TRANSFORMAES BIOQUMICAS

Guia de Normas e Experimentos 3 quadrimestre/2013

Coordenao: Prof. Dr. Tiago Rodrigues Autores: Ncleo Docente da UFABC 2013

Sumrio

AULA
Introduo Experimento 1

CONTEDO
Apresentao e Disposies Gerais do Curso Experimental Uso e Calibrao de Micropipetadores

Experimento 2

Espectrofotometria: Conceitos e Aplicao

Experimento 3

Aminocidos: Estudo da Estrutura e Propriedade cido-Base

Experimento 4

Desnaturao

Precipitao

de

Protenas:

Atividade

Enzimtica Presente no Suco do Abacaxi sobre Gelatina (Colgeno)

Experimento 5

Extrao e Caracterizao de Lipdios

Experimento 6

Extrao e Caracterizao Bioqumica do Amido da Batata: Reao com Iodo e Poder Redutor de Carboidratos

Apresentao e Disposies Gerais do Curso Experimental

APRESENTAO

A disciplina Transformaes Bioqumicas composta por aulas expositivas em sala de aula e por aulas prticas nos laboratrios didticos. Este guia traz ao estudante o contedo das aulas prticas, com introduo, objetivos, procedimentos e normas que regem a execuo destas atividades.

OBJETIVOS E COMPETNCIAS

Os mdulos prticos desta disciplina tm como objetivo apresentar uma seqncia de experimentos que permitir ao aluno identificar aspectos estruturais, funcionais e de reatividade de aminocidos, carboidratos, lipdeos e enzimas. Espera-se que, aps a realizao das aulas prticas, o aluno seja capaz de compreender os conceitos fundamentais das Transformaes Bioqumicas, fazendo a conexo entre o macroscpico, acessvel aos nossos sentidos, e os eventos que ocorrem em escala molecular.

AULAS PRTICAS

Existem normas de segurana para o trabalho em laboratrio que devem ser seguidas e respeitadas. Um conjunto destas normas ser entregue ao aluno no incio das aulas de laboratrio juntamente com um termo de compromisso (caso no o tenha recebido em disciplina anterior) no qual o aluno se compromete a ler e seguir as mesmas. Todos os trabalhos em laboratrio sero realizados por equipes de no mximo 5 alunos. Espera-se que os resultados obtidos sejam obra de um esforo conjunto e que todos os componentes estejam presentes na hora marcada para o incio das aulas. Haver uma tolerncia de 10 minutos e

aps esse tempo os alunos retardatrios no podero realizar as atividades do dia. A aula ser encerrada no horrio pr-estabelecido, no havendo prorrogao para os alunos que no tenham concludo os experimentos dentro do prazo previsto por motivos alheios prtica. IMPORTANTE: No haver reposio de experimentos no caso de falta, ficando o aluno prejudicado com o aprendizado daquele contedo.

AVALIAO

Para a avaliao das atividades prticas, ser utilizado o contedo do caderno de laboratrio elaborado individualmente pelo aluno sobre cada experimento. O aluno dever fazer um pr-relatrio no caderno anteriormente a aula em questo e utiliz-lo para as anotaes durante a aula, bem como as anotaes referentes discusso dos resultados obtidos. Esse caderno deve ser apenas manuscrito e no poder conter cpia xerogrfica do caderno dos colegas ou de qualquer outro material. O aluno no poder participar, em hiptese alguma, da aula prtica sem o caderno de laboratrio contendo o pr-relatrio. O aprendizado na disciplina de Transformaes Bioqumicas ser avaliado continuamente ao longo da disciplina pelo acompanhamento direto do docente e tambm ao final por meio de provas tericas e prticas. O componente da teoria da nota final ter peso 6 e o prtico, peso 4. A prova prtica envolver a execuo de experimentos no laboratrio e resposta a questes propostas durante a execuo. Alunos com rendimento igual ou superior a 86% obtero conceito A; com rendimento entre 70 e 85%, conceito B; com rendimento entre 56 e 70%, conceito C; de 50 a 55%, conceito D e rendimento inferior a 50% com conceito F. O aluno reprovado (conceito F) poder fazer EXAME com o contedo todo do quadrimestre, cuja nota constituir uma nova mdia aritmtica com a mdia quadrimestral obtida previamente para chegar em seu conceito final.

RECOMENDAES PARA AS AULAS EXPERIMENTAIS

1. obrigatrio o uso de avental (jaleco) no laboratrio; o mesmo deve ser comprido, de mangas compridas e ser usado fechado (com os botes fechados); 2. No ser permitido fazer a aula de laboratrio usando sandlias, bermudas, shorts ou saia; 3. No permitida a execuo da aula de Transformaes Bioqumicas de bon, culos escuros nos olhos ou na cabea e fones de ouvido; 4. proibido comer ou beber no laboratrio; 5. Proibido o uso de telefone celular durante as aulas de Transformaes Bioqumicas; 5. Cabelos compridos devem estar devidamente presos; 5. No dia da aula experimental todos devem apresentar um fluxograma individual (PRRELATRIO) e feito mo no caderno de laboratrio para dar incio aula, sendo que o mesmo poder ser utilizado durante a execuo do experimento; 5. Evitar ao mximo faltar ou chegar atrasado s aulas prticas para no ser prejudicado; 6. O aluno que faltou em aula prtica ter prejuzo no componente da parte prtica da nota e nos seus conhecimentos daquele tpico, uma vez que no h possibilidade de reposio da aula;

Modelo de Fluxograma O fluxograma pode ser feito de maneira esquemtica ou na forma descritiva. O objetivo fazer com que todos leiam os contedos do experimento e resumam as atividades experimentais, ou seja, cheguem sabendo exatamente o que ser feito. Sem o fluxograma no ser permitido realizar a aula experimental.

Modelo de Fluxograma 1: Esquemtico Experimento 1 Parte 1:

Modelo de Fluxograma 2: Descritivo

Experimento 1 Uso e Calibrao de Micropipetadores

Abstract
The purpose of this didactic experiment is to make students of Biochemical Transformations have the knowledge of correct use of micropipettes, pipetting modes applied to normal, volatile, foaming and viscous liquids, precision limits, and pipette calibration tests.

Resumo
Este experimento didtico tem como proposta fazer com que os estudantes de Transformaes Bioqumicas tenham conhecimento e desenvolvam a habilidade do uso correto de micropipetas, modos de pipetagem dos lquidos normais, volteis, espumantes e viscosos, limites de preciso e testes da calibrao de pipetas.

Introduo
A transferncia de volume exato de lquidos fundamental para vasta maioria dos experimentos nas reas de bioqumica, biologia molecular, qumica, etc. De uma maneira geral, o conhecimento sobre o pipetamento de lquidos, a compreenso de seus limites de preciso, bem como o estudo de sua importncia na execuo reprodutvel de experimentos justifica a relevncia e abordagem deste tema nesta aula do curso de Transformaes Bioqumicas da UFABC.

Fundamentao Terica

Pipetas automticas Micropipetas so aparelhos designados para a transferncia de pequenos volumes (entre 0,2 a 5000 l) com mxima preciso. A construo das micropipetas consiste em um corpo anatmico de polipropileno (autoclavvel) equipado com um boto dispensador e um ejetor de ponteiras no topo, um indicador de volume na lateral e uma haste para encaixe de ponteiras descartveis na parte inferior. Existem vrios tipos de micropipetas: pipetas monocanal ou multicanal pipetas com volume fixo ou com volume varivel pipetas com deslocamento de ar ou com deslocamento positivo

Figura 1: A - Pipeta de Deslocamento Positivo; B - Pipeta Deslocamento de Ar (monocanal) e C - Pipeta Deslocamento de Ar (multicanal).

Funcionamento de micropipetas com deslocamento de ar Este tipo de pipetas o mais utilizado, por ser muito verstil. O boto dispensador ligado a um pisto dentro da pipeta. Ao pressionar o boto, o pisto se move deslocando o ar que por sua vez desloca um lquido para dentro ou para fora da ponteira. A trajetria de boto dispensador tem dois estgios que podem ser percebidos por diferena da resistncia de molas que retornam o boto dispensador para posio de repouso aps ele ser liberado. Os dois estgios permitem fazer a pipetagem usando duas tcnicas diferentes: a pipetagem direta (esgotamento total) ou a pipetagem reversa (esgotamento parcial). A escolha da tcnica depende das caractersticas do lquido a ser pipetado (viscosidade, volatilidade, hidrofilicidade) e do processo da pipetagem (pipetagem nica, titulante ou repetida).

A preciso da pipetagem influenciada por vrios fatores: - encaixe da ponteira na haste: antes de pipetar, a compatibilidade do tipo de ponteira (fabricante) com o tipo de haste deve ser verificada para evitar passagem de ar no encaixe. A ponteira deve ser encaixada por movimento circular que assegura boa vedao entre a ponteira e a haste, alm de maior durabilidade pelo uso correto da haste. Por estas razes, o encaixe da ponteira por batimentos repetidos de haste na ponteira deve ser evitado. - ajuste de volume (pipetas com volume varivel): cada indicador de volume tem uma pequena folga. Assim, para a maior preciso, o volume deve ser ajustado sempre e somente de um lado (de preferncia, no sentido horrio). Quando o ajuste ultrapassa o volume desejado, recomenda-se voltar <1/3 da rotao e ajustar o volume de novo. Para ajustar corretamente o volume, deve ser considerado o erro paraltico; o eixo da viso tem que ser perpendicular escala do indicador do volume.

- a poro imersa no lquido: por causa da compressibilidade do ar, existe uma medida ideal da imerso da ponta da ponteira que minimiza tais imprecises (Tabela 1).
Tabela 1: Imerso ideal da ponta da ponteira em relao do tipo de ponteira - volume pipetado

- tenso lateral do lquido: os lquidos podem molhar a parede da ponteira, o que pode resultar em perdas de volume ejetado (parte dele fica nas paredes). A minimizao dessa impreciso consiste em aspirao e ejeo de lquido sem efetuar a transferncia (no mesmo recipiente). Assim, as paredes j estaro molhadas e o volume da 2a aspirao ser transferido por completo. - volatilidade do lquido: para diminuir gotejamento do lquido durante a transferncia e quando a natureza do lquido permite (no corrosivo, no infectante ou no radioativo), o lquido pode ser aspirado/ejetado no mesmo recipiente vrias vezes at o ar em cima do lquido ser trocado completamente por vapor do lquido.

Pipetagem direta (esgotamento total) a tcnica de pipetagem mais conhecida. Utiliza-se para transferir volumes nicos de lquidos aquosos ou de lquidos no volteis, no viscosos e no espumantes. O princpio de transferncia de lquido mostrado na Figura 2:

Figura 2: Esquema de procedimento usado por a tcnica de pipetagem direta. Linhas pontilhadas representam as posies de boto de esgotamento: Repouso (linha superior), 1o estgio (linha no meio) e 2o estgio (linha inferior).

Pipetagem reversa (esgotamento parcial) uma tcnica de pipetagem pouco conhecida. Recomenda-se fortemente o uso desta tcnica em casos de pipetagem de lquidos viscosos, volteis e espumantes. Uso da pipetagem reversa em casos de pipetagem repetida de um volume do mesmo lquido (por exemplo, em dosagens de protena amostra e curva padro) pode melhorar a confiabilidade do mtodo at 10 vezes. A transferncia de lquidos por esta tcnica resulta em um volume que sobra na ponteira aps da transferncia que pode ser uma desvantagem caso de lquidos caros ou de volume limitado. Porm, a grande vantagem consiste em ejeo de lquido viscoso ou espumante, onde praticamente impossvel realizar o esgotamento total (da tcnica direta). Caso de lquidos volteis, a transferncia do lquido pode ser acompanhada por gotejamento do lquido fora da ponteira (vapor do lquido voltil expande o ar dentro da pipeta). A tcnica da pipetagem reversa garante um volume de reserva na ponteira que permite a transferncia de volume correto at de lquido bastante voltil. O princpio de transferncia de lquido mostrado na Figura 3:

Figura 3: Esquema de procedimento usado por a tcnica de pipetagem reversa. Linhas pontilhadas representam as posies de boto de esgotamento: Repouso (linha superior), 1o estgio (linha no meio) e 2o estgio (linha inferior)

Teste de calibrao Cada micropipeta calibrada para o valor indicado (valor terico) corresponder ao valor efetivamente medido (valor real) na faixa da preciso de micropipeta (erro 2% para pipetas P10, P20, P100, P200, P1000 e 5% para pipetas P2 e P5000). Porm, com tempo e uso prolongado, os componentes mecnicos so sujeitos ao desgaste ou disfuno resultante de uso inadequado.

A medio de volume um passo importante em qualquer laboratrio porque um pequeno erro de pipetagem pode causar um erro significativo no resultado obtido. Assim, essencial a verificao da calibrao das micropipetas nas mesmas condies em que so utilizadas no laboratrio. Esta verificao consiste essencialmente em um conjunto de medies usadas para restabelecer/atualizar a relao entre o valor indicado e o valor efetivamente medido. Normalmente, a verificao deve ser realizada nas seguintes situaes:

- aps uma manuteno e/ou troca de peas; - aps de um perodo de uso (~ 1 ano); - quando a pipeta sofre um dano: queda, contaminao da haste, etc; - de acordo com orientaes do fabricante;

Empregam-se geralmente trs mtodos de calibrao de pipetas automticas:

1. Mtodo gravimtrico: uma srie de medies do peso de lquido pipetado (considerando a temperatura, umidade, presso atmosfrica e coeficiente de expanso) posteriormente convertida em volume. Este mtodo realizado por laboratrios de calibrao especializados.

2. Mtodo titrimtrico: uma srie de medies de quantidades de NaOH com concentrao conhecida em volumes pipetados (sem interferncia da temperatura, umidade ou presso atmosfrica). Exige uma padronizao das solues envolvidas.

3. Mtodo fotomtrico: uma srie de medies fotomtricas de diferentes diluies de um cromforo com concentrao conhecida. Este mtodo pode ser facilmente implantado no laboratrio.

Para a anlise dos resultados da calibrao, as sries de medies so convertidas para volume (valor efetivamente medido) e comparados com volumes ajustados no indicador da micropipeta (valores indicados). Calcula-se uma mdia (para mesmos volumes) ou regresso linear (para volumes diferentes) desvio padro.

Objetivo Geral

Aprender o modo de pipetagem direta (esgotamento total) no modo positivo, determinar o limite de preciso de micropipetas e testar a sua calibrao (volume real).

Materiais

gua destilada 1 unidade de micropipeta automtica de volume varivel por grupo (P100, P200 ou P1000) Balana de preciso de 1 mg (3 ou 4 casas decimais) Ponteiras 1 bquer de 50 mL Papel absorvente

Procedimento

Para as pipetagens utilize a micropipeta de volume varivel disponvel para o seu grup (P100, P200 ou P1000). 1) Determine a massa do bquer seco e anote. Sem retirar o bquer da balana, execute o item 2. Evite manusear o bquer durante a pesagem para os resduos das mos (gorduras, ceras, cosmticos) no interferirem com a massa real. 2) Pipete gua com volume mximo (nominal) da micropipeta no modo positivo para o bquer e pese o bquer com o lquido. Anote o peso na tabela. Repita este passo 10 vezes. 3) Repita o item 1 e pipete gua com 50% do volume mximo (nominal) da micropipeta no modo positivo para o bquer e pese o bquer com o lquido. Anote o peso na tabela. Repita este passo 10 vezes. 4) Repita o item 1 e pipete gua com 40%, 60%, 80% e 100% do volume mximo (nominal) da micropipeta no modo positivo, ajustando o volume sempre no sentido horrio, para o bquer e pese o bquer com o lquido. Anote o peso na tabela. 5) Repita o item 4, ajustando o volume aleatoriamente, isto , 2 volumes (a sua escolha) no sentido horrio e 2 volumes restantes no sentido anti-horrio.

Anlise dos dados

Fazer uma tabela contendo os valores de massa de cada pipetagem. Fazer grficos dos valores de peso de pipetagem de gua com volumes 100% e 50% do volume nominal da micropipeta. Fazer anlise da variao de volume por pipetagem. Expresse o valor mdio do volume pipetado erro padro. Discuta a preciso da calibrao da pipeta (diferena do volume mdio determinado experimentalmente com o volume garantido pelo fabricante).

Discuta a importncia de tipo de ajuste de um lado s do volume no marcador da pipeta em relao da preciso da pipetagem e compare o volume real com volume ajustado.

Experimento 2 Espectrofotometria: Conceitos e Aplicao

Abstract

The light absorption phenomenon directly by macromolecules or chromophores formed by secondary reactions is used by spectral characterization and/or quantification of such substances through spectrophotometry. The purpose of this experiment is to present UVvis electronic absorption spectrometry technique applied to Biochemistry, exploring the Lambert-Beers law. To this class, it will be used Biuret method to protein quantification, firstly determining the wavelength of maximum absorbance of the cromophore to build a standard curve for the molar extinction coefficient calculation that will be used after to determine the concentration of an unknown sample.

Resumo

O fenmeno de absoro de luz diretamente por macromolculas ou cromforos formados por reaes secundrias usado para caracterizao espectral e/ou quantificao dessas substncias por espectrofotometria. Este experimento didtico tem como proposta apresentar a tcnica de espectrometria de absoro eletrnica no UV-vis aplicada Bioqumica, explorando a Lei de Lambert-Beer. Para esta aula, ser usado o mtodo do Biureto para quantificao de protenas, primeiramente determinando o comprimento de onda de mxima absoro do cromforo para se construir uma curva-padro (curva de calibrao). Esta curva ser usada para a determinao da concentrao de protenas de uma amostra desconhecida.

Introduo O termo medida fotomtrica foi definido originalmente como o ato de medir a intensidade da luz, independente do comprimento de onda (energia). A maioria dos instrumentos tem, contudo, mecanismos para isolar uma faixa estreita de comprimentos de onda do espectro. Os instrumentos que usam filtros para esse propsito so referidos como fotmetros de filtro ou colormetros e os que utilizam prismas ou grades de difreo so chamados de espectrofotmetros. Comprimento de onda refere-se a distncia entre dois picos da propagao da luz que ocorre na forma de onda, e essa distncia normente dada em nanmetros (nm). A radiao eletromagntica inclui desde a energia radiante dos comprimentos de onda curtos dos raios aos comprimentos de onda longos das ondas de rdio. O termo luz usado para descrever a energia dos comprimentos de onda visveis ao olho humano e queles limtrofes. O olho humano capaz de detectar comprimentos de onda entre 380 e 750 nm, entretanto espectrofotmetros so capazes de medir tambm comprimentos de onda mais curtos (ultravioleta, UV) ou mais longos (infra-vermelho, IV) (Fig. 1).

Fig. 1. Espectro eletromagntico evidenciando a faixa dos comprimentos de onda visveis. (fonte: http://www.arq.ufsc.br/labcon/arq5656/Curso_Iluminacao/07_cores/luz_01.htm e http://www.wordpress.com/2009/03/teoriadacor_01.jpg).

A espectrofotometria um dos mtodos pticos de anlises mais usados nas investigaes bioqumicas (Fig. 2). O espectrofotmetro um instrumento que permite comparar a intensidade de luz absorvida ou transmitida por uma soluo que contm uma quantidade desconhecida de soluto, e uma quantidade conhecida da mesma substncia. Todas as substncias podem absorver energia radiante, como por exemplo, a gua que absorve fortemente na regio do IV. A absoro das radiaes ultravioletas, visveis e infravermelhas dependem da estrutura molecular e caracterstica para cada substncia qumica. Quando a luz atravessa uma soluo de determinada substncia, parte da energia absorvida (absorbncia). A cor das substncias se deve a no absoro (transmitncia) de certos comprimentos de ondas da luz branca que incide sobre elas, deixando transmitir aos nossos olhos apenas aqueles comprimentos de ondas no absorvidos. Esse fenmeno pode ser usado para quantificao de substncias por meio da intensidade de absorbncia em um comprimento de onda especfico, com base em uma curva-padro, utilizando-se da Lei de Lambert-Beer (PUNGOR, 1995).

Fig.

2.

Esquema

ptico

simplificado

de

um

espectrofotmetro.

(fonte:

http://www.ufpa.br/ccen/quimica/espect2.jpg)

Fundamentao Terica

Considere um feixe de luz incidente com intensidade Io passando por uma cubeta contendo uma soluo de uma determinada substncia que absorve luz de certo comprimento de onda (Fig. 3). A intensidade do feixe de luz transmitido (I) ser sempre menor que Io, sendo que a transmitncia (T) definida como uma relao entre a intensidade da luz transmitida e a intensidade da luz incidente (Lei de Beer).

T = I/Io

Fig. 3. Esquema demonstrando a incidncia de um feixe de luz em uma cubeta e sua transmitncia. (fonte:http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/0/04/B eer_lambert.png/300px-Beer_lambert.png)

medida que aumentamos a concentrao da substncia em soluo, a transmitncia varia em relao inversa ao logaritmo da concentrao. Em conseqncia disso, pode-se definir um novo termo, absorbncia (A), que ser diretamente proporcional concentrao. Portanto, A = log I/Io = log T A = log 1/T

Dessa forma, a absorbncia direta e linearmente proporcional concentrao. Esta varia tambm de forma direta com o caminho ptico (dimetro interno) da cubeta, ou seja, se dobrarmos o caminho ptico mantendo a concentrao constante, teremos um valor de absorbncia duas vezes maior. Essa relao frequentemente referida como Lei de LambertBeer:

A = a.b.c
Onde A = abosrbncia, a = constante de proporcionalidade (absortividade ou coeficiente de extino), b = caminho ptico (em centmetros) e c = concentrao. Como os valores de A so adimensionais, a unidade de a so as recprocas daquelas para b e c. Quando b = 1 cm (geralmente ) e c expresso em mol/L, a constante a pode ser chamada de absortividade ou coeficiente de extino molar (, epsilon) e constante para dado comprimento de onda, temperatura, pH, solvente, etc. Assim, a proporcionalidade direta entre absorbncia e concentrao pode ser usada para a determinao da absortividade de uma determinada substncia em determinada condio experimental por meio de realizao de uma curva-padro. Para a construo dessa curva, solues de concentraes conhecidas da substncia devem ser preparadas e as

absorbncias determinadas em determinado comprimento de onda. Posteriormente, essa absortividade pode ser utilizada para quantificao dessa substncia em uma soluo, cuja concentrao desconhecida (VOET & VOET, 2006).

Objetivo Geral Introduzir os conceitos de espectrofotometria ao aluno utilizando como exemplo a dosagem de protenas em uma amostra pelo mtodo do Biureto.

Objetivos especficos 1. Determinar o espectro de absoro UV-visvel do complexo formado entre os ons Cu2+ presentes no reagente de Biureto e as protenas. 2. Utilizar o comprimento de onda de absorbncia mxima para a elaborao de uma curvapadro e determinao da absortividade. 3. Calcular a concentrao protena de uma soluo de albumina.

Materiais

Reagente de Biureto H2O destilada espectrofotmetros cubetas papel absorvente macio para limpeza das cubetas 2 pipetas volumtricas de 2 mL pera estante com 2 tubos de ensaio + 9 tubos de ensaio agitador tipo vrtex Solues-padro de soro albumina bovina (BSA) com as seguintes concentraes em % (m/v): 0,125; 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 1,25 e 1,75. amostra de concentrao desconhecida

Procedimento

As solues a serem utilizadas sero previamente preparadas pelos colaboradores da disciplina ou preparadas pelos estudantes dependendo da disponibilidade de tempo. Caso sejam fornecidas aos estudantes solues prontas, os mesmos devero apresentar os clculos para a preparao de todas as solues envolvidas no experimento, admitindo a preparao de 1 mL de cada soluo-padro e 100 mL da soluo de Biureto.

O reagente de Biureto composto por CuSO4 0,15 % (m/v), tartarato de sdio e potssio 0,6 % (m/v) e NaOH 0,75 mol/L. Este reagente no deve ser guardado por mais de 30 dias, devido a possibilidade de precipitao do cobre na forma de xidos ou sais insolveis. As solues de BSA usadas como padro devem ser preparadas com o maior rigor possvel a fim de garantir a exatido da concentrao desejada.

REAO: Adicionar 0,5 mL da amostra, branco ou padro em cada tubo e completar o volume para 1,5 mL com H2O destilada. Aps agitao, adicionar 1,5 mL do reagente de Biureto e tornar a agitar. Aps 5 minutos a absorbncia pode ser determinada (Cain & Skilleter, 1987).

1. Para a determinao do comprimento de onda, inicialmente, deve fazer a reao com a amostra de concentrao 0,25 %. NO ESQUECER de fazer um tubo branco com a adio de gua no lugar da amostra. Fazer a aquisio do espectro de varredura (EM ESPECTROFOTMETRO) da reao obtida com a amostra de concentrao 0,25 % de 400 a 800 nm, de 10 em 10 nm, zerando sempre com o branco a cada mudana de comprimento de onda.

2. Para a elaborao da curva padro, numerar os nove tubos de ensaio, sendo um branco, oito padres e uma amostra desconhecida. Realizar a reao de Biureto e determinar a absorbncia no comprimento de onda onde a absoro mxima, conforme dados obtidos no item 1 acima. Usar os padres para o clculo da absortividade e, aps isso, usar a absortividade para calcular a concentrao da amostra desconhecida.

Anlise dos dados

1) Demonstrar os clculos para a obteno do reagente Biureto e das solues-padro de BSA; 2) Plotar a absorbncia da amostra do item 1 em funo do comprimento de onda, determinando o comprimento de onda de mxima absorbncia; 3) Plotar as absorbncias das solues padro em funo da concentrao e calcular a absortividade; 4) Determinar a concentrao da amostra desconhecida;

Exerccio: Descreva o princpio do mtodo de Biureto para a dosagem de protenas, relacionando suas vantagens e desvantagens em relao a outros mtodos para dosagem de protenas.

Referncias Bibliogrficas

1. PUNGOR, E. A practical guide to instrumental analysis. Boca Raton: CRC Press, c1995. 384 p. 2. VOET, D; VOET, J.G. Bioqumica, 3 ed., Porto Alegre: Artmed, 2006. 3. ZAIA, D.A.M.; ZAIA, C.T.B.V.; LICHTIG, J. Determinao de protenas totais via espectrofotometria: vantagens e desvantagens dos mtodos existentes. Qum. Nova 21(6):787793, 1998.

Experimento 3 Aminocidos: Estudo da Estrutura e Propriedade cido-Base.

Abstract

The purpose of this experiment is to introduce structural aspects of the amino acids, study their properties and structural differences, in order to learn some characteristics of protein "building blocks" through the acid-base titrations. From the experimental point of view, will just be used acid-base titration techniques, however, the aim is to illustrate several characteristics of these compounds, in order to lead the students beyond to the discussion presented in the practical class.

Resumo

Este experimento didtico tem como proposta fazer com que os estudantes de Transformaes Bioqumicas tenham contato com os aspectos estruturais dos aminocidos, estudem suas propriedades e diferenas estruturais e aprendam, por meio de titulao, as propriedades cido-base das unidades monomricas que constituem as protenas. Do ponto de vista experimental, sero utilizadas tcnicas simples de titulao cido-base, porm, permitir que o estudante correlacione diversas caractersticas estruturais destes compostos com seu comportamento qumico fixando conceitos tericos.

Introduo Em qumica, um aminocido qualquer molcula que contm simultaneamente grupos funcionais amina e cido carboxlico. Em bioqumica, este termo usado como termo curto e geral para referir os -aminocidos, ou seja, cidos carboxlicos em que as funes amino esto ligadas s posies (ou posio 2 em relao carboxila). Na natureza existem cerca de 200-300 aminocidos, entretanto, somente 21 podem ser metabolizados pelo organismo humano, sendo 20 aqueles que geralmente constituem as protenas. Dentre estes, 8 so chamados aminocidos essenciais, isto , no podem ser sintetizados pelo organismo humano, e precisam ser obtidos atravs de alimentos de origem animal ou vegetal. Os outros 12 aminocidos que geralmente constituem as protenas so produzidos por grande parte dos organismos superiores e so chamados no essenciais. H um aminocido, a taurina, que est presente nos organismos superiores, mas no na constituio das protenas. Aminocidos essenciais (no sintetizados pelo organismo humano): isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptofano e valina. Aminocidos no-essenciais (sintetizados pelo organismo humano): arginina, alanina, asparagina, cistena, glicina, glutamina, histidina, prolina, cido asprtico, cido glutmico, serina e tirosina.

Contudo, esta classificao no pode ser tomada como algo geral para todos os organismos superiores e em todas as etapas de seus ciclos de vida. Em crianas, por exemplo, os aminocidos cistena, tirosina, histidina e arginina so considerados semi-essenciais uma vez que as etapas metablicas para sintetizar estes aminocidos no esto completamente desenvolvidas. Portanto, esta classificao de essencial e no-essencial no reflete a importncia destes -aminocidos, uma vez que, todos os 20 -aminocidos so necessrios na constituio de protenas e peptdeos, conseqentemente, de toda a matria viva. O aminocido mais simples a glicina (Figura 1), e possui apenas um tomo de hidrognio em sua cadeia lateral. A alanina vem a seguir, com um grupamento metila. Cadeias laterais hidrocarbnicas maiores so encontradas na valina, leucina e isoleucina. A prolina tambm tem uma cadeia lateral aliftica, mas difere dos outros membros do conjunto dos vinte por sua cadeia lateral ser ligada tanto ao nitrognio quanto ao tomo de carbono .

Esta resultante estrutura cclica influencia fortemente a arquitetura das protenas. Trs aminocidos com cadeias laterais aromticas fazem parte do conjunto dos vinte. A fenilalanina contm um substituinte fenila ligado a um grupamento metileno. O anel aromtico da tirosina contm uma hidroxila, o que torna a tirosina menos hidrofbica do que a fenilalanina. O triptofano tem um anel indlico ligado a um grupamento metileno. Dois aminocidos, serina e treonina , contm hidroxilas alifticas, o que as tornam muito mais hidroflicas e reativas. Vamos agora aos aminocidos com cadeias laterais muito polares, sendo altamente hidroflicos. A lisina e a arginina tm cargas positivas em pH neutro. A histidina pode no ter carga ou t-la positiva, dependendo de seu ambiente local. As cadeias laterais da arginina e da lisina so as mais longas no conjunto dos vinte.
O OH NH2 NH2 OH

O OH NH2

O OH NH 2 H 2N

O OH NH 2 S

L-isoleucina
OH O OH NH 2

L-leucina
O OH NH2 HN

L-lisina
O OH NH 2

L-metionina
O OH NH 2 H 2N

L-fenilalanina
O OH O NH2

L-treonina
O HO O NH2 OH

L-valina
O HS NH 2 OH

L-triptof ano
O HO NH2 O OH

L-alanina
O H 2N NH 2 O OH

L-aspargina
O OH NH 2

cido L-asprtico

L-cistena

cido L-glutmico
O

L-glutamina

glicina
O

O HO NH 2 OH H N

O OH HO

NH OH H 2N N H

O OH NH 2 N HN

OH NH2

NH2

L-serina

L-prolina

L-tirosina

L-arginina

L-histidina

Figura 1. Estrutura dos 20 L-aminocidos encontrados em protenas.

Existem dois aminocidos com cadeias laterais cidas, o cido asprtico e o cido glutmico. Esses aminocidos so geralmente chamados de aspartato e glutamato para salientar que suas cadeias laterais tm, quase sempre, cargas negativas no pH fisiolgico. A glutamina e a asparagina so derivados no carregados de glutamato e aspartato que contm uma amida terminal em vez de um carboxilato. Sete dos vinte aminocidos tm cadeias laterais facilmente ionizveis. Um tomo de enxofre est presente nas cadeias laterais de dois aminocidos. A cistena contm uma sulfidrila (-SH) e a metionina possui um tomo de

enxofre em uma ligao tioter (-S-CH3). Ambas as cadeias laterais que contm enxofre so hidrofbicas. Deve-se destacar que a maioria destes aminocidos presentes em protenas possui pelo menos um centro quiral definido com estereoqumica (S) com exceo da cistena que (R) (notaes de Cahn-Ingold-Prelog) e da glicina que no possui centro quiral (Figura 1); ainda, todos os aminocidos comuns em protenas so freqentemente denominados Laminocidos, baseados na nomenclatura do gliceraldedo (configuraes de Fisher). Estas caractersticas conferem a estes compostos uma grande diversidade qumica e estrutural, permitindo que estes possam constituir uma gama enorme de diferentes protenas com diferentes arranjos espaciais e as mais diversas funes (Figura 2). Alguns autores relatam que para formar uma protena necessria uma cadeia com mais de 70 aminocidos. J os peptdeos (fragmentos de protenas) podem ser formados por dois ou mais aminocidos.

Figura 2. Esquema representativo dos diferentes nveis de estrutura protica da hemoglobina (LEHNINGER, NELSON & COX, 2006).

Todos os aminocidos so derivados de intermedirios da gliclise, do ciclo do cido ctrico (Krebs) ou da via das pentoses. O nitrognio entra nessas vias atravs do glutamato. H uma grande variao no nvel de complexidade destas vias, sendo que alguns aminocidos esto a apenas alguns passos enzimticos dos seus precursores e em outros as vias so complexas, como no caso dos aminocidos aromticos. De uma maneira geral, o conhecimento sobre as estruturas de aminocidos, a compreenso de suas peculiaridades estruturais e reacionais, bem como o estudo de sua importncia na qumica da vida (constituio de protenas) justifica a relevncia e abordagem deste tema nesta primeira aula do curso de Transformaes Bioqumicas da UFABC.

FUNDAMENTAO TERICA

Propriedades cido-base dos aminocidos No organismo, os aminocidos existem na forma de zwitterion, ou seja, compostos com cargas positivas e negativas totalizando uma carga nula (Figura 3).

O R NH3 O

Figura 3. Estrutura de um aminocido na forma de zwitterion.

Quimicamente, os aminocidos podem ser considerados como compostos anfotricos uma vez que podem atuar como cidos na presena de bases (Equao 1) ou como bases na presena de cidos (Equao 2), seguindo a definio de Brnsted.

O R NH 2 OH (aq)

+ OH (aq) Base

R NH 2

(aq)

+ H2O(l) cido

cido

Base

Equao 1. Aminocido atuando como cido.

O R NH 2 OH (aq)

+ H3O (aq) cido

R NH 3

OH (aq)

+ H2O(l) Base

Base

cido

Equao 2. Aminocido atuando como base.

Um estudo destas propriedades cido-base pode ser realizado utilizando-se titulaes partindo-se de aminocidos contidos em solues cidas (completamente protonados na funo amina). Nestes casos, quando se adiciona base (OH) na soluo, o pH aumenta gradativamente, sendo possvel monitorar o seu valor em funo das quantidades adicionadas pelo o uso de pHmetros ou papel de indicador universal (0-14 unidades). Se forem lanados

em grfico o volume ou numero de mols de base (OH) em funo do pH da mistura resultante, possvel obter algumas das propriedades intrnsecas dos aminocidos como o pKa (logaritmo negativo da constante de ionizao) e pI (ponto isoeltrico logaritmo negativo do pH em que os aminocidos esto completamente na forma de zwitterion) (Figura 4).

Titulao da ALANINA

Equivalentes de OH-

Figura 4. Curva de Titulao da Alanina. De uma maneira geral, quando consideramos um cido do tipo HA ionizado em soluo aquosa (Equao 3), podemos escrever a seguinte equao para descrever o pH do meio (Equao 4 Equao de Henderson-Hasselbach):
A(aq)

HA(aq) +

H2O(l)

H3O(aq)

Equao 3. cido de Brnsted em equilbrio aquoso.

pH = pKa + log

[A ] [HA]

Equao 4. Equao de Henderson-Hasselbach. Uma anlise simples da equao de HendersonHasselbach pode fornecer o pKa de um determinado cido de Brnsted. Se o termo logartmico da Equao 4 da for igual a 0 (zero), ou seja, quando as [HA] e [A] so idnticas no equilbrio, teremos que o pH do meio igual ao pKa (pH = pKa).

Tomando como exemplo o aminocido alanina (Figura 4), pode-se verificar experimentalmente que durante sua titulao com base surge um primeiro ponto de inflexo na curva (ponto (I), pKa1) onde as variaes de pH do meio so muito pequenas em funo das adies de base. Assim, pode-se dizer que as concentraes relativas das espcies em equilbrio [A]/[HA] (no caso, considere as duas espcies de aminocidos da Equao 5) no variam significativamente nas imediaes deste ponto porque o sistema est tamponado. O ponto de inflexo (II) obtido numa faixa muito pequena da variao da quantidade de base adicionada, caracterizando o ponto de viragem na titulao da funo cido carboxlico (funo mais acdica) e neste caso o pI (ponto isoeltrico). No ponto (III), de maneira similar ao que ocorre para o ponto (I), obtm-se o pKa2 da funo amina protonada. As Equaes 5 e 6 descrevem os equilbrios das espcies qumicas durante as titulaes.

O H3C NH 3 OH (aq)

+ H2O(l)

K a1

O H3C NH 3 O
(aq)

+ H3O(aq)

Equao 5. Equilbrio envolvido na primeira ionizao.

O H3C NH 3 O
(aq)

H2O(l)

K a2

H3C NH 2

(aq)

+ H3O(aq)

Equao 6. Equilbrio envolvido na segunda ionizao.

Objetivo Determinar os valores de pKa de aminocidos por titulaes cido-base. Construir os grficos e comparar os perfis das curvas, correlacionando os valores de pKa. Estudar as estruturas dos aminocidos por meio de exerccios com as estruturas moleculares em 3 dimenses.

Materiais

Solues 0,05 mol/L de glicina, arginina e cido glutmico. Soluo 4 mol/L de HCl Soluo 0,125 mol/L de NaOH pHmetro 1 pipetas volumtricas de 20 mL 1 pipetas de Pasteur 1 Bureta 1 bquer de 100 mL

Procedimento

As solues a serem utilizadas sero previamente preparadas pelos colaboradores da disciplina ou preparadas pelos estudantes dependendo da disponibilidade de tempo. Caso sejam fornecidas aos estudantes solues prontas, os mesmos devero apresentar os clculos para a preparao de todas as solues envolvidas no experimento, admitindo a preparao de 100 mL de cada e partindo dos reagentes comerciais. Para as titulaes, podero ser utilizados vrios aminocidos, sendo recomendado didaticamente o uso de glicina, arginina e cido glutmico. 1) Pipete 20 mL de uma soluo 0,05 mol/L da soluo de aminocido e adicione em um bquer de 100 mL. Insira o eletrodo do pHmetro (devidamente calibrado) no bquer e faa a medida do pH e anote o valor. Em seguida, acidifique a soluo do aminocido com HCl 4 mol/L at o pH do meio atingir 1,0. Seja cuidadoso com a adio de cido para no baixar demasiadamente o pH. Utilize conta-gotas para esta etapa. 2) Em seguida, complete uma bureta de 50 mL com soluo de NaOH 0,125 mol/L e inicie a titulao adicionando pores de 0,5 mL da base, medindo o pH aps cada adio. Lembre-se de agitar com cuidado a mistura titulada e ento aferir o pH. (Muito cuidado ao agitar a soluo para no quebrar o eletrodo do pHmetro!). 3) Efetue adies sucessivas at que o pH do meio atinja valores entre 12,0 a 12,5. Aps isso, lave o eletrodo com gua destilada e coloque-o imerso na soluo tampo de armazenamento do eletrodo. 4) Faa o procedimento para um aminocido sugerido. Cada grupo dever titular um aminocido e os resultados devero ser trocados entre os grupos de modo que cada grupo possua as trs titulaes para elaborar o relatrio.

Anlise dos dados

1) Uma tabela contendo os valores de pH juntamente com os respectivos volumes de NaOH adicionados para cada aminocido titulado. 2) Lance em grfico os valores de pH (eixo y) em funo dos volumes da soluo titulante de NaOH (eixo x). Faa isso para cada aminocido (trs grficos separados) e depois faa um grfico contendo as trs curvas superpostas. 3) Indique nos grficos lanados individualmente os valores dos pKa (pKa1, pKa2 e pKaR se houver) e indique o ponto isoeltrico (pI). Obtenha os valores de pKa determinados experimentalmente (localizando os pontos de inflexo na curvas) e compare-os com os valores de referncia da literatura. (Sugesto: no exerccio localizado no final deste experimento esto listados todos estes valores de referncia da literatura!) 4) Escreva as equaes de equilbrio (todas as etapas) das espcies qumicas envolvidas nas titulaes. 5) Faa uma anlise do perfil das curvas obtidas correlacionando com os valores de pK a obtidos e as funes orgnicas presentes. Voc acha que se fossem realizadas adies sucessivas de 0,25 mL de soluo de NaOH seria possvel calcular o valor de pK a com maior preciso? E se fosse utilizada uma soluo 0,1 mol/L de NaOH? 6) No caso especfico do cido glutmico, os primeiros valores de pKa so relativamente difceis de serem obtidos experimentalmente. Explique estes fatos dizendo se as medidas citadas acima podem melhorar a qualidade da curva e facilitar a obteno destes valores de pKa. 7) Aps construir todas as curvas aponte qual a espcie predominante nas solues iniciais de aminocidos utilizadas (medida inicial do pH antes da adio do HCl). Explique suas respostas.

EXERCCIO

Atribua o nome de cada aminocido (como exemplificado para a L-alanina) comparando as estruturas qumicas (Figura 1) com as projees moleculares 3D abaixo. Nas estruturas, considere os tomos de carbono em cinza, oxignio em vermelho, nitrognio em azul, enxofre em amarelo e hidrognio em branco. No se esquea de considerar as mltiplas ligaes que esto implcitas nestes modelos (por exemplo, uma nica ligao entre um dos

carbonos e um dos oxignios da L-alanina, significando que h uma dupla ligao pois o oxignio bivalente veja a posio circulada).

L-alanina

/ 3,9

/ 4,3

Referncias Bibliogrficas

1. LEHNINGER, A.L; NELSON, D.L; COX, M.M. Princpios de bioqumica. 4 ed. So Paulo: Sarvier, 2006. 1202 p.

2. BERG, M.J.; TYMOCZKO, J.L., STRYER, L. Biochemistry 5th. Edition. W. H. Freeman and Company. New York, 2002.

3. BETTELHEIM, F.A.; LANDESBERG, J.M. Laboratory Experiments for General, Organic & Biochemistry, Harcourt College Pub, New York, 2000.

4. VOET, D.; VOET, J.G. Bioqumica, 3 ed., Porto Alegre: Artmed, 2006.

Experimento 4 - Desnaturao e Precipitao de Protenas: Atividade Enzimtica Presente no Suco do Abacaxi sobre Gelatina (Colgeno).

Abstract The first aim of this experiment is to demonstrate the enzyme activity present in pineapple, these activities promote the degradation of collagen, additionally, the experiment shows that the proteolytic activity can be destroyed boiling the pineapple juice, probably due the protein denaturation process caused by the heating. The second aim of this experiment is to demonstrate the protein precipitation by the addition of alcohol (coagulation) or ammonium sulfate (salting out) in the collagen solution, showing the modification of protein solubility.

Resumo O primeiro objetivo desse experimento demonstrar a atividade enzimtica presente no abacaxi, essas atividades promovem a degradao do colgeno, adicionalmente o experimento mostra que a atividade proteoltica pode ser destruda pela fervura do suco de abacaxi, provavelmente devido ao processo de desnaturao protica causado pelo aquecimento. O segundo objetivo do experimento mostrar a precipitao protica pela adio de lcool (coagulao) ou sulfato de amnio (salting out) na soluo de colgeno, mostrando a alterao da solubilidade protica.

Introduo

Enzimas proteolticas ou proteases catalisam o rompimento das ligaes peptdicas em protenas. So enzimas da classe 3, as hidrolases, e subclasse 3.4, as peptdeo-hidrolases ou peptidases. Estas enzimas constituem uma grande famlia (EC 3.4), dividida em endopeptidases ou proteinases (EC 3.4. 21-99) e exopetidases (EC 3.4.11-19), de acordo com a posio da ligao peptdica a ser clivada na cadeia peptdica. Estas endopeptidases podem ser ainda subdivididas de acordo com o grupo reativo no stio ativo envolvido com a catlise em serina- (EC 3.4.21), cistena- (EC 3.4.22), asprtico-proteinases ou endopeptidases (EC 3.4.23) e metalloproteinases ou metalloendopeptidases (EC 3.4.24). As enzimas cujo mecanismo de ao no est completamente elucidado so classificadas no subgrupo EC. 3.4.99. Exopeptidases As exopeptidases atuam somente nos finais das cadeias polipeptdicas na regio N ou C terminal. Aquelas que atuam na regio amino terminal livre liberam um nico resduo de aminocido (aminopeptidases), um dipeptdeo (dipeptidil-peptidases) ou um tripeptdeo (tripeptidil-peptidases). As exopeptidases que atuam na regio carboxi terminal livre liberam um nico aminocido (carboxipeptidases) ou um dipeptdeo (peptidil-dipeptidases). Endopeptidases Endopeptidases atuam preferencialmente nas regies internas da cadeia polipeptdica, entre as regies N e C terminal. Tipos catalticos Segundo Barret, 1994 as proteases so classificadas em carboxipeptidases e as endopeptidases e so divididas em subclasses, tendo como base o seu mecanismo cataltico. As carboxipeptidases foram subdivididas em serino-, metalo- e cisteno- carboxipeptidases e as endopeptidases em serino-, cisteino-, asprtico- e metaloendopeptidases. Serino peptidases possuem um resduo de serina em seu centro ativo, enquanto as asprtico-peptidases tm duas unidades de cido asprtico no seu centro cataltico. Cisteno-proteases apresentam um aminocido cistena e as metalo-proteases usam um on metal no seu mecanismo cataltico.

 Proteases: funo e aplicao Proteases representam uma classe de enzimas com importantes papis em processos fisiolgicos. Alm disto, elas possuem aplicao comercial, estando entre os trs maiores grupos de enzimas industriais, sendo responsveis por 60% da venda internacional de enzimas. Estas enzimas esto envolvidas em processos biolgicos essenciais, como a coagulao sangunea, morte celular e diferenciao de tecidos. Vrias etapas proteolticas importantes ocorrem no mecanismo invasivo de tumores, assim como no ciclo de infeco de um grande nmero de vrus e microrganismos patognicos. Estes fatos tornam as proteases um alvo quimioterpico valioso para o desenvolvimento de novos compostos farmacuticos. As enzimas proteolticas tambm participam no catabolismo de protenas, tanto nas vias degradativas como nas biossintticas, e na liberao de hormnios peptdeos

farmaceuticamente ativos a partir de protenas precursoras. Certas modificaes especficas e seletivas de protenas durante a ativao de enzimas ocorrem via protelise, que tambm colabora no transporte de protenas secretrias na membrana. As proteases tm tambm uma variedade de aplicaes principalmente na indstria de detergentes e de alimentos. Tendo em vista os recentes acordos mundiais para uso de tecnologias no poluentes, as proteases comearam a ser usadas em larga escala no tratamento do couro, em substituio aos compostos txicos e poluentes at ento usados. Na indstria farmacutica, as proteases so usadas em pomadas cicatrizantes e tm um uso potencial para outros medicamentos. Proteases hidrolisam as protenas em peptdeos e aminocidos, facilitando a sua absoro pelas clulas; devido a seu papel despolimerizante, as enzimas extracelulares tm um papel importante na nutrio.

Objetivo Demonstrar a atividade proteoltica presente no suco de abacaxi, o efeito da desnaturao protica por temperatura e o efeito da alterao de solubilidade protica, e conseqente precipitao, provocados pela adio de lcool ou sal de amnio em soluo de gelatina (colgeno).

Materiais 8 tubos de ensaio de 20 mL 1 tubo de ensaio de 30 mL Estante para tubos de ensaio Bquer de vidro de 100 mL (para aquecer gua) Bquer de 25 ou 50 mL (para gua destilada) Funil de vidro pequeno e papel de filtro, tesoura para cortar o papel de filtro Recipiente com gelo Almofariz e pistilo Pipetadores automticos de 1,0 mL e ponteiras, ou pipetas de vidro de 5,0 mL Faca ou estilete Luvas de ltex Basto de vidro (para dissolver a gelatina) Placa aquecida ou banho-maria 100C Banho-maria 60C Banho-maria 30C Balana

Reagentes Soluo de sulfato de amnio 3 mol/L Etanol absoluto ou comercial 99,3 INPM Abacaxi maduro (1 fatia mdia) Gelatina incolor e sem sabor gua destilada Procedimento

Parte 1: Atividade enzimtica do suco de abacaxi e desnaturao protica por aquecimento.

Extrao do suco de abacaxi Uma fatia de abacaxi deve ser cortada em pequenos pedaos. A extrao do suco ser feita macerando-se os pedaos utilizando almofariz e pistilo. O suco deve em seguida ser filtrado utilizando funil de vidro e papel de filtro em um tubo de ensaio de 20 mL. O tubo dever ser armazenado no gelo.

Preparo da gelatina Pesar 2 g de gelatina incolor e sem sabor de qualquer marca comercialmente disponvel e dissolver em 20 mL de gua destilada, em tudo de ensaio de 30 mL, aps solubilizao a soluo de gelatina deve ser aquecida a 60C e mantida nessa temperatura at o uso.

Ensaio Primeiramente, deve-se preparar as amostras de abacaxi. Para isso, utilizando tubos de ensaio de 20 mL, deve-se pipetar 2,0 mL de gua no tubo 1 e 2,0 mL do extrato de abacaxi nos tubos 2, 3 e 4. O tubo 2 deve ser mantido temperatura ambiente, o tubo 3 aquecido 60C e o tubo 4 fervido por 5 minutos. Aps este tempo de tratamento de cada uma das amostras, resfriar no gelo imediatamente por 1 minuto. Aps o resfriamento das amostras fervidas adicionar em todos os tubos a soluo de gelatina. Homogneizar. Incubar as amostras por 10 minutos a 37oC e em seguida resfriar todas as amostras no gelo por 7 minutos, observar e anotar o resultado.

Tabela 1. Resumo do procedimento experimental.

Tubo 1
gua Amostra Abacaxi Amostra Abacaxi 60C Amostra Abacaxi Fervida Gelatina 2,0 mL 2,0 mL

Tubo 2
2,0 mL 2,0 mL

Tubo 3
2,0 mL 2,0 mL

Tubo 4
2,0 mL 2,0 mL

Parte 2: Precipitao de protenas. Pipetar nos tubos de ensaio de 20 mL os reagentes conforme a tabela 2, realizar o experimento em temperatura ambiente (~ 25C). Observar e anotar o resultado para posterior discusso.

Tabela 2. Resumo do procedimento experimental. Tubo 1 gua Sulfato de amnio Etanol Absoluto Gelatina 2,0 mL 2,0 mL Tubo 2 2,0 mL 2,0 mL Tubo 3 2,0 mL 2,0 mL

Anlise dos dados:

1. Prepara uma tabela indicando os resultados observados de cada experimento. 2. Tirar uma fotografia dos resultados para anexar ao relatrio como figura. 3. Discutir o efeito do suco de abacaxi sobre o colgeno (gelatina). 4. Discutir o efeito da temperatura sobre as enzimas (proteases) presentes no suco do abacaxi. 5. Discutir o efeito do etanol e do sulfato de amnio sobre as protenas em soluo. Qual o princpio de cada efeito.

Para discusso:

1. Pesquisar: qual(is) protease(s) est(o) presente(s) no suco de abacaxi. 2. Como poderia ser realizada a purificao dessa(s) protena(s)? 3. A atividade das proteases pode ser otimizada? Como? 4. Discuta o efeito da temperatura sobre a desnaturao de protenas no processo de cozimento dos alimentos, qual a importncia disso? 5. Por que se pode utilizar abacaxi para amaciar carnes? Qual a relao entre o suco do abacaxi e os amaciantes de carnes comerciais.

Referncias Bibliogrficas URL: http://www.protease.ufrj.br/ProteaseApres.htm Rawling, N.D., Barret, A. 1994. Families of serine peptidases. Meth. Enzymol. 244:18-61. Rawling, N.D., Barret, A. 1994. Families of cysteine peptidases. Meth. Enzymol. 244:461486. Rawling, N.D., Barret, A. 1994. Families of aspartic peptidases, and those of unknown mechanism. Meth. Enzymol. 248:105-120. Rawling, N.D., Barret, A. 1994. Families of metallopeptidases. Meth. Enzymol. 248:183-228. Francisco Jr, W.E. et Francisco W. Protenas: hidrlise, precipitao e um tema para o ensino de qumica. Qumica Nova na Escola, 24, 2006.

Experimento 5 - Extrao e Caracterizao de Lipdios

Abstract The aim of this experiment is to introduce the students of the Federal University of ABC to the procedures related to the extraction and characterization of lipids employing soybean as a source of triacylglycerol, one type of biologic lipids. Furthermore the students will learn the saponification concept through the alcaline hydrolysis of soybean triacylglycerol and the physical and chemical properties of the soap obtained will be exploited.

Resumo O presente experimento visa introduo dos alunos de Bacharelado em Cincias e Tecnologia, da Universidade Federal do ABC, s tcnicas de extrao e caracterizao de lipdios utilizando soja como fonte de triacilgliceris, um dos tipos de lipdios biolgicos. Adicionalmente, ser abordado o conceito de saponificao, demonstrado atravs da hidrlise alcalina dos triacilgliceris obtidos da soja, e sero exploradas as propriedades fsicoqumicas dos sabes.

Introduo Os lipdios so representados por um grupo de biomolculas baixa massa molecular que apresentam estruturas qumicas bastante variadas e so praticamente insolveis em gua. A diversidade de estruturas apresentadas pelos lipdios faz com que esses compostos tenham a capacidade de exercer diversas funes biolgicas atuando desde componentes de membranas celulares, isolantes trmicos, sinalizadores celulares, pigmentos e reservas de energia (leos e gorduras). Adicionalmente, os prprios lipdios ou seus derivados, podem tambm exercer funes de vitaminas e hormnios. As principais classes de compostos pertencentes ao grupo dos lipdios so os triacilgliceris, glicerofosfolipdeos, esfingolipdios, glicolipdios e esterides (Figura 1).

(A)

(B)

Figura 1. As principais classes de lipdios biolgicos. Em (A) todos os lipdios mostrados apresentam glicerol ou esfingosina, estrutura central, ligados a cidos graxos. (B) Estrutura de trs hormnios esterides.

Tipicamente, os lipdios apresentam em suas estruturas longas cadeias carbnicas, como os cidos graxos e isoprenos, ou mltiplos anis interligados, como no caso dos esterides. Vrias classes de lipdios apresentam cidos graxos como componentes estruturais. cidos graxos so cidos monocarboxlicos, molculas anfipticas que apresentam uma regio polar, representada pelo grupo carboxila (ionizado em pH neutro), e uma regio apolar, representada por uma cadeia carbnica com comprimento variando entre 4 a 36 tomos de carbono (Figura 2). Estruturalmente, a cadeia carbnica dos cidos graxos caracterizada pela presena de nmero par de carbonos formando uma estrutura no ramificada que pode ser saturada ou conter uma, duas ou mais insaturaes.

Grupo carboxila

Insaturao Cadeia carbnica

(A)

(B)

Figura 2. Estrutura de cidos graxos. Os cidos graxos so compostos anfipticos formados por uma longa cadeia carbnica apolar e um grupo carboxila polar. As cadeias carbnicas dos cidos graxos no possuem ramificaes e podem ser saturadas, como no caso do cido esterico, (A) ou insaturadas, como no caso do cido oleico (B).

Lipdios como triacilgliceris, fosfolipdios, glicolipdios e esfingolipdios apresentam cidos graxos esterificados em suas estruturas. Uma das funes mais importantes dos cidos graxos nas clulas a participao na construo das membranas celulares, finas camadas lipdicas que circundam todas as clulas e suas organelas internas. As membranas celulares so compostas em grande parte por fosfolipdios, pequenas molculas constitudas principalmente por cidos graxos e glicerol. Outra importante funo desempenhada pelos cidos graxos est associada manuteno de uma reserva energtica celular. De fato, os cidos graxos podem ser estocados no citoplasma celular na forma de gotculas lipdicas constitudas por molculas de triacilgliceris. Os triacilgliceris, tambm conhecidos como triglicerdeos, triglicrides ou gorduras neutras, representam os lipdios mais abundantes na natureza sendo formados pela esterificao de trs cidos graxos a uma molcula de glicerol. este estabelecimento de ligaes ster entre os precursores polares dos triacilgliceris (hidroxilas do glicerol e carboxilas dos cidos graxos) que confere ao composto carter essencialmente apolar, permitindo com que seja armazenado nas clulas de forma praticamente anidra (Figura 3).

Glicerol

Triacilglicerol

Figura 3. Triacilglicerois so compostos apolares resultantes da formao de ligaes ster entre as hidroxilas livres de uma molcula de glicerol e os grupos carboxila dos cidos graxos.

As gorduras animais e leos vegetais so misturas de triacilgliceris, que diferem na sua composio em cidos graxos e, conseqentemente, no seu ponto de fuso. Os triacilgliceris das gorduras animais so ricos em cidos graxos saturados, o que atribui a esses lipdeos uma consistncia slida temperatura ambiente. J os triacilgliceris origem vegetal so ricos em cidos graxos poliinsaturados sendo, portanto, lquidos temperatura ambiente. Os leos vegetais so utilizados para a fabricao de margarinas atravs de um processo de hidrogenao que reduz parte de suas duplas ligaes e os torna slidos temperatura ambiente. cidos graxos saturados Cadeia carbnica no apresentam ligaes duplas entre os tomos de carbono e, assim, contem o nmero mximo possvel de hidrognios.

cidos graxos insaturados Cadeia carbnica possui uma ou mais ligaes duplas entre tomos de carbono contendo o nmero mximo possvel de hidrognios. Os lipdios anfipticos, tais como os cidos graxos, quando so adicionados a um meio

aquoso,

tendem

agregar-se,

organizando-se

espontaneamente

em

estruturas

plurimoleculares. Essas estruturas permitem maximizar as interaes hidrofbicas entre as cadeias carbnicas, isolando-as da gua, e deixar os grupos polares em contato com o solvente, com o qual podem interagir. Tais arranjos moleculares constituem o estado de

menor energia livre para esses lipdios em gua e resultam da presena de duas regies com solubilidades diferentes na mesma molcula. O tipo de estrutura formada determinado pela geometria da molcula do lipdio anfiptico (Figura 4). Lipdios com uma nica cadeia carbnica, como sabes de detergentes, devido a forma cnica e afilada de suas molculas, formam, preferencialmente, micelas. Nesta estrutura esfrica, as cadeias carbnicas organizam-se no interior, isolando-se da gua, e os grupos polares posicionam-se na superfcie externa, interagindo com o solvente. A formao de micelas uma etapa importante na digesto dos lipdios da dieta. A maioria dos fosfolipdios e glicolipdios associam-se em uma camada dupla de molculas, chamada bicamada lipdica. Esta estrutura permite uma agregao mais estvel das molculas desses lipdios, que tm forma cilndrica pela presena de duas cadeias apolares. As molculas de lipdios alinham-se lado a lado, compondo duas monocamadas e as cadeias carbnicas das monocamadas agrupam-se frente a frente de modo a criar um domnio hidrofbico no meio da bicamada; os grupos hidroflicos dispem-se na superfcie das duas faces da bicamada, interagindo com a gua. Bicamadas lipdicas tendem a se converter em estruturas fechadas, chamadas lipossomos, que so mais estveis porque no apresentam caudas hidrofbicas expostas ao solvente, como acontece na periferia das bicamadas planas. Lipossomos so, portanto, vesculas sintticas esfricas formadas por uma bicamada lipdica contnua, que delimita uma cavidade interna preenchida por solvente.

Cavidade Aquosa

(A) Micela

(B) Bicamada Lipdica

(C) Lipossomo

Figura 4. Estruturas formadas por lipdios anfipticos em meio aquoso. (A) Micelas so formadas por molculas de lipdios com uma nica cadeia carbnica, cadeias estas que se localizam no interior dessas estruturas. (B) Bicamada lipdica uma estrutura bidimensional na qual as cadeias carbnicas formam um domnio central hidrofbico, isolando-se da gua, exceto nas extremidades da bicamada; a estrutura comumente formada por lipdios anfipticos com duas cadeias de hidrocarbonetos. (C) Liposssomo uma vescula oca, resultante do fechamento de uma bicamada lipdica, dotada de uma cavidade central preenchida por solvente.

1. Fundamentao Terica Os lipdios representam um grupo de compostos com estrutura bastante variada. Vrias classes de lipdios apresentam cidos graxos como componentes estruturais entre eles, os fosfolipdeos, glicolipdeos e os triacilgliceris. Os lipdios podem ser caracterizados por suas propriedades fsico-qumicas. Em geral, so praticamente insolveis em gua enquanto apresentam alta solubilidade em solventes orgnicos como clorofrmio, ter, benzeno, mistura de Folch (clorofrmio:metanol), entre outros. Os triacilgliceris, que constituem o principal grupo de lipdios, podem ser hidrolisados liberando cidos graxos e glicerol. Se esta hidrlise feita mediante aquecimento em meio alcalino (hidrlise alcalina), formam-se sais de cidos graxos (sabes) e o processo chamado saponificao (Figura 5). Este o princpio da fabricao dos sabes a partir de gordura animal fervida em presena de NaOH ou KOH.

Triestearina

Glicerol

Estearato de Sdio

Figura 5. Hidrlise alcalina de triacilgliceris. Triacilgliceris, mediante aquecimento em presena de bases fortes, como hidrxido de sdio (NaOH) ou hidrxido de potssio (KOH), sofrem hidrlise produzindo sais de cidos graxos (sabes). No esquema acima mostrada a hidrlise do triestearina na presena de NaOH dando origem a glicerol e sal sdico (estereato de sdio).

Assim como os cidos graxos, os sabes so molculas anfipticas apresentando em sua estrutura uma longa cadeia carbnica (cauda apolar, lipoflica) e um grupo carboxilato (cabea polar, hidroflica). Dessa maneira, os sabes, quando em soluo aquosa, associam-se por interaes hidrofbicas entre as caudas apolares formando um uma pelcula lipdica na superfcie do liquido ou dando origem a estruturas como as micelas (Figura 6).

Pelcula lipdica

Grupo carboxilato Cadeia carbnica

Sabo

Micela

Figura 6. Formao de micelas a partir das interaes entre sabes dispersos em soluo aquosa.

Propriedades dos sabes: Sob condies especficas, os cidos graxos dos sabes podem ser precipitados. A adio de cidos fracos, como cido actico, leva a formao de cidos graxos insolveis por causa do baixo grau de dissociao (Figura 7).

OLEATO DE POTSSIO

CIDO ACTICO

CIDO OLICO (precipita)

ACETATO DE POTSSIO

Figura 7. Precipitao de cidos graxos a partir da hidrlise cida de sabes. Em presena de cido actico (cido fraco), cido olico (cido graxo) precipitado a partir da hidrlise cida do oleato de potssio (sabo).

Os sabes precipitam quando so usados em guas ricas em sais de clcio ou magnsio (guas duras). Os ons clcio e magnsio da gua reagem com cidos graxos formando sais insolveis. Os sabes tambm podem precipitar pela adio de excesso de eletrlitos, os quais reprimem a dissociao dos sabes, fazendo com que as micelas percam a carga e precipitem.

OLEATO DE POTSSIO

CLORETO DE CLCIO

OLEATO DE CLCIO (precipita)

CLORETO DE POTSSIO

Figura 8. Reao de precipitao de sabo atravs de salificao. A exposio de sabes, como o oleato de potssio, ambientes ricos em sais de clcio ou magnsio induz a formao de sabes insolveis.

Os sabes possuem propriedades emulsificantes. Emulso a mistura entre dois lquidos imiscveis em que um deles (fase dispersa) encontra-se na forma de pequenos glbulos dispersos em meio ao outro (fase contnua). Minsculas partculas de leo ou solventes orgnicos so sustentadas em suspenso numa soluo aquosa. Porm, quando as duas fases so misturadas ou agitadas vigorosamente, essas partculas formam uma emulso onde os leos ou os solventes orgnicos tendem a dispersar-se pela soluo. Com o tempo, as emulses tendem a retornar para o estado estvel podendo se observar duas ou mais fases distintas (Figura 9A). Os sabes so agentes emulsificantes, pois quando adicionados s emulses, tendem a torn-las mais estveis e homogneas (Figura 9B).

(A)
AGITAO TEMPO

MISTURA

EMULSO

MISTURA

SABO

(B)
AGITAO

MICELA MISTURA EMULSO

Figura 9. Propriedade emulsificante dos sabes. Uma mistura de dois lquidos imiscveis pode formar uma emulso atravs de agitao (fornecimento de energia). Contudo, as emulses so instveis e tendem a tornar-se misturas com o passar do tempo (A). Os sabes agem como surfactantes estabilizando a emulso formada atravs da formao de micelas com leos ou solventes orgnicos. As cadeias hidrocarbnicas no-polares dos sabes dissolvem-se no leo ou solvente orgnico enquanto os grupos inicos polares na fase aquosa. As gotculas carregadas negativamente repelem-se mutuamente (B).

Curiosidade: Um subproduto da manufatura de sabes a glicerina (glicerol), da qual se pode obter a nitroglicerina, um poderoso explosivo. Durante a I e II Guerras Mundiais, as donas de casa guardavam o excesso de leo e gorduras de cozinha e o devolviam para a recuperao da glicerina.

2. Objetivos da aula A aula apresenta como objetivo a extrao de leo de soja, a saponificao do leo extrado e a caracterizao das propriedades fsico-qumicas dos sabes. Para isso devero ser realizados os seguintes procedimentos: I- Extrao do leo de soja Obteno de leo (triacilgliceris) a partir de sementes de soja. Determinao da solubilidade do leo de soja em diferentes solventes;

II- Saponificao do leo extrado Obteno de sais de potssio de cido graxo (sabes) a partir da hidrlise alcalina dos triacilgliceris obtidos das sementes de soja.

III- Caracterizao das propriedades fsico-qumicas dos sabes Precipitao de cidos graxos atravs de hidrlise cida; Purificao de sabo atravs de salificao; Propriedade emulsificante dos sabes; Ressaponificao a partir de cidos graxos.

Materiais 1. Reagentes leo de soja Soja moda e seca gua destilada Etanol ter etlico Acetona Hidrxido de potssio Hidrxido de sdio Fenolftalena cido clordrico Cloreto de Sdio 2. Materiais e vidrarias Liquidificador Balana analtica Banho de aquecimento fervente ( 50C e 100C) Estante para tubos de ensaio Pina de madeira Pipeta graduada de 10 mL Pipetador automtico e ponteiras de 1000 L Conta gotas ou pipeta de Pasteur Esptula para pesagem Proveta de 25 mL

 Tubos de ensaio Bquer de 100 mL Bquer de 10 mL

Erlenmeyer de 125 mL Papel de filtro

3. Procedimento experimental

3.1. Extrao de leo vegetal da soja. 1. Em um bquer de 100 mL (bquer A), pesar 10 g de soja moda e seca. 2. Adicionar 25 mL de acetona e agitar por 5 minutos. 3. Pesar um segundo bquer (bquer B) e anotar sua massa. 4. Utilizando o bquer B e papel de filtro, filtrar a soluo obtida no bquer A. 5. Lavar o resduo obtido com 10 mL de acetona uma vez. 6. Evaporar o filtrado em chapa de aquecimento (200C), com agitao peridica, at a eliminao da acetona. Ao final, ser obtido um resduo amarelo e viscoso. 7. Determinar o peso do produto obtido na etapa anterior e calcular o rendimento da extrao.

3.2. Solubilidade do leo de soja. 1. Numere 4 tubos de ensaio e coloque 1 mL dos seguintes solventes: gua, etanol, ter etlico e acetona. 2. Adicione 1,0 mL de leo de soja a cada tubo e agite-os. Classifique os solventes segundo a solubilidade apresentada pelo leo de soja.

TUBO 1 2 3 4

SOLVENTE gua etanol ter etlico acetona

SOLUBILIDADE (+, ++, +++ ou ++++)

3.3. Reao de saponificao. 1. Preparar uma soluo de potassa alcolica 20% Em um erlenmeyer de 125 mL, misture 10 mL de soluo aquosa de hidrxido de potssio (KOH) 40% a 10 mL de etanol.

2. Adicionar 5,0 mL de leo vegetal a soluo de potassa alcolica e aquecer o sistema em banho-maria FERVENTE durante 20 minutos. 3. Em um tubo de ensaio, adicionar 2 gotas da soluo obtida a 2,0 mL de gua destilada. Agitar. Observe se h ou no formao de espuma e explique. 5. Esquematize a reao de hidrlise alcalina de um triacilglicerol na presena de hidrxido de sdio e, alternativamente, na presena de hidrxido de potssio. 6. Esquematize uma molcula de sabo.

3.4. Separao de cidos graxos. 1. Transferir 4,0 mL do erlenmeyer contendo o sabo para um tubo de ensaio. 2. Adicionar 1 gota de fenolftalena (indicador de pH). 3. Manter o tubo de ensaio EM AGITAO e colocar, gota a gota, cido clordrico (HCl) concentrado at que a soluo mude de colorao (rosa para incolor) indicando a viragem do indicador. 4. Observe a diviso da mistura em duas fases. Que compostos representam cada uma das duas fases? Esquematize a reao ocorrida. 5. Reserve a soluo para teste posterior (item 3.5)

3.5. Ressaponificao. 1. Transferir 4 gotas da soluo obtida no item 3.4 para um tubo de ensaio contendo 5 mL de gua destilada quente. 2. Adicionar, gota a gota, soluo de hidrxido de sdio (NaOH) 1 mol.L-1 ate que seja solubilizada a parte oleosa. 3. Agitar o tubo e verificar se h formao de espuma. 4. Explicar a reao qumica ocorrida, seu mecanismo de ao e indicar o produto formado.

3.6. Propriedades emulsificantes dos sabes. 1. Agitar 5 gotas de leo de soja num tubo de ensaio contendo 5 mL de gua. Observe a formao temporria de uma emulso gua-leo. 2. Repetir o mesmo teste, adicionando 5 gotas de sabo (obtido no item anterior) antes de agitar. O que acontece com a emulso gua-leo? 3. Comparar a aparncia das duas emulses obtidas no 1 e 2 passos. Anlise dos dados

1) Tabela apresentada no item 3.1 com os respectivos valores de solubilidade do leo de sojas nos diferentes solventes utilizados. 2) Resultado do rendimento da reao de extrao de leo da soja. Esquematizar frmula utilizada para o clculo. 3) Esquema da reao de saponificao do leo de soja em presena de KOH. 4) Esquematizar uma molcula de sabo e discutir suas propriedades fsico-qumicas: - Mostrar a reao de formao de cidos graxos a partir de sabes em meio cidos. - Mostrar a reao de precipitao de sabes em solues rica em sal. - Esquematizar uma molcula de sabo e discutir suas propriedades fsico-qumicas. - Esquematizar e caracterizar uma reao de ressaponificao.

Exerccios 1. Como podem ser explicadas as diferenas de solubilidade do leo de soja nos diferentes solventes usados no experimento? 2. Qual a importncia da determinao da solubilidade do leo de soja em diferentes solventes para a parte de extrao de leo vegetal a partir da soja? 3. Por que se utiliza etanol na reao de saponificao? 4. Se o sabo feito de leos e gorduras, como capaz de limpar superfcies engorduradas? Como o sabo remove a sujeira?

Referncias Bibliogrficas 1. MARZZOCO, A.; TORRES, B. B. Bioqumica Bsica, 3 ed., Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2007. 2. ALBERTS, B.; JOHNSON, A.; LEWIS, J.; RAFF, M.; ROBERTS, K.; WALTER, P. Molecular Biology of the Cell, 5 ed., Garland Science, New York, 2008. 3. LEHNINGER, ALBERT L.; NELSON, DAVID L.; COX, MICHAEL M. Princpios de bioqumica, 4 ed., So Paulo: Sarvier, 2006. 4. NEPOMUCENO, M. F.; RUGGIERO, A. C. Manual de Bioqumica: Roteiros de Anlises Bioqumicas Qualitativas e Quantitativas, 1 ed., Ribeiro Preto: Tecmedd, 2004. 5. PETKOWICZ, I.; DE OLIVEIRA, C. L. Bioqumica: Aulas Prticas, 7 Ed., Editora UFPR, Paran, 2007.

Experimento 6 - Extrao e Caracterizao Bioqumica do Amido da Batata: Reao com Iodo e Poder Redutor de Carboidratos

Abstract

In this experiment the extraction and purification of the polysaccharide starch from potatoes will be performed. After the microscopic characterization of the starch granules morphology, biochemical reactions using iodide will be performed at several experimental conditions. Besides, a qualitative analysis of reducing power of starch will be done in comparison with glucose. The observed results will be discussed in terms of chemical structure of the polymer. This practical application of the theoretical concepts learned inside the classes about the spatial structure of starch is helpful for the improvement of biochemistry understanding of UFABC students.

Resumo

Nesta aula prtica os alunos realizaro a extrao e purificao do amido da batata. Aps a caracterizao microscpica dos grnulos de amido, observando a morfologia especfica, sero feitas reaes bioqumicas de caracterizao utilizando iodo em diversas condies experimentais. Alm disso, uma anlise qualitativa do poder redutor do amido ser feita em comparao com a glicose e a sacarose. Os resultados obtidos sero discutidos em funo da estrutura qumica espacial adquirida em meio aquoso por este polissacardeo. Este experimento permite a aplicao dos conceitos tericos adquiridos durante as aulas sobre a conformao espacial do amido extremamente importante para o aprendizado de bioqumica estrutural pelos estudantes da UFABC.

Introduo O amido um polissacardeo que tem como funo reserva energtica na forma de carboidratos em plantas, que so consumidas por organismos heterotrficos como principal fonte de glicose para gerao de ATP (LEHNINGER, NELSON, & COX, 2006). O amido constitui de 50% a 65% do peso das sementes de cereais secos, e at 80% da substncia seca dos tubrculos. Nos pases europeus e nos Estados Unidos, mais de 50% da produo de amido destinada produo de hidrolisados, tais como glicose, maltose, dextrinas e maltodextrinas. Esses hidrolisados, por suas propriedades especficas e seus diferentes usos no setor alimentcio, constituem uma excelente valorizao da fcula (SUMERLY et al., 2002). Embora a distribuio do amido seja ampla no reino vegetal, poucas plantas o produzem em grandes quantidades. Milho e outros cereais, como o arroz, o sorgo e o trigo, contribuem significativamente para o suprimento mundial de amido. Nos Estados Unidos mais de 95% do amido comercializado proveniente do milho. Em muitos pases, como por exemplo, no Brasil, o amido tambm extrado da batata, dos rizomas da araruta e das razes da mandioca. Comercialmente, o amido usado na alimentao, fabricao de xaropes, preparo de colas e gomas, com excipiente farmacutico, na fabricao de etanol, entre outros. O amido ocorre em grnulos (ou gros) que tm estrias tpicas. Estas, aliadas ao tamanho e forma dos grnulos, so especficas de cada espcie de planta e esta caracterstica morfolgica pode servir de meio de identificao microscpica da origem botnica do amido (Fig. 1).

Fig. 1 Microscopia eletrnica de varredura (MEV) esquerda e microscopia ptica direita de um grnulo de amido. (fonte: http://www.cheng.cam.ac.uk/research/groups/polymer/RMP/nitin/Granule.jpg).

Estruturalmente, o amido classificado como um homopolissacardeo, sendo que a hidrlise de suas ligaes glicosdicas fornece unidades de glicose livres. Tal hidrlise pode ser qumica ou enzimtica e a glicose formada que pode ter diversos destinos, variando desde uma aplicao biolgica, sendo fundamental fonte de energia para as clulas vivas sendo convertida em ATP por reaes catablicas oxidativas, at aplicaes biotecnolgicas, servindo como fonte de carboidratos para reaes fermentativas para produo de etanol em indstrias qumicas, de alimentos, de bebidas ou de combustveis. Fundamentao Terica O amido um polissacardeo sintetizado pelos vegetais e tem a funo de reserva energtica, semelhante ao glicognio nas clulas animais. Estruturalmente, o amido formado pela mistura de dois polmeros, a amilose e a amilopectina, que so homopolissacardeos constitudos por resduos de -D-glicopiranose ligados entre si por ligaes glicosdicas. A amilopectina constitui aproximadamente 80% do peso seco dos polissacardeos existentes no gro de amido e menos hidrossolvel que a amilose. formada por resduos de -D-glicose unidos entre si por ligaes glicosdicas (14) com ramificaes (16), enquanto que a amilose no possui tais ramificaes, formando um polmero linear (Fig. 2).

AMILOSE
CH2OH O H H OH H O H H H OH H O CH2OH O H

OH

OH

ligao 14
CH2OH O H H OH H O H OH CH2 O H H OH H O H H H OH H O H

AMILOPECTINA
ligao 16
CH2OH O H

OH

OH

ligao 14

Fig. 2 Estruturas qumicas da amilose e amilopectina, evidenciando as ligaes glicosdicas.

Os tipos de ligaes presentes na amilose e amilopectina foram esses polmeros a adquirem uma conformao espacial helicoidal (Fig. 3). Estas estruturas compactas produzem os grnulos densos de estocagem do amido, j mostrados na Fig. 1.

Fig. 3 Representao da estrutura helicoidal de uma cadeia de amilose, polmero que compe a estrutura do amido (fonte: LEHNINGER, NELSON & COX, 2006).

O amido tem estrutura qumica muito parecida com o glicognio, porm possui menos ramificaes. Sua sntese em plantas tambm bastante semelhante sntese do glicognio em animais, com a substituio da forma ativada da glicose de UDP-glicose por ADP-glicose, com catlise pela enzima amido sintase. No processo de digesto, a hidrlise do amido catalisada enzimaticamente pelas -amilases salivar e pancretica, que clivam as ligaes glicosdicas 14 da amilose originando uma mistura de maltose, amilopectina e glicose, e tambm as ligaes 14 da amilopectina, originando uma mistura de polissacardeos denominados dextrinas. Os monossacardeos so definidos como poli-hidroxialdedos ou poli-hidroxicetonas ou compostos que os liberem por hidrlise. Apresentam a frmula geral [C(H2O)]n e apresentam uma propriedade qumica muito importante em meio aquoso devido reatividade ca carbonila: ciclizao em meio aquoso. Este processo de ciclizao leva a formao de um carbono anomrico, sendo que a hidroxila formada ligada a esse carbono apresenta propriedades redutoras. Diversos reagentes so utilizados para a anlise de poder redutor em acares. Alguns desses mtodos utilizam agentes oxidantes suaves, tais como ons frrico (Fe3+) e cprico (Cu2+) em meio alcalino, fazendo deteco qualitativa. Mtodos quantitativos utilizam tcnicas espectrofotomtricas, titulomtricas ou gravimtricas (SILVA et al., 2003). Dissacardeos ligados pelas suas hidroxilas redutores como o caso da sacarose no apresentam poder redutor, porm quando hidrolisados passam a exibir esta caracterstica.

Tais propriedades so muito importantes e, por muitas vezes, utilizadas para identificao de acares, verificao de adulterao e falsificao de alimentos, entre outros.

Objetivo

Permitir a compreenso de processos de extrao do amido da batata e, aps etapa de purificao e secagem, realizar sua caracterizao bioqumica. Para isso, so propostos os seguintes objetivos especficos: - extrair e purificar o amido da batata; - realizar observao morfolgica por microscopia ptica; - fazer a reao de identificao com iodo, variando condies de temperatura, utilizando tubos abertos e tampados; - fazer a reao qualitativa de identificao de acares redutores no amido utilizando o reagente de Benedict, em comparao com solues de glicose e sacarose.

MATERIAIS E MTODOS 1. Reagentes - batatas in natura; - gua destilada; - lugol; - reagente de Benedict; - soluo de glicose 1,0 % (m/v); - soluo de sacarose 1,0 % (m/v); - suspenso de amido 1,0 % (m/v); 2. Materiais e Vidrarias - liquidificador; - bquer 200 mL; - gaze; - estufa de secagem; - papel de filtro; - bomba de vcuo; - funil de Bchner; - balana analtica;

- papel de pesagem (ou vidro de relgio) e esptulas; - proveta 50 mL; - estante para tubos de ensaio; - 5 tubos de ensaio, um deles com tampa; - bico de Bunsen; - banho de aquecimento fervente (~ 100C); - pipetador automtico e ponteiras de 500 e 1000 L; - conta-gotas ou pipeta de Pasteur; - pina de madeira

3. Procedimento Experimental

3.1. Extrao do amido da batata (j realizado previamente pelo tcnico de laboratrio). Homogeneizar 50g de batata descascada em liquidificador com 200 mL de gua destilada. Filtrar em gaze dobrada, recolhendo a suspenso de amido em um bquer. Deixar o amido depositar no fundo do bquer (~ 5 min). Desprezar cuidadosamente o sobrenadante. Adicionar cerca de 100 mL de gua. Agitar, deixar decantar (~5 min), remover o sobrenadante. Repetir esse procedimento de lavagem por 5 vezes. Juntar ao amido 200 mL de gua destilada, filtrar em Bchner e deixar secar em estufa.

3.2. Preparo da suspenso de amido. Pesar 0,5 g do amido seco e ressuspender em 50 mL de gua destilada (suspenso de amido 1,0 % (m/v)).

3.3. Exame microscpico dos grnulos de amido. Adicionar 2 mL desta soluo em 2 tubos de ensaio numerados 1 e 2. Ferver um deles at que a soluo fique opalescente, agitando sempre. Pingar uma gota das solues dos tubos 1 e 2 um uma lmina, cobrir com uma lamnula e observar em microscpio ptico. Pingar uma gota de lugol e observar novamente em microscpio ptico.

3.4. Reao de caracterizao com iodo. Tomar 4 tubos de ensaio, sendo um deles com tampa, e adicionar em dois deles (sendo um com tampa) 1 mL de amido 1 % (m/v) e nos demais 1 mL de gua destilada e 1 mL de glicose 1 % (m/v). Em seguida, adicionar 1 gota da soluo de lugol em cada um dos tubos de ensaio e observar o resultado. Aquecer cuidadosamente o tubo tampado contendo amido (direto na chama) e observar o resultado. Deixar o tubo resfriar e observar o resultado. Repetir o procedimento para o tubo sem tampa contendo amido e anotar o resultado. ***CUIDADOS ESPECIAIS: 1. O tubo com tampa

deve estar com a mesma pouco (frouxa) e no muito apertada. 2. O aquecimento direto na chama deve ser feito com auxlio da pina, com quantos ciclos forem necessrios (CADA CICLO: no mximo 2 segundos na chama agitao fora da chama).

3.5. Pesquisa de poder redutor. Tomar 4 tubos de ensaio e seguir procedimento abaixo: Tubos B 1* 2* 3* Amostras (mL) 1,0 1,0 1,0 H2O (mL) 1,5 0,5 0,5 0,5 Benedict (mL) 1,0 1,0 1,0 1,0

*onde, 1, 2 e 3 so as amostras numeradas fornecidas para o experimento.

Em seguida, ferver os tubos em banho-maria por 5 minutos e observar as possveis alteraes. Sabendo que entre as amostras 1, 2 e 3 tratam-se de glicose, amido e sacarose, identifique as amostras em funo da colorao observada e discuta os resultados.

BIBLIOGRAFIA
1

LEHNINGER, A. L.; NELSON, D. L.; COX, M. M. Princpios de Bioqumica, 4. ed. New York: Worth Publishers, 2006, p.685-686.
2

SUMERLY, R.; ALVAREZ, H.; CEREDA, M.P.; VILPOUX, O.F. Tecnologia, usos e potencialidades de tuberosas amilceas latino-americanas. Em: Culturas de tuberosas amilceas latino-americanas. v. 3, p. 377-448, 2002.
3

SILVA, R.N.; MONTEIRO, V.N.; ALCANFOR, J.D.X.; ASSIS, E.M.; ASQUIERI, E.R. Comparao de Mtodos para a Determinao de Acares Redutores e Totais em Mel. Cin. Tecnol. Aliment., v. 23, n. 3, p. 337-341, 2003.