portillo, 2005), sin embargo Rodrguez & Niemeyer (2000) afirman que D. coccus es una especie colonizadora en Mxico y su centro de origen es el rea andina central. Cuando los espaoles llegaron a Amrica en el siglo XVI, se inici un intercambio de diferentes recursos, donde la cochinilla lleg a convertirse en el tercer artculo de exportacin, slo superado por el oro y la plata. En 1820 la cochinilla llega en una muestra de nopales infestados del insecto a la sociedad econmica de Cdiz, donde es reproducida eficientemente y en 1825 se introduce a Dactylopius coccus en las Islas Canarias, convirtindose en este lugar en la base de su economa y 45 aos despus, en 1870, Europa supera la produccin de la cochinilla a Amrica (Prez & Becerra, 2001).

Tras siglos del exitoso uso de este recurso, en 1856, se produce el primer colorante artificial, con lo que la demanda de la cochinilla se reduce notablemente, siendo reemplazado por eritrosinas y anilinas. A mediados del siglo XX se reportan alergias provocadas por los colorantes artificiales y en la actualidad se sabe que son potencialmente cancergenos (Saltzaman, 1992), por lo que el carmn de la cochinilla resurge en el mercado global al considerrsele inocuo. A nivel mundial, Per es el primer productor de cochinilla, seguido por Chile donde fue introducida en 1988 y en menos de diez aos lleg a cubrir el 10 % de las exportaciones al mundo (Bustamante, 2002), el tercer productor son las Islas Canarias. La ubicacin taxonmica de la cochinilla del carmn, de acuerdo a Triplehorn y Jonson (2005) es: Clase: Hexpoda Orden: Hemptera Sub. Orden: Stenorrhyncha Sup. Familia: Coccoidea Familia: Dactylopiidae Gnero: Dactylopius Especie: Dactylopius coccus Costa (1835) Los cccidos, como son comnmente llamados los insectos de la sper familia Coccoidea, tienen adaptaciones morfolgicas muy distintas a los dems Hempteros, dentro de las cuales resalta el hecho de que las hembras albergan los huevos en su cuerpo y la oviposicin es lenta y asincrnica, por otro lado presentan una cubierta cerosa que los protege del ambiente y de sus enemigos naturales (Gullan & Korztarab, 1997). La alta similitud entre los miembros de Coccoidea ha generado complicaciones al momento de clasificarlos. As la familia Dactylopiidae alberga solo al gnero Dactylopius, el cual a su vez rene diez especies: D. bassi, D. austrinus, D. ceylonicus, D. confertus, D. opuntiae, D. salmianus, D. tomentosus , D. zimmermanni, D.confusus y D.coccus. sta ltima es la de mayor importancia por su alto contenido de cido carmnico en comparacin con las dems.

D. coccus tiene un marcado dimorfismo sexual, donde los machos son alados y slo viven entre tres y cuatro das como adultos y las hembras son pteras y viven ms de cien das (Marn & Cisneros, 1977). El ciclo de vida est seriamente afectado por los factores externos como lluvias, temperatura, humedad relativa, predadores naturales, etc. (Daz & Quispe, 1989; Rodrguez et al., 2005; Romero et al., 2006). La hembra grvida es utilizada en la industria por su mayor concentracin de carmn y por su fcil colecta, razones por la cuales la presente investigacin se realizar en hembras. Los estudios de cariotipo proveen los datos del fenotipo de los cromosomas, en cuanto a su forma, tamao y nmero, lo cual es de utilidad para conocer los arreglos cromosmicos que ha tenido determinado grupo en su especiacin, tambin nos permite saber si es factible la realizacin de cruces intersespecficos con el fin de mejorar una especie. En relacin a D. coccus Costa, son pocos los trabajos que hacen referencia a su biologa, morfologa o ecologa, la mayor parte de estos estn orientados a los diversos mtodos de infestacin de las tunas teniendo como finalidad incrementar la produccin de la cochinilla para luego industrializar el cido carmnico. En el Per no existen trabajos pioneros en citogentica de cochinilla, la mayora de investigaciones de este tipo, se han realizado en vegetales o mamferos, incluyendo al hombre. Aquino (1991), en Mxico, determin que el nmero cromosmico de D. coccus es 2n=16 cromosomas, de los cuales cuatro pares son ms grandes que los otros y estos ltimos cuatro pares se cree provengan del fraccionamiento del cromosoma grande presente slo en especies silvestres y cuyo nmero diploide es 2n=10, tanto para D. confusus como para otras dos especies no identificadas. Conociendo que el ambiente y la geografa tienen fuerte influencia en la fijacin de los genes y la posterior adaptacin y establecimiento de una especie, se pretende establecer las diferencias, si las hubiese, del complemento cromosmico de la especie en estudio bajo las condiciones geogrficas y ambientales de San Bartolom- Huarochir-Lima. Los puntos mencionados anteriormente justifican la realizacin de estudios citogenticos en D. coccus, considerando adems que Per provee el 85% de este recurso al mundo (ADEX, 2006),

lo que hace necesario mejorar la calidad de los insumos que exportamos y as mantenernos en el mercado internacional como el primer productor de la grana fina. Por otro lado, los cccidos, al igual que muchos otros insectos se caracterizan por tener cromosomas holocntricos, es decir con centrmero difuso y por ende con actividad cinetocrica a lo largo del cromosoma, confirindole caractersticas particulares tanto en la mitosis como en la meiosis. En la presente investigacin, adems de determinar el cariotipo de D. coccus, se caracterizar la divisin mittica en clulas embrionarias, as mismo los aspectos citogenticos relevantes.

2. ANTECEDENTES

2.1 La importancia de los estudios del Cariotipo y la Citogentica

El cariotipo es la suma de todos los rasgos estructurales de los cromosomas, incluyendo el nmero, tamao y forma, que al ser constante nos proporciona una caracterstica ms del material biolgico en estudio. La Citogentica estudia el cromosoma (el material hereditario organizado) bajo cualquier nivel o dimensin" (Lacadena, 1996). Para establecer el cariotipo se usan preferentemente cromosomas metafsicos ya que debido a su alta condensacin se tornan muy evidentes las cromtidas y la posicin de la constriccin primaria o centrmero, lo cual es importante para la clasificacin de acuerdo a la nomenclatura de Levan et al.(1964). De acuerdo a su tamao los cromosomas se clasifican en largos y cortos, as por ejemplo Lacadena (1996) hace mencin que los cromosomas largos corresponden a las monocotiledneas (Trillium 30) y los cortos a la mayora de animales (Drosophila 3.5 ). El nmero cromosmico tambin es variable en la naturaleza, encontrndose especies con un bajo nmero cromosmico: Mymercia pilosula (Formicidae) 2n=2, especies con un nmero elevado de cromosomas como Tympanoctomys barrerae (Octodontidae) 2n=102 y la especie con el mayor nmero de cromosomas es Aulacantha scolymantha (Aulacanthidae) 2n= 1600. Las investigaciones a nivel citogentico permiten posteriormente realizar estudios evolutivos, identificar el banco de genes y realizar el mejoramiento gentico del gnero o especie en inters (Siles, 1996; Gonzles, 1998).

Los datos citogenticos pueden ser utilizados para la identificacin de eventuales arreglos cromosmicos dentro de una misma especie (Mandrioli et al., 1999) por lo tanto proveernos de informacin sobre su evolucin. Siendo la citogentica una herramienta que permite identificar el banco de genes e indagar los aspectos evolutivos de una especie, ha sido utilizada durante aos en diversos seres vivos. En los insectos, estos estudios han estado orientados a conocer el nmero de cromosomas y el comportamiento de los mismos, as se tiene que Callimenus macrogaster perteneciente al orden Orthoptera, presenta 2n=23 cromosomas, con esta informacin y gracias al uso de tcnicas de bandeo C se pudo conocer la relacin existente entre C. macrogaster y otras especies del gnero Callimenus (Turkoglu et al., 2006). Por otro lado en este tipo de investigaciones se ha analizado tambin la distribucin y el nmero de las Regiones Organizadoras del Nucleolo (NORs), considerndosele un buen marcador para las especies en estudio. As dentro del gnero Schistocerca, se observ que S. flavofasciata y S. pallens, coinciden en presentar como nmero diploide 2n=23X en machos y 2n=24XX en hembras, ambas especies tienen cariotipos similares, sin embargo muestran diferencias en el nmero y la distribucin de los NORs (De Souza & Franklin de Melo, 2007). Los Hempteros presentan un tipo peculiar de cromosomas, son los denominados holocntricos, los cuales se caracterizan por no tener un centrmero localizado. En este grupo se encuentran Cimex rotundatus con 2n= 28 cromosomas (Darlington & La Cour, 1969), Belostoma sp. presenta 2n=16 (Papeschi, 1996). En la subfamilia Triatominae (vectores del parsito Trypanosoma cruzi), las investigaciones a nivel cromosmico han permitido aclarar aspectos evolutivos y sistemticos, ellos han revelado que este es un grupo homogneo con 2n=21-25 y que las variaciones en el nmero de cromosomas se debe principalmente a los distintos sistemas sexuales debido a la naturaleza holocntrica de sus cromosomas (Prez et al., 1997, 2003).

Los estudios cromosmicos han permitido identificar hibridaciones en la familia Pentatomidae, tal es el caso de Eurydema pulchrum y Bagrada cruciferarum ambas especies tienen 2n= 14, y todos sus cromosomas son de tipo holocntrico (Harbhajan et al., 2006).

2.2 Los Cromosomas Holocntricos

2.2.1 Caractersticas de los cromosomas holocntricos

El centrmero es la regin de DNA de los cromosomas eucariticos que determina la formacin del cinetocoro y la unin de las cromtidas hermanas a ste. La interaccin del centrmero con los microtbulos del huso asegura la segregacin de las cromtidas en la mitosis y de los cromosomas homlogos durante la meiosis. La elongacin de las fibras del huso estn estrechamente relacionadas con el movimiento del cinetocoro, as especies con mayor incremento en la longitud del huso muestran mayor movimiento del cinetocoro mientras especies en las que la elongacin del huso es corta tienen poco movimiento en el cinetocoro (Hughes-Schrader, 1943). El origen del centrmero no es muy comprendido, Villasante et al. (2007) proponen que los centrmeros se originan a partir de los telmeros lo cual indica que los centrmeros primero fueron de tipo telocntrico y luego se desarrollaron los otros tipos incluyendo el holocntrico, pero este es un proceso que an no est del todo aclarado. En los cromosomas holocntricos no se visualiza el centrmero localizado, sino es difuso y las fibras del huso se conectan a lo largo de todo el cromosoma a diferencia de los cromosomas monocntricos donde el huso se ancla en una regin especfica del cromosoma y cuando hay fragmentos de cromosoma, inducidos por radiacin (rayos x), estos se mueven desde una generacin celular hasta la siguiente y no se pierde ninguno, entonces si cada fragmento tiene la capacidad de migrar hacia los polos es indicador de que la actividad cinetocrica es a lo largo del cromosoma (Nokkala et al., 2002). Los cromosomas llegan a ser unidos a las fibras del huso en su longitud entera y durante la anafase de la mitosis ellos ordinariamente se mueven a cada polo siguiendo su eje longitudinal paralelo a la placa metafsica (Muramoto, 1985).

Por otro lado, ya que el cinetocoro no est localizado las cuatro cromtidas no podrn ser segregadas de dos en dos en la primera anafase meitica, lo que quiere decir que no habr divisin centromrica como en una meiosis normal, en respuesta a ello como adaptacin a la naturaleza holocntrica la secuencia meitica se invierte, lo cual asegura una segregacin exacta del material hereditario (Chandra, 1962),as la primera divisin ser de tipo ecuacional, mientras que la segunda divisin ser de tipo reduccional. Fenmenos caractersticos de los cromosomas holocntricos (King, 1958):

1. En la profase tarda se da la separacin completa de las cromtidas hermanas de cada cromosoma. 2. No existe constriccin primaria. 3. Las cromtidas se separan paralelamente en la anafase.

Los cromosomas holocntricos presentan algunas caractersticas comunes durante la mitosis (John, 1990 citado por Prez et al., 1997): 1. No presentan constriccin primaria aunque se observa las estructuras cinetocricas que permitirn el movimiento. 2. En la metafase cada cromosoma es orientado con su eje longitudinal paralelo al plano ecuatorial. 3. La unin de las fibras del huso mittico es a lo largo de la longitud de las cromtidas. 4. En la anafase las cromtidas se mueven hacia los polos con su eje longitudinal paralelo al plano ecuatorial. Las caractersticas observadas por King y John, tambin han sido encontradas por Nokkala et al. (2002) y por Aquino & Brcenas (2002).

A nivel molecular el cromosoma holocntrico ha sido estudiado en Caenorhabditis elegans, cuyo genoma es similar al humano (Dernburg, 2001). Howe et al.(2001) encontraron una protena altamente conservada en su cinetocoro, HIM-10, que media la unin de los cromosomas al huso y cuya ausencia repercute en la no disyuncin de las cromtidas. Tambin ha sido estudiada la protena del huso acromtico, la KLP-19, cuya ausencia genera aberraciones cromosmicas que se traducen en puentes anafsicos y el incorrecto alineamiento de los cromosomas (Powers et al.,2004). HCP-4 tambin es requerida para la segregacin de las cromtidas hermanas en C. elegans y su ausencia evita que las cromtidas se unan a los microtbulos del huso (Moore & Roth, 2001). 2.2.2 Los cromosomas holocntricos en los insectos Los cromosomas holocntricos estn presente en una amplia gama de insectos de diferentes ordenes incluyendo: Hemptera, Coleptera, Dermptera, Lepidptera, Odonata y Orthoptera, ello sugiere estudiar la evolucin de los cromosomas en este grupo tan variado. Las especies con cromosomas holocntricos de acuerdo a Muramoto (1985) son: Coleptera Aulacophora femoralis. Dermptera Forficula mikado. Hemptera Cicadella viridis. Lygaeus equestris Eurydema rugosa Plautia stali Schizaphis graminun, 2n = 8 (Mandrioli et al., 1999). Orthoptera Oxya yezoensis. Lepidptera Abraxas sp. y Bombyx mori , 2n = 56 (Yoshido et al., 2005).

En la mayora de insectos del orden Odonata se han encontrado que los cromosomas son de tipo monocntrico es decir con centrmero localizado, siendo as bastante comn en este grupo los del tipo metacntrico, sin embargo la especie Somatochlora metallica ha sido de particular inters porque presenta cromosomas holocntricos (Nokkala et al., 2002), este hecho nos motiva a investigar a fondo cuales han sido los mecanismos evolutivos que han llevado a esta transicin de la naturaleza holocntrica y monocntrica dentro de un mismo clado y conocer los arreglos que se han dado a nivel cromosmico y explicar as mismo como ha repercutido en la variabilidad del grupo. Con respecto a la superfamilia Coccoidea, se sabe que Pseudococcus nipae presenta 2n=10 cromosomas, todos de tipo holocntrico y de pequea longitud (Schrader, 1921). Dactylopiidae al igual que muchas familias de los Coccoidea tambin se caracterizan por la naturaleza holocntrica de sus cromosomas (Aquino & Brcenas, 2002). En la familia Dactylopiidae se ha encontrado que tres especies mexicanas, Dactylopius confusus y dos especies de Dactylopius spp. (no identificadas) presentan como nmero diploide 2n=10, coincidiendo con Schrader (1921) en encontrar un bajo nmero cromosmico en cccidos y todos de naturaleza holocntrica, as mismo se ha reportado que el nmero diploide de D. coccus es de 2n=16, donde se hipotetiza que los tres pares adicionales que tiene esta ltima especie en comparacin con las anteriores se debe ha un posible fraccionamiento del primer par de cromosomas (Aquino, 1991).

2.2.3 Fusin y fisin de los cromosomas holocntricos Los procesos de fusin y fisin en los cromosomas holocntricos son los responsables de la variacin cariotpica dentro de un mismo gnero, as lo demuestra Cook (2000) para justificar la alta variacin en el nmero cromosmico del gnero Apiomorpha (Hemptera: Coccoidea: Eriococcidae), donde el nmero cromosmico ms bajo fue atribuido a A. baeuerleni (2n=4) y el ms elevado a A. macqueeni (2n=192) y entre ambos existen especies con diferentes nmeros diploides 2n= 10,18,28,32,56,80,144,etc y casualmente los cromosomas de las especies con

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elevado nmero son de pequeo tamao y las especies que presentaron bajo nmero diploide tienen cromosomas bastante grandes. Lo encontrado en el gnero Apiomorpha, es bastante similar a lo encontrado por Aquino (1991) en el gnero Dactylopius, en el cual reporta que las especies silvestres de este gnero D. confusus y otras dos especies no determinadas tienen como nmero diploide 2n=10, con un par de cromosomas bastante grandes y los cuatro pares restantes pequeos mientras que D. coccus presenta 2n=16 cromosomas todos pequeos. Estos dos eventos pueden explicarse por los procesos de fusin-fisin de los cromosomas holocntricos lo cual juega un rol importante en la evolucin. La naturaleza holocntrica en los cromosomas ha sido tambin observada en algas como: Cosmarium botrytis, Closterium acerosum, Hyalotheca dissiliens, entre otros, en las cuales King (1958) encuentra diferentes nmeros cromosmicos en clones de una misma especie, as para Netrium digitus reporta una variedad con 2n=56, otra 2n=86 y una ltima 2n=296 cromosomas y afirma que este nmero es variable debido a la naturaleza holocntrica de los cromosomas donde es usual que se den procesos de fusin y fisin. Las tcnicas moleculares son una herramienta muy til para detectar fusiones entre cromosomas, tal es el caso de Arabidopsis mutants, esta planta tiene cromosomas monocntricos (centrmero localizado) pero la peculiaridad de este organismo es que es deficiente en el gen de la telomerasa reversa transcripatasa (TERT). Cuando un cromosoma se parte sus regiones terminales tienden a fusionarse debido a que la clula opta por reparar este dao mediante la recombinacin de terminaciones entre homlogos o no homlogos que se juntan, el resultado es que en las subsecuentes mitosis se observan puentes anafsicos. Los telmeros de A. mutants en ausencia de TERT pasan por este proceso de reparacin, dichas uniones fueron evidenciadas por Mokros et al. (2006) quienes utilizaron BAC-FISH bicolor, sta tcnica resultara de gran ayuda para el anlisis de cromosomas holocntricos donde los procesos de fusin y fisin son constantes.

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2.3 La evolucin en los cccidos debido a los cromosomas holocntricos

As como existen modificaciones a nivel fenotpico, a lo largo del proceso evolutivo se han dado modificaciones a nivel cromosmico, particularmente porque poseen cromosomas de tipo holocntrico. Brown (1966), Nur (1982) y Aquino (1991), demuestran que la naturaleza holocntrica de los cromosomas ha conducido a este grupo a una evolucin poco usual, donde se encuentran como causantes de ello los procesos de fraccionamiento y fusin de los cromosomas, as mismo en el particular comportamiento que van a tener los cromosomas en la meiosis donde la primera divisin va a ser ecuacional y la segunda reduccional, es decir, la secuencia se invierte, ya que como explica Chandra (1962), en la primera divisin meitica debido a la naturaleza holocntrica de los cromosomas ellos van a comportarse como en la mitosis donde las cromtidas migrarn a los polos en la anafase I y no los cromosomas, es decir, las cromtidas se van a auto-orientar para luego reasociarse y en la anafase II las cromtidas homlogas se separarn como sucedera en la anafase I normal, por lo tanto la segunda divisin es reduccional. (Chandra, 1962; Nur, 1982; Aquino, 1991). La inversin de la secuencia meitica va a permitir que se eliminen cromosomas de origen paterno, los cuales dependiendo de en que momento se eliminan o inactivan van a conocerse como sistemas: Lecanoide, Comstockiella o Diaspididae. Tanto la naturaleza holocntrica de los cromosomas como la secuencia meitica inversa pueden ser los responsables de la diversificacin de las especies de cochinilla, a travs de fisiones y fusiones de los cromosomas (Aquino & Brcenas, 2002).

2.4 Heterocromatinizacin y determinacin del Sexo

2.4.1 La Heterocromatina Una regin especfica dentro del cromosoma (centrmero) es responsable del movimiento durante la separacin de stos hacia los polos. Esta regin tiene una tincin diferencial al resto del cromosoma, por tanto se reconocen dos clases de material cromosmico: eucromatina y

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heterocromatina. La eucromatina tiene alta tasa de mutacin, no presenta alociclia y es de rpida replicacin. La heterocromatina posee secuencias repetidas, no expresa todos sus genes y presenta alociclia, proceso por el cual una misma regin heterocromtica puede aparecer heteropicnticamente positivo o negativo dependiendo del estadio celular. La heterocromatina puede ser de dos tipos: constitutiva y facultativa. H. Constitutiva: aquella que conserva su estado de condensacin en todas las clulas y en todo momento y por lo tanto corresponde a DNA permanentemente silencioso y consta en general de secuencias altamente repetitivas, por lo tanto es heteropicnticamente constante. H. Facultativa: es cromatina especficamente inactiva durante ciertas fases de la vida de un organismo (Karp, 1998) y vara heteropicnticamente (Lacadena, 1996). Las zonas heterocromticas de un cromosoma van a ser ubicadas exactamente en la misma regin de su homlogo.

2.4.2 La heterocromatinizacin y la determinacin del sexo en los cccidos Al estudiar los cromosomas de los cccidos no se aprecian cromosomas sexuales, ambos, machos y hembras se desarrollan a partir de huevos fertilizados, pero en los embriones de machos los cromosomas de origen paterno llegan a heterocromatinizarse y se inactivan genticamente o se eliminan (Nur, 1982, 1990). El genoma paterno no es activo en los machos, Brown & Nelson-Res (1961) lo comprobaron al exponer a radiacin a cccidos machos los cuales luego se cruzaron con hembras no irradiadas, lo que dio como resultado que casi todos los machos sobrevivieran en contraste con las hembras donde casi todas murieron, por lo tanto se vio inactividad gentica de los cromosomas paternos en machos, en los cuales los cromosomas de origen paterno se heterocromatinizan en la

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embriognesis para hacerse no funcionales o destruirse, mientras que en la hembras descendientes fue perjudicial ya que en ellas si hay actividad gentica de los cromosomas paternos y todos estos son eucromticos. La heterocromatinizacin en los cccidos parece ser un mecanismo mediante el cual parte de un cromosoma o todo el cromosoma o varios cromosomas van a llegar a ser genticamente inactivos durante el desarrollo del individuo (Brown & Nur, 1964). Estos autores explican este proceso afirmando que en la primera divisin inmediatamente despus de la fertilizacin los cromosomas de los embriones aparecen eucromticos, poco despus en el estado de blstula la mitad de los cromosomas llegan a ser heterocromticos en aquellos embriones que estn destinados a ser machos, mientras que en las hembras todo el juego de cromosomas se mantiene eucromtico. Esta heterocromatinizacin fue observada por primera vez por Franz Schrader en1921, en el Pseudococcidae Pseudococcus nipae, donde encontr cinco cromosomas eucromticos (E) y cinco heterocromticos (H). Sobre este grupo heterocromtico se sabe que son de origen paterno, como se mencion antes y adems que el juego heterocromtico en los machos es genticamente inerte (Schrader, 1921), lo que significa que a pesar de que el nmero de cromosomas en machos es diploide, son virtual o fisiolgicamente haploides. En los embriones destinados a ser machos los cromosomas heterocromticos se mantienen juntos en interfase y en esta etapa estn mas condensados que en profase (Brown, 1966). El cccido Phenacoccus acericola tiene 2n=12 cromosomas de naturaleza holocntrica y los procesos de heterocromatinizacin son tpicos en este gnero, as se encontr que los machos de esta especie durante la metafase I de la meiosis, que es similar a la mitosis, presentan dos juegos de cromosomas uno que se tie densamente y forma un anillo y otro que tiene una tincin ms baja y no se tiende a agrupar (Hughes-Schrader, 1935). La heterocromatinizacin del juego paterno de cromosomas en la embriognesis ha sido

estudiado tambin en el gnero Parlatoria (2n=8). La hetecromatinizacin se da con el fin de destruir estos cromosomas durante la espermatognesis, lo peculiar de este gnero es que antes de iniciada la meiosis uno de los cromosomas del juego paterno es destruido y slo entrarn a

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meiosis el juego materno de cromosomas y los tres restantes paternos que finalmente tambin van a ser destruidos (Kitchin, 1975). La heterocromatina de los cccidos es conocida por ser genticamente inactiva sin embargo se le atribuyen dos tipos de actividad residual, la primera es un requerimiento de un volumen normal de heterocromatina y la segunda radica en que al realizar un cruce el juego paterno de los machos no puede ser sustituido por otro (Berlowitz, 1964). Nur (1990) demostr que existe una relacin ntima entre los cromosomas heterocromticos (H) y los eucromticos (E), como se explica a continuacin: se cruzaron machos de Pseudococcus calceolariae en los que la serosa (membrana embrionaria) de los embriones machos mantenan el genoma paterno heterocromtico (H) con hembras de P. afinnis donde el genoma paterno es eucromtico y ello result en hbridos que tenan la serosa eucromtica, lo cual muestra que existe una activacin de los homlogos H, por sus homlogos E y que a lo largo del desarrollo de los machos, el juego heterocromtico se divide sincrnicamente con el juego eucromtico. Adems en la metafase ambos juegos no son distinguibles y esta etapa se observa igual en hembras y machos. En los machos a nivel citogentico se caracterizan por la

Dactylopius

coccus

heterocromatinizacin de los cromosomas paternos, mientras los de origen materno permanecen eucromticos (Aquino & Brcenas, 2002). Reversin de H a E: En algunos tejidos de cccidos machos se observ la prdida de los cromosomas heterocromticos H, debido a un proceso de reversin de la heterocromatinizacin y por tanto el retorno de los cromosomas H a un estado eucromtico E. Este proceso inverso vara de especie a especie y el tiempo que tarde vara de tejido a tejido (Nur, 1967). Los cromosomas heterocromticos tienen la capacidad de revertir su condicin a eucromticos (Brown, 1966) lo cual tambin ha sido observado por Nur (1990) en algunos rganos y tejidos

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como los tbulos de Malpighi, las glndulas salivales y la serosa (membrana embrionaria) de Pseudococcus spp. Actualmente con el desarrollo de muchas tcnicas moleculares es posible explicar a nivel de protenas o con marcadores moleculares los pasos exactos en los diversos procesos biolgicos. As Bongiorni et al. (2001) investigaron la actividad de la protena no histona HP-1 en el proceso de heterocromatinizacin, la cual es una protena cromosmica altamente conservada y se report por primera vez en Drosophila melanogaster en la heterocromatina de sus cromosomas politnicos. Con el uso de anticuerpos monoclonales se evidenci que HP-1 est presente en Planococcus citri, y est preferencialmente asociada con regiones especficas de los cromosomas heterocromticos de los machos y se le observ dispersa a lo largo del cromosoma con un patrn reproducible. Estos resultados indican un rol importante de la HP-1 en el proceso de heterocromatinizacin.

2.5 Poliploida
Se dice que un individuo es diploide cuando su dotacin autosmica normal est compuesta por dos juegos idnticos de x cromosomas cada uno, de forma que dichos x cromosomas son todos diferentes entre si tales que no pueden reagruparse en grupos inferiores x1, x2,.....xn (x1+ x2+.....xn = x). El conjunto de los x cromosomas es el genomio y se llama nmero bsico al nmero de cromosomas que lo conforman. Si la dotacin de un individuo est compuesta por ms de dos genomios o juegos completos de cromosomas se dice que es un poliploide (Lacadena, 1996). La poliploida puede ser generada por endorreduplicacin, este proceso es la ocurrencia de dos o ms rondas sucesivas de replicacin cromosmica sin pasar por ningn periodo mittico intermedio ocasionando que la clula pase de 2n a 4n. Nur (1989), menciona que la poliploida es un posible mecanismo para el aumento en el nmero cromosmico. As existen especies dentro de un mismo gnero con 2n=8, 2n= 16, 2n=18 y se

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cree que 2n=16 ha derivado o se origina de un doble juega de 2n=8 y que en el caso de 2n=18 este se form a partir de 2n=16 y los 2 cromosomas anexos provienen de la fragmentacin de algn cromosoma y los posteriores arreglos. Una alternativa para explicar mejor esto es que 2n=16 y 2n=18 fueron derivados de 2n=8 mediante una serie de pasos (8, 10, 12, 14, 16,18). Pero la ausencia de dicho grupos, 12,14, tiende a favor de la hiptesis de la poliploidizacin. Otro dato que confirma el origen poliploide en una especie es la longitud total del complemento (LTC) cromosmico, as por ejemplo Diaspis echinocacti con 2n=16 y LTC = 65,1 +/- 0,6 m y Grenaspis decurvata con 2n=8 tiene LTC = 31.1+- 1.2 m. Estas especies de gneros diferentes son de la familia Diaspidiidae y la LTC se sabe que est relacionado con el contenido de DNA de los cromosomas. Por tanto, este dato sugiere que D. echinocacti es tetraploide (Nur, 1989). Hughes-Schrader (1948), citado por Aquino (1991), seala que la poliploida es un fenmeno comn en los huevos de cccidos y su tarea es participar en el desarrollo de los embriones.

2.6 Microncleos
Los microncleos son fragmentos de cromosoma o cromosomas completos que quedan fuera del ncleo en mitosis (Schmid, 1975 citado por Castaeda, 2008). El principio de su formacin es en la anafase, donde cualquier fragmento cromosmico que no posea centrmero no podr integrarse al ncleo pues carece del elemento necesario para unirse al huso. Calvert et al.,1998 citado por Castro et al.,2004 sealan que su formacin tambin est relacionada con el dao a las protenas que constituyen el huso mittico las cuales no estarn en capacidad de unirse a uno o ms centrmeros dejando cromosomas o restos de este a un lado. Los elementos rezagados quedan integrados en el citoplasma de las clulas hijas y son ms pequeos que el ncleo principal de ah el nombre de microncleos MN. Este fenmeno se traduce como prdida de DNA, lo que puede inducir mutaciones de clulas somticas. Se ha atribuido la presencia de microncleos a metales pesados por lo que cuando las clulas de un organismo lo presentan indicara contaminacin en el ambiente, as por ejemplo Prieto et al. (2006-a) encuentran que la presencia de arsnico en el agua ha provocado la formacin de

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microncleos en las branquias de Danio rerio (pez cebra), que se incrementa cuando la concentracin de arsnico aumenta. El arsnico tambin ha inducido la formacin de microncleos en Vicia faba (Prieto et al., 2006-b) por lo tanto estos estudios son de gran importancia para el rescate de ecosistemas que han sido impactados por metales pesados u otros agentes contaminantes. Domnguez et al. (2006) encontraron que el dixido de carbono, amoniaco, metanol y xileno inducen lesiones predominantemente citotxicas incluyendo la formacin de microncleos en clulas bucoepiteliales humanas y que estos procesos son independientes de la edad o los hbitos de cada persona, en este mismo tipo celular se ha reportado la presencia de microncleos en mujeres que ocupacionalmente se exponen a plaguicidas (Castro et al., 2004). Los microncleos influyen en la tasa de divisin celular, es decir en el ndice mittico de modo que mientras el nmero de microncleos aumenta el ndice mittico disminuye (Hick et al., 2007). La disminucin del ndice mittico por la presencia de microncleos tambin ha sido encontrada en las branquias del mejilln Mytilus californianus de las aguas del mar de Baja California donde hubo derrame de petrleo (Mrquez, 2005). Liu et al., 1994 han demostrado los efectos que tiene el plomo en altas concentraciones en el desarrollo de Allium cepa. Encontraron clulas con microncleos y aberraciones en la anafase donde se forman puentes entre los grupos de cromosomas que migran hacia los polos y ncleos con forma irregular. La presencia de puentes anafsicos debido a los microncleos ha sido igualmente encontrado en Lens culinaris debido a efectos citotxicos por cadmio (Kiran & Sahin, 2006).

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3. MATERIALES Y MTODOS 3.1 Materiales:

3.1.1 Material biolgico: Muestras de hembras grvidas de Dactylopius coccus, colectadas en el distrito de San Bartolom, Huarochir, Lima. Latitud Sur: 11 54' 26'' Longitud Oeste: 76 31' 28'' Altura: 1584 msnm 3.1.2 Material qumico: Agua destilada cido clorhdrico HCl 0.25N Orcena lacto-actica OLA 2% Alcohol 70 Blsamo de Canad Esmalte de uas

3.1.3 Material de vidrio: Lminas portaobjetos Lminas cubreobjetos Placas Petri Beakers Bagueta Frascos de vidrio Pipetas de 1ml

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3.1.4 Equipos e instrumentos: GPS: Etrex-Garmin Microscopio compuesto Carl Zeiss Microscopio estereoscopio Refrigeradora Cmara fotogrfica digital Cera o parafina Pinzas relojero Tijera de punta fina Alfileres Pincel Comps Guantes Papel lente Papel toalla Papel canson Calculadora Lpiz

3.2 Metodologa
3.2.1 Preparaciones Citolgicas

Los ejemplares de Dactylopius coccus fueron colectados en el distrito de San Bartolom, Provincia de Huarochir, en el Departamento de Lima. (Ver anexo), stos encontraron parasitando el tallo, cladodios y frutos de una poblacin natural de cactceas, se les separ de las mismas con la ayuda de una esptula cuidando no aplastarlas y manteniendo intacta su coccerina. Se les deposit en un frasco y se les traslad a la ciudad de Lima.

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Para las preparaciones citolgicas se sigui el protocolo dado por Aquino (1991), con algunas modificaciones. Se colocaron los ejemplares en la parte superior del refrigerador (4C) durante veinticuatro horas. Se fijaron las muestras en alcohol etlico al 70% durante 15 minutos, mientras con la ayuda de un pincel se retiraba cuidadosamente la coccerina. Los ejemplares fueron sometidos a una hidrlisis lenta, pasndolos a una placa petri con HCl 0.25N y se les dej reposar por veinticuatro horas. Se tom un individuo y se le coloc en una placa petri con cera, bajo el microscopio estereoscopio se sujet al insecto con una pinza relojero y mantenindolo en posicin dorsal se inici la diseccin por la regin anterior, cuidando en lo posible no daar los rganos internos del individuo. Se utilizaron alfileres para sujetar la cutcula sobre la cera y as tener expuesto el sistema reproductor. Se extrajeron los embriones separndoles cuidadosamente de los ovarios y oviductos y a estos se les coloc en una placa petri con agua destilada por espacio de una hora para hipotonizarlos. Se pusieron tres embriones en cada laminilla siliconizada y se les cubri con una gota de orcena lacto-actica al 2 %, se dej colorear durante 30 minutos. Se cubri cada laminilla con una lmina, evitando la formacin de burbujas se realiz el squash (aplastado) a cada una de las lminas- laminillas y finalmente se cerraron los bordes con esmalte transparente. Se observaron las lminas preparadas bajo un microscopio Zeiss y se fotografiaron las placas metafsicas, aquellas que nos permitan contar el nmero cromosmico de la especie en estudio. Para establecer el cariotipo se trabaj con cada una de las fotografas de las mejores placas metafsicas, las cuales se copiaron a lpiz sobre papel canson para individualizar los cromosomas en caso hubiese sobreposicin. Para establecer la longitud de los cromosomas se utiliz un lente ocular micromtrico y se midieron slo las placas en metafase porque sta es la fase donde los cromosomas alcanzan su mximo grado de condensacin.

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Se midi la longitud total de cada cromosoma (C) y se calcul la longitud relativa (Lr), que se obtiene de la relacin porcentual entre la longitud total (C) y la suma de las longitudes totales de los cromosomas del complemento haploide. Lr = C x 100 / Cn

Los cromosomas se enumeraron al azar. Con los datos anteriores y considerando su forma se establecieron los pares de homlogos. De esta forma se estableci el cariotipo de D. coccus. Para analizar los dems aspectos citogenticos, se fotografiaron las otras fases del ciclo celular: clulas en interfase, en profase, anafase y telofase. 3.2.2 Mtodo estadstico Para conocer cual es el nmero apropiado de placas mnimas para conocer cuantos cromosomas hay por clula, se calcul el tamao de muestra sugerido por Wayne (1998), bajo la siguiente frmula:

N = s2 x Z /2 / e2
Donde:

s2: varianza de la muestra. Z

es el grado de confiabilidad, en la presente investigacin se trabajo con un nivel de

/2:

confianza del 95%.

e2: en el presente trabajo se admiti como error mximo 0,05 unidades.

Para el clculo de la varianza muestral, se analizaron inicialmente 30 placas. Tomando como nica variable el nmero de cromosomas por placa.

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Cuadro 01 Clculo de la varianza muestral: N de placa 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 N de cromosomas 16 16 16 16 16 16 16 16 16 14 16 16 16 16 16 16 16 16 16 16 16 16 16 16 15 16 16 16 16 16

s2 = (x-u)2 / n-1
Donde: u = E = promedio de las placas observadas. u = 15.9

s2 = [(16-15, 9)2+......... (14-15, 9)2+ (16-15, 9)2]/ 29 s2= [28x (0, 01) + 3.61 + 0, 81]/ 29 s2= 0,162 Clculo del tamao de muestra:
N = s2 x Z /2 / e
2

Z /2 = +/- 1.96 (de acuerdo a tabla) e = error mximo admitido, en este caso 0,05. Se obtuvo entonces: N = 1,962 x 0.,622 / 0,052 N = 40,33 Por lo tanto, el nmero mnimo de placas para determinar el nmero de cromosomas en las clulas de Dactylopius coccus es 40.

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4. RESULTADOS

4.1 Sobre la Metodologa

Congelar los ejemplares de Dactylopius coccus facilita su posterior diseccin ya que el cuerpo de la hembra grvida se torna ms compacto y esto permite una mejor sujecin de la misma, pero la tcnica de congelar se usa en realidad con el objetivo de inhibir el ensamblaje de tubulina y por ende la formacin de los microtbulos del huso, lo cual se traduce finalmente en obtener un nmero mayor de placas metafsicas. Esta tcnica es muy apropiada ya que evita el uso de drogas como la colchicina o la hidroxiquinolina las cuales aumentan la concentracin de los cromosomas reduciendo an ms su tamao, y en el presente estudio esto no sera nada favorable porque los cromosomas naturalmente son ya bastante pequeos. Para fijar los tejidos de D. coccus se obtuvo que el alcohol etlico 70% es el ideal, siendo apropiado para preservar los tejidos de cualquier insecto, pero adems ya que dicha solucin es una sustancia polar, fue de utilidad para retirar la coccerina (cera blanquecina que cubre su cuerpo), lo cual es de mucha importancia primero porque nos permite ver las regiones del cuerpo de la hembra de la cochinilla: cabeza, trax y su amplio abdomen, as mismo sus tres pequeos pares de patas y diferenciar por tanto la zona anterior de la posterior y el lado ventral y dorsal que antes era imposible apreciar. El librar a la cochinilla de su cera nos ayuda adems a darle permeabilidad al tegumento, ello es necesario para el siguiente paso. La hidrlisis, tanto de rganos, tejidos y clulas se realiz usando una solucin de HCl 0.25N, es importante que la hidrlisis sea lenta porque una concentracin elevada de cido provocar la desintegracin del exoesqueleto de las cochinillas en formacin, lo que finalmente se observa como suciedad en las lminas a analizar (Fig.74). En este paso se debe tener en cuenta que el carmn es un indicador de pH que se torna rojo en un medio cido y tiende a fucsia en un medio alcalino. En la metodologa se determin que la hidrlisis debe ser durante 24 h, sin embargo en algunas cochinillas, en especial las ms jvenes, este tiempo es menor, quiz porque las

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cochinillas viejas tengan el tegumento ms grueso y por lo tanto menos permeable que una cochinilla joven. Se puede determinar que la lisis ha sido excesiva cuando todo el lquido que rodea a la cochinilla se ha tornado rojo, en estas cochinillas el material tisular de los embriones estar destrozado y no se encontrarn clulas enteras. Lo ideal es que el cido que rodea a la hembra no llegue al rojo (Fig.75 y 76). La diseccin se realiz de forma anterodorsal y no posteroventral ya que ello asegurar no daar el sistema reproductor que contiene los embriones, los cuales luego van a ser depositados en una nueva placa Petri. Luego de haber sometido a hidrlisis lenta al ejemplar, es importante lavar los restos de HCl presente en el medio porque estos interfieren en la coloracin final. Adems se deben hipotonizar las clulas del embrin para una mejor visualizacin de su contenido, para ello se utiliz en un inicio diferentes concentraciones de solucin salina NaCl desde un 0.9% hasta un 0.1%, observando que los mejores resultados se obtuvieron con concentraciones bajas o nulas de sal. Se decidi finalmente trabajar con agua destilada pura. El agua destilada permiti por smosis que las clulas aumenten de tamao y facilit la tincin con la orcena lacto- actica. Para la determinacin del cariotipo se seleccionaron las placas metafsicas bajo los siguientes criterios: Las clulas deben de estar completas, ya que de lo contrario podramos contabilizar un nmero de cromosomas menor al real. Las clulas deben estar en monocapa, ya que las sobreposiciones de capas celulares dificultarn la individualizacin objetiva de los cromosomas. Las clulas deben de estar lo suficientemente hipotonizadas para una mejor visualizacin de cada cromosoma. El citoplasma de cada clula debe de estar limpio, de modo tal que lo nico que resalte en la clula sean los cromosomas.

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 Los cromosomas en lo posible deben de estar separados entre s, es decir, se trabaj slo con las placas metafsicas polares en la que la distribucin de los cromosomas es en toda la clula y no en el plano ecuatorial. Se encontr que la hora ptima donde es posible visualizar la mayor cantidad de metafases es entre las 10 y las 11horas. Para la visualizacin y posterior anlisis de los aspectos citogenticos relevantes se seleccionaron preferencialmente las clulas bien hipotonizadas.

Determinacin del Cariotipo de D. coccus

En los cromosomas de D. coccus, no se observ la presencia de constriccin primaria, por lo que se determin que son de tipo holocntrico y al elaborar el cariotipo no se consider la posicin del centrmero, ni los ndices de brazos; tan slo la longitud total y la forma de condensacin de cada uno de ellos. En el presente trabajo se busc primero establecer el nmero cromosmico para lo cual se analizaron 72 (N mayor al requerido estadsticamente) ncleos en estado profsico tardo y metafsico, provenientes de 37 embriones. Se observaron clulas con condensacin diferencial de la cromatina y clulas que tienen condensacin pareja en todos los cromosomas, los primeros corresponden a embriones machos como se explicar ms adelante y los segundos a embriones hembra. Ambas clulas fueron incluidas en el anlisis porque en ellas se encontraron el mismo nmero de cromosomas. El nmero cromosmico de esta especie es 2n=16. Se seleccionaron las mejores veinte placas, aquellas donde los cromosomas no estuvieron fusionados entre s y en esta seleccin se dio preferencia a las placas en proceso metafsico ya que es en la metafase donde los cromosomas adquieren su mximo grado de condensacin. (Fig. 06-46). Se midi minuciosamente cada cromosoma. En general las diferencias en su longitud fueron pequeas pero muy importantes para determinar cuales eran los pares de homlogos, as con la mayor precisin posible se establecieron dichos pares y posteriormente se calcul la longitud

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relativa (ver anexos). Se encontraron variaciones en el tamao por lo que se determin una longitud promedio para cada par homlogo, como se muestra a continuacin: Cuadro 02 Estos datos son el consenso de 20 placas metafsicas. (Ver anexos) Cromosomas Longitud mnima (m) 1er par 2dopar 3ropar 4topar 5topar 6topar 7mopar 8vopar 0,94 0,86 0,765 0,75 0,715 0,70 0,65 0,56 Longitud mxima (m) 2,59 2,51 1,75 1,72 1,63 1,50 1,47 1,39 Longitud promedio (m) 1,64 1,44 1,26 1,16 1,03 0,91 0,81 0,70 Longitud relativa (%) 18,37 16,13 14,04 12,96 11,46 10,16 9,07 7,81

En el estado ms condensado, conocido como una metafase tpica (Placa N 04) la longitud de los cromosomas flucta entre 0,6 m y 1,5 m. Y en el estado menos comprimido, lo que es conocido como una metafase inicial o prometafase tarda (Placa N 20), esta longitud flucta entre 0,97 m y 2,59 m. El cariotipo (Fig. 01) est formado por ocho pares cromosmicos y la longitud promedio, mxima (estado de baja condensacin) y mnima (estado de alta condensacin) son mostrados en el cuadro 02. El promedio de longitud de cada par homlogo es en todos los casos, ms cercano a la longitud mnima, lo que indicara que esta diferencia en tamao ha sido influenciada por ciertas placas como se discutir ms adelante.

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Es importante mencionar que se observaron fibras de cromatina entre los cromosomas, los cuales han sido sealados en las representaciones esquemticas con flechas rojas. (Ver anexos).

Fig. 01

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4.3 Mitosis en clulas embrionarias de D. coccus

De ms de 730 preparaciones citolgicas, 292 fueron tiles para estudiar la mitosis de D. coccus por presentar un alto ndice de divisin. En stas ltimas lminas que involucraron 876 embriones, cada uno de los cuales presentaron cientos de clulas, se caracteriz cada fase de la mitosis, encontrndose clulas en interfase de dos tipos, el primero (Fig. 02), mostr una tincin diferencial de la cromatina, donde la cromatina altamente condensada (flecha azul) se mantuvo excntrica y aislada de la cromatina de baja condensacin (flecha roja), mientras que en el segundo tipo de clulas (Fig. 03), la condensacin y por tanto la tincin de la cromatina fue homognea y de posicin central. El primer tipo celular en profase se caracteriz porque todos los cromosomas condensaron de modo similar (Fig. 04), mientras que en el segundo tipo celular (Fig. 05) algunos cromosomas presentaban mayor condensacin y se juntaban entre s (flecha azul). En Interfase y Profase se han encontrado dos grupos celulares distintos:

Fig.02

Fig.03

Fig.04

Fig.05

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A medida que las clulas se acercan a la Metafase los cromosomas se alinean en el plano ecuatorial y todas las clulas guardan un patrn de condensacin similar en sus cromosomas. En la metafase tpica no se aprecia diferencia en la condensacin de los cromosomas (Fig. 06, 07).

Fig.06

Fig.07

La Anafase se aprecia desde el plano ecuatorial y existe una fuerte atraccin entre los bloques de cromosomas que migran, observndose la presencia de fibras de cromatina entre los cromosomas que se separan (flecha verde), adems no se observa la forma de V de los cromosomas al migrar sino la separacin es paralela al ecuador (Fig. 08, 09, 10).

Fig.08

Fig. 09

Fig.10

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En Telofase los grupos de cromosomas se encuentran alejados en los polos como en una telofase normal, no se apreci la presencia de puentes en este grupo (Fig. 11, 12, 13).

Fig.11

Fig.12

Fig.13

4.4 Poliploida en clulas embrionarias de D. coccus

Se encontraron clulas poliploides pero el nmero de cromosomas no fue determinado debido a que estos se encontraban muy fusionados entre s, sin embargo en ambos casos parece tratarse de una tetraploida 4n=32 (Fig. 15, 17). A las clulas poliploides se les ha encontrado rodeadas de clulas de menor tamao, este patrn de distribucin: clula grande rodeada por varias pequeas, se repite frecuentemente en los tejidos embrionarios de la especie en estudio (Fig. 14, 16, 18, 19).

Fig. 14

Fig. 15

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Fig. 16

Fig. 17

Fig. 18

Fig. 19

Obsrvese que las clulas poliploides tienen alrededor clulas pequeas, similar a las imgenes posteriores. Podra tratarse de las mismas clulas, slo que en una etapa distinta en su ciclo celular?

4.5 Presencia eventual de microncleos MN

De las 730 preparaciones citolgicas, slo en 14 se apreciaron clulas interfsicas con la cromatina desorganizada y fragmentada (Fig. 20, 21), encontrndose en este grupo clulas con microncleos (Fig. 22, 23, flecha morada). En ste ltimo grupo tambin se encontr una anafase polar (Fig. 24).

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Fig.20

Fig.21

Fig.22

Fig.23

Fig. 24

La presencia de microncleos no ha sido estudiada a fondo en la presente investigacin, sin embargo es importante mencionarlo porque los microncleos, al igual que la anafase polar, son indicadores de contaminacin ambiental, lo que se discutir ms adelante.

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5. DISCUSIN DE RESULTADOS

5.1 Cariotipo de Dactylopius coccus Costa

El estudio cariotpico de una especie permite conocer las relaciones evolutivas, determinar el origen de una especie o gnero y los eventos que se han dado en el camino de su especiacin, por lo que se le considera una herramienta importante en las investigaciones sistemticas. As mismo permite a futuro identificar el banco de genes de la especie para luego ubicarlos en el mapa cromosmico, por ejemplo el CMH (complejo mayor de Histocompatibilidad) de clase II est codificado por la regin HLA-D del brazo corto del cromosoma 6 en seres humanos. Por otro lado uno de los caminos en la mejora gentica de especies es la realizacin de cruces interespecficos, pero ello requiere que antes se conozca el nmero cromosmico y el comportamiento de los cromosomas de las especies que se cruzan, dicho nmero es proporcionado por el estudio cariotpico y estos deben de ser iguales en las especies a cruzar de lo contrario existir un desbalance en la meiosis generando aneuploidas o incluso que los futuros embriones no sean viables. En el presente trabajo se determin el cariotipo de D. coccus, se encontr que su nmero diploide es 2n=16 y todos sus cromosomas son holocntricos. En D. coccus no es posible seguir la clasificacin de Levan et al. (1964), debido a que sus cromosomas tienen centrmero difuso, es decir no existe una constriccin primaria como la apreciable en los cromosomas monocntricos, sino el centrmero est distribuido a lo largo de toda la longitud del cromosoma, de modo que todo el muestra movilidad sobre el huso. En algunas placas fue posible observar la separacin total de las cromtidas hermanas, HughesSchrader (1948) citado por Aquino (1991) afirma que la naturaleza dual de las cromtidas en cromosomas holocntricos es observable en profase tarda. Brown & Nur (1964), encontraron que existe dos tipos de clulas embrionarias en los cccidos, las primeras se caracterizan porque todos su cromosomas tienen una condensacin similar y estos sern futuras hembras, mientras

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que el segundo tipo presenta cromosomas con condensacin diferencial y estos sern los futuros machos. En sta investigacin se encontraron clulas en profase tarda de embriones hembra, donde se observ la condensacin similar en todos los cromosomas (Fig. 25) y la separacin total de las cromtidas hermanas (flecha negra).

Fig.25

En algunas placas determinados cromosomas han condensado ms que otros y a estos ltimos se les observa de menor tamao y de color ms intenso (flechas negras), lo que nos permite inferir que se trate de una clula en profase tarda o en proceso metafsico de un embrin macho (Fig. 26).

Fig.26

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Las diferencias vistas anteriormente pueden explicar en parte la variabilidad en tamao de los cromosomas en las 20 placas medidas, ya que el estudio cariotpico se ha realizado en embriones hembra y macho. El promedio de la longitud de cada par de homlogos se acerca ms a la longitud mnima de stos (Cuadro 02), lo que indica que la variacin es generada por ciertas placas que se encuentran en un estado menos avanzado de la mitosis (cromosomas menos condensados), como lo apreciado en las placas 20, 3 y 7 (ver anexos) cuyos datos numricos son los ms elevados en contraste con las dems placas que guardan mayor similitud entre s. Tradicionalmente la mitosis se divide en 5 fases o etapas sucesivas, cada fase pasa a la siguiente sin que exista una lnea de transicin definida, es decir el establecimiento de estas 5 etapas est relacionado con procesos tpicos que suceden en cada una de ellas. En realidad, como afirman Karp (1998) y Hickman et al. (1998), la mitosis es un proceso continuo y esta divisin se efecta slo para facilitar el anlisis y la experimentacin. Por lo expuesto, entre la profase y la metafase, al igual que entre cada una de las fases mencionadas lneas arriba, existe un proceso lento y continuo, sta es la segunda razn por la que se observa variacin en la medida de los cromosomas, ya que cada vez stos se condensan ms para ubicarse luego en el plano ecuatorial, hecho conocido como metafase tpica (Fig. 27), donde los cromosomas han alcanzado su mximo grado de condensacin y precisamente stas placas tienen las medidas longitudinales ms bajas.

Fig.27

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La tercera razn para encontrar variabilidad en el tamao de las placas examinadas puede atribuirse a que toda la clula y, por tanto, su contenido estn expuestos al efecto mecnicofsico del squash y ello, al igual que todo el proceso experimental, pudo generar cierto alejamiento de la medida real, anteriormente. Se ha observado que cuando los cromosomas se acercan ms a la metafase tpica, tal como las placas Nos 4, 14, 5 y 19 (ver anexos), son ms homogneos entre s, lo cual hace pensar que todos tienen un tamao similar. Pero al medirlos se encontraron diferencias, que por pequeas que fueron, resultaron significativas a la hora de establecer los pares de homlogos. En esta fase, como explican Brown & Nur (1964), no es posible distinguir cuales son las clulas de embriones destinados a ser machos o hembras por la condensacin en grado similar de todos los cromosomas, lo que es observable en el presente trabajo. Cuando los cromosomas de D. coccus llegan al estado de mxima condensacin, la longitud de stos es aparentemente similar, pero al medirlos se tiene que sus longitudes van descendiendo lentamente desde el par ms grande hasta el par ms pequeo, es decir no hay un cambio drstico como lo observado en la placa N 17, donde se podra hablar de cromosomas grandes y pequeos, ac solo podemos decir que el primer par es relativamente algo ms grande que el segundo par y ste ms grande que el tercero y as de modo sucesivo hasta el octavo par homlogo. Estos datos coinciden con lo finalmente hallado en el consenso de las 20 placas de las que se obtuvo la longitud relativa promedio (Cuadro 02), y se aprecia finalmente que la longitud relativa de los pares de homlogos va decreciendo gradualmente desde el primer par al ltimo par. As se tiene que el primer par homlogo representa el 18.37%, el segundo par: el 16.13%, el tercer par: el 14.04%, el cuarto par: el 12.96%, el quinto par: el 11.46%, el sexto par: el 10.16%, el sptimo par: el 9.07% y el octavo par: el 7.81% (Cuadro 03). Estos datos difieren un poco de los obtenidos por Aquino (1991). pero no en un grado tan alto como los fundamentados

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Cuadro 03 Datos comparativos de las longitudes relativas de los cromosomas de D. coccus en dos pases. CROMOSOMA
(par homlogo)

Longitud Relativa Aquino(1991) Mxico 16.9% 14.9 13.4 12.4 11.8 11.0 10.1 9.4

Longitud Relativa Molero(2008) Per 18.37% 16.13 14.04 12.96 11.46 10.16 9.07 7.81

1 2 3 4 5 6 7 8

l menciona que existen cuatro cromosomas grandes y cuatro pequeos como se puede apreciar en sus datos. Ntese que en los primeros cuatro pares de homlogos existe un descenso gradual en la longitud relativa de los cromosomas similares a los obtenidos en este trabajo. Sin embargo, en los cuatro ltimos pares de homlogos los datos de la primera investigacin muestran un descenso gradual desde 11.8 hasta 9.4% y guardan mayor similitud entre s, por lo que son llamados los cuatro pequeos separndose de los otros que seran los cuatro grandes, lo cual no se observa en los datos presentes, ya que los ltimos cuatro pares tambin varan gradualmente desde 11.46 hasta 7.81% y esta variacin es similar a los cuatro primeros pares por lo que no se les puede agrupar en cuatro pares grandes y cuatro pequeos sino solo se podr afirmar que existe un descenso gradual entre los ocho pares de homlogos. Los datos de Aquino (1991) y Molero (2008) tienen una ligera variacin que puede deberse en principio al diferente estadio de las clulas, ya que l utiliza clulas en profase tarda mientras que en el presente trabajo se utilizan clulas en proceso metafsico, es decir clulas cuya condensacin de los cromosomas va desde una profase tarda hasta una metafase tpica.

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Lo segundo es el grado de condensacin diferencial existente en los cromosomas de embriones machos y su influencia en la variacin obtenida al medir los cromosomas de esta especie, porque lo ms probable es que ambas investigaciones hayan involucrado un nmero diferente de embriones machos en el anlisis cariotpico. Lo tercero, como se explic anteriormente, es que las clulas de ambas investigaciones ciertamente estn impactadas por el efecto mecnico-fsico del squash. Aquino utiliz clulas en profase tarda debido a que l realiz una comparacin cromosmica entre la grana fina D. coccus y tres especies silvestres que presentaron regin organizadora de nuclolo, la cual slo es apreciable en profase tarda. La misma investigacin reporta que las especies silvestres tienen 2n=10 cromosomas y que el primer par es bastante ms largo que los dems y adems, cuando se suman las longitudes de los cuatro cromosomas pequeos de D. coccus este nmero es altamente similar a la longitud del cromosoma grande presente en las especies silvestres, lo cual hace suponer que los cuatro pares adicionales que tiene la grana fina son producto de la fragmentacin del cromosoma grande. En especies que presentan cromosomas holocntricos es comn observar procesos de fusin y fisin entre los cromosomas que finalmente conduce a la especiacin. Esto ha sido observado tambin por Cook (2000) en Apiomorpha, gnero que rene especies con alta variabilidad en nmero cromosmico, as algunas tienen 2n=4, cuyos cromosomas son grandes, y especies con 2n=192 cromosomas sumamente pequeos y bastante homogneos entre s, lo cual tambin le hizo suponer a Cook que el origen de este ltimo grupo haya sido la fragmentacin de los cromosomas grandes. En este gnero existen muchas especies con nmero cromosmico intermedio, postulando que esta fragmentacin ha sido en serie, donde el nmero cromosmico aument de 2n=4 a 2n=10, 2n=12, 2n=18, 2n= 32, 2n=56, 2n= 80, 2n=144 y 2n= 192. Otra posibilidad para explicar este fenmeno sera considerarlo a partir de una posible fusin, donde la especie ancestral tuvo un alto nmero de cromosomas que se fueron fusionando y que dieron como resultado la reduccin del nmero cromosmico. Por otro lado habra que preguntarse si en el gnero Dactylopius existen especies intermedias como lo apreciado en Apiomorpha. No obstante, esta hiptesis es la menos aceptada ya que en ambas investigaciones, tanto para Dactylopius y Apiomorpha, se encontr que la mayor cantidad de especies citadas tienen un

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bajo nmero cromosmico, lo cual respalda la primera hiptesis de la fragmentacin, infiriendo que las especies ancestrales tuvieron un nmero cromosmico menor que las ms evolucionadas. En general se cree que los cccidos han iniciado su proceso evolutivo con uno o varios ancestros de bajo nmero cromosmico pero de mayor tamao y probablemente con bajo contenido e DNA (Brown, 1961, citado por Aquino, 1991). Bajo esta perspectiva, si en el gnero Dactylopius se ha dado la fragmentacin del cromosoma largo de las especies silvestres (2n=10) para dar origen a la grana fina (2n=16), habra que preguntarse si dicha fragmentacin se dio en las tres mismas regiones del cromosoma largo para dar como resultado cuatro cromosomas pequeos y si en esta fragmentacin ha existido la influencia del ambiente o los factores externos que rodean a los individuos, ya que se sabe que el ambiente juega un papel importante en la especiacin y los datos obtenidos por Aquino(1991) contrastados con la presente investigacin son altamente similares para los cuatro primeros pares de cromosomas donde se ve un descenso gradual en el tamao, ms no as para los ltimos cuatro pares (los posibles provenientes de la fragmentacin) donde la investigacin precedente muestra una longitud similar entre los cuatro cromosomas (los pequeos) y en la presente se observa un descenso gradual entre ellos. Aquino utiliz cochinillas de Salinas de Hidalgo, San Luis Potos, en Mxico, localizado entre los 100 00 y 102 4 Longitud Oeste y los 21 45 30 Latitud Norte mientras que en Per se utilizaron cochinillas de San Bartolom, Huarochir, Lima, localizado entre los 11 54' 26'' Latitud Sur y 76 31' 28'' Longitud Oeste. De ser cierta la fragmentacin cromosmica del quinto par largo (spp. silvestres), es probable que haya habido una influencia ambiental y geogrfica para determinar los tres puntos de ruptura en el cromosoma, ya que las medidas longitudinales obtenidas de los ltimos cuatro pares de homlogos de D. coccus, varan entre Mxico y Per. Gracias al aporte de Aquino se sabe que D .confusus y otras dos especies silvestres no

determinadas tienen 2n=10 cromosomas y D. coccus 2n=16, pero no se conocen estos datos para D. bassi, D. austrinus, D. ceylonicus, D. confertus, D. salmianus, D. tomentosus y D. zimmermanni. Todas las especies del gnero Dactylopius estn dispersas a lo largo del continente americano y el xito para su sobrevivencia en cada lugar ha dependido en gran parte

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de los factores externos: clima, geografa, predadores naturales, etc. As la especie predominante en el Per es D. coccus (Marn, 2008 com. pers.) y en muchos lugares como en San Bartolom, se desarrolla sin ninguna atencin por parte de los agricultores, a diferencia de Argentina, Colombia, Mxico y Chile donde los agricultores ponen mayor esmero en el cultivo de la grana fina y sta es menos abundante que las especies silvestres.

5.2 Mitosis en D. coccus

El ciclo celular de la clula eucariota se divide en dos etapas importantes, la etapa de interfase que puede durar horas, das, semanas o ms, dependiendo del tipo celular y la etapa de mitosis que dura entre treinta a sesenta minutos (Karp, 1998), por lo cual podemos entender porque es ms frecuente encontrar clulas en interfase. Aunque se ha dicho que los cromosomas son como el muerto en el funeral ya que toda la atencin se centra en ellos pero estos no se mueven independientemente, ya que dependen de las fibras del huso (Alberts et al.,1996 ), el periodo que suele ser ms atractivo bajo el microscopio es la mitosis debido al desplazamiento de los cromosomas (Hickman et al., 1996, Karp, 1998). Sin embargo en D. coccus la interfase de algunos embriones s es llamativa debido a que se observa como un grupo de cromosomas se aslan del resto, se condensan ms y por tanto se les ve ms teidos (Fig.02). Brown & Nur (1964) encontraron que en los machos de Pseudococcidae el juego paterno de cromosomas se condensan ms, hacindose heterocromticos, y adems tienden a mantenerse juntos en el estado embrionario y en meiosis van a ser destruidos ocasionando que los espermatozoides provengan nicamente de cromosomas maternos, lo cual tambin fue observado en D. coccus por Aquino (1991), donde el grupo heterocromtico se mantiene junto a lo largo de la meiosis. Por lo tanto, el aislamiento observado de un grupo de cromosomas, as como su alta condensacin, nos indica que se trata de clulas de embriones macho. En los cccidos existe dos mecanismos de determinacin sexual, la primera involucra la presencia de un cromosoma sexual (XX, XO) y la segunda depende de la heterocromatinizacin

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de los cromosomas paternos y ello se presenta en las familias ms evolucionadas (Nur, 1980). Dentro de este ltimo grupo se encuentra la familia Dactylopiidae. El estudio de la mitosis de D. coccus resulta de particular inters debido a la naturaleza holocntrica de sus cromosomas, y el que dicho estudio se haga en clulas embrionarias lo hace doblemente importante porque en la embriognesis se da el mecanismo de determinacin del sexo (Nur,1990). Conociendo lo anterior centrmonos ahora en los resultados. Cuando las clulas estn en Interfase si son clulas embrionarias de hembra, el citoplasma se observa homogneo debido a que la cromatina proveniente del padre y de la madre estn condensando de modo similar (Fig.03), mientras que en la imagen de al lado se observa un cmulo de cromatina aislado que podra ser confundido con el ncleo, pero por su forma irregular y su posicin excntrica es ms probable que se trate del grupo de cromosomas heterocromticos (H) de origen paterno, que tienden a reunirse entre s, alejndose del grupo eucromtico (E) condensacin es ms lenta y es de baja tincin. Cuando la clula est en mitosis se vern claramente los dos casos explicados lneas arriba. En Profase los cromosomas de clulas embrionarias hembra van a ser homogneos entre s (Fig.04) y cuando esta fase est acercndose a la metafase va a ser posible visualizar por separado las dos cromtidas hermanas (Hughes-Schrader, 1935) como se aprecia en la placa N 03 (Fig.25). Pero la naturaleza dual del cromosoma holocntrico tambin se puede apreciar en metafase al realizar una tincin con nitrato de plata (Nokkala et al., 2002). En los embriones macho se va a poner ms de manifiesto la condensacin diferencial que ya se observaba en interfase, pudiendo distinguirse la separacin entre el grupo heterocromtico (H) y el grupo eucromtico (E) y si la hipotonizacin o el squash no han sido buenos es muy difcil determinar el nmero real de cromosomas debido a que tienden a fusionarse entre s (Fig.68 y 69). Una vez que la clula llega a la Metafase, como se explic en el anlisis del cariotipo, todos los cromosomas guardan homogeneidad en condensacin, por lo que se les observa similares en de lnea materna, cuya

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tamao y tincin y ya no es posible distinguir por separado el grupo H del E (Hughes-Schrader, 1935, Brown & Nur, 1964). Por otro lado, en muchas placas en proceso metafsico, en especial en las que se acercan a una metafase tpica, se ha observado la presencia de formaciones fibrilares de cromatina que unen los cromosoma como en las placas N 02, 04, 09, 12 y 14 (ver anexos) las cuales son denominadas ligaciones cromosmicas y han sido encontradas antes en cromosomas mitticos de Phaseolus lunatus (Bracamonte, 1992), Capsicum pubescens (Siles, 1996) y en los cromosomas politnicos de Rhynchoscaria angelae (Guevara,1975). En esta ltima especie es muy frecuente y est relacionado con el estado larval. Bracamonte (1992) refiere que estas ligaciones entre cromosomas van a permitir que se guarde un orden tridimensional en la clula y que por lo general las ligaciones unen cromosomas similares (homlogos), lo que favorece el ordenamiento dentro de la clula. Se sabe que cuando un cromosoma se fragmenta, posterior a esta ruptura las regiones telomricas tienden a unirse, como ha sido demostrado a nivel molecular en Arabidopsis mutants (Mokros et al., 2006) y estas ligaciones luego son observadas como puentes cuando la clula entra a anafase. Estas ligaciones cromosmicas tambin se presentan en las especies de Apiomorpha que tienen bajo nmero cromosmico, aunque el autor no da detalle sobre las mismas, pero en este caso tambin podra poner de manifiesto el origen comn que tienen estas regiones que se unen de manera similar a lo que sucede en A. mutants. En las clulas de D. coccus estas ligaciones son una evidencia de que los cromosomas tienden a fusionarse entre s, dificultando en muchos casos el conteo y la individualizacin. Las mismas no se manifiestan en todos los cromosomas y cuando se les ve no necesariamente unen homlogos. La placa Anafsica es peculiar en D. Coccus por su diferencia con una anafase tpica donde los cromosomas son monocntricos, en la que una vez que las fibras del huso mittico se unen al cinetocoro cada cromtida hermana va a ser arrastrada hacia los polos opuestos de la clula, lo cual hace que en la migracin se les observe en forma de v o (Prez et al.,1997)dependiendo del polo al que migren, pero en el caso de la especie en estudio al igual que en otras que tienen centrmero difuso, el huso mittico va a unirse a lo largo de toda la longitud de las cromtidas, va a jalar de estas hacia los polos y no ser posible visualizar la forma anteriormente mencionada sino se apreciar como en lnea recta (Muramoto, 1985; Nokkala et al., 2002).

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Algo caracterstico de la anafases de D. coccus es la presencia de puentes entre los dos bloques migrantes, lo que puede ser una manifestacin continua de las ligaciones cromosmicas que se apreciaron en metafase. Dichos puentes a veces se ven bastante densos, como si estuviesen formados por uno o ms cromosomas, pero en la mayora de los casos se ve que son slo fibras de cromatina bastante finas que se ven como hilos entre ellos. Todas las anafases observadas en estado temprano y medio han mantenido esta caracterstica, pero a medida que los cromosomas se acercan a los polos estas fibras de cromatina o en general nexos entre los bloques migrantes desaparecen por completo, as la Telofase se visualiza de modo normal como en cualquier clula eucariota. Una vez que los bloques de cromosomas han migrado por completo hacia los polos opuestos la clula est lista para el inicio de la citocinesis y los cromosomas de las clulas hijas empiezan a descondensarse lentamente.

5.3 Clulas Poliploides en D. coccus:

En las clulas poliploides que se obtuvieron no fue posible contabilizar con exactitud el nmero de cromosomas debido a que ellos tienden a fusionarse entre s, pero pese a ello en ambas clulas (Fig.15 y 17.) parece tratarse de tetraploida 4n=32.

Debido a que las clulas poliploides van a albergar mayor cantidad de cromosomas y porque se originan a partir de una endorreplicacin, ellas van a ser de mayor tamao que las dems clulas a su alrededor. Lo sobresaliente en nuestras observaciones citolgicas es que este mismo patrn ha sido observado repetidas veces en el desarrollo de los embriones de D. coccus (Fig.18 y 19), pudiendo pensarse que las clulas grandes son las poliploides, slo que no estn en actividad mittica. Este patrn de clula grande rodeada por clulas pequeas es similar a lo que sucede en humanos en el proceso conocido como educacin tmica, donde una clula nodriza se rodea de muchos linfocitos de pequeo tamao para ensearles a reconocer lo propio de lo extrao. Esta clula nodriza no es una clula poliploide, pero lo rescatable de este proceso es esa gran diferencia de tamaos y la distribucin espacial entre ambos tipos celulares, reflejando que guardan una estrecha relacin entre s. En el caso de D. coccus, tratndose de clulas embrionarias, las clulas

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grandes rodeadas por pequeas posiblemente tengan la funcin de nutrirlas, lo cual concuerda con lo expuesto por Hughes-Schrader (1948), citada por Aquino (1991), quien menciona que la poliploidizacin en embriones es comn y est relacionada con el desarrollo embrionario. Si este proceso es comn y est relacionado con el desarrollo de los embriones es posible que las clulas grandes que se observan rodeadas de muchas clulas pequeas sean las poliploides, slo que no estn en divisin, ya que si lo estuviesen, todo el gasto energtico de la clula estara destinado a la duplicacin del material gentico y de las organelas, por lo que no sera posible que al mismo tiempo de estar en divisin celular tenga tambin que desempear el rol de nodriza ya que ello implicara demasiado gasto energtico para la clula.

5.4 Presencia eventual de microncleos (MN)

Los microncleos se han definido como cromosomas, o restos de cromosomas, que se desintegran del ncleo quedando fuera de ste. As, cuando un cromosoma se parte, las regiones que no poseen centrmero no podrn migrar y quedarn a un lado como ncleos de menor tamao, llamndose ahora microncleos, pero su origen no se le atribuye nicamente a la ruptura cromosmica sino tambin a que el huso no reconoce las regiones centromricas (cinetocricas) de determinados cromosomas. En D. coccus el primer caso no podra darse debido a que cada uno de los fragmentos

cromosmicos, si es que los hubiese, tienen la capacidad de migrar hacia los polos gracias a la naturaleza holocntrica de sus cromosomas. Ya que el centrmero es difuso cada fragmento va a actuar como una entidad independiente. Podra entonces darse el caso de que el huso no haya reconocido determinado cromosoma o grupo de cromosomas y que ellos no hayan podido migrar en anafase, quedando finalmente como microncleos una vez concluida la telofase. Muchos investigadores como Liu et al. (1994), Mrquez (2005), Hick et al. (2007), entre otros, han indicado que la presencia de microncleos es indicio de contaminacin ambiental, en su mayora por metales pesados aunque tambin ha sido encontrado, pero con menor frecuencia, por contaminacin con dixido de carbono.

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En la presente investigacin se ha observado la presencia eventual de microncleos, pero esto ha sido bastante raro ya que en ms de 730 preparaciones citolgicas, conteniendo cada una tres embriones, solo se observaron MN en 14 lminas. Como se aprecian en las imgenes, las clulas tienen la cromatina bastante desorganizada, lo que evita que entren en mitosis, ya que cuando el ndice de MN aumenta, el ndice mittico disminuye (Castro et al., 2004). Los investigadores sealan que cuando existen MN es usual que se aprecien puentes anafsicos , telofsicos y tambin anafases polares. En D. coccus los puentes en la placa anafsica se presenta espordicamente al igual que en otros organismos que tienen cromosomas holocntricos como Phenacoccus acericola (Hughes-Schrader, 1935) y tambin han sido encontrados en la especie bajo estudio por Aquino (1991) en clulas meiticas, lo que indica que es caracterstico de la placa anafsica y no se le puede tomar como un indicador de la continuidad de los microncleos. Sin embargo en este ltimo grupo analizado se encontr una anafase polar (Fig.24), lo que s puede ser tomado como un indicador de contaminacin ambiental. Ello no es lejano a la realidad porque San Bartolom, si bien es cierto es un lugar bastante limpio, donde no se pone de manifiesto la actividad agrcola y la cochinilla se desarrolla naturalmente, es ciertamente impactado por la actividad ferroviaria diaria, generando contaminacin ambiental. Es altamente probable que la colecta de individuos de este ltimo grupo haya sido en un rea que pudo contener componentes dainos para la cromatina, ya sea el suelo o las partculas del aire, que finalmente se depositarn en las pencas y en la cochinilla. Esta presencia muy extraa de microncleos sugiere que se analice a fondo si en San Bartolom existe contaminacin por metales pesados u otros agentes, pero si se realizase un estudio de este tipo, es recomendable utilizar especies que tengan cromosomas monocntricos ya que la naturaleza de los cromosomas de D. coccus no favorece este tipo de anlisis por los puntos explicados lneas arriba.

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6. CONCLUSIONES

1. La especie Dactylopius coccus tiene como nmero cromosmico 2n=16 para ambos sexos. 2. Los cromosomas de Dactylopius coccus son de tipo holocntrico en los cuales no se observa constriccin primaria. 3. La longitud de los cromosomas de Dactylopius coccus estn en un rango de 0.70 m. hasta 1.64 m. y se observa un descenso gradual en los ocho pares de homlogos. 4. La variabilidad encontrada entre las placas metafsicas de Dactylopius coccus,

analizadas en la presente investigacin, se debe principalmente al grado de condensacin diferencial de los cromosomas paternos en embriones machos. 5. La diferencia entre los datos obtenidos por Aquino (1991) en Mxico, con la presente investigacin, en especial en los ltimos cuatro pares cromosmicos, indicara la influencia del ambiente en el comportamiento del complemento cromosmico. 6. En embriones machos de Dactylopius coccus los cromosomas de origen paterno (H) tienden a agruparse entre s, aislndose del resto y ocurre desde la interfase hasta la prometafase de la mitosis, lo cual es conocido como heterocromatinizacin que es un mecanismo relacionado a la determinacin del sexo. 7. En la metafase mittica de clulas embrionarias de Dactylopius coccus, el grado de condensacin es similar entre los ocho pares de cromosomas por lo que esta fase no es til para reconocer el sexo del embrin.

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8. En metafase algunos cromosomas de Dactylopius coccus presentan ligaciones cromosmicas entre ellos, los cuales van a ser vistos como puentes entre los dos bloques migrantes en la anafase temprana, pero llegan a desaparecer cuando la clula se acerca a la telofase. 9. En la anafase mittica de Dactylopius coccus, los cromosomas al migrar no muestran la conformacin V porque la separacin de las cromtidas es paralela al plano ecuatorial (metafase). 10. Las clulas poliploides estn relacionadas con el desarrollo del embrin y su rol es probablemente nutrir a las clulas de menor tamao que la rodean. 11. La presencia de microncleos MN, al igual que la anafase polar, encontradas en un grupo pequeo de muestras evidenciara dao genotxico causado por ambiental. contaminacin

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7. RECOMENDACIONES

1.

Es necesario realizar estudios similares a este trabajo en las especies de cochinilla, Dactylopius spp., que an no han sido evaluadas, ya que ello permitira descubrir los arreglos cromosmicos que se dieron en su especiacin.

2. Se requiere hacer anlisis a nivel molecular para determinar que regiones se unen frecuentemente en el proceso conocido como fusin cromosmica. 3. Es importante realizar anlisis de impacto ambiental en la zona de colecta, San Bartolom, para descartar la presencia de agentes genotxicos, y si es a nivel citolgico, es preferible utilizar especies con cromosomas monocntricos.

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8. REFERENCIA BIBLIOGRFICA

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9. ANEXOS
9.1 LONGITUD DE LOS CROMOSOMAS METAFSICOS de Dactylopius Coccus COSTA PLACA N 1 N DE CROMOSOMA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 LONGITUD(m) 0,73 0,75 1,0 0,71 0,82 0,90 1,77 1,0 1,68 1,64 1,73 1,37 1,33 0,73 1,5 1,5

ESTABLECIMIENTO DE LOS HOMLOGOS: ( Cn = 9,58 m) PARES HOMLOGOS (m) 7^11 9^10 15^16 12^13 3^8 14^1 2^4 5^6 LONGITUD PROMEDIO (m) 1,75 1,66 1,5 1,35 1,0 0,73 0,73 0,86 LONGITUD RELATIVA (%) 18,27 14,08 17,33 15,66 10,44 7,62 7,62 8,98

60

PLACA N 2 N DE CROMOSOMA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

LONGITUD 1,54 1,64 1,36 1,51 1,37 0,89 1,0 1,0 1,48 1,60 0,92 1,46 0,82 0,87 0,65 0,63

ESTABLECIMIENTO DE LOS HOMLOGOS: ( Cn = 9,37 m) PARES HOMLOGOS (m) 2^10 1^4 9^12 3^5 7^8 6^11 13^14 15^16 LONGITUD PROMEDIO (m) 1,62 1,525 1,47 1,365 1,00 0,905 0,845 0,64 LONGITUD RELATIVA (%) 17,29 16,28 15,69 14,56 10,67 9,66 9,02 6,83

61

PLACA N 3 N DE CROMOSOMA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

LONGITUD 2,25 2,19 1,52 1,49 1,62 1,60 1,41 1,37 1,46 1,48 1,58 1,62 1,51 1,48 1,53 1,53

ESTABLECIMIENTO DE LOS HOMLOGOS: ( Cn = 12,82 m) PARES HOMLOGOS (m) 1^2 5^6 11^12 15^16 3^4 13^14 9^10 7^8 LONGITUD RELATIVA (%) 17,32 12,56 12,48 11,93 11,74 11,66 11,47 10,84

LONGITUD PROMEDIO (m) 2,22 1,61 1,60 1,53 1,505 1,495 1,47 1,39

62

PLACA N 4 N DE CROMOSOMA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

LONGITUD 1,49 0,68 0,9 0,72 0,62 0,75 1,51 0,75 0,76 0,82 0,63 0,70 0,73 0,58 0,67 0,77

ESTABLECIMIENTO DE LOS HOMLOGOS: ( Cn = 6,54 m) PARES HOMLOGOS (m) 1^7 3^10 9^16 6^8 12^13 2^4 11^15 14^5 LONGITUD RELATIVA (%) 22,94 13,15 11,70 11,47 10,93 10,70 9,94 9,17

LONGITUD PROMEDIO (m) 1,50 0,86 0,765 0,75 0,715 0,7 0,65 0,6

63

PLACA N 5 N DE CROMOSOMA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

LONGITUD 0,71 0,81 1,39 1,37 1,46 1,50 0,75 0,61 0,81 0,67 0,75 0,64 0,75 0,78 0,68 0,73

ESTABLECIMIENTO DE LOS HOMLOGOS: ( Cn = 7,205 m)

PARES HOMLOGOS (m) 5^6 3^4 14^9 2^11 13^7 1^16 10^15 8^12

LONGITUD PROMEDIO (m) 1,48 1,38 0,795 0,78 0,75 0,72 0,675 0,625

LONGITUD RELATIVA (%) 20,54 19,15 11,03 10,83 10,41 10,00 9,37 8,67

64

PLACA N 6 N DE CROMOSOMA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

LONGITUD 1,00 0,82 0,77 1,42 1,40 0,80 1,44 1,50 0,81 1,3 0,98 0,75 1,50 0,77 0,89 0,89

ESTABLECIMIENTO DE LOS HOMLOGOS: ( Cn = 8,52 m)

PARES HOMLOGOS (m) 8^13 4^7 5^10 1^11 15^16 2^9 14^6 3^12

LONGITUD PROMEDIO (m) 1,50 1,43 1,35 0,99 0,89 0,815 0,785 0,76

LONGITUD RELATIVA (%) 17,61 16,78 15,85 11,62 10,45 9,56 9,21 8,92

65

PLACA N 7 N DE CROMOSOMA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

LONGITUD 1,54 0,88 1,62 1,60 1,00 1,00 1,43 1,50 1,50 1,44 1,82 0,82 1,80 2,10 2,00 1,64

ESTABLECIMIENTO DE LOS HOMLOGOS: ( Cn = 12,295 m) PARES HOMLOGOS (m) 14^15 11^13 3^16 1^4 8^9 7^10 5^6 2^12 LONGITUD PROMEDIO (m) 2,5 1,81 1,63 1,57 1,50 1,435 1,00 0,85 LONGITUD RELATIVA (%) 20,33 14,72 13,26 12,77 12,20 11,68 8,13 6,91

66

PLACA N 8 N DE CROMOSOMA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

LONGITUD 1,68 1,96 1,70 2,20 1,60 0,97 1,62 0,91 0,94 1,30 0,96 1,46 0,89 0,87 1,34 1,42

ESTABLECIMIENTO DE LOS HOMLOGOS: ( Cn = 10,91 m) PARES HOMLOGOS (m) 2^4 1^3 5^7 12^16 10^15 6^11 8^9 13^14 LONGITUD PROMEDIO (m) 2,08 1,69 1,61 1,44 1,32 0,965 0,925 0,88 LONGITUD RELATIVA (%) 19,07 15,49 14,76 13,19 12,09 8,85 8,48 8,07

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PLACA N 9 N DE CROMOSOMA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

LONGITUD 1,15 0,77 0,84 1,06 1,20 0,64 0,76 0,88 1,30 0,82 0,72 1,40 1,10 0,76 0,88 0,80

ESTABLECIMIENTO DE LOS HOMLOGOS: ( Cn = 7,515 m) PARES HOMLOGOS (m) 9^12 1^5 4^13 2^15 3^10 2^16 7^14 11^6 LONGITUD PROMEDIO (m) 1,35 1,15 1,08 0,88 0,23 0,785 0,76 0,68 LONGITUD RELATIVA (%) 17,96 15,30 14,37 11,71 11,05 10,45 10,11 9,05

68

PLACA N 10 N DE CROMOSOMA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

LONGITUD 1,81 1,42 1,37 0,74 1,75 0,80 1,77 0,75 0,75 1,00 1,70 1,00 0,75 0,70 1,38 1,48

ESTABLECIMIENTO DE LOS HOMLOGOS: ( Cn = 9,585 m) PARES HOMLOGOS (m) 1^7 5^11 2^16 3^15 12^10 6^13 8^9 4^14 LONGITUD PROMEDIO (m) 1,79 1,725 1,45 1,375 1,00 0,775 0,75 0,72 LONGITUD RELATIVA (%) 18,68 17,99 15,13 14,35 10,43 8,09 7,82 7,51

69

PLACA N 11 N DE CROMOSOMA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

LONGITUD 1,54 0,75 1,46 1,16 1,50 1,79 1,52 1,53 1,82 0,98 0,71 1,82 1,44 1,76 0,64 0,64

ESTABLECIMIENTO DE LOS HOMLOGOS: ( Cn = 10,515 m) PARES HOMLOGOS (m) 9^12 6^14 7^8 1^5 3^13 10^4 2^11 15^16 LONGITUD PROMEDIO (m) 1,82 1,76 1,525 1,52 1,45 1,07 0,73 0,64 LONGITUD RELATIVA (%) 17,31 16,74 14,49 14,46 13,79 10,18 6,94 6,09

70

PLACA N 12 N DE CROMOSOMA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

LONGITUD 1,51 1,62 0,89 1,36 0,68 0,92 0,72 1,20 0,85 0,89 1,48 1,39 1,58 1,49 1,55 1,00

ESTABLECIMIENTO DE LOS HOMLOGOS: ( Cn = 9,565) PARES HOMLOGOS (m) 2^13 1^15 14^11 4^12 16^8 3^6 9^10 7^5 LONGITUD PROMEDIO (m) 1,60 1,53 1,485 1,375 1,100 0,905 0,87 0,70 LONGITUD RELATIVA (%) 16,73 15,99 15,53 14,38 11,50 9,46 9,09 7,32

71

PLACA N 13 N DE CROMOSOMA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

LONGITUD 0,58 1,50 1,37 1,30 1,10 0,98 0,96 1,43 1,72 1,72 0,76 0,88 0,78 0,54 1,74 1,66

ESTABLECIMIENTO DE LOS HOMLOGOS: ( Cn = 9,51 m) PARES HOMLOGOS (m) 9^10 15^16 2^8 3^4 5^6 7^12 11^13 1^14 LONGITUD PROMEDIO (m) 1,72 1,70 1,465 1,335 1,04 0,78 0,77 0,56 LONGITUD RELATIVA (%) 16,73 15,99 15,53 14,38 11,50 9,46 9,09 7,32

72

PLACA N 14 N DE CROMOSOMA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

LONGITUD 1,10 0,92 0,79 0,70 0,75 1,20 0,64 0,93 0,87 1,26 0,89 1,30 0,77 0,82 0,94 0,87

ESTABLECIMIENTO DE LOS HOMLOGOS: ( Cn = 7,375 m) PARES HOMLOGOS (m) 6^12 1^10 2^15 8^11 9^16 3^14 5^13 4^7 LONGITUD PROMEDIO (m) 1,25 1,18 0,93 0,91 0,87 0,805 0,76 0,67 LONGITUD RELATIVA (%) 16,95 16,00 12,61 12,34 11,80 10,91 10,31 9,08

73

PLACA N 15

N DE CROMOSOMA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

LONGITUD 1,62 0,94 1,37 0,68 0,87 0,78 1,00 0,76 0,82 1,37 0,87 1,62 0,70 0,84 0,75 0,84

ESTABLECIMIENTO DE LOS HOMLOGOS: ( Cn = 7,945 m) PARES HOMLOGOS (m) 1^12 3^10 2^7 16^14 5^11 6^9 8^15 4^13 LONGITUD PROMEDIO (m) 1,62 1,37 0,97 0,87 0,87 0,80 0,755 0,69 LONGITUD RELATIVA (%) 20,39 17,24 12,21 10,95 10,95 10,08 9,50 8,68

74

PLACA N 16 N DE CROMOSOMA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

LONGITUD 0,92 1,02 0,99 0,77 0,84 0,71 1,00 0,90 0,89 1,65 1,63 0,65 1,02 0,77 0,80 0,90

ESTABLECIMIENTO DE LOS HOMLOGOS: ( Cn = 7,73 m) PARES HOMLOGOS (m) 10^11 2^13 3^7 1^16 8^9 5^15 4^14 6^12 LONGITUD PROMEDIO (m) 1,64 1,02 0,995 0,91 0,895 0,82 0,77 0,68 LONGITUD RELATIVA (%) 21,22 13,20 12,87 11,77 11,58 10,61 9,96 8,79

75

PLACA N 17 N DE CROMOSOMA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

LONGITUD 1,75 0,94 1,77 1,70 1,24 1,58 0,62 0,62 0,74 1,45 1,30 1,64 0,90 1,41 1,70 0,70

ESTABLECIMIENTO DE LOS HOMLOGOS: ( Cn = 10,01 m) PARES HOMLOGOS (m) 1^3 4^15 6^12 10^14 5^11 2^13 9^16 7^8 LONGITUD PROMEDIO (m) 1,76 1,70 1,61 1,41 1,27 0,92 0,72 0,62 LONGITUD RELATIVA (%) 17,58 16,98 16,09 14,09 12,69 9,19 7,19 6,19

76

PLACA N 18

N DE CROMOSOMA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

LONGITUD 1,37 1,50 0,90 0,94 0,78 1,20 0,76 0,98 0,62 1,10 0,70 1,50 1,50 1,48 1,05 1,37

ESTABLECIMIENTO DE LOS HOMLOGOS: ( Cn = 8,875 m) PARES HOMLOGOS (m) 13^2 14^12 1^16 6^10 2^15 3^4 7^5 9^11 LONGITUD PROMEDIO (m) 1,50 1,49 1,37 1,15 1,015 0,92 0,77 0,66 LONGITUD RELATIVA (%) 16,90 16,78 15,44 12,95 11,44 10,37 8,68 7,44

77

PLACA N 19 N DE CROMOSOMA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

LONGITUD 0,62 0,85 0,87 0,85 0,80 0,77 0,79 0,94 0,62 0,92 0,92 0,85 0,94 0,76 0,74 0,82

ESTABLECIMIENTO DE LOS HOMLOGOS: ( Cn = 6,53 m) PARES HOMLOGOS (m) 8^13 10^11 3^4 2^12 5^16 6^7 14^15 1^9 LONGITUD PROMEDIO (m) 0,94 0,92 0,86 0,85 0,81 0,78 0,75 0,62 LONGITUD RELATIVA (%) 14,40 14,09 13,17 13,02 12,40 11,94 11,49 9,49

78

PLACA N 20

N DE CROMOSOMA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

LONGITUD 1,58 1,42 1,73 1,71 2,54 1,73 2,58 2,60 1,64 2,48 1,77 1,00 1,48 1,44 1,62 0,94

ESTABLECIMIENTO DE LOS HOMLOGOS: ( Cn = 14,13 m) PARES HOMLOGOS (m) 7^8 5^10 6^11 3^4 9^15 1^2 13^14 12^16 LONGITUD PROMEDIO (m) 2,59 2,51 1,75 1,72 1,63 1,50 1,46 0,97 LONGITUD RELATIVA (%) 18,33 17,76 12,38 12,17 11,54 10,62 10,33 6,87

79

9.2 PLACAS METAFSICAS UTILIZADAS AL MEDIR LOS CROMOSOMAS DE Dactylopius coccus Costa

PLACA N 01

Fig. 28

Fig. 29

Fig. 28: Fotografa de la placa metafsica 01. Fig. 29: Representacin Esquemtica de la placa metafsica 01.

80

PLACA N 02

Fig. 30

Fig. 31 Fig. 30: Fotografa de la placa metafsica 03. Fig. 31: Representacin Esquemtica de la placa metafsica 03.La flecha roja indica la presencia de ligaciones cromosmicas.

81

PLACA N 03

Fig. 32

Fig. 33 Fig. 32: Fotografa de la placa metafsica 03. Fig. 33: Representacin Esquemtica de la placa metafsica 03.

82

PLACA N 04

Fig. 34

Fig. 35 Fig. 34: Fotografa de la placa metafsica 04. Fig. 35: Representacin Esquemtica de la placa metafsica 04.La flecha roja indica la
presencia de ligaciones cromosmicas.

83

PLACA N 05

Fig. 36

Fig. 37 Fig. 36: Fotografa de la placa metafsica 03. Fig. 37: Representacin Esquemtica de la placa metafsica 03.

84

PLACA N 06

Fig. 38

Fig. 39

Fig. 38: Fotografa de la placa metafsica 06. Fig. 39: Representacin Esquemtica de la placa metafsica 06.

85

PLACA N 07

Fig. 40

Fig. 41

Fig. 40: Fotografa de la placa metafsica 07. Fig. 41: Representacin Esquemtica de la placa metafsica 07.

86

PLACA N 08

Fig. 42

Fig. 43

Fig. 42: Fotografa de la placa metafsica 08. Fig. 43: Representacin Esquemtica de la placa metafsica 08.

87

PLACA N 09

Fig. 44

Fig. 45 Fig. 44: Fotografa de la placa metafsica 03. Fig. 45: Representacin Esquemtica de la placa metafsica 03. La flecha roja indica la presencia de ligaciones cromosmicas

88

PLACA N 10

Fig. 46

Fig. 47

Fig. 46: Fotografa de la placa metafsica 10. Fig. 47: Representacin Esquemtica de la placa metafsica 10.

89

PLACA N 11

Fig. 48

Fig.49 Fig. 48: Fotografa de la placa metafsica 11. Fig. 49: Representacin Esquemtica de la placa metafsica 11.

90

PLACA N 12

Fig. 50

Fig. 51 Fig. 50: Fotografa de la placa metafsica 04. Fig. 51: Representacin Esquemtica de la placa metafsica 11. Las flecha rojas indican, la presencia de ligaciones cromosmicas.

91

PLACA N 13

Fig. 52

Fig. 53 Fig. 52: Fotografa de la placa metafsica 04. Fig. 53: Representacin Esquemtica de la placa metafsica 04

92

PLACA N 14

Fig. 54

Fig. 55 Fig. 54: Fotografa de la placa metafsica 04. Fig. 55: Representacin Esquemtica de la placa metafsica 04.

93

PLACA N 15

Fig. 56

Fig. 57 Fig. 56: Fotografa de la placa metafsica 04. Fig. 57: Representacin Esquemtica de la placa metafsica 04.

94

PLACA N 16

Fig. 58

Fig. 59 Fig. 58: Fotografa de la placa metafsica 04. Fig. 59: Representacin Esquemtica de la placa metafsica 04.

95

PLACA N 17

Fig. 60

Fig. 61 Fig. 60: Fotografa de la placa metafsica 04. Fig. 61: Representacin Esquemtica de la placa metafsica 04.

96

PLACA N 18

Fig. 62

Fig. 63

Fig. 62: Fotografa de la placa metafsica 03. Fig. 63: Representacin Esquemtica de la placa metafsica 03.

97

PLACA N 19

Fig. 64

Fig. 65 Fig. 64: Fotografa de la placa metafsica 03. Fig. 65: Representacin Esquemtica de la placa metafsica 03.

98

PLACA N 20

Fig. 66

Fig. 67

Fig. 66: Fotografa de la placa metafsica 03. Fig. 67: Representacin Esquemtica de la placa metafsica 03.

99

9.3 IDIOGRAMA de Dactylopius coccus Costa

Idiograma de Dactylopius coccus Costa

1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 1 2 3 4 5 6 7 8

Longitud en um.

CROMOSOMAS

100

9.4 FUSIN Y HETEROCROMATINIZACIN EN LOS CROMOSOMAS DE Dactylopius coccus Costa

PLACA N 21

Fig. 68: Clula en Metafase tpica. La flecha azul, indica la fusin entre cromosomas. Las flechas rojas indican la presencia de ligaciones cromosmicas

PLACA N 22

Fig. 69 Cromosomas Metafsicos con atraccin en las regiones telomricas.

101

PLACA N 23

Fig. 70: Cromosomas Prometafsicos de Embrin .Las flechas azules, indicas la fusin entre cromosomas. La condensacin es similar en todos los cromosomas.

PLACA N 24

Fig. 71: Cromosomas Prometafsicos de Embrin . Las flechas azules indican los H. Las flechas rojas indican los E. La condensacin es diferencial entre los cromosomas.

102

9.5 Dactylopious coccus Costa en el Laboratorio

Fig.72 Embriones de Dactylopius coccus C.

Fig. 73 Ninfa de Dactylopius coccus C.

Fig. 74 Si la lisis es excesiva el exoesqueleto en formacin de desintegrar, generando suciedad en las preparaciones citolgicas.

Fig. 75 lisis excesiva

Fig. 76 lisis adecuada

Fig. 77 Vista dorsal

Fig. 78 Vista ventral

Fig. 79 Vista ventral

de hembra de D. coccus

de hembra de D. coccus

de macho de D. coccus

103

9.6 MAPA GEOGRFICO DE SAN BARTOLOM- HUAROCHIR- LIMA

Fig. 80 MAPA DE HUAROCHIRI-LIMA

Fig. 81 MAPA San Bartolom-HUAROCHIR

Fig.82 Zona de colecta de la cochinilla del carmn

104

9.7 Dactylopius coccus Costa en San Bartolom

Fig.83 Pencas de Opuntia sp. infestadas con D. coccus

Fig.84 Colectando cochinilla

Fig.85 Cladodio de Opuntia sp. con cochinilla en reproduccin

Fig.85 Oviposicin de D. coccus

105

10. ADDENDUM
A los cccidos se les conoce tambin como insectos escamosos debido a la coccerina que cubre sus cuerpos y que comnmente son llamadas escamas (Gullan & Korztarab, 1997). La similitud morfolgica en los cccidos es tan alta que ha llevado en ms de una ocasin a tener problemas a la hora de ser clasificados. As Gullan & Cook (1997) generan expectativas sobre la relacin filogentica entre los Dactylopiidae y los Eriococcidae sin embargo pese a las similitudes entre ambos grupos la primera familia con su nico gnero Dactylopius es reconocido reconocido como una familia monofiltica y aprobado oficialmente por la comisin internacional de nomenclatura zoolgica (1983). Por ello, los mismos autores, para evitar mayores confusiones, sugieren finalmente que se mantengan los nombres Eriococcidae y Dactylopiidae por separado. En el proceso evolutivo los cccidos han desarrollado especializaciones muy diferentes al resto de los Heterptera, tales como: La reduccin en la forma y movilidad. La reduccin o prdida de estructuras, como sus pequeas patas. El desarrollo de varios mecanismos para proteger sus huevos donde la hembra retiene los huevos dentro de su cuerpo previo a la incubacin. La secrecin de filamentos cerosos que forman un ovisaco. La secrecin de una cera para cubrir su cuerpo y la formacin de las verdaderas escamas en los ms evolucionados, la familia Diaspidiidae (Gullan & Cook, 1997).

10.1 Biologa de Dactylopius coccus Costa 10.1.1 Ciclo de vida y los factores que influyen en su desarrollo Dactylopius coccus presenta un marcado dimorfismo sexual, donde las hembras tienen el cuerpo oval y convexo, distinguindose apenas la cabeza, trax y abdomen mientras que el macho es

106

ms pequeo y alado. El dimorfismo sexual sin embargo es raro, ya que en ms de veinte familias de cccidos slo seis lo presentan, entre ellos Apiomorpha rbsaamen (Hemptera: Coccoidea; Eriococcidae) pariente cercano de los Dactylopiidae slo que de mayor tamao, la hembra tiene 40 mm de longitud (Cook et al., 2000). La reproduccin de D. coccus es sexual o partenogentica (Romero et al., 2006), con una puesta que va desde los 230-596 huevos, estos son depositados individualmente y luego de forma continua observndosele como una cadena, eclosionan aproximadamente a los veinte minutos. Presenta dos estadios ninfales, la ninfa I es la que migra buscando un lugar en el cladodio para fijarse con sus estiletes (aparato bucal) donde pasar el resto de su vida, alimentndose (Marn & Cisneros, l977). Tras las respectivas mudas, emerge la hembra adulta que mide 2,81 x 1,87 mm. La cpula se da en los siguientes das, lo que ocasionar que la hembra incremente su volumen hasta 6,24 x 4,71 mm, tal cambio se debe a la acumulacin de huevos dentro de su sistema reproductor el cual est compuesto por un par de ovarios cada uno de los cuales est formado por aproximadamente 400 ovariolas y el proceso de maduracin es asincrnico lo que le permite ovipositar continuamente (Ramrez-Cruz et al., 2008). En el caso del macho la ninfa II se diferencia en protopupa y pupa, el adulto es frgil de 2,2mm de largo y 4,8mm de expansin alar (Palomino, 1998), es de movimiento lento y vive de 3-4 das, porque su aparato bucal es atrofiado. El ciclo biolgico de Dactylopius coccus vara de 64-114 das para la hembra y de 47 a 70 das para el macho, ello de acuerdo a los factores ambientales (Marn & Cisneros, 1977; Romero et al., 2006). Ambos estn cubiertos por una cera blanquecina (coccerina) que los protege de la desecacin, de otros factores ambientales y de sus enemigos naturales. El ciclo de vida de la cochinilla del carmn se ve seriamente afectado por los factores externos, los cuales son cuidados buscando su ptimo desarrollo y una mayor produccin del cido carmnico. Se ha determinado que uno de los factores biticos ms importantes es la calidad de la planta hospedadora (cactcea). As se sabe que los cladodios de un ao de edad son los ms apropiados (Monge et al., 1990), estas plantas deben ser protegidas de las infecciones fngicas ya que ellas disminuyen la superficie fotosinttica de la planta y con ello su metabolismo, no obstante dicha infeccin en la cochinilla ser beneficioso para los productores ya que los individuos aumentaran su contenido de cido carmnico como mecanismo de defensa, a pesar de ello los factores

107

abiticos como el fotoperiodo, la temperatura, el riego, etc. tienen un mayor efecto sobre la concentracin de cido carmnico (Rodrguez et al.,2005). Otro de los factores que reducen la poblacin de cochinilla son sus predadores naturales y la mayor cantidad de entomfagos de cochinilla se encuentran en Mxico (Portillo & Vigueras, 2002). Dentro de los factores abiticos ms importantes se encuentran la temperatura y la humedad relativa. Las investigaciones prueban que mientras la temperatura sea ms elevada y la humedad relativa ms baja el ciclo de vida se acorta, ello se ve reflejado en la distribucin natural en el Per, en quebradas calurosas y secas (Daz & Quispe, 1989). As mismo se ha notado que los suelos altoandinos son los ms apropiados para el desarrollo de las plantas hospedadoras de cochinilla por su contenido elevado en calcio Ca++ y por mantener un pH neutro (Flores, 2002), pero stas regiones en el Per tienen una tasa elevada de precipitaciones anualmente por lo que Quispe et al. (1990) sugieren que la comunidad de cochinillas debe ser protegida de los factores adversos como lluvias y vientos fuertes ya que generan desprendimiento de los primeros estadios ninfales. En la bsqueda del incremento de la produccin de cochinilla y lidiando con los factores externos antes mencionados se han desarrollado diferentes mtodos de infestacin dentro de ellos la bolsa de tul y el cladodio cortado (Vigueras et al., 2005).

10.1.2 Dactylopius coccus Costa y la produccin de cido carmnico El sistema reproductor femenino de D. coccus est asociado con la produccin del cido carmnico. As, Corts et al. (2005) sugirieron que el tracto reproductor femenino de esta especie es un posible sitio de la sntesis de cido carmnico. Es comn imaginar que una cochinilla mientras ms grande sea (la hembra oviplena) mayor ser la cantidad de cido carmnico que contenga, pero Rodrguez et al. (2005) demostraron que es todo lo contrario: las cochinillas de mayor peso poseen menor concentracin de cido carmnico dado que el carmn cumple una funcin defensiva ante los microorganismos y predadores de la cochinilla.

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En los insectos el sistema de profenoloxidasa PFO es un mecanismo regulador del sistema inmune comprometido con la defensa ante agentes microbianos y el cierre de heridas, Garca et al. (2002) caracterizaron parcialmente el gen de la profenoloxidasa el cual se sabe est involucrado en la sntesis final del cido carmnico, pese a que no se conoce a cabalidad la ruta biosinttica del mismo se ha sugerido tambin que existe una participacin importante de la hemolinfa del insecto (Lambdin et al., 2002), lo cual conduce ahondar en las caractersticas de dicha hemolinfa. Uno de los trabajos ms actualizados al respecto es el de Caseln-Castro et al.(2008) gracias al cual se sabe hoy que D. coccus tiene cuatro tipos de hemocitos: granulocitos, plasmatocitos, prohemocitos y oenocitos, no obstante dicha investigacin slo menciona datos morfolgicos ms no explica el rol que cada uno de los hemocitos desempea, ello sumado a que como se mencion anteriormente se cree tambin este implicado el sistema reproductor femenino del insecto, indica la necesidad de continuar con las investigaciones sobre la ruta metablica biosinttica del cido carmnico en D. coccus . Ya que los cccidos (hembra) son ssiles toda su existencia, se ha ahondado poco sobre su ecologa o las relaciones que tienen los individuos dentro de la comunidad. Respecto a ello Rodrguez et al. (2005) han reportado la existencia de una feromona sexual presente en las hembras emergentes de D. coccus, este conocimiento de ser profundizado se convertira en una herramienta til para mejorar la produccin de cochinilla. La biotecnologa por su parte se ha encargado del anlisis del cido carmnico y su preocupado afn por una obtencin a mayor escala del mismo ha llevado a disear mtodos de cultivo in vitro de clulas madre de cochinilla (Gonzles et al., 2002). Todo muestra que el objetivo principal de las investigaciones en D. coccus, cual sea el camino y las herramientas a utilizar es sin lugar a dudas aumentar la produccin de la cochinilla y por ende del cido carmnico. Tanto los entomlogos, como los biotecnlogos, ingenieros industriales, genetistas e investigadores en general, buscan mejorar la calidad del cido carmnico de D. coccus, para lo cual una alternativa es mejorar primero al insecto en s, lo cual es posible gracias a cruces interespecficos y una herramienta bsica es la citogentica, ya que nos permite conocer el nmero de cromosomas, el comportamiento mittico y meitico de los mismos.

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