UNIVERSIDADE FEDERAL DO PAR

DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA
LABORATRIO DE GENTICA HUMANA E MDICA
CURSO DE ESPECIALIZAO EM GENTICA FORENSE
SEMINRIO
DNA MITOCONDRIAL
Docente: ndrea Kely Campos Ribeiro dos Santos
Discentes: Andrea Cristina SantAna
Alessandra Paiva Puertas Alves
Outubro/2005
1
DNA MITOCONDRIAL
Dentre as organelas presentes no citossol da clula dos organismos superiores
encontram-se as mitocndrias! S"o respons#veis pelo processo de respira$"o celular%
possuindo um taman&o variando de '%( a 1%' )m de di*metro e (%' a 1' )m de comprimento!
S"o consideradas aut+nticas ,#bricas de produ$"o da energia necess#ria para o bom
,uncionamento da clula! Pode-se acrescentar ainda -ue s"o em si% providas de uma carga
gentica pr.pria% o D/A mitocondrial 0mtD/A1 0D2 R342R56S% 7''81!
Di,erente do D/A nuclear -ue ,orma longas ,itas% constitu9das cada uma por dupla
&lice e -ue codi,icam apro:imadamente 1''!''' genes% o mtD/A representa de 1 a 7; do
D/A celular% em duplo ,ilamento circular% codi,icando 8< genes! 2le codi,ica
apro:imadamente 1'; das prote9nas constitutivas das mitocndrias% como conse-=+ncia% para
um bom ,uncionamento destas% necess#ria uma boa coopera$"o entre o D/A nuclear e o
D/A mitocondrial!
3 mtD/A n"o tem nada de especial em sua composi$"o -u9mica -ue o di,erencie do
D/A nuclear% entretanto% possui um c.digo gentico pr.prio! Por outro lado sua organi>a$"o
grandemente econmica% ?# -ue somente 1'; de sua totalidade n"o codi,icante! Seu
genoma &apl.ide devido sua &eran$a ser estritamente materna% por isso n"o est# submetido a
processos de recombina$"o! 3 mecanismo pelo -ual a mitocndria paterna e:clu9da do
embri"o logo ap.s a ,ertili>a$"o ainda n"o est# bem esclarecida% tendo permanecido obscuro o
mecanismo de elimina$"o 0@6A2S et al% 1BC'D CA// et al, 1BC<1!
2ste D/A se encontra entre as menores molculas de D/A% circular com um
taman&o de 1E!(EB pares de base 0Figura 11% tendo sido completamente se-=enciado por
Anderson et al. 01BC11! 3 mesmo autor ainda assinalou a todos os genes mitocondriais suas
,un$Ges e seus produtos g+nicos% incluindo 18 prote9nas% 7 rR/As e 77 genes tR/A!
As ,itas de D/A mitocondrial tem uma distribui$"o assimtrica de guaninas e
citosinas% o -ue gera uma cadeia pesada 0H1 e outra leve 0A1! Cada ,ita transcrita a partir de
um promotor PA e PH1% locali>ados na regi"o controle% na -ual se inclui o D-Aoop 0Figura 71%
-ue uma regi"o gerada pela s9ntese de um segmento curto da cadeia pesada H denominado
7
<SD/A% onde se encontra a origem da replica$"o da cadeia H! 2sta regi"o muito importante
do ponto de vista ,orense% devido ser uma regi"o &ipervari#vel e su,icientemente pe-uena para
ser abordada por meio de se-=enciamento por PCR 0@I2S% 7''81!
Figura 01- Dupla cadeia de DNA mitocondrial, cadeia pesada (H) e cadeia leve (L)
Figura 02 - Duplicao do mtDNA, formando ala D-Loop na cadeia pesada.
Devido sua grande variabilidade% a regi"o controle a -ue normalmente se analisa!
Jede apro:imadamente 1!1'' pares de base e se subdivide em duas regiGes maioresK a regi"o
&ipervari#vel 1 0HL61% -ue compreende as posi$Ges 1E!'7M N 1E!'8(% e a regi"o &ipervari#vel
8
66 0HL661% -ue compreende as posi$Ges <8 a 8M' e uma regi"o &ipervari#vel menor 0HL6661 !
Convencionou-se iniciar a numera$"o nucleot9dica da mitocndria na regi"o controle% de
modo -ue esta regi"o compreende as posi$Ges ,inais 01E!'7M N 1E!(EB1 e iniciais 0 1 N (<E1!
Figura 03: Diviso da Regio Controle Mitocondrial
A regi"o controle respons#vel pela regula$"o da replica$"o e da transcri$"o de todo o
mtD/A! A replica$"o tendo in9cio nesta regi"o reali>ada por deslocamento de uma ,ita em
rela$"o N outra% ,ormando uma al$a% denominada D-Aoop 0displacemente loop1! /a regi"o
controle% s"o veri,icados os polimor,ismos do mD/A 0OPH3A5 e DAP6D% 1B<<1!
A grande varia$"o desta regi"o devida a v#rios ,atoresK
i1 o mtD/A muito sens9vel ao dano o:idativo causado principalmente por um
grande nQmero de radicais livres proporcionado um ambiente ,avor#vel a muta$"o do
D/A!
ii1 o mtD/A n"o possui &istonas% -ue e:erce um papel protetor no D/A nuclear
0RAK2S e van 3O52/%1BB<1D
iii1 a mtD/A polimerase possui uma pobre atividade reparadora se comparada a
polimerase nuclear!
iv1 a repara$"o do D/A dependente de e:cis"o de nucleot9deos n"o est# presente em
mitocndrias 0C3/5R2AO et al% 1BBB1!
M
v1 a t9pica estrutura D-Aoop% onde &# ,orma$"o moment*nea de ,itas simples pode
in,luenciar o padr"o de muta$"o pontual 0Reyes et al% 1BBC1% ?# -ue a ta:a de depurina$"o de
D/A ,ita-simples -uatro ve>es maior -ue a do D/A ,ita-dupla 0A6/DAHA e /R42R@%
1B<71!
5odos estes ,atores ,a>em com -ue o D/A mitocondrial ten&a uma ta:a de evolu$"o
( a 1' ve>es maior -ue o D/A nuclear% o -ue implica em uma &ipervariabilidade entre a
popula$"o &umana! A alta ta:a de substitui$"o de bases possibilita -ue se?a observada uma ou
mais di,eren$as na se-=+ncia nucleot9dica das regiGes &ipervari#veis do mtD/A% -uando
indiv9duos da lin&agem materna de uma mesma ,am9lia s"o comparados 0SARR25A% 1BBB1!
Por outro lado% o mtD/A est# presente em grande -uantidade em todas as clulas
0entre 1!''' e 1'!''' molculas de mtD/A por clula1% o -ue l&e con,ere um menor risco de
degrada$"o em rela$"o ao D/A nuclear! Por ele estar protegido por uma membrana% o torna
e:tremamente importante -uando do estudo de espcimes biol.gicas antigas% cu?o D/A
nuclear% em c.pia Qnica% em geral% encontra-se degradado!
A ocorr+ncia de &eteroplasmia outro ,ator -ue se deve levar em conta ao analisar o
mtD/A! 2sta se caracteri>a pela presen$a% em um mesmo indiv9duo de mais um gen.tipo de
D/A mitocondrial 04O5A2R e A2L6/% 1BBC1! 3 ,enmeno pode decorrer da muta$"o do
genoma de uma ou mais mitocndrias% gerando uma mistura de molculas mutantes e
normais! Tuando uma clula &eteroplasm#tica se divide% a &eran$a mitocondrial nas clulas
,il&as ocorre ao acaso! Depois de v#rios ciclos de divis"o celular% poss9vel -ue prevale$a%
dentro de uma clula% somente uma das ,ormas de mtD/A% ou o normal ou o mutante! 2sse
processo pode ocorrer em uma clula som#tica -uanto em clulas germinativas ,emininas
0@I2S% 7''81!

2special relev*ncia ad-uire a &eteroplasmia -uando se compara D/As
mitocondriais de ,amiliares% principalmente% -uando vest9gios em an#lise podem ser
provenientes de amostras biol.gicas de di,erentes tecidos do mesmo indiv9duo! Tuando a
mesma &eteroplasmia observada na amostra em -uest"o e na re,er+ncia% interpreta-se como
re,or$o para a vincula$"o entre as mesmas! U mais prov#vel -ue a &eteroplasmia se?a uma
&eran$a materna -uando detectada em todos os tecidos estudados! Por outro lado% a
ocorr+ncia de &eterplasmia em um Qnico tecido de um indiv9duo parece ser proveniente de
(
muta$"o som#tica 0CAAA3PAR et al% 7'''1! U mais ,re-=ente o encontro de &eteroplasmia
em indiv9duos com idade mais avan$ada 0@I2S% 7''8D JAR6/H3% 7''81!
Anlise do DNA mitocondrial
3 mtodo mais utili>ado no estudo do polimor,ismo do mtD/A consiste em
ampli,icar a regi"o controle% por meio da tcnica de PCR e se-=+nciar o produto ampli,icado!
2nt"o% s"o veri,icadas muta$Ges pontuais% inser$Ges e dele$Ges em rela$"o N se-=+ncia padr"o%
descrita por Anderson 01BC11!
Com rela$"o ao D/A mitocondrial antigo% deve-se estar atento ao ,ato de -ue este se
apresenta em bai:as concentra$Ges% e a presen$a de um D/A e:terno N prepara$"o pode
,acilmente provocar uma contamina$"o!
As regiGes &ipervari#veis contem um sitio rico em citosina% denominado poli C%
apresentando uma timina locali>ada apro:imadamente no centro da se-=+ncia! 2stes s9tios s"o
altamente suscept9veis a muta$"o% e% usualmente% veri,icada a substitui$"o de timina por
citosina! 0CA// e P6AS3/% 1BC81! 5ambm pode ocorrer o acrscimo de uma ou duas
citosinas N-uela regi"o em algumas popula$Ges de mitocndria% gerando &eteroplasmia! 2ste
tipo de muta$"o pode promover o surgimento de c.pias mais curtas em 1'pb% -uando na
ampli,ica$"o in vitro por PCR% considerando -ue o s9tio poli C encontra-se locali>ado na
regi"o ,inali>adora HL66! 3 s9tio poli C estando no centro da regi"o HL6 promove o
abortamento precoce da rea$"o de PCR 0@I2S% 7''81!
A substitui$"o do tipo transi$"o o polimor,ismo dominante e a troca entre as
bases 5 e C s"o mais ,re-=entes! 2m estudo sobre o padr"o de substitui$"o de nucleot9deos
nas regiGes HL6 e HL66% observou-se uma ta:a de substitui$"o em HL6 duas ve>es maior -ue
HL66! 2sta di,eren$a devida% principalmente% N alta ,re-=+ncia de transi$Ges de pirimidina
em HL6 0J2R2R% et al% 1BBB1!
Emprego da anlise de mtDNA
Para ,ins ,orenses% a an#lise do mtD/A deve se restringir a situa$Ges em -ue n"o
poss9vel a an#lise do D/A nuclear 0,ios de cabelo sem bulbo1% isto % -uando n"o &# material
E
gentico ade-uado eVou su,iciente para tipagem de regiGes S5R do D/A genmico% ou
-uando o material apresenta alta grau de degrada$"o 0ossos antigos1!
Por meio do con&ecimento ad-uirido sobre a estrutura do mtD/A% o estudo da
evolu$"o &umana e:perimentou enormes avan$os% tendo em vista a possibilidade de se
analisar com +:ito% restos &umanos antigos% como tecido cerebral de <!''' anos de idade e
ossos de at (!('' anos! Como e:emplo de estudos de evolu$"o% a an#lise das varia$Ges do
mtD/A permitiu a reconstru$"o de eventos migrat.rios de mul&eres ancestrais e a
conse-=ente divis"o de &aplotipos% tendo sido proposto -ue a espcie &umana surgiu na
W,rica a apro:imadamente 1('!''' anos 0L6@6AA/5% et al% 1BB11!
Para identi,icar os &aplogrupos mais antigos% os &aplotipos &umanos ,oram
comparados ao mtD/A de c&ipan>! 3s &aplotipos a,ricanos apresentam a maior varia$"o% e a
rai> mais pro,unda da #rvore ,ilogentica% consiste na origem% na W,rica da espcie &umana! A
#rvore ,ilogentica consiste nos seguintes gruposK A,ricano% com 8 &aplotipos 0A1% A7% e A81D
2uropeu com B &aplotipos 0H% 5% O% L% P% R% 6% S% K1D Asi#tico% com 7 macro&aplogrupos%
divididos em v#rios &aplotipos e% Americano% com ( &aplotipos 0A% 4% C% D e X1! Oma ve>
-ue os &aplotipos A% 4% C e D s"o caracter9sticas do grupo Asi#tico% especula-se -ue o grupo
Americano teria se originado deste por meio de migra$Ges a partir da Sibria 0PAAAAC2 et
al% 1BBB1
Diferenas Bsicas entre o DNA Nuclear e o DNA Mitocondrial
Con,orme descrito anteriormente% e:istem inQmeras di,eren$as entre o Dna /uclear
e o D/A Jitocondrial! As principais di,eren$as est"o listadas no -uadro 1% abai:o
demonstradoK
<
Tuadro 1- Di,eren$as 4#sicas entre o D/A /uclear e o D/A Jitocondrial
PARAMETRO DNA NUCLEAR DNA MITOCONDRIAL
Localizao No ncleo da clula, protegido pela
membrana nuclear
Nas mitocndrias, protegidas pela
membrana mitocondrial -
influncia de radicais livres
Conformao Dupla hlice Dupla fita circular
Mecanismo de proteo Protegido por histonas Desprovido de histonas
N de Genes 100.000 genes 37 genes
Funcionamento Autnomo Necesita da cooperao do DNA
nuclear
Composio Regies codificantes (xons) e no
codificantes (ntrons)
90 DNA codificante
Caracterstica do genoma Genoma diploide (materno/
paterno) - sofre recombinao
Genoma haploide (herana
materna) - no sofre recombinao
Formao momentnes de fita
simples
N de pares de bases Bilhes de pares de bases 16.569 pares de bases
Atividade da Polimerase Grande Fraca
Sistema de reparo Presente Ausente
Taxa de evoluo Pequena 5 a 10 x maior que a nuclear
N de DNA por clula 1 1.000 a 10.000
C
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